СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ УРОВНЯ АРТЕРИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ У ЖЕНЩИН НА СРОКЕ РОДОРАЗРЕШЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА 4a/4b eNOS Российский патент 2015 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано в акушерстве для прогнозирования уровня артериального давления у женщин на сроке родоразрешения с использованием генетического полиморфизма 4a/4b eNOS.

Артериальная гипертензия (АГ) у беременных является одной из наиболее распространенных форм патологии. АГ увеличивает частоту внутриутробной гибели плода, преждевременных родов, отслойки нормально расположенной плаценты. Перинатальная смертность (30-100%) и преждевременные роды (10-12%) у беременных с АГ значительно превышают соответствующие показатели у беременных без АГ [И.М. Меллина. Сочетанная преэклампсия у беременных с гипертонической болезнью: предупредить возможно и необходимо [Текст] //Медицинские аспекты здоровья женщины. - 2011. - №4 (44). - С. 5-13]. АГ у беременных повышает риск неврологических и сердечно-сосудистых заболеваний у детей [Maqnussek E.B. Pregnancy cardiovascular risk as predictors of preeclampsia: population based cohort study /Maqnussek E.B. et al. //BMJ. - 2007. - №335. - Р. 978-986]. Осложнения АГ составляют 20-30% случаев в структуре материнской смертности. Грозными осложнениями являются нарушения мозгового кровообращения, отслойка сетчатки, преэклампсия (ПЭ), эклампсия, массивные коагулопатические кровотечения [Павлова Т.В. Морфологические особенности маточно-плацентарного кровотока при гестозе [Текст] /Павлова Т.В., Семыкин А.Н., Петрухин В.А., Селиванова А.В. //Российский вестник акушера и гинеколога. - 2009. - Т. 9, №5. - С. 15-19]. У новорожденных, матери которых имели гипертензивные расстройства, имеются достоверные различия по сравнению с детьми, рожденными матерями-нормотониками: низкий вес при рождении (12,1% и 7,15% соответственно), досрочные роды (1% и 0,5% соответственно), ацидоз в умбиликальной артерии (0,58% и 0,19% соответственно), менее 3 баллов по шкале Апгар через 5 минут (0,89% и 0,66% соответственно) [Skiaerven R. et al. Recurrence of preeclampsia across generations: exploring. fetal and maternal genetic components in a population based cohort /Skiaerven R. et al. //B.M.J. - 2005. - Vol.331. - 877.].

Генетическими факторами обусловлены 30-40% случаев первичной артериальной гипертензии. Развитие артериальной гипертензии обусловлено полиморфизмом многих генов [П.Н. Веропотвелян. Генетические аспекты гестозов /П.Н. Веропотвелян, Н.П. Веропотвелян, Н.С. Ельчанинова и др. // ПАГ. - 2008. - №2 (426). - С. 62-65].

Артериальное давление регулируется различными механизмами. К артериальной гипертензии, наряду с другими факторами, может приводить нарушение его сосудистой регуляции, ассоциированное со сниженным содержанием оксида азота в крови.

Ранним предиктором этих нарушений является эндотелиальная дисфункция, к наиболее важным маркерам которой относят уровни оксида азота и эндотелина-1 [Вихляева Е.М. Доклинические проявления системных нарушений, клинические исходы и отдаленные последствия преэклампсии [Текст] / Е.М. Вихляева // Акушерство и гинекология. - 2009. - №1. - С. 3-6]. При «нормальной» функции эндотелия баланс всегда сдвинут в сторону поддержания вазодилятации, который обеспечивается в том числе и за счет стабильной, достаточной экспрессии эндотелиальной NO-синтазы. Этот фермент участвует в синтезе NO и, следовательно, в регуляции сосудистого тонуса и артериального давления. Ингибирование eNOS приводит к увеличению АД, а повышенная экспрессия гена eNOS вызывает развитие гипотензии [Солов И.А. Дисфункция эндотелия как один из патогенетических факторов расстройств микроциркуляции при гестозе [Текст] / Солов И.А., Глухова Т.Н., Чеснокова Н.П. // Российский вестник акушера и гинеколога. - 2006. - Т. 6, №6. - С. 4-9.].

