МИКРОБНЫЙ СПОСОБ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2016 года по МПК A01N63/02 A01N63/04 

По данной заявке испрашивается приоритет в порядке 35 U.SC. §119 в отношении Предварительной заявки США №61/355447, поданной 16 июня 2010 года.

Область техники

Раскрыты микробные способы и микробные композиции, которые повышают урожайность, усиливают защитные способы у растений, понижают уровень патогенов растений и снижают количество используемого удобрения.

Уровень техники

Микроорганизмы использовались ранее в сельском хозяйстве. Примеры этого раскрыты в Патентах США 4952229; 6232270 и 5266096.

Хитин также использовался в сельском хозяйстве как в виде белкового комплекса (Патент США 4536207), так и в комбинации с различными микроорганизмами (Патенты США 6524998 и 6060429).

Хитозан в комбинации с другими компонентами использовался в сельскохозяйственных приложениях. См., например, Патенты США 6649566; 4812159; 6407040; 5374627 и 5733851. Он также использовался для обработки семян зерновых культур. См. Патент США 4978381. В Патенте США 6524998 также раскрывается, что хитозан может применяться в комбинации с особыми микроорганизмами в сельскохозяйственных нуждах.

Независимо от вышеизложенного имеется необходимость в улучшенных микробных композициях и способах для повышения урожайности и снижения количества обычных фунгицидов и инсектицидов, применяемых в сельскохозяйственных и садоводческих приложениях.

Сущность изобретения

Раскрыты микробные композиции, содержащие, по меньшей мере, два компонента. Первый компонент включает HYTa, являющийся сообществом микроорганизмов, происходящих из плодородных почв и коммерческих источников. Второй компонент включает, по меньшей мере, одно из следующего: хитин, хитозан, глюкозамин и аминокислоты. Различные микроорганизмы в составе HYTa способны фиксировать азот, расщеплять белки и иные биополимеры, например хитин и хитозан, обеспечивая защиту от растительных патогенов и поддерживая микрофлору почвы.

Также раскрыты способы, в которых вышеупомянутые микробные композиции или их компоненты используются для обработки почвы, семян, сеянцев и/или листвы растений.

В предпочтительных вариантах воплощения HYTa активируется в водном растворе в течение 24-168 часов, чтобы позволить микроорганизмам вырасти и размножиться до использования в способе. Условия инкубации влияют на общие начальные характеристики HYTa.

В предпочтительном варианте воплощения HYTa активируется в присутствии хитина. Хитин-отзывчивые микроорганизмы в составе HYTa размножаются в данных условиях. Это дает HYTa, обладающий всеми свойствами HYTa. Однако он обладает повышенной активностью против хитин-содержащих растительных патогенов.

В предпочтительном варианте воплощения HYTa активируется в присутствии хитина, хитозана, глюкозамина и аминокислот. В этом варианте воплощения после роста HYTa может содержать остаточные хитин, хитозан, глюкозамин и/или аминокислоты. В таких условиях культура восстанавливает раскрытый микробный состав и может вноситься непосредственно в почву, наноситься на семена, сеянцы или листву растений. Альтернативно, один или более вторых компонентов могут добавляться для того, чтобы поддержать вторые компоненты, уже присутствующие в композиции, или чтобы изменить компоненты, присутствующие в полученной таким образом микробной композиции.

В некоторых вариантах воплощения активированный HYTa комбинируется с одним или более вторых компонентов и вносится в почву, наносится на семена, сеянцы или листву растений, либо HYTa и второй(ые) компонент(ы) наносятся раздельно. Подобные вторые компоненты включают хитин, хитозан, глюкозамин и аминокислоты.

Нанесение раскрытых микробных составов позволяет устранить необходимость или значительно уменьшить количество удобрения, фунгицида и инсектицида, используемых в сельскохозяйственных приложениях. В некоторых вариантах воплощения использование микробных составов обеспечивает понижение объема выбросов парниковых газов.

Также раскрыт состав обработанной почвы, содержащей почву, обработанную HYTa.

Также раскрыто обработанное растение, содержащее растение, обработанное HYTa.

Также раскрыты обработанные семена, сеянцы и растения, содержащие семя, сеянец или растение, обработанные HYTa.

Краткое описание чертежей

На Фигуре 1 показана диаграмма области испытания, на которой выращивалась твердая пшеница в Соноре, Мексика, и где применялись HYTa и HYTb.

На Фигуре 2 показан аналогичный Фигуре 3 чертеж, на котором показаны зоны, поврежденные и пострадавшие от воздействия внешних факторов во время испытания.

На Фигуре 3 графически показаны результаты обработки почвы и листвы твердой пшеницы при помощи HYTa и HYTb.

На Фигуре 4 представлен выход дынь в виде зависимости размера от обработки или отсутствия обработки почвы и листвы HYTa и HYTb.

На Фигуре 5 представлен выход клубней картофеля с диаметром больше 42 мм от растений, обработанных HYTa, HYTb и HYTc в сравнении с необработанными.

