СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РЕЦЕПТИВНОСТИ ЭНДОМЕТРИЯ НА ОСНОВАНИИ ОЦЕНКИ ЭКСПРЕССИИ И ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ ЭЗРИНА В ЭНДОМЕТРИИ ЖЕНЩИН С БЕСПЛОДИЕМ И ПОВТОРНЫМИ НЕУДАЧАМИ ПРОГРАММЫ ЭКО Российский патент 2016 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии и патологической анатомии, предназначено для прогнозирования рецептивности экдометрия и наступления беременности в программе ЭКО.

Проблемы реализации репродуктивного потенциала женщин России, рост количества бесплодных семей, а также случаев невынашивания беременности, ухудшение здоровья детей и подростков диктуют необходимость разработки и внедрения в акушерско-гинекологическую практику новых медицинских технологий.

Улучшение результативности ЭКО во многом связано не только с качеством эмбриона, но и с состоянием эндометрия, его зрелостью и готовностью к имплантации. Учитывая тот факт, что с каждой последующей попыткой вероятность положительного результата ЭКО уменьшается, оптимизация процессов созревания эндометрия, подготовка «окна имплантации», а также поддержка развития беременности на ранних этапах ее развития представляются важнейшими аспектами повышения эффективности ВРТ. Эти факторы во многом определяют конечный результат ЭКО.

Поэтому в комплексе исследований функционального состояния эндометрия значительное место занимает изучение маркеров рецептивности для адекватной оценки и разработки лечебно-профилактических мероприятий.

Под рецептивностью эндометрия понимают комплекс структурно-функциональных характеристик эндометрия с четкими временными и пространственными константами, определяющих способность эндометрия к имплантации. Правильная циклическая экспрессия рецепторов играет критическую роль для восприимчивости эндометрия и успешности имплантации [8].

Для успешной имплантации созревание эндометрия, в том числе образование пиноподий и готовность эмбриона, должны быть точно синхронизированы во времени и в пространстве (в «окно имплантации), что соответствует к 19-21 день менструальному циклу.

Установленными ранее показателями состояния рецептивности эндометрия являются следующие маркеры, определяемые в окно имплантации, такие как - LIF, LIF-R, ER, PR, HB-EGF, VEGF, IGF, (IL)-lbeta, -2, -4, -6, -3, -10, -12. [1-5]. В последние годы установлено, что в эндометрии обнаружен такой новый белок эзрин [6]. Эзрин, или цитовиллин, принадлежит к семейству ERM (Ezrin, Radixin, Moesin), входит в надсемейство белков, связывающих мембранные белки с актиновым цитоскелетом [7, 9], участвует в процессах поверхностной адгезии, «миграции клеток» и ремоделировании экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ). Фосфорилирование эзрина происходит под действием тирозина 353 (р-эзрина) [7]. Под действием эстрогенов и факторов роста развивается экспрессия эзрина и его активация [10, 11]. Фосфолириванный эзрин регулирует образование микроворсинок, пиноподий и соединительных комплексов [9, 12, 13]. В межклеточных взаимодействиях эзрин играет важную роль в адгезии бластоцисты и имплантации ее в эндометрий [14].

По данным Orkun Tan и соавт. (2012 г.) пик экспрессии эзрина в биоптатах эндометрия фертильных женщин отмечается в середину и конец секреторной фазы [15].

Задачей изобретения является определение способа прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии и внутриклеточной локализации эзрина в эндометрии женщин с бесплодием и повторными неудачами программы ЭКО, отличающегося тем, что определяют уровень экспрессии эзрина и его внутриклеточную локализацию в биоптате эндометрия средней стадии фазы секреции, при этом прогностически неблагоприятными показателями рецептивности эндометрия считают дискоординацию созревания эндометрия, отставание секреторной трансформации, снижение количества зрелых пиноподий в поверхностном эпителии менее чем 20% в сочетании с падением в них экспрессии эзрина.

Поставленная задача решается способом прогнозирования рецептивности эндометрия при бесплодии у женщин с повторными неудачами программ ЭКО, включающим определение уровней экспрессии и внутриклеточной локализации эзрина в эндометрии.

Как следствие, последнее приобретает чрезвычайную актуальность в связи с очевидной перспективностью для разработки новых подходов к патогенетической профилактике бесплодия и подготовке эндометрия к имплантации в программах ЭКО.

В связи с чем было проведено исследование, целью которого явилось изучение морфологических особенностей эндометрия и экспрессии эзрина в эндометрии женщин с ТПФ бесплодия и повторными неудачами программы ЭКО.

