Способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии GnRG и GnRGR в "окно имплантации" в эндометрии женщин бесплодием и неудачными попытками программы эко Российский патент 2017 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии и патологической анатомии, предназначено для прогнозирования рецептивности эндометрия и наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

В связи с постоянным ростом проблема бесплодия на сегодняшний день приобретает не только медицинское, но и социально-демографическое значение. Таким образом, все большее распространение получает метод лечения бесплодия путем ЭКО и переноса эмбрионов.

Повышение эффективности методов вспомогательных репродуктивных технологий является актуальной задачей современной репродуктивной медицины, а результативность программ ЭКО во многом зависит не только от качества перенесенных эмбрионов, но и от функционального состояния эндометрия, его зрелости и готовности к имплантации.

Таким образом, в изучении функционального состояния эндометрия особое место занимает исследование маркеров рецептивности для адекватной оценки и разработки лечебно-профилактических мероприятий.

Эндометрий восприимчив для имплантации эмбриона только в течение ограниченного периода, в которое наблюдается максимальная его рецептивность. Это так называемое «окно имплантации», период которого составляет несколько дней - примерно с 20-го по 24-й день нормального менструального цикла, на 6-10 день после пика лютеинизирующего гормона (ЛГ) [1, 2, 3]. Для успешной имплантации необходима синхронизация между эмбрионом и эндометрием. Таким образом, правильная циклическая экспрессия рецепторов играет критическую роль для восприимчивости эндометрия и успешности имплантации [4].

На сегодняшний день имеется широкий спектр иммуногистохимических маркеров рецептивности эндометрия определяемые в окно имплантации, такие как: прогестероновые и эстрогеновые рецепторы, лейкемия ингибирующий фактор и его рецептор, эзрин, интегрины, селектины, простогландины, муцины [5, 6, 7, 8, 9, 10].

В ряде исследований было показано, что гонадотропин - рилизинг гормон (GnRG) и рецептор гонадотропин - рилизинг гормона (GnRGR) присутствуют в эндометрии женщин на протяжении всего менструального цикла в эпителиальных и стромальных клетках с повышением экспрессии рецепторов GnRG в децидуализированных стромальных клетках в ЛФ [11, 12]. Локальная экспрессия GnRG трофобластом и присутствие его рецепторов в децидуализированном эндометрии предположительно играет важную роль в диалоге между бластоцистой и эндометрием на стадии ранней имплантации, путем модуляции баланса между матриксными металлопротеиназами (ММР) и их ингибиторами [12, 13]. Повышается инвазивная способность трофобласта путем специфического ингибирования тканевых ингибиторов металлопротеиназ (TIMP), что способствует более успешной имплантации бластоцисты [12]. Также было показано, что GnRG индуцирует апоптоз в клетках эндометрия in vitro.

У изобретения задачей является способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии GnRG и GnRGR в «окно имплантации» в эндометрии женщин с бесплодием и неудачными попытками программ ЭКО.

Способ прогнозирования рецептивности эндометрия при бесплодии у женщин с неудачными программами ЭКО включает определение уровней экспрессии GnRG и GnRGR в эндометрии в период «окна имплантации».

Как следствие, последнее приобретает чрезвычайную актуальность в связи с высокой перспективностью для разработки новых подходов к патогенетической профилактике бесплодия и подготовке эндометрия к импланатации в программах ЭКО.

В связи с чем было проведено исследование, целью которого явилось изучение морфологических особенностей эндометрия и экспрессии GnRG и GnRGR в эндометрии пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия и неудачными программами ЭКО.

Материалы и методы

В исследование была включена 41 пациентка с трубно-перитонеальным фактором (ТПФ) бесплодия, в возрасте от 26 до 38 лет, имеющие 1-2 неудачные программы ЭКО в анамнезе (основная группа), и 14 здоровых фертильных женщин аналогичного возраста имеющих в анамнезе здоровых детей (группа контроля). Аспирационная пайпель - биопсия эндометрия проводилась из области дна матки в «окно имплантации» (ЛГ+7) на 7-8 день после овуляции. Материалы биоптатов фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 ч. Образцы были обработаны по общепринятой стандартной методике и заключены в парафин. Срезы толщиной 4 мкм готовили на роторных микротомах и окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование гистологических препаратов проводилось в световом микроскопе Carl Zeiss Axio Imager A2 при увеличении от ×50 до ×600. Гистологическое датирование эндометрия, оценку процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий осуществляли на том же световом микроскопе при увеличении ×400 в 5 полях зрения. Пиноподии оценивались как изобилующие, умеренные и незначительные в зависимости от % занимаемой ими поверхности эндометрия (>40, 20-40 и <20 соответственно).

