ШТАММ ВИРУСА ЯЩУРА Aphtae epizooticae ТИПА А ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЯЩУРА ТИПА А И ИХ КОНТРОЛЯ Российский патент 2015 года по МПК C12N7/00 A61K39/135 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму вируса ящура Aphtae epizooticae, и может быть использовано для контроля антигенной и иммуногенной активности для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.

Ящур - это острое, контагиозное, вирусное заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными (афтозными) поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытной щели и сопровождающееся нарушением движения. Для этого возбудителя характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. Многолетний опыт показывает, что при эндемичном ящуре снижаются доходы в молочном и мясном животноводстве на (%): 30÷40.

Вирус ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus. Он имеет 7 антигенных типов, большое количество подтипов и множество штаммов.

Возбудитель ящура обладает значительной антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов. Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков.

Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. Они вызывают также затруднения штаммоспецифической диагностики.

В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.

Известны штаммы вируса ящура типа А, использовавшиеся в качестве производственных на территории СССР и РФ в течение последних 50 лет.

К ним относятся следующие штаммы: А₇ №103, выделенный в 1962 году в Куйбышевской области; А₇ №2, выделенный в 1965 году в Таджикской ССР; А №717/73, выделенный в 1973 году в Ставропольском крае.

Указанные штаммы использовали для получения диагностикумов и противоящурных вакцин, применявшихся в различных регионах страны.

Однако после ликвидации ящура, вызываемого близкими им в антигенном отношении штаммами вируса, они были сняты с производства и в настоящее время поддерживаются лишь в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ» [1, 2, 3].

Известен штамм №550 вируса ящура А₂₂, выделенный в 1964 году в Азербайджане и используемый в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах постсоветсткого пространства [4].

В 1990-2000-х годах в Центральной Азии и на Ближнем Востоке доминировали две генетические линии вируса ящура типа А: линия А/Иран/96 (к этой генетической группе относится российский производственный штамм А/Армения/98) и А/Иран/2005. Генетическая линия А/Иран/99 не получила такого широкого распространения, как две упомянутые выше. Штаммы из группы А/Иран/99 и А/Иран/96 не входят в настоящее время в первоочередной перечень рекомендуемых Всемирной референтной лабораторией МЭБ/ФАО по ящуру вакцинных штаммов, тогда как штамм А/Иран/2005 (А/Турция/06)относится к высоко приоритетным [5].

Известен штамм вируса ящура Aphtae epizooticae A №1707 «Армения-98» для изготовления диагностических и вакцинных препаратов [6].

Выделение в 1998 г. в хозяйстве Охчик Амассийского района Армении от КРС вируса ящура типа А и изучение его филогенетического родства показало, что при сравнительном исследовании первичной структуры гена VP₁ штамма вируса ящура типа А №1707 «Армения-98» с производственными штаммами и полевыми изолятами установлено, что изоляты «Армения - 98» идентичны между собой и родственны штаммам типа А Турция/97, Турция/98 и Иран/96. Также установлено, что исследованные изоляты существенно отличаются от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от вируса подтипа A₂₂ (18% различий), куда относится и используемый для производства средств диагностики и специфической профилактики штамм А₂₂ №550.

Производственный штамм А №1707 «Армения-98» применяли в составе противоящурных вакцин в буферной зоне Закавказья.

Известен относящийся этой же линии выделенный в 1999 г. от больных коров в частном секторе села Уде Адигенского района Республики Грузия штамм А (Грузия) 1999/№1721 [7].

С 2003 года на территории Ирана был выделен изолят вируса ящура типа А, значительно отличающийся от ранее изученных штаммов этого типа. В течение 2005-2006 гг. ящур типа А получил широкое распространение в странах Западной Азии-Иране, Турции, Саудовской Аравии и Пакистане. В феврале 2006 года ящур типа А линии Иран/05 попал во Фракию - европейскую часть Турции, которая граничит с Болгарией и Грецией. Проведение 100% вакцинации всех жвачных с применением штамма А₂₂ во Фракии в феврале-марте 2006 г. предотвратило распространение ящура в соседние Грецию и Болгарию, однако через 3-4 месяца появились свежие случаи заболевания [8].

Известен штамм вируса ящура А №2045/Киргизия/2007, выделенный в Киргизской Республике от больной ящуром телки в 2007 г., принадлежащий к генетической линии, получившей название А Иран/2005 [9].