Материалы и методы

В исследование были включены 60 пациенток с ТПФ бесплодия, в возрасте от 26 до 38 лет, имеющих более 2-х неудачных программ ЭКО в анамнезе (основная группа), и 20 здоровых фертильных женщин аналогичного возраста, имеющих в анамнезе здоровых детей (группа контроля). Пайпель-биопсия эндометрия проводилась в «окно имплантации» (ЛГ+7) и на 8-9 день цикла для исключения хронического эндометрита. Для морфологического и иммуногистохимического исследования эндометрия материал фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 ч. Образцы обрабатывали по общепринятой стандартной методике и заключены в парафин. Срезы толщиной 5 мкм готовили на роторных микротомах и окрашивали гематоксилином и эозином. Проводилось гистологическое исследование эндометрии с оценкой процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий в световом микроскопе при ×400 в 5 полях зрения. Иммуногистохимические реакции проводили на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм по общепринятым протоколам (DAKO protocols). Для выявления экспрессии эзрина использовали первичные антитела к эзрину (Epitomic, 1:100). Результаты иммуногистохимической реакции оценивали полуколичественным методом в баллах: отсутствие иммуноокрашенных клеток (-) - 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенных клеток (±) - 0,5 балла; менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) - 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (++) - 4 балла; более 40% окрашенных клеток (+++) - 6 баллов. По результатам исследования проводили статистический анализ с использованием метода дисперсионного анализа ANOVA (для нескольких групп) и по методу Манна-Уитни.

Результаты исследования

Большинство пациенток с ТПФ бесплодия были в возрасте от 25 до 38 лет. Длительность бесплодия в среднем составила 4,7±2,9 года, преобладало вторичное бесплодие. У 65% пациенток основной группы в анамнезе имели место 2 неудачных попытки ЭКО, у 25% женщин - 3 попытки и у 10% - 4 и более неудачных циклов ЭКО. Фертильные женщины контрольной группы были аналогичного возраста.

Анализ морфологической структуры эндометрия показал, что в «окно имплантации» у всех пациенток наблюдалась секреторная трансформация эндометрия. При этом ранняя стадия фазы секреции обнаружена у 24 (40%), средняя стадия фазы секреции - у 27 (45%) и поздняя стадия фазы секреции - у 9 (15%) пациенток основной группы, тогда как в группе контроля превалировал эндометрий средней стадии секреции - 16(80%)(фиг. 1, 2).

Результаты иммуногистохимического исследования эндометрия показали, что в основной группе преобладали пациентки с количеством зрелых пиноподий менее 20% в поверхностном эпителии эндометрия (45%). В контрольной группе зрелые пиноподии выявлялись более чем на 40% поверхностного эпителия эндометрия у подавляющего большинства женщин.

Изучение поверхностного эпителия и оценка количества клеток с наличием пиноподий показала, что пиноподий в исследуемой группе покрывали в среднем 34±4,8% клеток поверхностного эпителия эндометрия (от 10 до 50% клеток). Почти в половине случаев (45%) пиноподии покрывали не более 20% клеток поверхностного эпителия. В контрольной группе пиноподии в среднем покрывали 45% поверхностного эпителия эндометрия (фиг. 3).

При ИГХ исследовании эзрин выявлялся в виде коричневого окрашивания апикальной мембраны эпителиоцитов эндометрия, в пиноподиях, в клеточной мембране и цитоплазме железистого эпителия и в строме. Изучаемое нами антитело обнаруживалось как в виде фосфорилированного активного белка, так и в виде нефосфорилированного белка. Таким образом, мы определяли накопление в клетках общего эзрина.

Максимальная экспрессия белка обнаруживалась в пиноподиях и эпителиоцитов эндометрия в контрольной группе, тогда как в основной группе она была минимальной. В клетках стромы эзрин накапливался в чуть меньшем количестве в основной группе по сравнению с контролем (фиг. 4).

Сравнительная характеристика экспрессии эзрина в ткани эндометрия у женщин с ТПФ бесплодия и у фертильных женщин в окно имплантации (ЛГ+7) представлена в фиг. 5.

Как видно из данных таблицы, в исследуемой группе в эпителий эндометрия у 45 (75%) женщин отмечался низкий уровень экспрессии эзрина (1-2 балла), у 15 (25%) женщин отмечался средний уровень экспрессии эзрина. Высокий уровень экспрессии эзрина в исследуемой группе не отмечался 0 (0%). Напротив, в контрольной группе низкий уровень экспрессии эзрина в эпителиях эндометрии не отмечался 0 (0%), а средний уровень экспрессии эзрина отмечался у 21 (35%) женщин. Высокий уровень экспрессии эзрина в контрольной группе выявлен больше в половине случаев 39 (65%).