Иммуногистохимические (ИГХ) реакции проводили на серийных депарафинированных срезах толщиной 3-4 мкм по общепринятым методикам (DAKO protocols).

Экспрессию GnRH выявляли первичными антителами к GnRH (Abcam, 1:400), a GnRHR - первичными антителами к GnRHR (Gene Тех, 1:100).

Результаты ИГХ реакции GnRH и GnRHR оценивали полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике: отсутствие иммуноокрашенных клеток (-) - 0 баллов, менее 5% иммуноокрашенных клеток (±) - 0,5 баллов, менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) - 2 балла (низкая), от 20 до 40% окрашенных клеток (++) - 4 балла (умеренная), более 40% окрашенных клеток (+++) - 6 баллов (высокая).

По результатам исследования проводили статистический анализ с использованием метода дисперсионного анализа ANOVA (для нескольких групп) и по методу Манна-Уитни.

Для каждого количественного параметра были определены: среднее значение (М), среднеквадратичное отклонение (δ), ошибка среднего (m), медиана (Me), 95% доверительный интервал, для качественных данных - частоты (%).

При нормальном характере распределения данных результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (M±m). При распределении данных, отличных от нормального (значение теста Колмогорова - Смирнова менее 0,05), исследованные количественные показатели представлены в виде Me (L-H), где Me - медиана, L - 25 (нижний) квартиль, H - 75 (верхний) квартиль.

Результаты исследования

У большинства пациенток с ТПФ бесплодия средний возраст составил - 32,1±0,2 года. Длительность бесплодия в среднем составила 5,3±0,4 года, преобладало первичное бесплодие. У всех пациенток с бесплодием в анамнезе имели место 1-2 неудачных попытки ЭКО. Фертильные женщины контрольной группы были аналогичного возраста.

Анализ морфологической структуры эндометрия, показал, что у большинства пациенток исследуемой группы наблюдалась секреторная трансформация эндометрия, при этом ранняя стадия фазы секреции обнаружена у 5 (12,2%), средняя стадия фазы секреции - у 32 (78%) и поздняя стадия фазы секреции - у 4 (9,8%) пациенток основной группы. В группе контроля также превалировал эндометрий средней стадии фазы секреции у 13 (92,9%), ранняя стадия фазы секреции наблюдалась - у 1 (7,1%) женщины (таблица 1).

Результаты морфологического исследования эндометрия показали, что в исследуемой группе зрелые пиноподии наблюдались у 35 (85,4%), регрессирующие у 6 (14,6%) пациенток, тогда как в контрольной группе у всех женщин выявлялись зрелые пиноподии (100%). Количество зрелых пиноподий в исследуемой группе было достоверно ниже (p<0,05), чем в контрольной. При этом медиана количества клеток поверхностного эпителия, содержащих пиноподии в естественном цикле в «окно имплантации», у пациенток основной группы составила 20% (интерквартильный интервал 17-25%), что было существенно ниже, чем в группе фертильных женщин (медиана 30%, интерквартильный интервал 20-35%; р=0,003) (таблица 2).

При ИГХ исследовании GnRH экспрессировался в виде коричневого окрашивания цитоплазмы клеток поверхностного эпителия, эпителия желез и стромы эндометрия.

У пациенток с бесплодием экспрессии GnRG в поверхностном эпителии (медиана 2 и 5 интерквартильный интервал 2-4 и 4-6, р=0,0001), в эпителии желез (медиана 2 и 4 интерквартильный интервал 1-2 и 2,75-4, р=0,0001) и в строме (медиана 1 и 2 интерквартильный интервал 1-2 и 2-4, р=0,0001) была значительно ниже по сравнению с фертильными женщинами (табл. 3).

