УЛУЧШЕННАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Российский патент 2015 года по МПК C12N5/02 C12N5/71 

Область техники

Настоящее изобретение относится к общей биотехнологии, в частности к культивированию клеток и их применению для получения полипептидов в промышленном масштабе.

Настоящее изобретение относится к средам для культивирования клеток с высоким содержанием хлорида холина, которые обеспечивают культивирование клеток с высокой жизнеспособностью в течение более длительного периода времени. Среды для культивирования клеток по настоящему изобретению, кроме того, позволяют обеспечить высокую продуктивность полипептида и/или улучшенное качество продукта при его использовании для получения полипептида путем рекомбинантной экспрессии полипептидов с использованием систем для культивирования клеток CHO, в частности, в промышленном масштабе.

Уровень техники, к которому относится изобретение

Получение полипептидов с использованием рекомбинантной технологии стало стандартной методикой за последние два десятилетия. Доступ к рекомбинантным полипептидам путем клонирования генов, кодирующих соответствующий полипептид, с последующей трансформацией подходящих хозяев для экспрессии экспрессируемого геном и конечным продуцированием и очисткой полученного рекомбинантного полипептидого продукта позволил получить целый новый класс биологически смоделированных и продуцированных лекарственных средств.

Фармацевтически активные соединения получают в повышающихся количествах в фармацевтической промышленности с использованием технологии рекомбинантных ДНК, а затем способами обработки, разработанными в области биоинженерии.

Такие биологические продукты включают моноклональные антитела, на основе которых были созданы важные варианты лечения в различных областях медицины, включая аутоиммунные заболевания, воспалительные нарушения, заболевание с подавлением иммунного ответа, онкологию или тому подобное.

Для создания таких лекарственных средств биологического происхождения требуется получение в промышленном масштабе, тем самым, обеспечения доступа к большим количествам рекомбинантного полипептида. Предпочтительными экспрессирующими системами являются культуры клеток млекопитающих, которые превосходят большинство других эукариотических систем, основанных на клетках насекомых, дрожжах или тому подобное, или даже традиционные прокариотические экспрессирующие системы.

Однако с клеточной культурой млекопитающих связаны значительные проблемы, особенно при получении в промышленном масштабе. Средства производства для культуры клеток млекопитающих требуют тщательной оптимизации многих условий процесса.

Одним из наиболее важных параметров процесса для контроля общего процесса получения является среда, в которой растут клетки. Подходящие среды для культивирования клеток должны снабжать клеточные культуры всеми необходимыми питательными веществами, что особенно трудно, если в среду не добавляют компонентов животного происхождения, таких как сыворотка или белки, например факторы роста.

Кроме того, для культуры клеток млекопитающих требуются конкретные дополнительные компоненты на различных стадиях процесса получения полипептидов. Таким образом, среда для культивирования клеток должна представлять необходимые субстраты в ходе a) первоначального роста и пролиферации клеток-хозяев при более низкой плотности; b) последующего культивирования клеток до высокой плотности; c) фактического процесса формирования полипептида в культивируемых клетках.

Общий способ продуцирования рекомбинантного полипептида предпочтительно включает фазу увеличения количества и фазу продуцирования. В фазе увеличения количества клетки-хозяева культивируют до высокой плотности с использованием среды для роста для максимизации последующей продукции полипептида. На стадии продукции достигают фактического образования желаемого полипептида в больших количествах с использованием среды для продуцирования. Для удовлетворения конкретных метаболических потребностей клеток на каждой фазе всего процесса получения полипептида были разработаны различные композиции сред для стадии увеличения количества и получения соответственно. Например, среды для продуцирования часто содержат более высокие количества аминокислот, чем среды для роста.

Таким образом, в прошлом были предприняты значительные усилия для разработки сред для культивирования клеток, конкретно, с акцентом на их применение для крупномасштабного получения полипептидов. Тем не менее, постоянное улучшение среды для культивирования клеток остается важной задачей дальнейшей максимизации получения полипептида с точки зрения качества продукта и количественного выхода.

Ранее были исследованы многие компоненты клеточных культуральных сред с точки зрения их роли в получении полипептида. Возможными мишенями являются неорганические соли, аминокислоты, источники углерода, такие как глюкоза, или витамины.

Например, было показано, что добавление соединениями, такими как витамины, хлорид холина или аминокислоты, может увеличить жизнеспособность и продуктивность клеток, культивируемых в условиях отсутствия белка (Kim do Y et al., Cytotechnology 2005, 47, 37-49).

Хлорид холина является стандартным компонентом среды для культивирования клеток, который служит в качестве предшественника фосфолипидов для клеток. После захвата и процессирования клетками его конечным продуктом является, помимо фосфатидилэтаноламина и фосфатидилинозитола, один из основных фосфолипидов в клеточных мембранах, называемый фосфатидилхолином.

Широко используемые среды для культивирования клеток, такие как D-MEM (модифицированная способом Дульбекко среда Игла) и D-MEM/F-12, широко используют для выращивания широкого диапазона клеточных линий млекопитающих. Эти среды включают количества хлорида холина, составляющие 4 мг/л и 8,98 мг/л соответственно.

Другие коммерчески доступные среды, такие как среда Хэма F-12 (коммерчески доступная от BioConcept) и MEM (коммерчески доступная от HyClone), также содержат низкие количества хлорида холина, составляющие 13,96 мг/л и 56 мг/л соответственно.

В US 6180401 описан улучшенный способ получения полипептида в культуре клеток животных. Одной из задач является увеличение концентрации конечного продукта. Для максимизации выхода продукта на стадии продукции модифицируют несколько параметров, включая концентрацию глюкозы, осмолярность и концентрацию глутамина. В US 6180401 описана среда для культивирования клеток, которая имеет содержание хлорида холина 50,86 мг/л.

В US 5122469 описана культуральная среда для размножения различных клеточных линий млекопитающих, в частности клеток яичника китайского хомячка (CHO), и она обеспечивает культивирование клеток при высокой плотности в качестве монослоев или в суспензии, подходящих для мелкомасштабного и крупномасштабного размножения клеток млекопитающих. Еще одним преимуществом является повышение выхода продукта. Среда представляет собой культуральную среду с определенным химическим составом, содержащую повышенные уровни определенных аминокислот. Содержание хлорида холина составляет 50,86 мг/л.

Из уровня техники известно очень мало сред с высоким содержанием хлорида холина. Waymouth описал среду для культивирования клеток, которую можно использовать для культивирования клеточной линии фибробластов соединительной ткани L929 (C. Waymouth, J. Natl. Cancer. Inst., 1959, 22, 1003-1017). Эта среда представляет собой бессывороточную среду с определенным химическим составом, и содержание хлорида холина в ней составляет 250 мг/л. Эта среда коммерчески доступна под названием Waymouth's Medium MB 752/1 (BioConcept and Sigma-Aldrich). Известная возможность использования ограничена культурой целого органа, установлением клеточных линий карциномы из плевральных выпотов и выращиванием потенциально образующих опухоли клеток перед их оценкой in vivo.

В WO 02/101019 описаны две композиции среды с относительно высоким содержанием хлорида холина 101,72 мг/л и 209,40 мг/л соответственно. Эти среды использовали для исследования влияния глутамина и глутамата на получение рекомбинантных белков. Однако обе среды, тем не менее, содержали высокие количества глутамина.

Из уровня техники известна лишь ограниченная информация в отношении роли содержания хлорида холина в средах для культивирования клеток в продуцировании полипептида. В US 6048728 кратко обсуждается роль содержания хлорида холина в средах для культивирования клеток в продуцировании биологических продуктов с использованием клеток гибридом. В случае клеток, экспрессирующих антитело, секрецию максимальных количеств антитела наблюдали в средах с добавлением холина более 4 мг/л и предпочтительно приблизительно от 4 до 75 мг/л в сочетании с другими реагентами Primary Supplement. Описано, что в этих концентрациях холин не является ограничивающим и не проявляет заметной токсичности.