В пиноподиях эндометрии в исследуемой группе выявлен низкий уровень экспрессии эзрина у 21 (35%) и средний уровень экспрессии эзрина у 33 (55%) женщин. Высокий уровень экспрессии эзрина выявлен у 9 (15%) женщин.

В контрольной группе в пиноподиях эндометрии у всех женщин отмечался высокий уровень экспрессия эзрина 20 (100%).

В строме эндометрии в исследуемой группе у всех женщин выявлена низкая экспрессия эзрина 60 (100%), а в контрольной группе у большинства 51 (85%) женщин выявлена низкая экспрессия эзрина. Лишь у 9 (15%) женщин выявлен высокий уровень экспрессия эзрина.

Средний уровень экспрессии эзрина в «окно имплантации» в эпителии эндометрия в группе бесплодием составил 2,2 балла, а в контрольной группе - 5,3 баллов, что статистически было достоверно ниже, p<0,05. В пиноподиях эндометрия средний уровень экспрессии эзрина в основной группе также статически был достоверно ниже (3,8 балла) по сравнению с контрольной группой (6 баллов), p<0,05. В исследуемой группе в строме эндометрия средний уровень экспрессии эзрина статистически достоверно не различался от аналогичного показателя контрольной группы (1,6 баллов и 1,9 баллов, p>0,05) (фиг. 6).

Таким образом, выявлено снижение эзрина в пиноподиях и цитоплазмах клеток эпителия эндометрия у бесплодных женщин, что свидетельствует о возможном нарушении адгезии бластоцисты, образования и созревания пиноподий, а также ремоделирования цитоскелета клетки, что проявляется в патологии рецептивности эндометрия и отражает нарушение его имплантационных свойств.

Обсуждение

Изучение поверхностного эпителия и оценка количества клеток с наличием пиноподий показала, что пиноподий в исследуемой группе покрывали в среднем 34±4,8% клеток поверхностного эпителия эндометрия (от 10 до 50% клеток). Почти в половине случаев (45%) пиноподии покрывали не более 20% клеток поверхностного эпителия. В контрольной группе пиноподии в среднем покрывали 45% поверхностного эпителия эндометрия.

В исследовании, проведенном Nikas G. и соавт. (2002 г.), было показано снижение количества зрелых пиноподий у пациенток с бесплодием с неясного генеза с нарушением имплантации эндометрия в анамнезе [16].

Наши данные согласуются с результатами предыдущих отечественных исследований, в которых была также показана значительная роль в наступлении имплантации количества зрелых пиниподий и созревания эндометрия [17, 18, 19].

В нашем исследовании мы выявляли общий эзрин, который по данным литературы изменяется в фазу пролиферации также, как и фосфорилированный эзрин. Установлено, что эзрин действительно является важным фактором рецептивности эндометрия, т.к. обнаруживается в ключевых структурах эпителиоцитах - в пиноподиях и в цитоплазме, но преимущественно вокруг секреторных вакуолей эпителиоцитов эндометрия.

При исследовании ИГХ экспрессии эзрина выявлено снижение его накопления в области пиноподий в основной группе по сравнению с группой контроля.

В пиноподиях эндометрия исследуемой группы высокий уровень экспрессии эзрина выявлен у 9 (15%) женщин. В контрольной группе у всех пациенток (100%) выявлен высокий уровень экспрессии эзрина в эндометрии (p<0,05).

В среднем экспрессия эзрина в эндометрии в группе с бесплодием составила 3,8 балла, а в контрольной группе - 6 баллов (p<0,05), что также свидетельствует о нарушении рецептивности эндометрия и отражает нарушение его имплантационных свойств в исследуемой группе.

Полученные нами данные подтверждаются исследованием, проведенным в 2011 г. группой исследователей из Австралии, которые показали ключевую роль белка эзрина в успешной имплантации эмбриона [20].

Одним из ключевых факторов, отвечающих за изменение клеточной мембраны, цитоскелета эпителиоцитов эндометрия и формирования и транспорта вакуолей в последних является эзрин. Эзрин находится в клеточной мембране в неактивной или нефосфорилированной форме, а при взаимодействии с тирозиназой (тирозин 353) активируется или переходит в фосфорилированную форму. В активированном виде фосфоэзрин связывается с различными лигандами, что потенциирует формирование ресничек и пиноподий, образование и транспорт вакуолей. Кроме того, по данным литературы эзрин посредством взаимодействий с CD43, VCAM-1 влияет на клетки иммунной системы, а также за счет связывания с FASL регулирует апоптоз, а с SDC2 - клеточную пролиферацию. За счет взаимодействия с ICAM-1, -2, -3, MSN, PALLD и VCAM-1 эзрин участвует в регуляции клеточной адгезии, а при связывании с MSN, PALLD, SDC2 происходит ремоделирование актинового цитоскелета.