Недостатки вышеуказанных штаммов, в том, что приготовленные на их основе вакцины обеспечивают эффективную защиту животных только против заражения гомологичным вирусом.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к настоящему изобретению является штамм А №2045/Киргизия/2007 (прототип).

Вспышка ящура на территории РФ была отмечена в июле 2013 г. во дворах у жителей села Нижний Куркужин Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики в буферной зоне, где КРС и МРС с профилактической целью вакцинировали против ящура типа О, А, Азия-1. Из имевшихся у жителей села 2721 голов КРС разного возраста и 941 голов МРС заболело 23 головы КРС.

В связи с этим возникла необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического вируса ящура серотипа А для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серотипа А, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняющих антигенную и иммуногенную активность после инактивации, пригодных для изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и иммуногенных вакцинных препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся на территории России.

Указанная задача решена получением штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 (авторское наименование) вируса ящура типа А для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, был выделен в июле 2013 года от больных животных в селе Нижний Куркужин Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики (экспертиза №2171). Производственный штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А депонирован 28 января 2014 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 (производственный).

По сравнению со штаммом-прототипом штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 обладает более высокой инфекционной и антигенной активностью.

Экспериментально подтверждена возможность использования вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 для изготовления средств диагностики и специфической профилактики ящура типа А.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении, на котором дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А.

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:30.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 значительно отличается от производственных штаммов типа А. Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 со штаммами вируса ящура серологического типа А составила: А₂₂ №550 - 22,65%, А₂₂/Ирак/64 - 21,66%, А/Иран/96 - 21,43%, А/Армения/98 - 21,98%, А/Турция/06 - 8,23%, А/Иран/05 - 8,75%.

Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 принадлежит к генетической линии Иран 2005 топотипа Азия.

Антигенное родство штамма ВЯ А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 антигенно отличается от производственных штаммов А₂₂ №550, А₂₂ Ирак/64, А/Иран/97, А/Турция/2006 и А/Киргизия/07. Штамм ВЯ А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 не является для них близкородственным.

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r₁) составило для А₂₂ №550 - 0,013, А₂₂ Ирак/64 - 0,02, А/Иран/97 - 0,03, А/Турция/Об - 0,19 и А/Киргизия/2007 - 0,03. При значении r₁≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r₁<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [10, 11].

Биотехнологические характеристики

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 репродуцируется в монослойных культурах клеток: первично трипсинизированной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2. В течение 18-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений от 6,0 до 7,5 lg ТЦД₅₀/см³. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вирус вызывает ЦПД через 5 часов. Вирус сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).

Генотаксономическая характеристика

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7х10⁶ Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Антигенная активность - введение инактивированного антигена морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в июле 2013 года от подозреваемого в заболевании ящуром КРС из села Нижний Куркужин Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики (экспертиза №2171/2013). Пробы афтозного материала поступили в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 9 июля 2013 года.

При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [12].

Биологические и вирусологические методы включали выделение вируса на культуре первично трипсинизированных клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2 с последующей адаптацией. Для постановки биопробы в первичных и перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см², отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1÷10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После 30-минутного контакта при 37°С во флаконы вносили по 5 см³ поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК на наличие вирусного антигена, при этом использовали коммерческие типоспецифические сыворотки, хранящихся в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ». Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 18÷24 часов проявлялось (%) 90-100 ЦПД в монослое.

Вирус, адаптированный к культурам клеток IB-RS-2, использовали для получения антигена для РСК.

Адаптация эпизоотического изолята А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 к различным клеточным линиям наступала на уровне 3 пассажей. Вирус, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, был использован для заражения суспензии клеток ВНК-21 с целью получения антигена для изготовления экспериментальной серии вакцины, а также для гипериммунизации морских свинок. Результаты адаптации вируса к клеточным культурам представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А к использованным клеточным культурам.

Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован в реакции: РСК с целью идентификации его типовой принадлежности (таблица 3). Проведена проверка штамма на отсутствие контаминации бактериальной и грибной микрофлорой и микоплазмами, а также посторонними вирусами в ПЦР и ОТ-ПЦР.

Приведенные в таблице 3 результаты свидетельствуют о том, что в афтозном материале экспертизы №2171/Кабардино-Балкарский/2013 выявлен антиген вируса ящура типа А в разведении 1:2 в РСК. Контаминации посторонними вирусами не обнаружено.