Получение сред для культивирования клеток, особенно сред, предназначенных для использования для продукции рекомбинантных полипептидов в промышленном масштабе, требует увеличенных количеств компонентов, например аминокислот.

Однако было показано, что высококонцентрированные среды для культивирования клеток имеют ограниченную растворимость отдельных компонентов сред. Ограниченная растворимость является техническим недостатком, поскольку высоко концентрированные среды для крупномасштабного получения несут в себе риск выпадения в осадок отдельных компонентов, например в фазе получения и особенно в ходе хранения. Это может привести к изменению состава сред и ухудшению условий культивирования клеток в критический момент образования белка.

В дальнейшем, осаждение приводит к удалению ценных компонентов сред из фактического процесса получения. Дополнительные процессы рециклирования, предназначенные для устранения таких недостатков, являются технически трудными для осуществления и требуют дополнительных усилий с точки зрения ресурсов и времени. Менее концентрированные среды для культивирования клеток, когда они в равной степени эффективны в отношении получения полипептида, обеспечивают достижения значительного снижения затрат в процессах промышленного продуцирования.

Учитывая указанные выше проблемы и существующие недостатки, продолжает существовать потребность в области промышленной биотехнологии в улучшенных средах для культивирования, которые обеспечивают получение рекомбинантных полипептидов в промышленном масштабе с еще более высокими выходами, т.е. повышенной удельной и общей продуктивностью, и повышенным качеством продукта. Улучшенные среды для культивирования клеток особенно необходимы для повышения продуктивности на стадии продукции.

Конкретной технической задачей процессов получения полипептидов является поддержание более высокой жизнеспособности клеток в конце процесса получения для максимального увеличения конечного выхода полипептида, в частности, вследствие продления времени продуцирования. Более того, также важной технической задачей является уменьшение агрегации образовавшегося рекомбинантного полипептида и улучшение качества продукта, в частности, с точки зрения посттрансляционных модификаций, таких как паттерн гликозилирования.

Наконец, желательным является улучшение среды для крупномасштабной продукции полипептидов, которая содержит уменьшенные количества компонентов, одновременно оставаясь равно эффективной или даже лучшей с точки зрения роста клеток, продуктивности в отношении полипептида, качества рекомбинантного полипептида и функциональности полипептида.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к средам для культивирования клеток с высоким содержанием хлорида холина, что приводит к неожиданному увеличению удельной продуктивности клеток и жизнеспособности клеток, особенно на более поздних стадиях процессов биотехнологического получения, и которые предназначены для решения технических проблем, указанных выше. Кроме того, качество рекомбинантного продукта при использовании сред для культивирования клеток также неожиданно улучшается. Среды для культивирования клеток по настоящему изобретению особенно эффективны для использования на фазе стадии продукции. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает получение рекомбинантного полипептида из клеток CHO.

Среды для культивирования клеток можно использовать, в частности, в качестве среды для продуцирования для обеспечения высокого роста клеток, высокой плотности жизнеспособных клеток и высокого титра полипептидов на стадии продукции. Также было обнаружено, что качество продуктов, состоящее в меньшей агрегации и/или лучшей посттрансляционной модификации, такой как характер гликозилирования рекомбинантного продукта, может быть улучшено при использовании сред для культивирования клеток по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении, предпочтительно, используют хлорид холина. Однако другие источники холина, например гидроксид холина, тартрат/битартрат холина, сульфат холина, фосфат холина или любое другое соединение холина, основанное на использовании отличающегося противоиона, также подходят для использования в средах для культивирования клеток по настоящему изобретению. При использовании таких других соединений холина их количество предпочтительно выбирают так, чтобы достигнуть той же молярной концентрации холина, которую достигают с использованием хлорида холина в диапазонах и величинах концентраций, приведенных выше, т.е. другая соль холина предпочтительно присутствует в концентрации, эквивалентной описанной концентрации хлорида холина. Это также справедливо для конкретных аспектов и вариантов осуществления, описанных ниже.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения, предусмотрена среда для культивирования клеток с содержанием хлорида холина в диапазоне от 60 мг/л до 2500 мг/л. Содержание хлорида холина в среде для культивирования клеток может составлять 80 мг/л или выше, альтернативно 160 мг/л или выше, 200 мг/л или выше или 220 мг/л или выше. Содержание хлорида холина в среде для культивирования клеток ограничено до 2500 мг/л, альтернативно 1000 мг/л, 840 мг/л, 500 мг/л или 300 мг/л. Хлорид холина может находиться в концентрации приблизительно 240 мг/л.

Среда для культивирования клеток согласно первому аспекту изобретения, кроме того, имеет только ограниченное содержание аминокислот, выражаемое общей концентрацией аминокислот от 20 до 57 ммоль/л. Альтернативно, общая концентрация аминокислот составляет выше 25 ммоль/л, выше 30 ммоль/л, выше 35 ммоль/л или даже выше 40 ммоль/л. Кроме того, общая концентрация аминокислот может составлять ниже 54 ммоль/л. Общая концентрация аминокислот, например, может составлять приблизительно 51 ммоль/л.

Кроме того, среда для культивирования клеток необязательно содержит сниженное количество глутамина. В частности, глутамин присутствует в концентрации от 500 до 1400 мг/л, альтернативно от 800 до 1400 мг/л или даже от 900 до 1200 мг/л.

Содержащиеся аминокислоты в среде для культивирования клеток согласно первому аспекту изобретения необязательно могут включать следующие аминокислоты в следующих концентрациях, выраженных в ммоль/л:

Аргинин 4,0-6,0, предпочтительно, 4,5-5,5 Аспарагин 3,0-6,0, предпочтительно, 4,0-5,5 Аспарагиновая кислота 2,5-4,0, предпочтительно, 3,0-3,6 Глицин 0,3-0,8, предпочтительно, 0,5-0,7 Гистидин 0,6-1,0, предпочтительно, 0,7-0,9 Изолейцин 2,0-5,0, предпочтительно, 3,0-4,0 Лейцин 3,0-7,0, предпочтительно, 3,5-6,0 Лизин 2,0-4,0, предпочтительно, 2,5-3,5 Метионин 1,0-1,5, предпочтительно, 1,2-1,4 Фенилаланин 1,0-2,0, предпочтительно, 1,3-1,8 Пролин 2,5-6,0, предпочтительно, 3,0-5,5 Серин 3,0-8,0, предпочтительно, 4,0-7,0 Треонин 2,0-3,5, предпочтительно, 2,5-3,1 Триптофан 0,4-1,0, предпочтительно, 0,5-0,8 Валин 2,5-5,0, предпочтительно, 3,0-4,5 Тирозин 1,0-2,0, предпочтительно, 1,2-1,8 Цистин 0,5-1,0, предпочтительно, 0,6-0,8

Среды для культивирования клеток предпочтительно являются средами, не содержащими сыворотку и не содержащими белок. Предпочтительно, они также не содержат гидролизаты белка.

Согласно второму аспекту, настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного полипептида, включающему фазу продуцирования, где рекомбинантные клетки CHO культивируют в средах для культивирования клеток, согласно первому аспекту изобретения.

Получаемый рекомбинантный полипептид представляет собой, в частности, рекомбинантное антитело. В способе по изобретению клетки предпочтительно культивируют в периодическом процессе с подпиткой.

Краткое описание чертежей

На фиг.1-8 три среды представляют собой среду для роста с низким содержанием холина (♦ (ромб); контроль 1), среду для продуцирования (▲ (треугольник); контроль 2) и среду с высоким содержанием холина, т.е. среду для роста с низким содержанием холина, дополненную дополнительным количеством хлорида холина 200 мг/л (■ (квадрат)).

На фиг.1 представлены нормализованные плотности жизнеспособных клеток для клеток, экспрессирующих mAb1, культивируемых во вращающихся флаконах, в качестве функции времени в трех различных средах для культивирования клеток (эксперимент 1).