Ген eNOS локализован в хромосоме 7q35-36. В экзонах и интронах гена eNOS обнаружено несколько полиморфных участков, среди которых наиболее изучены два, а именно минисателлитный повтор в интроне 4 (eNOS 4a/4b полиморфизм) и мутация в положении 298 белковой последовательности, ведущая к замене остатка глутаминовой кислоты на аспарагиновую (Glu298Asp). В случае полиморфного маркера 4a/4b eNOS обнаружена корреляция между генотипами и уровнем нитратов и нитритов в крови, напрямую связанная со скоростью выработки NO эндотелием сосудов. Носители генотипа 4b/4b имеют уровень нитратов и нитритов в крови на 25% выше, чем носители генотипа 4а/4а. Таким образом, можно говорить о потенциальной генетической роли генотипа 4а/4а как фактора риска развития атеросклероза и заболеваний, приводящих к нарушению нормальной выработки NO [Endothelial nitric oxide synthase Glu298Asp gene polymorphism, blood pressure and hypertension in a general population sample [Text] / B. Wolff, H.J. Grabe, C. Schlüter [et al.] // J. Hypertens. - 2005. - Vol. 23, №7. - P. 1361-1366.].

Задачей настоящего изобретения является разработка способа прогнозирования уровня артериального давления у беременных на сроке родоразрешения в зависимости от генетического полиморфизма eNOS.

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования уровня артериального давления у женщин на сроке родоразрешения на основе данных о генетическом полиморфизме 4a/4b eNOS.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2013 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования уровня артериального давления на основе молекулярно генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов.

В заявке на получение патента РФ №2012123860 (дата публикации заявки 20.12.2013) предложен способ оценки риска возникновения патологии беременности, заключающийся в том, что для оценки риска возникновения преэклампсии, преждевременных родов, а также преэклампсии на фоне артериальной гипертензии проводят анализ биологических жидкостей человека, а именно сыворотки крови, с помощью обращено-фазовой жидкостной хроматографии с регистрацией результата анализа в ультрафиолетовой области спектра, а в качестве биомаркеров патологии беременности используются гипоксантин, ксантин, мочевая кислота.

Недостаток метода заключается в сложности анализа, его длительности и не рассматриваются генетические полиморфизмы прогнозирования уровня артериального давления у женщин на сроке родоразрешения.

Известен патент РФ №2473912 по заявке РФ №2011139871/15, 30.09.2011 «Способ прогнозирования уровня артериального давления у беременных в зависимости от генетического полиморфизма эндотелина - 1» (Чурносов М.И., Решетников Е.А., Акулова Л.Ю.; Колесников Ю.В., Полоников А.В.). Заявляемый способ, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови и анализ полиморфизма K198N гена эндотелина 1 (ЕТ-1) методом полимеразной цепной реакции, обеспечивает получение эффективного критерия оценки изменения артериального давления у беременных, позволяющего до наступления беременности определить вероятность изменения артериального давления в сторону его повышения и применить определенную тактику ведения женщины во время всего срока гестации.

Недостаток метода в том, что анализируется только один генетический фактор, а именно генетический полиморфизм эндотелина -1, связанный с уровнем артериального давления у беременных, и не рассматриваются другие генетические полиморфизмы прогнозирования уровня артериального давления у женщин на сроке родоразрешения.

Наиболее близкий способ описан в источнике (Решетников Е.А. Полиморфизм генов вазоактивных гормонов и изменения характера функционирования сердечнососудистой системы у женщин при беременности», автореферат диссертации на соискание кандидата биологических наук), где указано, что женщины русской национальности, являющиеся уроженками Центрального Черноземья РФ, имеющие генотип АА локуса 4a/4b eNOS, характеризуются более высокими значениями диастолического давления и, соответственно, более высокими значениями среднего артериального давления в конце беременности.

Задача изобретения - расширение арсенала технических средств для оценки прогноза уровня артериального давления у женщин на сроке родоразрешения в зависимости от генетического полиморфизма eNOS.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки прогноза уровня повышенного артериального давления у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России, на сроке родоразрешения, что позволяет до наступления беременности реализовать определенную тактику ведения женщин группы риска во время всего срока гестации.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования уровня артериального давления у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России, на сроке родоразрешения, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизмов методом полимеразной цепной реакции;

- прогнозирование повышения уровня артериального давления у женщин на сроке родоразрешения в случае выявленного генетического варианта по локусу 4a/4b eNOS.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники неизвестна возможность прогноза повышения уровня артериального давления у женщин на сроке родоразрешения по наличию генетического варианта 4a/4b eNOS.

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови пациентки в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°C, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (pH=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°C в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров, приведенных в таблице 1.