Полученному штамму вируса ящура типа А присвоено авторское наименование: штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013.

Пример 2

Для гипериммунизации морских свинок используют антиген из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А, репродуцированный в монослойной культуре клеток ПСГК-30. Вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением 8-10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000, очищают от балластных примесей добавлением 10% хлороформа. Очищенный вирус и инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,025-0,05% при значении рН 8,0-8,3.

Инактивированный антиген в смеси с равным объемом масляного адъюванта типа неполного адъюванта Фрейнда вводят морским свинкам в объеме 1,0 см³ внутримышечно. Через 21 и 7 дней иммунизацию повторяют и через 10 дней после последнего введения антигена животных обескровливают. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК в соответствии с методическими рекомендациями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [12].

После этого готовят серию путем смешивания типоспецифичных индивидуальных проб сыворотки одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.

После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при температуре 4°С в течение 30 дней полученную сыворотку фасуют во флаконы по 0,5÷1,0 см³ и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Способом, описанным в примере 2, была приготовлена 1 серия гипериммунной сыворотки, характеристика которой представлена в таблице 4.

Данные, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о том, что получена диагностическая сыворотка, по специфической активности отвечающая требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 3

Для получения антигена для серологических и иммунохимических реакций используют штамм вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, адаптированный к культуре клеток перевиваемых линий ПСГК-30 и IB-RS-2. Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10% афтозной суспензии. Пассирование проводят в течение 3-5 последовательных пассажей. Полученный вирус используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике. Данные представлены в таблице 5.

Полученную вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением (%) 8-10 ПЭГ. Полученный концентрат инактивируют АЭЭИ, фасуют во флаконы и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Пример 4

Для изготовления вакцины инактивированной сорбированной типа А штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вирус ящура репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,2÷7,4. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,001÷0,05 ТЦЦ₅₀ на клетку. Культивирование вируса ведут при температуре (36°C)÷(37°C). Через 8-10 часов культивирования проводят подсчет живых и мертвых клеток путем окраски трипановым синим. Если количество живых клеток составляет (%) 15÷20, то культивирование продолжают еще 2÷3 часа. При достижении количества мертвых клеток (%) 90-95 культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S и 75S компонентов.

Количество 146S и 75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/см³. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20%-ный раствор АЭЭИ, подкисленной ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной (%) 0,025÷0,05. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12÷24 часов при (36°C)÷(37°C) и рН 7,2÷7,6 с перемешиванием через 5÷6 часов в течение 3÷5 минут. По окончании инактивации суспензию антигена охлаждают до (4°C)÷(8°C). В охлажденную суспензию добавляют 10%-ный раствор ПГМГ до концентрации 0,005÷0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией. Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем гидрата окиси алюминия (ГОА).

Расчетный объем геля ГОА 3%-ной концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 минут. После седиментации геля ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62±0,488 мг/см³ Р<0,01 n=10, а концентрация 146S и 75S компонентов вируса ящура не менее 3,0 мкг/см³. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10%-ный раствор сапонина до конечной концентрации не менее 0,075%.

Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные или полипропиленовые флаконы и проводят контроль стерильности по ГОСТ 28085-89.

Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2 см³, затем подкожно в дозе 10 см³. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 5 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или морских свинках.

Пример 5

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура Aphtae epizooticae типа А, предназначенный для контроля иммуногенной активности противоящурных вакцин на КРС, готовят следующим образом. Полученный вирус предварительно освежают на КРС, заражая 1-2 животных массой 250÷300 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны, где в течение последних 2-х лет не проводили вакцинацию животных против ящура. Количество пассажей вируса не должно превышать 20, начиная от исходного вируса. Суспензию вируса, содержащую 10000÷10000000 ИД₅₀/1 см³ с антибиотиками, вводят по 0,2÷0,3 см³ в 20÷40 каналов интрадермалингвально по всей поверхности языка. Зараженных животных не кормят до снятия вируса. Через 20÷30 часов после заражения афты снимают по мере их созревания. Лимфу собирают шприцом. На основе собранного афтозного материала готовят 20%-ную суспензию вируса, которую очищают от балластных примесей с последующим добавлением в нее антибиотиков и равного объема глицерина. Полученную 10% суспензию вируса оценивают в РСК на типоспецифичность и методом ОТ-ПЦР с последующим проведением нуклеотидного секвенирования на соответствие исходному вирусу по первичной структуре гена VP1. Активность вируса в РСК должна быть не ниже 1:4.