На фиг.2 представлена жизнеспособность клеток, экспрессирующих mAb1, культивируемых во вращающихся флаконах, в качестве функции времени в трех различных средах для культивирования клеток (эксперимент 1).

На фиг.3 представлен нормализованный титр полипептида, полученный после культивирования клеток, экспрессирующих mAb1, во вращающихся флаконах в качестве функции времени для трех различных сред (эксперимент 1).

На фиг.4 представлены нормализованные плотности жизнеспособных клеток, экспрессирующих mAb2, культивируемых во вращающихся флаконах в качестве функции времени в трех различных средах для культивирования клеток (эксперимент 2).

На фиг.5 представлена жизнеспособность клеток, экспрессирующих mAb2, культивируемых во вращающихся флаконах, в качестве функции времени в трех различных средах для культивирования клеток (эксперимент 2).

На фиг.6 представлен нормализованный титр полипептида, полученный после культивирования клеток, экспрессирующих mAb2, во вращающихся флаконах, в качестве функции времени для трех различных сред (эксперимент 2).

На фиг.7 представлены нормализованные плотности жизнеспособных клеток, экспрессирующих mAb3, культивируемых во вращающихся флаконах, в качестве функции времени в трех различных средах для культивирования клеток (эксперимент 3).

На фиг.8 представлена жизнеспособность клеток, экспрессирующих mAb3, культивируемых во вращающихся флаконах, в качестве функции времени в трех различных средах для культивирования клеток (эксперимент 3).

На фиг.9 представлен нормализованный титр полипептида, полученный после культивирования клеток, экспрессирующих mAb3, во вращающихся флаконах в качестве функции времени для трех различных сред (эксперимент 3).

На фиг.10 представлен уровень агрегации mAb3, продуцированного после семи суток культивирования во вращающихся колбах. Уровень агрегации измеряют эксклюзионной хроматографией (SEC). Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения для трех повторений биологических экспериментов.

На фиг.11 представлена нормализованная плотность жизнеспособных клеток для клеток, экспрессирующих mAb3, культивируемых при периодическом культивировании с подпиткой в биореакторе в качестве функции времени в трех различных средах для культивирования клеток (эксперимент 4).

На фиг.12 представлена жизнеспособность клеток, экспрессирующих mAb3, культивируемых путем периодического культивирования с подпиткой в биореакторе в качестве функции времени в трех различных средах для культивирования клеток (эксперимент 4).

На фиг.13 представлен нормализованный титр полипептида, полученный с использованием клеток, экспрессирующих mAb3, при периодическом культивировании с подпиткой в качестве функции времени с использованием трех различных сред (эксперимент 4).

На фиг.14 представлен нормализованный титр антитела mAb3, полученный после культивирования клеток в течение 13 суток с использованием среды для роста с низким содержанием холина, дополненной различными концентрациями хлорида холина.

На фиг.15 представлена жизнеспособность клеток, экспрессирующих mAb-3, на 13 сутки культивирования клеток с использованием среды для роста с низким содержанием холина, дополненной различными концентрациями хлорида холина.

На фиг.16 представлена нормализованная плотность жизнеспособных клеток для клеток, экспрессирующих mAb3, начиная с 3 суток (100%) по 13 сутки, с использованием среды для роста с низким содержанием холина, дополненной различными концентрациями хлорида холина.

На фиг.17 представлена жизнеспособность клеток, экспрессирующих mAb3, начиная с 3 суток по 13 сутки, с использованием среды для роста с низким содержанием холина, дополненной различными концентрациями хлорида холина.

На фиг.18 представлено нормализованное развитие титра антитела mAb3, начиная с 3 суток по 13 сутки, при культивировании с использованием среды с низким содержанием холина, дополненной различными концентрациями хлорида холина.

На фиг.19 представлена нормализованная плотность жизнеспособных клеток для клеток, экспрессирующих mAb4, начиная с 0 суток по 17 сутки, с использованием среды с низким содержанием холина, дополненной различными концентрациями хлорида холина.

На фиг.20 представлена жизнеспособность клеток, экспрессирующих mAb4, начиная с 0 суток по 17 сутки, с использованием среды для роста с низким содержанием холина, дополненной различными концентрациями хлорида холина.

На фиг.21 представлена жизнеспособность клеток, экспрессирующих mAb4, на 17 сутки при использовании среды для роста с низким содержанием холина, дополненной различными концентрациями хлорида холина.

На фиг.22 представлен нормализованный титр антитела mAb4, начиная с 7 суток по 17 сутки с использованием среды для роста с низким содержанием холина, дополненной различными концентрациями хлорида холина.

На фиг.23 представлена нормализованная концентрация антитела mAb4 на 17 сутки при использовании среды для роста с низким содержанием холина, дополненной различными концентрациями хлорида холина.

На фиг.24 представлена нормализованная средняя удельная продуктивность клеток (qP) для клеток, экспрессирующих mAb4, полученная при культивировании клеток в течение 17 суток с использованием среды для роста с низким содержанием хлорида холина, дополненной различными концентрациями хлорида холина.

Подробное описание изобретения

Общепринятые среды для культивирования клеток, которые используют для культивирования клеток и последующего получения полипептидов из этих клеточных культур, содержат только небольшие количества хлорида холина. Только очень немногие среды для культивирования клеток, описанные в уровне техники, содержат умеренные или даже высокие количества хлорида холина. Однако эти среды не были системно исследованы с точки зрения того, какую роль высокие количества хлорида холина играют в удельной продуктивности клетки, росте клетки и качестве продукта, особенно при использовании на стадии продукции.

По настоящему изобретению наблюдается неожиданное улучшение удельной продуктивности клеток (или экспрессии полипептида) при культивировании клеток CHO с использованием в качестве сред для получения сред для культивирования клеток, содержащих высокие количества хлорида холина по сравнению с более низкими количествами хлорида холина. В настоящем документе показано, что даже среду для роста, когда в нее добавлены высокие количества хлорида холина, можно неожиданно использовать в качестве эффективной среды для получения в целях культивирования клеток CHO на стадии продукции, тем самым получая большие количества полипептида, предпочтительно полипептида, получаемого рекомбинантной экспрессией полипептида в клеточных культурах.

Хотя по настоящему изобретению предпочтительно используют хлорид холина, другие источники холина, например гидроксид холина, тартрат/битартрат холина, сульфат холина, фосфат холина или любое другое соединение холина, основанное на использовании отличающегося противоиона, также в равной степени подходят для применения в средах для культивирования клеток по настоящему изобретению.

Использование среды для культивирования клеток по настоящему изобретению для получения полипептидов обычно вовлекает культивирование клеток CHO для рекомбинантной экспрессии полипептидов. Предпочтительно среду для культивирования клеток используют для крупномасштабного получения полипептидов. Крупномасштабное получение полипептидов относится к количествам, обычно требуемым для промышленного получения рекомбинантных полипептидов, используемых для получения терапевтически активных биофармацевтических средств. Для использования для крупномасштабного получения, как правило, обычно применяют культуры клеток объемом по меньшей мере 500 л, по меньшей мере 1000 л, по меньшей мере 5000 л или даже больших объемов.

Количество хлорида холина в среде для культивирования клеток по настоящему изобретению, используемой для получения полипептида, значительно превышает содержание хлорида холина, известное для ранее использованных сред для культивирования клеток, используемых для крупномасштабного получения полипептида.

Таким образом, настоящее изобретение может использоваться для получения рекомбинантного полипептида с использованием клеток CHO, имеющих высокое содержание хлорида холина, такое как 60 мг/л или выше, 80 мг/л или выше, 160 мг/л или выше, 200 мг/л или выше или даже 220 мг/л или выше. Содержание хлорида холина в среде для культивирования клеток ограничено до 2500 мг/л, 1000 мг/л, 840 мг/л, 500 мг/л или даже 300 мг/л. Хлорид холина может присутствовать в концентрации приблизительно 240 мг/л.