Детальное описание

Раскрыты микробные композиции, содержащие HYTa и второй компонент. HYTa является сообществом микроорганизмов, происходящих из плодородных почв и коммерческих источников. Второй компонент включает, по меньшей мере, одно из следующего: хитин, хитозан, глюкозамин и аминокислоты. Различные микроорганизмы в составе HYTa способны фиксировать азот, расщеплять белки и иные биополимеры, например хитин и хитозан, обеспечивая защиту от патогенов растений и поддерживая микрофлору почвы. Микробные композиции или их компоненты используются для обработки почвы, семян, сеянцев и/или листвы растений.

HYTa

При использовании здесь, термин «HYTa» обозначает сообщество микроорганизмов, происходящих из образцов плодородных почв и коммерческих источников. HYTa был депонирован в Американской Коллекции Типовых Культур (АТТС), Роквилль, Мэриленд, 19 мая 2010 года, под номером депозита РТА-10973.

В Таблице 1 представлены некоторые из микроорганизмов HYTa, которые считаются ответственными за благоприятные эффекты, наблюдаемые при обработке им почвы и/или листвы.

Таблица 1   Бактерии   I. Azotobacter   1. Azotobacter vinlandii   II. Clostridium   1. Clostridium pasteurianum   2. Clostridium beijerinckii   3. Clostridium sphenoides   4. Clostridium bifermentans   III. Lactobacillus   1. Lactobacillus paracasei ss. paracasei   2. Lactobacillus acidophillus   3. Lactobacillus delbrueckii ss. Bulgaricus   4. Lactobacillus brevis   IV. Bacillus   1. Bacillus amyloliquefaciens (Bacillus subtilis ((SILoSil^® BS);   2. Bacillus thuringiensis var. kurstakii (Bacillus thuringiensis (Штаммы HD-1))   3. Bacillus thuringiensis var. canadensis (труппа Bacillus cereus)   4. Bacillus pasteurii (группа Bacillus cereus)   5. Bacillus spbaericus (подгруппа I, III и IV)   6. Bacillus megaterium (подгруппа А)   V. Acetobacter или Gluconacetobacter   1. Acetobacter aceti ss. liquefaciens   2. Acetobacter aceti ss. xylimum   VI. Enterococcus   1. Enterococcus faecium (подгруппа А)   VII. Pediococcus   1. Pediococcus pentosaceus   VII. Rhizobium   1. Rhizobium japonicum   Грибы   I. Saccharomyces   1. Saccharomyces cerevisiae   II. Penicillium   1. Penicillium roqueforti   III. Monascus   1. Monascus ruber   IV. Aspergillus   1. Aspergillus oryzae   V. Trichoderma   1. Trichoderma harzianum (TRICHOSIL)   Растения   I. Arthrospiro   1. Arthrospira platensis  

Иные микроорганизмы, содержащиеся в HYTa: Nitrobacter, Nitrosomonads, Nitrococcus, Pseudomonas, Micrococcus luteus, Actinomycete, Azotobacter vinelandii, Lactobacillus casei, Trichoderma harzianum, Bacillus licheniformis, Pseudomonas fluorescens и Streptomyces.

Активные микроорганизмы в HYTa включают азотфиксирующие микроорганизмы, входящие в состав почвы. К ним относятся Azotobacter vinelandii и Clostridium pasteurianum. Bacillus subtilis выделяет ферменты, расщепляющие растительные остатки. Bacillus cereus выделяет дополнительные ферменты для расщепления растительных остатков и пенициллиназу для устранения нежелательных бактерий. Bacillus megaterium расщепляет сложные сахара после расщепления пожнивных остатков. Lactobacillus обеспечивает питанием микроорганизмы HYTa и контролирует pH окружающей среды. Организмы Nitrobacter окисляют аммиак в нитрит (NO₂), а микроорганизмы Nitrosomonas окисляют нитрит до нитрата (NO₃).

Важное свойство HYTa - фиксация атмосферного азота. Азотфиксирующая способность микроорганизмов HYTa усиливается другими организмами HYTa. Для фиксации азота требуется, чтобы были доступными фосфор (Р), калий (К) и углерод (C). HYTa содержит микроорганизмы, способные разлагать P, K и C в почве. Помимо этого азотфиксирующие бактерии дают источник азота для других микроорганизмов в HYTa.

Фиксация азота может происходить несимбиотическим способом бактериями Nitrosomonas, Nitrobacter, Azotobacter vinelandii u Clostridium pasteurinum, присутствующими в HYTa, либо симбиотическим способом, который встречается в корневых узелках бактериями Rhyzobium.

Углерод, необходимый азотфиксирующим микроорганизмам в HYTa, предоставляется С редуцентами, которые преобразуют сложные органические почвенные соединения в простые соединения типа сахаров, спиртов и органических кислот. С редуценты включают множество из указанных выше микроорганизмов.

Фосфор необходим азотфиксирующим микроорганизмам для размножения и образуется при метаболической активности Р редуцентов, которые преобразуют неподвижный фосфор почвы в биодоступные фосфорные питательные вещества. Р редуценты в HYTa включают Azotobacter, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens и Micrococcus luteus.

Калий, необходимый фиксаторам азота, предоставляется K редуцентными микроорганизмами, присутствующими в HYTa, активирующими калий почвы. K редуценты в HYTa включают Pseudomonas fluorescens.