Таким образом, у пациенток с бесплодием отмечена низкая экспрессия GnRH в поверхностном эпителии и строме. У фертильных женщин уровни экспрессии GnRG были выше в поверхностном эпителии - в 1,75 раза, в эпителии желез - в 1,9 раза и в строме - в 2 раза по сравнению с пациентками с бесплодием (фиг. 1, 2)

ИГХ экспрессию GnRHR в эндометрии оценивали путем исследования иммуноокрашивания цитоплазмы клеток эпителия и стромы эндометрия. GnRH выявлялся в цитоплазме клеток эндометрия в виде коричневого окрашивания.

Уровни экспрессии GnRGR в поверхностном эпителии (медиана 1 и 4, интерквартильный интервал 0,5-1 и 3,2-4, р=0,0001), в эпителии желез (медиана 1 и 3,7, интерквартильный интервал 0,5-1 и 2,5-4, р=0,0001) и строме (медиана 0,75 и 4 интерквартильный интервал 0,5-1 и 2,3-4, р=0,0001) были существенно выше в группе фертильных женщин по сравнению с группой пациенток с бесплодием (таблица 4).

Оценка средних уровней экспрессии GnRGR показала, что в группе пациенток с бесплодием уровни экспрессии GnRHR были низкими в поверхностном эпителии и строме. У фертильных женщин уровни экспрессии GnRGR были выше в поверхностном эпителии - в 4,2 раза, в эпителии желез - в 4,1 раза, в строме - в 4,5 раза в сравнении с пациентками с бесплодием (фиг. 3, 4)

Полученные результаты свидетельствует о нарушении рецептивности эндометрия в «окно имплантации» у исследуемых пациенток с бесплодием.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что снижение экспрессии рецепторов GnRH и GnRHR в эндометрии у пациенток с бесплодием отражает нарушение его рецептивности. И, в свою очередь, может явиться неблагоприятным прогностическим признаком для наступления беременности.

Обсуждение

В работе Raga F., 1998, исследовали экспрессию мРНК GnRH и GnRHR в эндометрии фертильных женщин в пременопаузе в динамике менструального цикла [11]. Было показано, что GnRH и GnRHR присутствуют в эндометрии женщин на протяжении всего менструального цикла, как в эпителии, так и в строме, с повышением экспрессии GnRH и GnRHR в секреторную фазу по сравнению с фазой пролиферации [11]. Кроме того, были показаны наиболее высокие уровни мРНК GnRH и GnRH-R в ЛФ в эпителиальных и стромальных клетках.

Таким образом, экспрессия GnRH трофобластом и присутствие его рецепторов в децидуализированном эндометрии, по-видимому, играет важную роль на стадии имплантации и плацентации, как молекулярный аутокринно/паракринный регулятор взаимоотношений эмбрион/эндометрий в период ранней имплантации, изменяя баланс между матриксными металлопротеиназами и их ингибиторами [12, 13].

Результаты нашего исследования показали существенное снижение экспрессии GnRH у пациенток с бесплодием в поверхностном эпителии - в 1,75 раза, в эпителии желез - в 1,9 раза и в строме - в 2 раза, GnRHR в поверхностном эпителии - в 4,2 раза, в эпителии желез - в 4,1 раза, в строме - в 4,5 раза в сравнении с группой фертильных женщин в «окно имплантации» (р=0,0001). Кроме того, в ходе проведенного нами морфологического и ИГХ исследования эндометрия у пациенток с бесплодием было отмечено более низкое количество клеток поверхностного эпителия, содержащих пиноподии (медиана 20% и 30%, р=0,003), и количество зрелых пиноподий (р<0,05).

Таким образом, прогностически благоприятными критериями наступления беременности являются: наличие в период «окна имплантации» более 20% клеток поверхностного эпителия со зрелыми пиноподиями, а также высокий уровень экспрессии GnRH и GnRHR в эндометрии. Эндометрий женщины с бесплодием и неудачными программами ЭКО характеризуется нарушением рецептивности эндометрия, что проявляется отставанием секреторных изменений, более низким количество клеток поверхностного эпителия содержащих зрелые пиноподии, а также низкой экспрессий GnRH и GnRHR.