Чем больше концентрация хлорида холина, тем больше стоимость среды. Таким образом, чрезмерно высокие концентрации хлорида холина невыгодны с экономической точки зрения. Более того, содержание хлорида холина влияет на осмолярность среды. Чрезмерно высокие концентрации хлорида холина могут быть неблагоприятны, поскольку они могут привести, совместно с другими компонентами среды, к общей осмолярности, превышающей желаемую. В частности, в периодических процессах культивирования с подпиткой нежелательно использовать чрезмерно высокую начальную осмолярность, поскольку она может налагать ограничения на стратегию подпиток.

По указанным выше причинам авторы изобретения полагают, что оптимальные концентрации хлорида холина находятся в пределах, указанных в настоящем описании.

Если используют соединения холина, отличные от хлорида холина, их используют в эквивалентных концентрациях. Эквивалентные концентрации означают, что достигают молярных концентраций холина, которые находятся в тех же диапазонах, которые достигаются, если хлорид холина используется в концентрациях в указанных выше диапазонах.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения, среда для культивирования клеток имеет только ограниченное содержание аминокислот, выражаемое в качестве общей концентрации аминокислот. Более конкретно, среда для культивирования клеток согласно первому аспекту изобретения характеризуется общей концентрацией аминокислот от 20 до 57 ммоль/л. Общая концентрация аминокислот может составлять более 25 ммоль/л, более 30 ммоль/л, более 35 ммоль/л или даже более 40 ммоль/л. Более того, общая концентрация аминокислот может составлять ниже 54 ммоль/л. Общая концентрация аминокислот может составлять, например, приблизительно 51 ммоль/л.

В то же время, концентрация хлорида холина соответствует той, которая указана выше, т.е. находится в диапазоне от 60 мг/л до 2500 мг/л, причем предпочтительные диапазоны и величины также соответствуют тем, которые указаны выше.

Среду для культивирования клеток согласно первому аспекту настоящего изобретения можно использовать, в частности, в качестве среды для получения для достижения высокого роста клеток, высокой плотности жизнеспособных клеток и высокого титра полипептида на стадии продукции. Кроме того, достигают более высокого качества рекомбинантного продукта, в частности, с точки зрения меньшей агрегации и/или лучших посттрансляционных модификаций, таких как улучшенный паттерн гликозилирования.

Роль аминокислоты глутамина для роста клеточных культур и конечной продуктивности в отношении полипептида в последние годы подвергалась тщательным исследованиям. Было обнаружено, что глутамин является не только важным структурным блоком для синтеза полипептида, но также он является основным источником энергии для клеток млекопитающих. Таким образом, в среды для культивирования клеток, используемые для получения полипептида, обычно вносят высокие концентрации глутамина. Высокие количества глутамина в средах для культивирования клеток являются важными для роста клеток и экспрессии полипептида, в частности в промышленном масштабе.

Тем не менее, метаболизм глутамина приводит к распаду глутамина и накоплению ионов аммония, которые известны в качестве побочного продукта, являющегося токсичным для роста клеток и получения полипептида. Таким образом, желательно ограничить количество глутамина в клеточных культурах. В уровне техники было предложено несколько агентов для замены глутамина, например глутаминовая кислота. Однако было описано, что замена глутамина глутаминовой кислотой в периодических процессах культивирования с подпиткой приводит не только к меньшему образованию побочных продуктов, но также к более низкой продуктивности (Doverskog et al., J. Biotechnol., 1997, 59, 103-115). Таким образом, для культивирования клеток желательны среды, содержащие пониженное количество глутамина, но при этом обеспечивающие высокий рост клеток и продуктивность полипептида.

Было обнаружено, что добавление высоких количеств хлорида холина позволяет использовать среды, содержащие пониженные количества глутамина по сравнению с некоторыми известными средами, особенно на стадии продукции, в то время как продуктивность клеток сохраняется по большей части неизмененной.

Таким образом, в соответствии с первым аспектом настоящее изобретение относится к среде для культивирования клеток, необязательно дополнительно содержащей количество глутамина, которое значительно снижено по сравнению со средами, известными из уровня техники. Среды для культивирования клеток также могут не содержать заменяющих глутамин агентов, таких как глутаминовая кислота или тому подобное. Среда для культивирования клеток, необязательно, содержит глутамин в концентрации от 500 до 1400 мг/л, от 800 до 1400 мг/л или от 900 до 1200 мг/л.

В то же время, концентрация хлорида холина соответствует той, которая указана выше, т.е. находится в диапазоне от 60 мг/л до 2500 мг/л, причем предпочтительные диапазоны и величины также соответствуют тем, которые указаны выше. Кроме того, в то же время общая концентрация аминокислот в среде для культивирования клеток составляет от 20 до 57 ммоль/л, причем предпочтительные диапазоны и величины также соответствуют тем, которые указаны выше.

Согласно другой необязательной модификации первого аспекта настоящего изобретения, соответствующие количества отдельных аминокислот соответствуют тем, которые указаны ниже.

Такие умеренные количества аминокислот, тем не менее, превышают количества аминокислот, содержащихся в общепринятых средах для культивирования клеток, таких как DMEM или RPMI, но в то же время являются значительно более низкими, чем количества аминокислот, содержащихся в типичных средах для продукции, используемых при крупномасштабном получении.

Повышенные количества аминокислот в средах для продукции считаются важными для высокой продуктивности и высокого качества продукта, особенно, если получение полипептида осуществляют в крупном масштабе или даже в промышленном масштабе. В рамках настоящего изобретения было обнаружено, что наличие высоких количеств хлорида холина позволяет ограничить количества отдельных аминокислот, особенно в средах для культивирования клеток, используемых на стадии продукции.

Содержание отдельных аминокислот в среде для культивирования клеток согласно этой необязательной модификации в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения включает следующие аминокислоты в следующих количествах, выраженных в ммоль/л:

Аргинин 4,0-6,0, предпочтительно 4,5-5,5 Аспарагин 3,0-6,0, предпочтительно 4,0-5,5 Аспарагиновая кислота 2,5-4,0, предпочтительно 3,0-3,6 Глицин 0,3-0,8, предпочтительно 0,5-0,7 Гистидин 0,6-1,0, предпочтительно 0,7-0,9 Изолейцин 2,0-5,0, предпочтительно 3,0-4,0 Лейцин 3,0-7,0, предпочтительно 3,5-6,0 Лизин 2,0-4,0, предпочтительно 2,5-3,5 Метионин 1,0-1,5, предпочтительно 1,2-1,4 Фенилаланин 1,0-2,0, предпочтительно 1,3-1,8 Пролин 2,5-6,0, предпочтительно 3,0-5,5 Серин 3,0-8,0, предпочтительно 4,0-7,0 Треонин 2,0-3,5, предпочтительно 2,5-3,1 Триптофан 0,4-1,0, предпочтительно 0,5-0,8 Валин 2,5-5,0, предпочтительно 3,0-4,5 Глутамин 6,0-10,0, предпочтительно 7,5-9,0 Тирозин 1,0-2,0, предпочтительно 1,2-1,8 Цистин 0,5-1,0, предпочтительно 0,6-0,8

В то же время, концентрация хлорида холина соответствует той, которая указана выше, т.е. находится в диапазоне от 60 мг/л до 2500 мг/л, причем предпочтительные диапазоны и величины также соответствуют тем, которые указаны выше. Кроме того, в то же время общая концентрация аминокислот в среде для культивирования клеток составляет от 20 до 57 ммоль/л, причем предпочтительные диапазоны и величины также соответствуют тем, которые указаны выше.