Структура праймеров и зондов, используемых для генотипирования исследуемых ДНК-маркеров

Таблица 1

Название 5'-3' последовательность праймеров
и зондов Литературный источник VNTR 4a/4b eNOS (rs699) F: 5-agg ccc tat ggt agt gcc ttt-3
R: 5-tct ctt agt gct gtg gtc ac-3 Спиридонова М.Г.и др., 2002, 2006

Изобретение характеризуется:

Фиг.1 - Электрофоретическое разделение продуктов амплификации локуса 4a/4b eNOS, где 3, 5, 6 - гомозиготы 4b4b; 2 -гомозиготы 4a4a; 1, 4 - гетерозиготы 4a4b

Возможность использования предложенного способа для оценки уровня артериального давления у женщин на сроке родоразрешения подтверждает анализ результатов обследования 349 женщин: из них 249 беременных, у которых отмечалось повышение давления на сроке родоразрешения, и 100 женщин из контрольной группы с нормальным течением беременности. В исследуемые выборки включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженками Центрально-Черноземного региона России и не имеющие родства между собой. Все клинические и клинико-лабораторные исследования проводились на базе Перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа, с информированного согласия пациенток на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, проводимых за период госпитализации и после, для научно-исследовательских целей и протоколировались по стандартам этического комитета Российской Федерации.

Ассоциации аллелей и генотипов ДНК - маркера с предрасположенностью к развитию гипертензии оцениваются с помощью непараметрического метода Манна-Уитни.

В качестве конкретного примера приведен анализ взаимосвязей полиморфного маркера 4a/4b eNOS с показателями артериального давления у женщин на сроке родоразрешения.

Установлено, что женщины с разными генотипами по локусу 4a/4b eNOS имеют значимые отличия по показателям артериального давления в конце беременности.

С целью решения проблемы множественных сравнений, связанной с получением ложноположительных результатов (ошибка 1-го рода), вводили поправку Бонферрони, т.е. производили перерасчет уровня значимости р для множественных парных сравнений по формуле [Реброва О.Ю., 2006]: рcor=р·n, где р - полученный уровень статистической значимости, n - количество парных сравнений. За статистически значимый уровень принимали рcor≤0,05.

В таблице 2 приведены данные ассоциации генетического полиморфизма 4a/4b eNOS с уровнем артериального давления: у беременных с генотипом 4а4а eNOS отмечаются более высокие значения медианы систолического, диастолического и среднего артериального давления в конце беременности (150,0 мм рт.ст. 100,0 мм рт.ст. и 113,3 мм рт.ст. соответственно) по сравнению с женщинами, имеющими генотип 4b4b (САД - 130,0 мм рт.ст., р=0,007, с учетом поправки Бонферрони р_cor=0,021; ДАД- 80,0 мм рт.ст.; р=0,004; р_cor=0,012; АД ср. - 100,0 мм рт.ст.; р=0,004; р_cor=0,012) и генотип 4а4b (САД - 130,0 мм рт.ст.; р=0,01, с учетом поправки Бонферрони р_cor=0,03; ДАД- 90,0 мм рт.ст.; р=0,006; р_cor=0,018; АД ср. - 103,3 мм рт.ст.; р=0,006; р_cor=0,018)

Ассоциации генетического полиморфизма 4a/4b eNOS с уровнем артериального давления у беременных (Ме, Q25-Q75)

Конкретный пример

У беременной А., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен генотип 4а4а по локусу 4a/4b eNOS. К концу гестации у беременной А. уровень артериального давления повысился и составил:

САД - 170,0 мм рт.ст., ДАД - 110,0 мм рт.ст. и АД ср. - 130 мм рт.ст.

Приведенный пример подтверждает, что поставленная задача - разработка способа прогнозирования повышения уровня артериального давления у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России, на сроке родоразрешения с использованием генетического полиморфизма 4a/4b eNOS - решена. На основе выявления у женщины генетического варианта 4a4а eNOS полиморфизма 4a/4b eNOS можно предсказать у них более высокие показатели артериального давления к концу гестации на сроках 37-40 недель.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования уровня артериального давления на сроке родоразрешения. У женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России, из периферической венозной крови выделяют ДНК. Методом полимеразной цепной реакции проводят анализ генетического полиморфизма 4a/4b eNOS. При выявлении генетического варианта 4а4а eNOS прогнозируют повышение показателей систолического артериального давления у женщин на сроке родоразрешения. Изобретение обеспечивает получение эффективного критерия оценки уровня артериального давления у женщин на сроке родоразрешения, позволяющего до наступления беременности или на ранних сроках беременности определить вероятность изменения артериального давления и применить определенную тактику ведения женщин группы риска. 1 ил., 2 табл., 1 пр.

Способ прогнозирования уровня артериального давления на сроке родоразрешения у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови и анализ полиморфизмов, методом полимеразной цепной реакции проводят анализ генетического полиморфизма 4a/4b eNOS, отличающийся тем, что прогнозируют повышение показателей систолического артериального давления у женщин на сроке родоразрешения при выявлении генетического варианта 4а4а eNOS.