Инфекционную активность вируса определяют на КРС и в первичной культуре клеток СП. Контрольный вирус должен иметь титр инфекционной активности не менее 10^4,0 ИД₅₀/0,1 см³. Флаконы с суспензией вируса в присутствии глицерина хранят в холодильнике при температуре минус (70°С÷40°С).

Пример 6

Контроль иммуногенной и антигенной активности вакцины инактивированной сорбированной из вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 осуществляли следующим образом. Для проверки иммуногенной активности препарата использовали 17 голов КРС массой 200-250 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон. Первой группе животных из 5 голов КРС ввели вакцину подкожно в цельном виде. Второй группе животных из 5 голов КРС ввели подкожно разведение вакцины на фосфатно-буферном растворе в соотношении 1:4 и третьей группе из 5 голов в разведении 1:16. Четвертая группа из 2 голов осталась без вакцинации.

Объем прививной дозы составил 2,0 см³. На 21 день после вакцинации у 15 вакцинированных и 2 контрольных голов КРС взяли пробы крови и провели контрольное заражение животных введением под слизистую языка суспензии вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,2 см³.

Данные по антигенной и протективной активности вакцины представлены в таблице 6.

Антигенную активность вакцины контролировали по уровню вируснейтрализующих антител в сыворотке крови в РН на монослое первично трипсинизированной культуры клеток СП и в реакции микронейтрализации (РМН) на культуре клеток IB-RS-2. На 21 день после вакцинации уровень вируснейтрализующих антител в РН у КРС, привитых цельной вакциной серий №1 и №2, составил 6,8±0,15 log₂ и 6,5±0,41 log₂, уровень вируснейтрализующих антител в РМН - 7,6±0,44 log₂ и 5,7±0,28 log₂.

Через 8 дней после заражения провели патологоанатомическое исследование КРС. Заболели все контрольные животные, 4 животных, привитых разведением вакцины 1:16 (серия №1), и 2 животных, привитых разведением вакцины 1:16 (серия №2).

ИмД₅₀ вакцин серий №1 и №2 составила 0,19 и 0,11 см³. Прививная доза вакцин содержала 10,56 ПД₅₀ и 18,38 ПД₅₀ соответственно, что свидетельствует об эффективности препарата. Такая вакцина считается иммуногенной и пригодной для практического применения.

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

Источники информации

1. Ререр X. Ящур: пер. с нем. Г.А.Сурковой / под ред. и с предисл. канд. вет.наук. П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971. - 432 с.

2. Ящур /. А.Н. Бурдов, А.И. Дудников, П.В. Малярец [и др.]. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

3. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев [и др.]. - М.: ВНИИТИБП, 1998. - С.532-548.

4. Промышленный регламент на производство вакцины против ящура типов А, О, С, Азия-1, Сат-1, Сат-2 и Сат-3 инактивированной сорбированной моно- и поливалентной (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21): утв. директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 11.09.2009.- Владимир, 2009. - 216 с.

5. WRLFMD Quarterly Report July-September 2013 - URL http://www.wrlfmd.org/ref_labs/rei_lab_reports/OIE-FAO

6. Пат. РФ №2140452, C12N 7/00, A61K 39/135, G01N 33/569, А61К39/42, С07К16/08,27.10.1999 г.

7. Пат. РФ №2242513, C12N 7/00, A61K 39/135, 20.12.2004 г.

8. Foot-and-mouth Disease. Situation worldwide and major epidemiological events in 2005-2006 / K. Sumption, J. Lubroth, T. Murrai, S. De La Rocqe // EMPRESS/ Focus on…, 2007, №1, IIP.

9. Пат. РФ №2451745, C12N 7/00, A61K 39/135, 27.05.2012 г.

10. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 7th Ed. -, Paris, 2012 - Vol.1, Chapter 2.1.5. - P.166-169.

11. Selection of foot and mouth disease vaccine strains - a review / D.J. Paton, J.-F. Valacher, J. Bergman [et al.] // Rev. Sci. Tech. OIE. - 2005. - Vol.24(3). - P.981-993.

12. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура / Гусев А.А., Захаров В.М., Шажко Ж.А. [и др.]. Владимир, 2002, 31 с.