Благодаря высокому содержанию хлорида холина, соответствующие количества аминокислот могут быть значительно более низкими, чем количества, используемые в других средах для культивирования клеток, используемых для крупномасштабного получения полипептидов. Иными словами, добавление высоких количеств хлорида холина позволяет значительно снизить количество большинства из аминокислот без снижения роста клеток, жизнеспособности клеток и титра полипептидов. Это имеет техническое преимущество, состоящее в том, что можно использовать среды для культивирования клеток с более низкой концентрацией большинства из включенных аминокислот, тем самым избегая проблем, связанных с выпадением в осадок менее растворимых компонентов сред для культивирования клеток. Кроме того, достигается значительное снижение затрат на среды для культивирования клеток без изменения или даже с улучшением общего качества и выхода полипептидного продукта. Как описано ниже, с использованием сред для культивирования клеток по настоящему изобретению может быть снижена агрегация рекомбинантного полипептидного продукта. Кроме того, также могут проходить лучшие посттрансляционные модификации, например, быть улучшен характер гликозилирования или улучшены другие признаки качества белка, такие как более низкая агрегация рекомбинантного полипептида. В некоторых случаях модификация сред для культивирования клеток, описанных в рамках настоящего изобретения, даже содействует увеличению жизнеспособности клеток и росту клеток, а также улучшает конечный титр полипептида.

Термин "среда для культивирования клеток" относится к водному раствору питательных веществ, которые можно использовать для выращивания клеток в течение продолжительного периода времени. Как правило, среды для культивирования клеток включают следующие компоненты: источник энергии, который обычно представляет собой углеводное соединение, предпочтительно глюкозу, аминокислоты, предпочтительно основной набор аминокислот, включая все незаменимые и заменимые аминокислоты, витамины и/или другие органические соединения, которые требуются при более низких концентрациях, свободные жирные кислоты и неорганические соединения, включающие микроэлементы, неорганические соли, буферные соединения и нуклеозиды и основания.

Термин "среда для роста" относится к среде для культивирования клеток, которую обычно используют на стадии увеличения количества общего процесса получения. Фаза увеличения количества клеток представляет собой первый период общего процесса культивирования/получения, который, главным образом, характеризуется высоким уровнем роста клеток и пониженным уровнем продукции полипептида. Фаза количества служит для размножения клеток, что означает получение надлежащего количества клеток, которые находятся в фазе экспоненциального роста, для инокуляции биореактора для продуцирования.

Термин "среда для продуцирования" относится к среде для культивирования клеток, которую обычно используют на стадии получения общего процесса продуцирования. Фаза получения представляет собой вторую фазу общего процесса культивирования/получения, которая служит для продукции высоких количеств продукта. На стадии продукции клетки необходимо поддерживать в жизнеспособном и активном режиме настолько долго, насколько это возможно.

Использование сред для культивирования клеток в области фармацевтической промышленности, например, для получения терапевтически активных рекомбинантных полипептидов, как правило, не позволяет использовать какой-либо материал животного происхождения по причинам безопасности и загрязнения. Таким образом, среда для культивирования клеток по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой не содержащую сыворотки и/или не содержащую белка среду. Термин "не содержащая сыворотки и/или не содержащая белка среда" представляет собой среду с полностью химически определенным составом, не содержит добавок из животного источника, таких как гидролизаты тканей, эмбриональная телячья сыворотка или тому подобное. Кроме того, также предпочтительно в клеточную среду по настоящему изобретению не добавляют белки, особенно факторы роста, такие как инсулин, трансферрин или тому подобное. Предпочтительно среду для культивирования клеток по настоящему изобретению также не дополняют источником гидролизованного белка, таким как соевый, пшеничный или рисовый пептон или гидролизат дрожжей или тому подобное.

Среду для культивирования клеток по настоящему изобретению можно использовать в различных способах культивирования клеток. Культивирование клеток можно проводить в прикрепляющейся культуре, например в культуре монослоя, или, предпочтительно в суспензионной культуре.

В крупномасштабном культивировании клеток можно использовать, например, различные способы ферментации, общеизвестные в промышленной биотехнологии. С использованием сред для культивирования клеток по настоящему изобретению можно проводить процессы прерывающегося и непрерывного культивирования клеток, такие как перфузионное и проводимое в хемостате. Одним из предпочтительных вариантов осуществления являются прерывающиеся процессы, включающие повторяющееся периодическое культивирование с подпиткой и повторяющееся периодическое культивирование.

Периодическая культура клеток включает периодическую культуру с подпиткой или простую периодическую культуру. Термин "периодическая культура клеток с подпиткой" относится к клеточной культуре, где первоначально в емкость для культивирования подаются клетки и среда для культивирования клеток, и дополнительные питательные вещества подаются в культуру непрерывно или отдельными шагами в ходе процесса культивирования с периодическим сбором клеток и/или продукта, или без него, до завершения культивирования. Термин "простое периодическое культивирование" относится к процессу, в котором все компоненты для культивирования клеток, включая клетки и среду для культивирования клеток, подаются в емкость для культивирования в начале процесса культивирования.

Клетки, культивируемые в среде для культивирования клеток по настоящему изобретению, представляют собой клетки CHO.

Полипептиды, которые можно получать из клеточных культур и сред для культивирования клеток по настоящему изобретению, не ограничиваются. Полипептиды могут быть рекомбинантными или нерекомбинантными. Термин "полипептид", как используют в рамках изобретения, охватывает молекулы, состоящие из цепи из более чем двух аминокислот, соединенных пептидными связями; молекулы, содержащие две или более таких цепей; молекулы, содержащую одну или несколько из таких цепей, дополнительно являющихся модифицированными, например, путем гликозилирования. Подразумевают, что термин "полипептид" охватывает белки.

Предпочтительный класс полипептидов, получаемых с помощью клеточных культур и сред для культивирования клеток по настоящему изобретению, представляет собой рекомбинантные антитела.

Термин "антитело" используют в наиболее широком значении и, в частности, он охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), наноантитела, модифицированные антитела, субъединицы антител, производные антител, искусственные антитела, комбинации антител с белками и фрагменты антител, достаточно длинные, чтобы проявлять желаемую биологическую активность. Моноклональные антитела, как используют в рамках изобретения, могут представлять собой антитела человека.

Однако также с использованием клеточных культур и сред для культивирования клеток по настоящему изобретению можно продуцировать, полипептиды, отличные от антител, например полипептиды, такие как трансмембранные белки, рецепторы, гормоны, факторы роста, протеазы, белки свертывающей и противосвертывающей системы, ингибиторные белки, интерлейкины, транспортные факторы, слитые белки и т.п. Среду для культивирования клеток также можно использовать для продуцирования вирусов.

Продукты, получаемые в таких процессах культивирования клеток, можно использовать для получения фармацевтических препаратов. Термин "фармацевтический препарат" указывает на композицию, подходящую или адаптированную для введения млекопитающему, особенно человеку. Кроме того, белок(белки) по изобретению можно вводить вместе с другими компонентами биологически активных веществ, такими как фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, реципиенты, носители, разбавители и наполнители.

Присутствие высоких количеств хлорида холина в среде для культивирования клеток по настоящему изобретению позволяет снизить содержание аминокислот в среде для культивирования клеток без отрицательного влияния на способность среды к поддержанию роста клеток при высоких плотностях и в то же время обеспечить высокий титр полипептида. Этот эффект особенно важен для фазы продуцирования общего процесса продуцирования.

Большинство экспериментов показало, что с помощью среды для культивирования клеток по настоящему изобретению достигают еще лучших параметров эффективности по сравнению с общепринятыми средами для получения, содержащими более высокие концентрации отдельных аминокислот в комбинации только с низкими количествами хлорида холина.