Тремя важными микроорганизмами в составе HYTa являются Bacillus subtilis (SILoSil^® BS), Bacillus thuringiensis штаммы HD-1 и HD-73 (SILoSil^® ВТ), а также Trichoderma harzianum (TRICHOSIL). Эти организмы находятся в депозите АТТС РТА-10973. Первоначально они были получены от Biotecnologia Agroindustrial S.A. DE C.V., Морелия, Мичоакан, Мексика.

Bacillus subtilis ((SILoSil-BS) - грамположительная мезофильная бактерия, оптимум температуры роста которой лежит в пределах 25-35°C. Она аэробна, может расти в анаэробных условиях и использует большое количество источников углерода. Она содержит две нитратредуктазы, одна из которых используется для усвоения азота. Она способна выделять амилазу, протеазы, пуллуланазы, хитиназы, ксиланазы и липазы.

Bacillus thuringiensis (Штаммы HD-1 и HD-73 (SILoSil^® ВТ)) - грамположительная бактерия, факультативный анаэроб с перитрихиальными жгутиками. Штаммы HD-1 и HD-73 синтезируют кристаллы разнообразных геометрических форм с белковой и инсектицидной активностью во время спорообразования. Штаммы HD-1 и HD-73 секретируют экзохитаназы при нахождении в хитинсодержащей среде и могут использоваться для деградации остатков ракообразных с образованием хитоолигосахаридов.

Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) - сапрофитный гриб. Он выделяет антибиотики и оказывает биологическое конкурентное воздействие, вследствие чего обладает биологическими контрольными свойствами. Он выделяет ферменты, расщепляющие клеточные стенки, или обладает комбинацией подобных типов активности. Он образует глюканазы, хитиназы, липазы и внеклеточные протеазы при взаимодействии с некоторыми патогенными грибами, такими как Fusarium.

Как показано выше, метаболизм каждой группы бактерий тесно зависит от других, поэтому жизнь в тесной симбиотической связи необходима для правильного функционирования HYTa.

Помимо углерода, водорода, фосфора, калия, серы и различных микроэлементов для оптимального роста бактерий необходима смесь специальных факторов роста, таких как В комплекс, свободные L-аминокислоты и ультрарастворимые микроэлементы. Для образования этих компонентов в состав HYTa включены ферментирующие дрожжи. Способ фиксации N₂ требует больших количеств АТФ. Количество АТФ, присутствующее естественным образом, недостаточно для активации биологической фиксации N₂. Ферментация дрожжами HYTa компенсирует большой энергетический дефицит. При ферментации во время способа дыхания образуются органические кислоты, которые вместе с фосфором, выделенным Р редуцентами, образуют АТФ. АТФ используется в способе биологической фиксации азота.

HYTa содержит ферменты и полезные почвенные микроорганизмы, которые замещают микроорганизмы, погибающие вследствие избыточного использования химикатов, что приводит к понижению урожайности. При повышении микробной активности в почве с внесением HYTa бактерии обеспечивают более эффективное и успешное поглощение (минерализацию) растениями питательных веществ и микроэлементов.

Гумус преобразуется некоторыми микроорганизмами HYTa, которые насыщают и почву, и корневую систему растения. Способ обеспечивает повышенное питание растения. Это повышает количество питательных веществ и необходимых элементов, находящихся в почве и могущих быть поглощенными растениями.

Использование HYTa самого по себе или в комбинации с хитином, хитозаном, глюкозамином и/или аминокислотами (1) обеспечивает почву питательными веществами и элементами, повышая урожайность на 25-55%, (2) понижает выбросы парниковых газов, (3) повышает эффективность минеральных удобрений, (3) снижает использование обычных фунгицидов и других пестицидов, (4) снижает образование регуляторов роста растений, (5) улучшает структуру почвы, качество обработки почвы, проникновение и удерживание воды, (6) очищает почву от остаточных химических веществ и (7) сдвигает pH почвы к нейтральному pH.

Микробные композиции

HYTa может использоваться сам по себе или в комбинации с одним или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из одной или более аминокислот, хитина, хитозана и/или глюкозамина. В некоторых случаях в микробную композицию может быть включен Ацетил-D-глюкозамин. Микробная композиция включает любую и все комбинации вышеупомянутых компонентов. Особенно предпочтительные комбинации включают: (1) HYTa и хитин; (2) HYTa и хитозан; (3) HYTa и глюкозамин; (4) HYTa и аминокислоты; (5) HYTa, хитин и аминокислоты; (6) HYTa, хитин, хитозан и аминокислоты; (7) HYTa, хитозан, глюкозамин и аминокислоты; (8) HYTa, хитозан и глюкозамин и (9) HYTa, хитин, хитозан, глюкозамин и аминокислоты, последний вариант особенно предпочтителен.

Если HYTa выращивается в присутствии хитина, хитозана и/или аминокислот, то он может содержать остаточные хитин, хитозан и/или аминокислоты. В таких условиях культура HYTa восстанавливает раскрытый микробный состав и может вноситься непосредственно в почву, наноситься на семена, сеянцы или листву растений. Альтернативно, один или более вторых компонентов могут добавляться для того, чтобы поддержать вторые компоненты, присутствующие в композиции, или чтобы изменить ее состав.