Определение клинических и молекулярно-биологических факторов рецептивности эндометрия позволяют достоверно прогнозировать наступление беременности как в естественном цикле, так и в программе ЭКО.

Полученные результаты исследования позволяют расширить спектр маркеров рецептивности эндометрия при бесплодии и повторных неудачах программ ЭКО в анамнезе.

Выявленное снижение экспрессии GnRH и GnRHR в эндометрии в «окно имплантации» при бесплодии, открывает перспективы для разработки новых подходов к патогенетической подготовке слизистой тела матки к имплантации бластоцисты.

Клинический пример 1

Больная А., 26 лет, обратилась с жалобами на отсутствие беременности в течение 2 лет в 1 браке. Гинекологический анамнез - отягощен. При гинекологическом осмотре патология не выявлена. В анамнезе 2 неудачные попытки программы ЭКО. Морфологический диагноз (21 день м./цикл.) - эндометрий ранней стадии фазы секреции, зрелые пиноподии определяются на 15% поверхностного эпителия. Методом иммуногистохимии определены уровни экспрессии GnRG и GnRGR в эпителии и строме. Выявлен низкий уровень экспрессии GnRG (2 балла) и GnRGR (1,5 балла) в эпителии и в строме GnRG (2 балла) и GnRGR (1 балл).

Пациентка направлена в программу ЭКО, в результате которой беременность не наступила.

Клинический пример 2

Больная Д., 28 лет, обратилась с жалобами на отсутствие беременности в течение 3 лет в 1 браке. В анамнезе 1 самостоятельные роды после программы ЭКО, без особенностей. Гинекологический анамнез - не отягощен. Морфологический диагноз (22 день м./цикл.) - эндометрий средней стадии фазы секреции и зрелые пиноподии определяются более чем на 45% поверхностного эпителия. Методом иммуногистохимии определены уровни экспрессии GnRG и GnRGR в эпителии и строме. Выявлен высокий уровень экспрессии GnRG (5,5 баллов) и GnRGR (5 баллов) в эпителии и в строме GnRG (4 балла) и GnRGR (4,5 балла).

Пациентка направлена в программу ЭКО, в результате которой была достигнута беременность.

Клинический пример 3

Больная Т., 30 лет, жалобы на отсутствие беременности в течение 6 лет в 1 браке. В анамнезе 1 неудачная программа ЭКО. Гинекологический анамнез - не отягощен. Морфологический диагноз (21 день м./цикл.) - эндометрий ранней стадии фазы секреции и зрелые пиноподии определяются на 20% поверхностного эпителия. Методом иммуногистохимии определены уровни экспрессии GnRG и GnRGR в эпителии и строме. Выявлен низкий уровень экспрессии GnRG (2 балла) и GnRGR (2 балла) в эпителии и в строме GnRG (1 балл) и GnRGR (1,5 балла).

Пациентка направлена в программу ЭКО, в результате которой беременность не наступила.

Список литературы

1. Tavaniotou A., Smitz J., Bourgain С., Devroey P. Ovulation induction disrupts phase function // Ann NY Acad Sci. - 2001; 943:55-63.

2. Lessey B.A. The role of the endometrium during embryo implantation // Hum Reprod. - 2000; 15:39-50.

3. Bourgain C., Devroey P. The endometrium in stimulated cycles for IVF // Hum Reprod Update. - 2003; 9(6): 515-522.

4. Lessey B.A. Two pathways of progesterone action in the human endometrium: implications for implantation and contraception // Steroids. - 2003. - Vol. 68. - P. 809-815.

5. Expression and activation of the membrane-cytoskeleton protein ezrin during normal endometrial cycle / Tan O., Ornek Т., Fadiel A. et al. // Fertility Sterility. - 2012. - Vol. 97. - №1. - P. 192-199.

6. Бурлев B.A., Кузьмичев Л.Н., Онищенко A.C., Ильясова Н.А., Щетинина Н.С. Функциональная активность эндометрия влияет на результаты ЭКО и перенос эмбрионов: молекулярные механизмы регуляции фертильности. Пробл. репрод., 2010; 2:41-52.