Без связи с конкретной теорией, полагают, что концентрация холина - предшественника фосфолипидов - связана с количеством необходимого компонента клеточных мембран фосфатидилхолина, который, помимо других фосфолипидов, необходим для сохранения целостности и функциональности клеточных мембран. Можно предположить, что клетки, растущие в среде с низким содержанием холина, ограничены по этому субстрату в процессе культивирования и тем самым по фосфатидилхолину, даже если холин не является необходимым компонентом среды и клетки должны быть способны синтезировать его независимо. Однако неактивный или ограниченный путь может быть причиной того, что доступны ограниченные количества холина для продуцирования достаточных количеств фосфатидилхолина. Это может приводить к "ненормальному" составу мембран, особенно мембран цитоплазматической сети и комплекса Гольджи. Это может отрицательно влиять на функцию этих мембран и снизить уровни экспрессии полипептида или транспорт полипептида в клетках. Ингибирование транспорта полипептида из комплекса Гольджи в направлении плазматической мембраны в клетках CHO с истощением фосфатидилхолина было показано Testerink et al. (2009; Journal of Lipid Research, Vol 50, 2182-2192). Этот дефект может быть устранен путем добавления экзогенного фосфатидилхолина.

Несколько важных преимуществ являются результатом конкретно состава сред для культивирования клеток по настоящему изобретению.

Во-первых, снижение общего содержания аминокислот в средах для культивирования клеток по настоящему изобретению позволяет осуществлять процессы культивирования клеток со сходными или даже улучшенными техническими параметрами эффективности с точки зрения роста клеток, плотности жизнеспособных клеток, а также продуктивности в отношении полипептида, и в то же время снижение общего содержания аминокислот или некоторых отдельных аминокислот в клеточной культуре приводит к лучшему общему экономическому балансу процесса продуцирования вследствие снижения затрат на среду для культивирования клеток.

Во-вторых, среды для культивирования клеток по настоящему изобретению лишены риска выпадения в осадок компонентов, содержащихся в среде для культивирования клеток, в частности гидрофобных аминокислот, содержащихся в среде в относительно высоких концентрациях. Это является особенно важным преимуществом в процессе хранения сред. Сниженные концентрации этих компонентов помогают избежать снижения поступления необходимого субстрата в процессе роста клеток и получения полипептида. Это имеет особенные преимущества на стадии продукции общего процесса продуцирования.

В-третьих, среды для культивирования клеток по настоящему изобретению позволяют продуцировать рекомбинантные полипептиды более высокого качества. Агрегация образовавшегося полипептида снижается, клетки способны продуцировать полипептид с лучшими посттрансляционными модификациями, и также улучшается характер гликозилирования.

Агрегация образовавшегося полипептида в ходе рекомбинантной экспрессии является технической проблемой, которая приводит к снижению выхода продукта. Более того, агрегация затрудняет очистку функционально активного полипептидного продукта.

Таким образом, желательно снизить агрегацию образовавшегося полипептидного продукта настолько, насколько это возможно, в ходе фактического процесса продуцирования. Было обнаружено, что среды для культивирования клеток по настоящему изобретению дают сниженную агрегацию рекомбинантного полипептидного продукта по сравнению с обычными средами для продуцирования.

Многие полипептиды подвергаются посттрансляционной модификации, в частности гликозилированию полипептидов. Образующиеся полипептиды содержат ковалентно присоединенные олигосахаридные цепи. Гликозилирование известно в качестве важного медиатора функциональности полипептида. Таким образом, способность системы клетки-хозяина, используемой для рекомбинантного получения полипептида, надлежащим образом имитировать эндогенные структуры гликозилирования является важным аспектом качества продукта. На терапевтическую эффективность рекомбинантного полипептида может в высокой степени влиять ненадлежащее гликозилирование полипептида вследствие иммуногенных свойств и сниженного времени полужизни in vivo после введения нанадлежащим образом гликозилированных полипептидов.

Как правило, маннозилирование считается важным аспектом в рекомбинантном продуцировании полипептида, особенно в области рекомбинантных антител. Общей задачей продуцирования рекомбинантного полипептида является избегание высокого маннозилирования полипептидов. Таким образом, важной задачей является снижение высокого маннозилирования в ходе продуцирования рекомбинантных полипептидов, насколько это возможно.

Среды для культивирования клеток по настоящему изобретению позволяют продуцировать рекомбинантные полипептиды с очень низкой степенью высокого маннозилирования. Этот технический эффект является особенно значительным в отношении типичных сред для продуцирования. Например, относительное количество высоко маннозилированного рекомбинантного полипептида при высоком маннозилировании всего количества рекомбинантного полипептида, получаемого экспрессией с использованием сред для культивирования клеток по настоящему изобретению, предпочтительно снижается приблизительно на 50% по сравнению со средой для продуцирования.

Кроме того, неожиданно было обнаружено, что рекомбинантные полипептиды, получаемые с использованием сред для культивирования клеток по настоящему изобретению, имеют более высокий процент β-галактозилирования относительно соответствующих полипептидов, получаемых с использованием общепринятых сред для роста или сред для продуцирования.

Следующее преимущество среды с высокими концентрациями холина состоит в том, что она позволяет иметь только одну среду фазы продуцирования и размножения, экономя время и ресурсы.

Примеры

Следующие эксперименты предназначены для дальнейшей иллюстрации изобретения, как определено в настоящей заявке.

Описание сред для культивирования клеток

Тестируют три следующие среды:

Среда для роста с низким содержанием холина, т.е. с содержанием хлорида холина 40 мг/л (контроль 1);

Среда для продуцирования (контроль 2);

Среда для роста с высоким содержанием холина, т.е. среда для роста с низким содержанием холина, дополненная дополнительным количеством хлорида холина, составляющим 200 мг/л, с получением в результате общего содержания хлорида холина 240 мг/л.

Первые две среды (среда для роста и продуцирования с низким содержанием холина) используют только для целей сравнения, в то время как третья среда с высоким содержанием хлорида холина представляет собой среду по настоящему изобретению.

Среда для роста с низким содержанием холина представляет собой типичную среду, предназначенную для роста и пролиферации клеточной культуры. Эта среда позволяет культивирование клеток до тех пор, пока не будет достигнута высокая плотность клеток, что является важным требованием для крупномасштабного получения полипептида. Однако среда для роста с низким содержанием холина не предназначена для получения полипептида из клеточной культуры, поскольку содержание многих аминокислот составляет от низкого до умеренного, учитывая общую концентрацию аминокислот в среде 51,1 ммоль/л.

Аминокислотный состав среды для роста с низким содержанием холина является следующим:

Аминокислота мг на л среды Концентрация (ммоль/л) L-аргинин, HCl 1053 5,0 L-аспарагин моногидрат 616 4,1 L-аспарагиновая кислота 461 3,5 Глицин 38 0,5 L-гистидин HCl H₂O 168 0,8 L-изолейцин 394 3,0 L-лейцин 500 3,8 L-лизин HCl 622 3,4 L-метионин 180 1,2 L-фенилаланин 264 1,6 L-пролин 368 3,2 L-серин 432 4,1 L-треонин 334 2,8 L-триптофан 102 0,5 L-валин 375 3,2 L-глутамин 1170 8,0 L-тирозин 278*) 1,5 L-цистин 200*) 0,8 Общее содержание   51,0 *) для достижения указанных выше концентраций тирозина и цистина L-тирозин и L-цистин добавляют в среду для роста с низким содержанием холина с использованием исходного раствора

В противоположность среде для роста с низким содержанием холина вторая среда (среда для продуцирования) представляет собой среду, пригодную для крупномасштабного получения полипептида с использованием культур клеток. Эта среда для продуцирования содержит более высокие количества большинства аминокислот (общая концентрация аминокислот в среде составляет 90,50 ммоль/л) по сравнению со средой для роста с низким содержанием холина, хотя количества других компонентов в основном идентичны.