При использовании здесь, термин «аминокислоты» относится к композиции, содержащей две или более аминокислот. Аминокислоты включают триптофан, гистидин, треонин, тирозин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, серии, глицин, аланин, пролин, аспарагин и аргинин. В предпочтительных вариантах воплощения аминокислоты предоставляются при помощи HYTb (см. ниже).

При использовании здесь, термин «хитин» относится к биополимеру, состоящему, преимущественно, из повторяющихся единиц бета-1-4-связанного N-ацетил-D-глюкозамина. Хитин находится в природе в качестве первичного структурного материала внешнего скелета таких животных, как Arthropoda, например ракообразных, насекомых, пауков и т.д., Mollusca, например брюхоногих моллюсков, головоногих моллюсков и т.д., Coelentara, например, таких организмов, как гидры и медузы, и Nematoda, например несегментированных червей. Хитин также находится в различных грибах, включая представителей рода Fusarium. Хитин может быть извлечен из этих природных источников обработкой щелочами или биоразложением. Молекулярная масса хитина варьируется в зависимости от источника и способа выделения. В предпочтительных вариантах воплощения хитин получается в твердом виде при биоразложении хитинсодержащих Членистоногих, согласно заявкам Bioderpac. Предпочтительно, чтобы хитин имел диаметр приблизительно 50-75 микрон для облегчения его нанесения через капельные и разбрызгивающие системы полива.

При использовании здесь, термин «хитозан» обозначает полисахарид, состоящий, преимущественно, из повторяющихся единиц D-глюкозамина. Хитозан получается деацетилированием хитина. Степень деацетилирования, в сравнении с хитином, предпочтительно, выше чем 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% и 95%. Предпочтительно, чтобы уровень деацетилирования был достаточен для поддержания хитозана водорастворимым при кислом pH. Молекулярная масса хитозана варьируется в зависимости от источника и способа выделения. Хитозан включает олигомеры хитозана. В предпочтительных вариантах воплощения хитозан осаждается при pH 9,0 из водной фракции, полученной при биоразложении хитинсодержащих Членистоногих, так, как описано в заявках Bioderpac.

При использовании здесь, термин «олигомер хитозана» обозначает хитозан, имеющий 2 или более повторяющихся единиц D-глюкозамина и, в случае неполного деацетилирования хитина, одну или более единиц N-ацетил-D-глюкозамина. В предпочтительных вариантах воплощения олигомеры хитозана получаются из водной фракции, полученной при биоразложении хитинсодержащих Членистоногих так, как описано в заявках Bioderpac. В некоторых вариантах воплощения олигомеры хитозана используются в качестве второго компонента микробной композиции.

При использовании здесь, термин «глюкозамин» обозначает аминомоносахарид. В предпочтительных вариантах воплощения он является остатком сахара, образующим скелет биополимеров хитина и хитозана. Глюкозамин присутствует в водной фракции, полученной при биоразложении хитинсодержащих Членистоногих так, как описано в заявках Bioderpac. Глюкозамин индуцирует синтез хитиназы растениями в качестве защитной меры против хитинсодержащих патогенов.

HYTb и HYTc

При использовании здесь, термин «HYTb» обозначает водную фракцию, а «HYTc» - твердую фракцию, получаемые при биоразложении Членистоногих, например отходов переработки креветок, полученных при биоразложении хитинсодержащих Членистоногих, таких как описано в Патентной Заявке США №61/289706, поданной 23.12.09 и озаглавленной «Биоразложение Побочных продуктов переработки Ракообразных», Патентной Заявке США №61/299869, поданной 29.1.10 и озаглавленной «Способ Биоразложения и Микробная Композиция», и Патентной Заявке США №61/355365, поданной 16 Июня 2010 года и озаглавленной «Способ Биоразложения и Композиция», каждая из которых включена сюда во всей полноте посредством ссылки.

Вкратце, при способе биоразложения членистоногого используется микробная композиция для разложения членистоногого или отработанных компонентов членистоногого. Этот способ представляет собой молочнокислую ферментацию. Микробная композиция содержит микроорганизмы, продуцирующие ферменты, которые могут разлагать хитинсодержащие компоненты членистоногого до хитина, хитозана, N-ацетилглюкозамина и глюкозамина. Также она содержит микроорганизмы, которые продуцируют ферменты, способные расщеплять белки и жиры до аминокислот и липидов. Предпочтительная микробная композиция для разложения членистоногих обозначается HQE. HQE была депонирована в Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС) Манассас, Вирджиния, США, 27 апреля 2010 года и получила номер патента депозита РТА-10861.

В предпочтительном варианте воплощения морское членистоногое является ракообразным, предпочтительное ракообразное - креветка. Побочные продукты креветок включают головогрудь креветок и/или экзоскелет.

В способе биоразложения предпочтительно, чтобы ферментация была ферментацией, осуществляемой факультативными аэробами. Также предпочтительно, чтобы ферментация производилась при температуре приблизительно 30°C-40°C, pH, предпочтительно, ниже 6, более предпочтительно ниже 5,5. Однако pH следует поддерживать выше 4,3. Ферментация проводится в течение приблизительно 24-96 часов. В некоторых вариантах воплощения ферментация проводится в течение приблизительно 24-48 часов и, более предпочтительно, 24-36 часов. Эти показатели продолжительности ферментации значительно ниже, чем известные ранее в отрасли показатели продолжительности ферментации, составляющие 10-15 дней до достижения примерно такой же степени расщепления, хотя и без обнаруживаемого образования хитозана и глюкозамина.