Таким образом, структурно-функциональные и молекулярные нарушения ремоделирования эндометрия в «окно имплантации» могут стать причиной нарушения его рецептивности.

Таким образом, прогностически благоприятными критериями наступления беременности являются: наличие в период «окна имплантации» более 45% клеток поверхностного эпителия со зрелыми пиноподиями, а также высокий уровень экспрессии эзрина в пиноподиях и вокруг секреторных вакуолей в клетках поверхностного эпителия эндометрия. Эндометрий женщины с бесплодием характеризуется отставанием секреторных изменений, что проявляется образованием малого количества зрелых пиноподий, а также сниженной экспрессий эзрина наиболее клинически.

Определение клинических и молекулярно-биологических факторов рецептивности эндометрия позволяет достоверно прогнозировать наступление беременности как в естественном цикле, так и в программе ЭКО.

Полученные результаты исследования позволяют расширить теоретические представления о роли эзрина при бесплодии и повторных неудачах программ ЭКО в анамнезе.

Выявленные закономерности экспрессии эзрина в эндометрии и созревания зрелых пиноподий при бесплодии открывают перспективы для разработки новых подходов к патогенетической подготовке слизистой тела матки к имплантации бластоцисты.

Клинический пример 1.

Больная А., 29 лет, обратилась с жалобами на отсутствие беременности в течение 7 лет. Гинекологический анамнез - отягощена. При гинекологическом осмотре патология не выявлена. В анамнезе 2 неудачные попытки программы ЭКО. Морфологический диагноз (20 день м/цикл.) - эндометрий ранней стадии фазы секреции, зрелые пиноподии определяются на 10% поверхностного эпителия. Методом иммуногистохимии определен уровень экспрессии эзрина в эпителии и в пиноподиях эндометрия. Выявлен низкий уровень эзрина (2 балла) как в эпителии, так и в пиноподиях (1,5 балла) эндометрия.

Предложена подготовка эндометрия в течение 3-х циклов препаратами прогестерона.

Клинический пример 2.

Больная С., 26 лет, жалоб не предъявляет. В анамнезе 2 самостоятельных родов, без особенности. Гинекологический анамнез - не отягощена. Морфологический диагноз (20 день м/цикл.) - эндометрий средней стадии фазы секреции и зрелые пиноподии определяются более чем на 45% поверхностного эпителия. Методом иммуногистохимии определены уровни экспрессии эзрина в эпителии и непосредственно в пиноподиях эндометрия. Выявлен высокий уровень эзрина (6 баллов) как в эпителии, так и в пиноподиях (6 баллов) эндометрия.

Пациентка направлена в программу ЭКО, в результате которой была достигнута беременность.

Список литературы

1. Manal A Tawfeek1, Manal A Eid1*, Azza M Hasan2, Manal Mostafa3 and Hesham A El-Serogy Tawfeek et al. Assessment of leukemia inhibitory factor and glycoprotein 130 expression in endometrium and uterine flushing: a possible diagnostic tool for impaired fertility BMC Women's Health 2012, 12:10

2. Costro-Rendon W.A., Costro-Alvares. Blastocyst-endometrium interaction: intertwining a cytokine network // Bras. J. Med. Biol. Res. - 2006. - Vol. 39 (11). - P. 1373-1385.

3. Aplin J.D., Kimber S.J. Trophoblast-uterine interactions at implantation // Reprod. Biol. Endocrinol. - 2004. - Vol. 2. - P. 48.

4. Beceriklisoy H., Schafer-Somi S. Cytokines, growth factors and prostaglandin synthesis in the uterus of pregnant and non-pregnant bitches: the features of placental sites // Reprod. Domest. Anim. - 2009. - Vol. 44 (Suppl. 2). - P. 115-119.

5. Achache H., Revel A. Endometrial receptivity markers, the journey to successful embryo implantation // Hum. Reprod. Update. - 2006. - Vol. 12, №6. - P. 731-746.

6. Orkun Tan, Turkan Ornek, Ahmed Fadiel, Kelley Carrick, Aydin Arici2, Kevin Doody1, Bruce R. Carr1, and Frederick Naftclin4 Expression and activation of the membrane-cytoskeleton protein ezrin during normal endometrial cycle, 2011

7. Lecce L, Lindsay LA, Murphy CR. Ezrin and EBP50 redistribute apically in rat uterine epithelial cells at the time of implantation and in response to cell contact. Cell Tissue Res 2011; 343: 445-53

8. Lessey B.A. Two pathways of progesterone action in the human endometrium: implications for implantation and contraception // Steroids. - 2003. - Vol. 68. - P. 809-815.