Аминокислотный состав используемой среды для продуцирования является следующим:

Аминокислота мг на л среды Концентрация (ммоль/л) L-аргинин, HCl 1053 5,0 L-аспарагин моногидрат 1501 10,0 L-аспарагиновая кислота 461 3,5 Глицин 38 0,5 L-гистидин HCl H₂O 268 1,3 L-изолейцин 894 6,8 L-лейцин 1200 9,2 L-лизин HCl 822 4,5 L-метионин 280 1,9 L-фенилаланин 464 2,8 L-пролин 968 8,4 L-серин 1232 11,7 L-треонин 534 4,5 L-триптофан 252 1,2 L-валин 776 6,6 L-глутамин 1169 8,0 L-глутаминовая кислота, Na-соль, гидрат 182 1,2 L-тирозин 423*) 2,3 L-цистин 305*) 1,3 Общее содержание   90,7

Содержание хлорида холина в этой сравнительной среде для продуцирования также является значительно более высоким, чем в среде для роста с низким содержанием холина. Важно отметить, что известные среды для продуцирования уровня техники обычно содержат значительно более низкие количества хлорида холина. Таким образом, высокое содержание хлорида холина в сравнительной среде для продуцирования необходимо считать важным отличием от известной среды для продуцирования уровня техники, которая обычно не отличается от известных сред для роста по их содержанию хлорида холина.

Третья среда представляет собой среду по настоящему изобретению, представляющую собой среду для роста с высоким содержанием холина, т.е. среду для роста с низким содержанием холина, дополненную 200 мг/л хлорида холина, с получением общего содержания хлорида холина 240 мг/л. За исключением более высокого содержания хлорида холина, третья среда по настоящему изобретению все еще может считаться типичной средой для роста.

Примеры демонстрируют выраженное улучшение, достигаемое с помощью высоких количеств хлорида холина в средах для роста, таких как среда для роста с низким содержанием холина, при использовании на стадии продукции, что делает такую среду для роста с высоким содержанием хлорида холина не только значительно улучшенной по сравнению со средами, дополненными низким содержанием холина, с точки зрения роста клеток, жизнеспособности клеток и титра полипептида, но даже улучшенной по сравнению со средами для продуцирования с равными количествами хлорида холина в тех же аспектах. Добавление более высоких количеств хлорида холина помогает достигнуть лучшего роста и жизнеспособности клеток и увеличенного титра полипептида в нормальной среде для роста.

Схема эксперимента

Для экспериментов используют клеточную линию CHO, которая получена из клеточной линии dhfr (+) CHO-K1 ATCC CCL-61 (Kao et al., Genetics, 1967, 55, 513-524; Kao et al., PNAS, 1968, 60, 1275-1281; Puck et al., J. Exp. Med., 1958, 108, 945-959) путем адаптации к условиям не содержащей сыворотку не содержащей белка среды. Три аликвоты этой исходной клеточной линии трансфицируют для экспрессии трех различных моноклональных антител: mAb1, mAb2, mAb3 соответственно.

Эксперименты во вращающихся флаконах (эксперименты 1-3)

Все девять вращающихся флаконов (по три для каждого эксперимента) анализируют в одинаковых условиях за исключением среды. Условия вовлекают периодическое культивирование с подпиткой с двумя болюсными подпитками, начиная на 3 и 5 сутки со скоростью подпитки 2 и 0,4% исходного объема культуры в сутки; сдвиг температур от 36,5°C до 33°C на 5 сутки; 10% CO₂ в инкубаторе; скорость вращения 150 об/мин (радиус хода=25 мм). Определяют рост/жизнеспособность клеток, а также конечный титр экспрессированного рекомбинантного антитела.

a) Эксперимент 1

На фиг.1 и 2 представлены результаты роста и жизнеспособности клеток, полученные для клеток, экспрессирующих mAb1, культивированных в эксперименте 1.

Как проиллюстрировано на фиг.1 и 2, среда с высоким содержанием хлорида холина по изобретению (среда для роста с высоким содержанием холина) демонстрирует 53% увеличение максимальной плотности жизнеспособности клеток и более медленное снижение жизнеспособности по сравнению со средой для роста с низким содержанием холина, имеющей низкое содержание хлорида холина.

На фиг.3 представлены результаты титра полипептида, полученные для клеток, культивированных в эксперименте 1.

Как проиллюстрировано на фиг.3, титр полипептида рекомбинантного антитела, полученного в среде с высоким содержанием хлорида холина по изобретению (среда для роста с высоким содержанием холина), демонстрирует увеличение титра полипептида, составляющее 330% на 13 сутки, по сравнению со средой для роста с низким содержанием холина, которая имеет только низкое содержание хлорида холина и представляет собой только типичную среду для роста.

На фиг.3 также показано, что среда с высоким содержанием хлорида холина по изобретению даже обеспечивает достижение титра полипептида, который немного превышает титр, полученный в среде для продуцирования.

b) Эксперимент 2

На фиг.4 и 5 представлены результаты роста и жизнеспособности клеток, полученные для клеток, экспрессирующих mAb2, культивированных в эксперименте 2.

Как проиллюстрировано на фиг.4 и 5, среда с высоким содержанием хлорида холина по изобретению (среда для роста с высоким содержанием холина) имеет только небольшое влияние на рост клеток, однако обеспечивает значительно более высокую жизнеспособность в конце процесса по сравнению со средой для роста с низким содержанием холина, которая имеет только низкое содержание хлорида холина.

На фиг.6 представлены результаты титра полипептида, полученные для клеток, культивированных в эксперименте 2.

На фиг.6 представлено 85% увеличение титра полипептида на 11 сутки для среды для культивирования клеток по настоящему изобретению по сравнению со средой для роста с низким содержанием холина. Кроме того, титр полипептида, полученный в среде для культивирования клеток по настоящему изобретению, является даже более высоким по сравнению с титром полипептида, полученным в среде для продуцирования, имеющей в равной степени высокое содержание хлорида холина.

c) Эксперимент 3

На фиг.7 и 8 представлены результаты роста и жизнеспособности клеток, полученные для клеток, экспрессирующих mAb3, культивированных в эксперименте 3.

Как проиллюстрировано на фиг.7 и 8, более высокой жизнеспособности клеток в конце процесса культивирования достигают с помощью среды по настоящему изобретению по сравнению со сравнительной средой для культивирования клеток (среда для роста с низким содержанием холина), содержащей только низкие количества хлорида холина.

На фиг.9 представлены результаты титра полипептидов, полученные для клеток, культивированных в эксперименте 3.

На фиг.9 показано, что титр полипептида, полученный в среде для культивирования клеток по настоящему изобретению, увеличивается на 145% на 11 сутки по сравнению со сравнительной средой - средой с низким содержанием холина. Титр полипептида в среде для культивирования клеток по настоящему изобретению даже немного превышает титр, полученный с использованием среды для продуцирования с высоким содержанием хлорида холина.

Кроме того, было экспериментально подтверждено, что применение более высоких концентраций хлорида холина в среде для продуцирования не приводило к увеличению роста клеток или титра полипептида по сравнению с использованием среды для продуцирования, имеющей стандартное количество хлорида холина, составляющее 240 мг/л.

Для определения влияния среды для культивирования клеток на качество полипептидного продукта проводят следующие дополнительные эксперименты. В частности, продукт анализируют для определения влияния среды на агрегацию и на гликозилирование.

На фиг.10 представлен процентный уровень агрегации продукта в виде рекомбинантного антитела относительно общего количества рекомбинантного антитела. Уровень агрегации в среде для культивирования клеток по настоящему изобретению снижен более чем на 30% относительно среды для продуцирования.

Экспрессия mAb3 в различных средах для культивирования клеток с последующим анализом паттерна гликозилирования рекомбинантных антител демонстрирует, что среда для роста по настоящему изобретению с высоким содержанием хлорида холина приводит к рекомбинантному антителу с низким количеством рекомбинантного продукта, имеющего высокое маннозилирование, которое представляет собой нежелательный паттерн гликозилирования. Применение среды по изобретению приводит к снижению уровня маннозилирования более чем на 55% по сравнению с использованием среды для продуцирования.