Разделение смеси предпочтительно производится центрифугированием, (например, при приблизительно 920 g). Также может применяться гравитационное разделение, хотя оно не является предпочтительным вследствие продолжительности времени, необходимого для достижения разделения.

Смесь разделяется на три фракции: твердую, водную и липидную. Твердая фракция содержит хитин и обозначается HYTc. Водная фракция содержит белковый гидролизат, аминокислоты, хитозан и глюкозамин и обозначается HYTb. Липидная фракция содержит стеролы, витамины А и Е и каротиноидные пигменты, такие как астаксантин.

Предпочтительно, чтобы в способе биоразложения использовался HQE. В других вариантах воплощения предпочтительно, чтобы ранее полученный HYTb добавлялся к HQE или к ферментативному бульону. Как описано выше, HYTb содержит аминокислоты, хитозан, глюкозамин и микроэлементы, включая кальций, магний, цинк, медь, железо и марганец. HYTb также содержит ферменты, такие как лактатные ферменты, протеазы, липазы, хитиназы, молочную кислоту, полипептиды и другие углеводы. HYTb также может содержать покоящиеся микроорганизмы из предшествующего способа биоразложения. Эти микроорганизмы могут реактивироваться и, совместно с HQE, могут дать вклад в повышение устойчивости биоразложения в сравнении с HQE, используемым без добавок или иным образом, описанным здесь.

Более конкретно, способ включает следующие этапы:

а. Активация микробных клеток в базовом растворе сахара для усиления роста и образования биомассы.

б. Измельчение побочных продуктов переработки креветок (головогруди и экзоскелета) до однородной пасты.

в. Гомогенное смешивание пасты отработанных компонентов креветок с, по меньшей мере, 10% активированного инокулята.

г. Корректировка pH смеси до величины ниже 6,0 при помощи раствора лимонной кислоты для ингибирования роста микроорганизмов и ускорения развития микробных клеток, составляющих инокулят.

д. Ферментация смеси в системе с прерывистым перемешиванием при температурах в интервале 30-40°C в течение, по меньшей мере, 96 часов с поддержанием pH ниже 5,0. pH периодически контролируется. Если pH поднимается выше 5,0, то добавляется буфер с лимонной кислотой в количестве, достаточном для поддержания pH ниже 5,0.

е. Центрифугирование ферментируемой массы для разделения трех основных фракций: хитина, жидкого гидролизата и пигментной пасты.

ж. Промывание сырого хитина и сбор промывных вод для восстановления мелких твердых частиц или минеральных веществ.

з. Высушивание хитина и хранение.

и. Высушивание и хранение жидкого гидролизата.

к. Пигментированную пасту (липидную фракцию) сохраняют в закрытых приемниках для консервации.

Способ и базовые операции лучше понимаются со ссылкой на приведенное ниже детальное описание.

Активация микробных клеток

Микробная композиция, раскрытая здесь, используется в качестве инокулята. Инокулят HQE содержит микроорганизмы в концентрации приблизительно 2,5-3,0% (мас./об.). HQE активируется разбавлением до 5% раствором тростникового сахара (конечная концентрация тростникового сахара 3,75%), после чего инкубируется при 37°C 5 дней. Предпочтительно добавление HYTb (10 мл на литр культуры) в качестве источника минеральных веществ и природных аминокислот. Клеточный рост микроорганизмов оценивался по оптической плотности, измеряемой на 540 нм. Активация считается завершенной при оптической плотности приблизительно 1,7. Концентрация микроорганизмов после активации составляет приблизительно 1,9-3,0% (мас./об.).

Приготовление образцов

Образцы побочных продуктов переработки креветок были получены от фабрик переработки креветок. Слегка оттаянные и измельченные остатки (1500 г в партии) смешивают с 99 граммами тростникового сахара (конечная концентрация 6,6% вес.%) и 85,5 мл активированного HQE 5% (об./вес.) (оптическая плотность ячейки =1,7). Затем pH корректируют до 5,5 при помощи 2 М лимонной кислоты.

Контроль ферментации

Смесь инкубируют при 36°C при прерывистом перемешивании в течение 96 ч. Во время способа ферментации контролируют pH потенциометром, общую титруемую кислотность (ТТА, %) определяли титрованием 0,1 Н NaOH до достижения pH 8,5. Из ТТА вычисляют процентное содержание молочной кислоты.

Условия разделения

Продукт ферментации представляет собой вязкий силос с интенсивной оранжевой окраской вследствие присутствия астаксантина. Силосную массу центрифугируют (5°C) при 1250 rpm (930 g) в течение 15 минут для получения хитина, жидких гидролизатов, а также пигментной пасты. Верхнюю фазу (пигментную пасту) отделяют вручную. Жидкие гидролизаты отделяют декантацией, осадок, состоящий из сырого хитина, промывают дистиллированной водой для отделения мелких твердых частиц. Полученную жидкость собирают и высушивают. Сырой хитин, жидкие гидролизаты и мелкие твердые частицы высушивают при 60°C. Все фракции хранят в защищенном от света месте.