9. Fehon RG, McClatchey AI, Bretscher A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat Rev Mol Cell Biol 2010; 11: 276-87

10. Smith PM, Cowan A, Milgram SL, White BA. Tissue-specific regulation by estrogen of ezrin and ezrin/radixin/moesin-binding protein 50. Endocrine 2003; 22: 119-26.

11 Sowers JR. Estrogen-inducible cytoskeletal linker protein ezrin interaction with the low - density lipoprotein receptor. Endocrinology 2004; 145: 3074.

12. Chen Y, Wang D, Guo Z, Zhao J, Wu B, Deng H et al. Rho Kinase Phosphorylation Promotes Ezrin-Mediated Metastasis in Hepatocellular Carcinoma. Cancer Res 2011; 71: 1721-9.

13 Huang H, Xiao Y, Lin H, Fu D, Zhan Z, Liang L et al. Increased phosphorylation of ezrin/radixin/moesin proteins contributes to proliferation of rheumatoid fibroblast-like synoviocytes. Rheumatology (Oxford) 2011.

14. Matsumoto H, Daikoku T, Wang H, Sato E, Dey SK. Differential expression of ezrin/radixin/moesin (ERM) and ERM-associated adhesion molecules in the blastocyst and uterus suggests their functions during implantation. Biol Reprod 2004; 70: 729-36.

15. O. Tan, K.S. Carrick, J. Kim, O. Bukulmez, K.J. Doody, B.R. Carr. Expression of Cytoskeletal-Linking ERM (Ezrin, Radixin and Moesin) Proteins in Human Endometrium DOI: http://dx.doi.Org/10.1016/j.fertnstert.2012.01.011

16. Nikas G., Aghalanova L. Endometrial pinopodes: some more understanding on human implantation // Reprod. Biomed. Online. - 2002. - Vol. 4 (3). - P. 18-23.

17. Митюрина E.B., Перминова С.Г., Демура T.A., Галлямова Е.М. // Морфофункциональное состояние эндометрия в стимулированных циклах программы экстракорпорального оплодотворения. Акушерство и гинекология №11/ 2014 - Р. 80-87

18. Шуршалина А.В., Демура Т.А. // Морфофункциональные перестройки эндометрия в «окно имплантации». Акушерство и гинекология №7-2 / 2011 - Р. 9-13

19. Левиашвили М.М., Демура Т.А., Мишиева Н.Г., Файзуллина Н.М., Назаренко Т.А., Коган Е.А.// Оценка рецептивности эндометрия у пациенток с безуспешными программами экстракорпорального оплодотворения в анамнезе. Акушерство и гинекология №4-1 / 2012. Р. 65-69

20. Heng S, Cervero A, Simon С, Stephens AN, Li Y, Zhang J, Paule S, Ralnczuk A, Singh H, Quinonero A, Tapia A, Velasquez L, Salamonsen L, Rombauts LJ, Nie G. Proprotein convertase 5/6 is critical for embryo implantation in women: regulating receptivity by cleaving EBP50, modulating ezrin binding, and membrane-cytoskeletal interactions. Endocrinology. 2011 Dec; 152 (12): 5041-52. doi: 10.1210/en.2011-1273. Epub 2011 Oct 4.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для

прогнозирования рецептивности эндометрия при бесплодии у женщин с повторными неудачами программ ЭКО. Для этого определяют уровень экспрессии эзрина и его внутриклеточную локализацию в биоптате эндометрия средней стадии фазы секреции. В период «окна имплантации» рецепторный эндометрий характеризуется средней стадией фазы секреции, зрелыми пиноподиями более чем на 20% поверхностного эпителия и высоким уровнем экспрессии эзрина и в эпителии, и пиноподиях. Изобретение позволяет прогнозировать наступления беременности в программах ЭКО и естественных циклах у женщин с бесплодием. 6 ил., 2 пр.

Способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии и внутриклеточной локализации эзрина в эндометрии женщин с бесплодием и повторными неудачами программы ЭКО, отличающийся тем, что определяют уровень экспрессии эзрина и его внутриклеточную локализацию в биоптате эндометрия средней стадии фазы секреции; прогностически неблагоприятными показателями рецептивности эндометрия считают дискоординацию созревания эндометрия, отставание секреторной трансформации, снижение количества зрелых пиноподий в поверхностном эпителии менее чем 20% в сочетании с падением в них экспрессии эзрина.