Проведение периодического культивирования с подпиткой в биореакторе (эксперимент 4)

Следующий эксперимент представляет собой проведение периодического культивирования с подпиткой в биореакторе. Он соответствует описанному выше эксперименту 3. Использовали клетки, экспрессирующие mAb3. Условия являются следующими: исходный объем 2 л; непрерывная подпитка двумя различными растворами для подпитки, начиная на 3 и 5 сутки, со скоростью подпитки 2 и 0,4% первоначального объема культуры в сутки; сдвиг температуры от 36,5°С до 33°C на 5 сутки; pO₂=30%; pH 6,9 (диапазон нечувствительности 0,1); с контролем CO₂ и 0,5 M NaOH; скорость вращения 300 об/мин.

На фиг.11 и 12 представлены результаты, полученные для плотности жизнеспособных клеток и процента жизнеспособности клеток в эксперименте 4, проведенном в качестве периодического культивирования с подпиткой в биореакторе.

Что касается роста и жизнеспособности клеток, результаты периодического культивирования с подпиткой в биореакторе согласуются результатами, полученными в экспериментах во вращающемся флаконе. Следовательно, проведение периодического культивирования с подпиткой в биореакторе в основном подтверждает результаты, полученные в экспериментах во вращающейся колбе.

Подобно эксперименту с вращающимися флаконами, максимальные плотности жизнеспособных клеток, достигаемые в среде для продуцирования, были немного более высокими по сравнению со средой для культивирования клеток по изобретению (среда с высоким содержанием холина) с высоким содержанием хлорида холина. Однако процент жизнеспособности остается на значительно более высоком уровне, когда используют среду для культивирования клеток по изобретению, т.е. среду, дополненную высоким содержанием хлорида холина, по сравнению со средой для роста без дополнения, имеющей только низкое содержание хлорида холина.

На фиг.13 представлены результаты, полученные для титра полипептида в эксперименте 4, проведенном в качестве периодического культивирования с подпиткой в биореакторе.

Титр полипептида, измеренный на 11 сутки для среды для культивирования клеток по изобретению с высоким содержанием хлорида холина, увеличивается на 170% по сравнению со сравнительной средой для роста, имеющей только низкие количества хлорида холина.

В то время как титр полипептида, полученный для среды для культивирования клеток с высоким содержанием хлорида холина по изобретению, является даже более высоким по сравнению с титром полипептида, полученным с использованием для целей сравнения среды для продуцирования в экспериментах во вращающихся флаконах, эксперимент с периодическим культивированием с подпиткой в биореакторе продемонстрировал немного более низкий титр полипептида в среде для культивирования клеток с высоким содержанием хлорида холина по изобретению по сравнению со средой для продуцирования. Тем не менее, титр полипептида, полученный в биореакторе с использованием среды для культивирования клеток с высоким содержанием хлорида холина по изобретению, является очень высоким и все еще находится на сравнимом уровне с титром полипептида, полученным с использованием для сравнительных целей среды для продуцирования.

Эксперимент 4 в биореакторе далее подтверждает, что среда для культивирования клеток с высоким содержанием хлорида холина по изобретению представляет собой пригодную альтернативу общепринятым средам для продуцирования, обеспечивающим достижение сравнимых титров полипептида, в то время как общее количество аминокислот или количества отдельных аминокислот могут быть значительно снижены в соответствующей среде для культивирования клеток.

Эксперимент 4 в биореакторе также еще раз доказывает, что увеличение содержания хлорида холина в типичной среде для роста помогает достигнуть чрезвычайного увеличения титра полипептида при использовании для получения полипептидов среды для роста.

Добавление различных концентраций хлорида холина в среду для роста

В следующем наборе экспериментов хлорид холина добавляют в различных концентрациях (40; 80; 120; 160; 200; 240; 500; 840; 1000; 3000 и 5000 мг/л в общем) к порошковой среде для роста. Полученную таким образом среду для роста используют для продуцирования mAb3 и mAb4 соответственно, главным образом, как описано выше.

Нормализованные концентрации антител, нормализованные плотности жизнеспособных клеток и жизнеспособность для mAb3 и, кроме того, для mAb4, нормализованная удельная продуктивность клеток на всем протяжении культивирования (соответственно 13 и 17 сутки) далее представлены на фиг.14-24.

Как можно видеть из этих данных, более низкие величины с точки зрения жизнеспособности и концентрации антител после культивирования в течение 13 или 17 суток достигаются в среде для роста с всего 40 мг/л хлорида холина. Концентрации 3000 мг/л и более не влияют отрицательно на жизнеспособность клеток, но также клетки не растут в этих средах, концентрация антитела остается ниже 1. Жизнеспособность является более высокой для всех концентраций холина, превышающих 40 мг/л. По-видимому, имеется зависимый от концентрации эффект хлорида холина на жизнеспособность. Более высокие концентрации хлорида холина в среде приводили к более высокой жизнеспособности в конце культивирования.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеток и их применению для получения полипептидов. Способ получения рекомбинантного посттрансляционно модифицированного полипептида предусматривает стадию продукции. Рекомбинантные клетки CHO культивируют в среде для культивирования клеток, причем среда для культивирования клеток представляет собой среду, не содержащую сыворотку и не содержащую белки, но содержащую от 220 до 2500 мг/л хлорида холина или эквивалентное количество другой соли холина. Среды для культивирования клеток с высоким содержанием хлорида холина особенно пригодны для периодического культивирования клеток с подпиткой, при котором жизнеспособность клеток остается на более высоком уровне в течение более длительного периода времени и с высокими титрами полипептида, хотя и используют ограниченные количества аминокислот. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 24 ил.

1. Способ получения рекомбинантного посттрансляционно модифицированного полипептида, включающий стадию продукции, где рекомбинантные клетки CHO культивируют в среде для культивирования клеток, где среда для культивирования клеток представляет собой среду, не содержащую сыворотку и не содержащую белки, содержащую от 220 до 2500 мг/л хлорида холина или эквивалентное количество другой соли холина и имеющую общую концентрацию аминокислот от 20 до 57 ммоль/л.

2. Способ по п.1, где рекомбинантный посттрансляционно модифицированный полипептид представляет собой рекомбинантное антитело.

3. Способ по п.1 или 2, где клетки культивируют в процессе периодического культивирования с подпиткой.

4. Способ по п.1, где среда для культивирования клеток содержит от 240 до 1500 мг/л хлорида холина или эквивалентное количество другой соли холина.

5. Способ по п.1, где среда для культивирования клеток имеет общую концентрацию аминокислот от 35 до 54 ммоль/л.

6. Способ по п.1, где среда для культивирования содержит глутамин в концентрации от 500 до 1400 мг/л.

7. Способ по п.1, где содержание глутамина в среде для культивирования клеток составляет от 900 до 1200 мг/л.

8. Способ по п.6 или 7, где среда для культивирования клеток содержит следующие аминокислоты в следующих концентрациях, выраженных в ммоль/л:
Аргинин 4,0-6,0 Аспарагин 3,0-6,0 Аспарагиновая кислота 2,5-4,0 Глицин 0,3-0,8 Гистидин 0,6-1,0 Изолейцин 2,0-5,0 Лейцин 3,0-7,0 Лизин 2,0-4,0 Метионин 1,0-1,5 Фенилаланин 1,0-2,0 Пролин 2,5-6,0 Серин 3,0-8,0 Треонин 2,0-3,5 Триптофан 0,4-1,0 Валин 2,5-5,0 Тирозин 1,0-2,0 Цистин 0,5-1,0

9. Способ получения рекомбинантного посттрансляционно модифицированного полипептида, включающий стадию продукции, где рекомбинантные клетки CHO культивируют в среде для культивирования клеток и экспрессируется рекомбинантный посттрансляционно модифицированный полипептид, где среда для культивирования клеток представляет собой среду, не содержащую сыворотку и не содержащую белки, содержащую от 220 до 2500 мг/л хлорида холина или эквивалентное количество другой соли холина и имеющую концентрацию глутамина от 500 до 1400 мг/л.