Иные микробные композиции для получения HYTb и HYTc приведены в Таблице 2 ниже.

Таблица 2 Культуральные композиции Микроорганизм 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Bacillus subtilis X X X X   X X X   X Bacillus cereus X X   X   X   X   X Bacillus megaterium X X                 Azotobacter vinelandii X X   X   X   X   X Lactobacillus acidophilus X X X X X   X X X   Lactobacillus casei X X   X X     X X   Trichoderma harzianum X X X X   X X X   X

Rhizobiumjaponicum X X   X   X   X   X Clostridium pasteurianum X X     X X     X X Bacillus licheniformis X X X   X X X   X X Pseudomonas fluorescens X X X   X X         Bacillus thuringiensis X         X X X X X Streptomyces X       X X X X X X Nitrobacter X           X X X X Micrococcus X           X X X X Proteus vulgaris X           X X X X

Эти микроорганизмы, предпочтительно, получены из HQE и называются Bacillus subtilis ((SILoSil^® BS), Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008), Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008), Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008), Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), Bacillus thuringiensis штаммы HD-1 и HD-73 (SILoSil^® ВТ), Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) и Proteus (Bioderpac, 2008). Каждый из этих организмов может быть легко выделен из HQE и рекомбинирован для получения раскрытой микробной композиции, расщепляющей членистоногих для получения HYTb и HYTc.

HYTb содержит аминокислоты (приблизительно 12 вес %), хитозан (приблизительно 1,2 вес %), глюкозамин (приблизительно 1 вес %) и микроэлементы (приблизительно 6 вес %), включая кальций, магний, цинк, медь, железо и марганец. Он также содержит ферменты, такие как лактатные ферменты, протеазы, липазы, хитиназы среди прочих, молочную кислоту, полипептиды и другие углеводы. Удельная плотность HYTb, как правило, составляет приблизительно 1,050-1,054. Средний аминокислотный состав HYTb представлен ниже в Таблице 3.

Таблица 3 Аминокислотный состав сухих порошковых гидролизатов (мг на г сухого веса) Аминокислота Сухие порошковые гидролизаты Аспарагиновая кислота 38 Глутаминовая кислота 39 Серин 16 Гистидин 9 Глицин 28 Треонин 14 Аланин 36,1 Пролин 25,8 Тирозин 70 Аргинин 22,2 Валин 20 Метионин 16,4 Изолейцин 18,3 Триптофан 3,1 Лейцин 23 Фенилаланин 39 Лизин 13 Итого 431

В некоторых вариантах воплощения, HYTb может составлять второй компонент, который либо комбинируется с HYTa, либо используется отдельно путем добавления в почву и/или опрыскивания листвы.

Основной компонент HYTc - хитин. Он имеет среднюю молекулярную массу примерно 2300 дальтон и составляет приблизительно 64 вес % композиции. Приблизительно 6% HYTc составляют минеральные вещества, включая кальций, магний, цинк, медь, железо и марганец, приблизительно 24 вес % белков и 6% воды. Он имеет удельную плотность приблизительно 272 кг/м³. В некоторых вариантах воплощения, HYTc может составлять второй компонент, который либо комбинируется с HYTa, либо используется отдельно путем добавления в почву и/или опрыскивания листвы.

HYTa предпочтительно используется с HYTb и HYTc либо в комбинации, либо отдельно путем добавления в почву или опрыскивания листвы.

Микроорганизмам HYTa требуются микроэлементы кальций, магний, сера, бор, марганец, цинк, молибден, железо, медь, натрий и кремний. Эти важные микроэлементы часто могут быть получены при токсичных химических реакциях, недопустимых для сертифицированных органических продуктов. Поэтому предпочтительно, чтобы эти микроэлементы были получены из органического источника, такого как HYTb и/или HYTc.

Активация HYTa

Упомянутые выше микробные композиции могут использоваться для обработки почвы, семян, сеянцев и/или листвы растений. Однако HYTa перед использованием необходимо активировать.

В предпочтительных вариантах воплощения HYTa активируется инкубированием инокулята HYTa в водном растворе в течение 24-168 часов, чтобы позволить микроорганизмам вырасти и размножиться до использования в способе обработки почвы, семян, сеянцев и/или листвы растений. Условия инкубации влияют на общие начальные характеристики HYTa.

В одном варианте воплощения инокулят HYTa разводится водой в соотношении 1/100 и инкубируется при температуре приблизительно 36°C и pH 6,8-7,1 в течение приблизительно 24-168 часов (7 дней). Во время этой активации может необязательно использоваться HYTb. Азотфиксирующие микроорганизмы Azotobacter vinelandii и Clostridium pasteurianum размножаются в условиях пониженного содержания азота. Помимо этого по мере понижения концентрации кислорода размножаются Lactobacilli, включая Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus casei.

Количества колониеобразующих единиц (КОЕ) некоторых бактерий в активированном HYTa показаны ниже в Таблице 4:

Таблица 4 Azotobacter vinelandii 101050000 КОЕ/мл Clostridium pasteurianum 104275000 КОЕ/мл Bacillus subtilis 1100000 КОЕ/мл Bacillus cereus 25000 КОЕ/мл Bacillus megaterium 10000 КОЕ/мл Lactobacillus 500000 КОЕ/мл Nitrobacter 5000 КОЕ/мл Nitrosomonas 2500 КОЕ/мл Итого 206967000 КОЕ/мл

HYTa, полученный после подобного инкубирования, сохраняет положительные свойства HYTa, но особенно пригоден в качестве добавки к почве для почв, истощенных по азоту благодаря азотфиксирующим способностям Azotobacter vinelandii и Clostridium pasteurianum.