7. Garcia Е., Bouchard Р. et al. Use of immunocytochemistry of progesterone and estrogen receptors for endometrial dating // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1988; 67:80-87.

8. Gemzell-Danielsson K., Bygdeman M. Effects of Progestogens on Endometrial Maturation in the Implantation Phase Ernst Schering Res Found Workshop. 2005; (52): 119-38.

9. Johnson P.M., Christmas S.E., Vince G.S. Immunological aspects of implantation and implantation failure // Human Reproduction. - 1999. - Vol. 14. - Suppl. 2. - P. 26-36.

10. Leukaemia inhibitory factor (LIF) gene mutations in women diagnosed with unexplained infertility and endometriosis have a negative impact on the IVF outcome. A pilot study / et al. // Folia Biology (Praha). - 2009. - Vol. 55. - P. 92-97.

11. Raga F, Casan EM, Kruessel JS, Wen Y, Huang HY, Nezhat C, Polan ML: Quantitative gonadotropin-releasing hormone gene expression and immunohistochemical localization in human endometrium throughout the menstrual cycle. Biol Reprod – 1998. - Vol. 59. - P. 661-669.

12. Raga F, Casan EM, Wen Y, Huang HY, Bonilla-Musoles F, Polan ML: Independent regulation of matrix metalloproteinase-9, tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIМР-1), and TIMP-3 in human endometrial stromal cells by gonadotropin-releasing hormone: implications in early human implantation. J Clin Endocrinol Metab - 1999 - Vol. 84. - P. 636-642.

13. Chou CS, Tai CJ, MacCalman CD, Leung PC: Dose-dependent effects of gonadotropin releasing hormone on matrix metalloproteinase (MMP)-2, and MMP-9 and tissue specific inhibitor of metalloproteinases-1 messenger ribonucleic acid levels in human decidual Stromal cells in vitro. J Clin Endocrinol Metab. - 2003. - Vol. 88. - P. 680-688.

Фиг. 1. Показатели средних уровней экспрессии GnRH у пациенток с бесплодием и фертильных женщин.

р<0,05 по сравнению с группой с фертильными женщинами (U-критерий Манна-Уитни).

Фиг. 2. Иммуногистохимическое исследование экспрессии GnRH в эндометрии в «окно имплантации» у пациенток с бесплодием и фертильных женщин (иммунопероксидазная реакция) (×200).

а - основная группа (отсутствие экспрессии);

б - контрольная группа (высокая экспрессия).

Фиг. 3. Показатели средних уровней экспрессии GnRHR у пациенток с бесплодием и фертильных женщин.

р<0,05 по сравнению с группой с фертильными женщинами (U-критерий Манна-Уитни).

Фиг. 4. Иммуногистохимическое исследование экспрессии GnRHR в эндометрии в «окно имплантации» у пациенток с бесплодием и фертильных женщин (иммунопероксидазная реакция) (×400).

а - основная группа (низкая экспрессия);

б - контрольная группа (высокая экспрессия).

Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии, и предназначено для прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии GnRG и GnRGR в «окно имплантации» в эндометрии женщин с бесплодием и неудачными попытками программ ЭКО. Прогностически неблагоприятными показателями рецептивности эндометрия считают отставание секреторной трансформации эндометрия, снижение количества клеток, содержащих зрелые пиноподии в поверхностном эпителии, менее чем 20%, а также низкую экспрессию (<2 баллов) GnRG и GnRGR. Предложенный способ повышает точность прогнозирования наступления беременности в программах ЭКО и естественных циклах у женщин с бесплодием. 4 ил., 4 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии GnRG и GnRGR в «окно имплантации» в эндометрии женщин с бесплодием и неудачными попытками программ ЭКО, отличающийся тем, что определяют на основании иммуногистохимического исследования в биоптате эндометрия в «окно имплантации» уровни экспрессии GnRG и GnRGR, прогностически неблагоприятными показателями рецептивности эндометрия считают отставание секреторной трансформации эндометрия, снижение количества клеток, содержащих зрелые пиноподии в поверхностном эпителии, менее чем 20%, а также низкую экспрессию (<2 баллов) GnRG и GnRGR.