Таблица 1 Антигенное соответствие (r₁) в РМН штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А с производственными штаммами вируса ящура типа А Штамм Показатель r₁ А₂₂ №550 0,013 А₂₂/Ирак/64 0,02 А/Иран/97 0,03 А/Турция/06 0,19 А №2045/Киргизия/2007 0,03

Таблица 2 Биологические свойства вируса эпизоотического штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А Система репродукции вируса Время проявления биологической активности (часы) Количество адаптационных пассажей Характеристика адаптированного материала Активность в РСК Титр инфекционной активности (lg ТЦД₅₀/см³) ПСГК-30 20 5 1:4 6,45 IB-RS-2 24 5 1:2 6,0 ВНК-21 20 5 1:2 7,5

Таблица 3 Определение типа вируса в 33%-ной суспензии афтозного материала в РСК (экспертиза №2171 /Кабардино-Балкарский/2013)   Экспертиза №2171 Контроль Гипериммунные сыворотки в рабочем разведении цельный 1:2 1:4 1:8 к/а А/Турция/06 А22/Ирак/64 OPanAsia2 Азия-1 Шамир 3/89 б/а А/Турция/06 4 - - -   4 4 - - - А₂₂/Ирак/64 4 4 - -     4 - - - O PanAsia2 - - - -   - - 4 - - Азия-1 Шамир 3/89 - - - -   - -   4 - б/с - - - -   - - - - - б/к 4 4 4 4   4 4 4 4 4 Примечание: 4 - 100% задержка гемолиза; «-« полный гемолиз; б/с - без сыворотки; б/а - без антигена; б/к - без комплемента

Таблица 4 Характеристика диагностической сыворотки, полученной на антиген из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура Наименование препарата Серия Объем (см³) Активность в РСК с гомологичным антигеном с гетерологичными антигенами А/Турция/Об O PanAsia2 Азия-1 Шамир3/89 Гипериммунная сыворотка 1 200 1:30 <1:20 <1:20 <1:20

Таблица 5 Характеристика диагностических антигенов из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура, выращенного в различных культурах клеток Наименование препарата Серия Объем (см³) Активность в РСК с гомологичным диагностикумом А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 с гетерологичным диагностикумом А Культуральный антиген ПСГК-30 1 40 1:8 <1:2 Культуральный антиген IB-RS-2 1 60 1:12 1:2

Таблица 6 Результаты испытания сорбированной инактивированной моновалентной вакцины из штамма ВЯ А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 на КРС Вакцина серии №1 Вакцина серии №2 Разведе-
ние Генерал.
п/зараж. Титр ВНА (log₂) ИМД₅₀ Разведе-
ние Генерал.
п/зараж. Титр ВНА (log₂) ИМД50 РН РМН РН РМН Ц - 7,0 7,5 0,19 Ц - 6,5 6,5 0,11 - 6,25 7,5 - 8,0 6,0 - 6,75 7,5 - 6,5 5,0 - 7,0 6,5 - 5,75 5,5 - 7,0 9,0 - 5,75 5,5 М±m   6,8±0,15 7,6±0,44 M±m   6,5±0,41 5,7±0,28 1:4 - 6,25 6,5 1:4 - 7,25 6,0 - 5,0 5,5 - 5,0 6,0 - 4,25 7,0 - 4,25 5,5 - 4,5 5,5 - 4,0 5,5 - 3,5 5,0 - 6,0 6,0 М±m   4,75±0,46 5,9±0,41 M±m   5,3±0,6 5,8±0,13 1:16 + 3,0 4,0 1:16 - 3,5 4,0 - 5,0 6,0 - 3,0 4,0 + 1,5 4,0 + 1,75 4,0 + 2,0 4,5 - 2,25 4,0 + 1,75 4,0 + 2,5 5,0 М±m   2,65±0,64 4,5±0,43   M±m   2,6±0,3 4,2±0,22  

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Предложен штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа А сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированный в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013. Предложенный штамм вируса может быть использован при изготовлении биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А и их контроля. Штамм способен репродуцироваться в первично-трипсинизированнной монослойной культуре клеток почки свиньи, перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21 и IB-RS-2. В течение 18÷24 часов инкубирования титр инфекционной активности вируса в указанных культурах клеток достигает значений 6,0÷7,5 lg ТЦД₅₀/см³. 1 ил., 6 табл., 6 пр.

Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа А, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, депонированный в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером А №2171 /Кабардино-Балкарский/2013 (производственный) для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А и их контроля.