Если присутствуют или предполагается присутствие таких почвенных патогенов, как филаментные грибки рода Fusarium или нематоды, то HYTa может быть активирован в практически таких же условиях, но в присутствии хитина. Хитин стимулирует экспансию хитин-откликающихся микроорганизмов, таких как Pseudomonas fluorescens, Trichoderma harzianum. Bacillus thuringiensis, Streptomyces sp., Nitrobacter sp., Micrococcus sp. и Bacillus subtilis. HYTa, полученный в этих условиях, обладает противогрибковыми, фунгицидными, противонематодными, нематоцидными и инсектицидными свойствами по отношению к патогенам, содержащим хитин. Такие микробные композиции могут непосредственно вноситься в почву или наноситься на семена, сеянцы и/или листву растений. Подобные микробные композиции также обладают способностью фиксировать азот, как в упомянутом выше инкубировании в отсутствие хитина.

Помимо инкубирования с хитином HYTa может быть активирован хитином и аминокислотами. Предпочтительный источник хитина - HYTc. Если используется HYTc, то во время активации также присутствуют белки и минералы, находящиеся в HYTc.

Помимо этого, HYTa может быть активирован в присутствии аминокислот и хитозана. Предпочтительный источник аминокислот и хитозана - HYTb. Если используется HYTb, то во время активации также присутствуют глюкозамин и иные компоненты, находящиеся в HYTb.

Необязательно, HYTa может быть активирован в присутствии хитина, аминокислот и хитозана. Предпочтительный источник хитина - HYTc. Предпочтительный источник аминокислот и хитозана - HYTb. Если используются HYTb и HYTc, то во время активации также присутствуют иные компоненты, находящиеся в этих составах.

Использование Активированного HYTa

Активированный HYTa может использоваться сам по себе или в комбинации с другими компонентами, такими как хитин, хитозан, глюкозамин и аминокислоты, для обработки почвы, семян, сеянцев или листвы. В некоторых вариантах воплощения, комбинации этих компонентов могут наноситься в виде смеси. В иных вариантах воплощения они могут наноситься раздельно. В других вариантах воплощения компоненты могут наноситься в разное время.

В одном варианте воплощения активированный HYTa может наноситься на почву, семена или сеянцы, или использоваться для нанесения на листву путем прямого нанесения на листву. Однако, в случае присутствия патогенов растений, предпочтительно, чтобы микробная композиция содержала активированный HYTa, хитин и/или хитозан. Альтернативно, HYTa может быть активирован в присутствии хитина. Хитозан обладает бактерицидными, фунгицидными и антивирусными свойствами, а также способностью стимулировать рост растений и индуцировать резистентность растений к патогенам. В иных вариантах воплощения глюкозамин входит в состав микробной композиции.

В предпочтительном варианте воплощения активированный HYTa сам по себе или в комбинации с хитином (предпочтительно HYTc) и/или хитином, хитозаном и аминокислотами (предпочтительно, HYTb и HYTc) наносится на почву, семена, сеянцы и/или листву. Предпочтительно, чтобы HYTa использовался в комбинации с хитином, хитозаном, глюкозамином и аминокислотами. HYTc - предпочтительный источник хитина, a HYTb - предпочтительный источник хитозана, глюкозамина и аминокислот. Однако компоненты микробной композиции, а именно HYTa, хитин, хитозан, глюкозамин и аминокислоты, могут наноситься отдельно или в любой комбинации или подкомбинации. Они могут наноситься одновременно или последовательно, в любом заданном порядке. Однако предпочтительный способ нанесения - первичное нанесение всех компонентов одновременно. Нанесение вышеперечисленных компонентов обеспечивает непосредственное лечение патогенов растений, индукцию путей резистентности к патогенам растений, поддержку микроорганизмов HYTa, собственной непатогенной флоры почвы и растения.

Если почва первоначально обрабатывается микробным составом, содержащим только активированный HYTa, то микроорганизмы, присутствующие в композиции, имеют возможность заселить почву и изменить его таксономический состав. В некоторых ситуациях первичная колонизация HYTa предоставляет растению малое количество питательных веществ или не предоставляет их. В таких случаях важно поддерживать резерв питательных веществ для поддерживания как роста микроорганизмов во время колонизации ризосферы, так и роста растений в почве. Может потребоваться повторить внесение HYTa, в зависимости от цикла роста растения и режима подкормок. В других случаях может быть достаточным произвести дополнительные внесения аминокислот, хитина и/или хитозана, например HYTb и HYTc, в обработанную ранее почву.

Если HYTa используется в комбинации с, например, HYTb и HYTc, добавочные питательные вещества становятся доступными микроорганизмам из HYTa и растениям, находящимся в обработанной почве.

В Таблице 5 представлена типичная четырнадцатинедельная программа внесения HYTa, HYTb и HYTc на культуры с капельным поливом, культивируемые в почве. Величины указаны из расчета на гектар. Для HYTa и HYTb величины приведены в литрах на неделю. Для HYTc величины приведены в килограммах на неделю.

Таблица 5 Л/кг/Неделя W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7 W8 W9 W10 W11 W12 W13 W14 HYT-A 3 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 HYT-B 10 5 0 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 HYT-C 1     1       1       1    

Ритм, с которым микробная композиция вводится в оросительную систему, должен быть таким, чтобы микробная композиция могла достичь корневой системы и оставаться там в течение ночи, когда система выключена. Для максимального использования HYTc он должен вводиться одновременно с HYTa в виде смеси. Протокол должен исполняться все время, в течение которого растение находится в производстве. Данный протокол охватывает все стадии развития растения, включая прорастание, образование корней, рост растения, цветение, завязывание плодов, формирование плодов, сбор урожая и повторный сбор урожая. Протокол разработан для обеспечения максимального потенциального урожая и охватывает аспекты питания, аспекты биостимулирования и защиты от заболеваний, таких как нематодные и грибковые.

Способ может осуществляться путем контактирования с почвой с получением обработанной почвы. В некоторых случаях способ повторяют. В некоторых случаях растения, сеянцы или семена уже присутствуют в почве до обработки микробной композицией. В других случаях растения, сеянцы или семена пересаживаются в почву после обработки микробной композицией.

В общем, до внесения определяется количество обрабатываемых гектаров или акров. Затем рекомендованное количество активированного HYTa на гектар или акр умножается на обрабатываемую площадь и разводится количеством воды, достаточным для орошения или обрызгивания почвы или культуры обрабатываемой области. Аналогичной процедуре можно следовать для жидкого HYTb. Поскольку HYTc является твердым веществом, он может вноситься непосредственно в почву или в виде суспензии в воде. Перед использованием предпочтительно, чтобы HYTc был измельчен до частиц микронного размера.

Способ может осуществляться для неплодородной почвы. К таким почвам, как правило, относятся те, для которых наблюдаются: низкая способность к катионному обмену, низкая водоудерживающая емкость, низкое содержание органических веществ и низкое количество доступных питательных веществ. В общем, неплодородные почвы не поддерживают сильного роста растений и/или дают низкие урожаи.

Для непочвенных систем, таких как гидропоника, применяется аналогичный протокол, но с дневным распределением, следуя программе орошения с повышением плодородности.

Микробные композиции могут использоваться с любым растением, включая, но не ограничиваясь ими, люцерну, банан, ячмень, брокколи, морковь, кукурузу, огурец, чеснок, виноград, лук-порей, дыни, лук, картофель, малину, рис, сою, кабачки, землянику, сахарный тростник, помидоры и арбуз.

При внесении в качестве добавки в почву микробная композиция, содержащая HYTa, хитин, аминокислоты и хитозан, повышает сбор урожая, в среднем, на 25%-55% в сравнении с 15-25% повышением сборов урожая, наблюдаемым при использовании Е2001. От Karl Co. SA de CV, Навохоа, Сонора, Мексика.

Микробные составы также могут обеспечить понижение используемого количества хитина. К примеру, ранее в области техники хитин использовался в качестве добавки к почве. Как правило, на гектар вносилось приблизительно 600 кг хитина. Однако положительные эффекты от этой операции не наблюдаются в течение шести месяцев. Если HYTa был активирован в присутствии хитина и затем смешан с хитином и внесен в виде почвенной добавки, то положительные эффекты наблюдаются спустя семь дней с использованием всего лишь 4-6 кг хитина на гектар.

Хотя раскрытие направлено в первую очередь на использование раскрытых микробных композиций в сельскохозяйственных целях, такие композиции или их компоненты и способы также могут использоваться в садовых целях для повышения продукции листвы и цветов и снижения использования обычных инсектицидов и фунгицидов.

Если активированный HYTa вносится в почву, на семя, сеянец или листву, то получаются обработанная почва, обработанное семя, обработанный сеянец, обработанная листва или обработанные растения. HYTa - новая микробная композиция. Таким образом, почва, семя, сеянец, листва и растения, обработанные HYTa, также являются новыми.

Обработанная почва определяется как почва, содержащая один или более микроорганизмов, которые уникальны для HYTa, диспергированного в обработанной почве. Такие микроорганизмы могут быть обнаружены в обработанной почве генетически с использованием BioChip, детектирующего популяции микроорганизмов по ДНК. См., например, Патентную Публикацию США 2007/0015175, включенную сюда посредством ссылки. Могут использоваться и иные способы, известные специалистам в данной отрасли техники, например, ПЦР. Особенно предпочтительными микроорганизмами в HYTa являются Bacillus subtilis (SILoSil^® BS), Bacillus thuringiensis штамм HD-1, Bacillus thuringiensis штамм HD-73 (SILoSil^® ВТ) и Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), каждый из которых может быть выделен из депозита HYTa или получен от Biotecnologia Agroindustrial S.A. DE C.V., Морелия, Мичоакан, Мексика. Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) наиболее предпочтителен, поскольку он важен при активации HYTa, во время которой он обуславливает межкомпонентное взаимодействие других микроорганизмов в составе HYTa. Идентификация одного или более из этих микроорганизмов может помимо этого быть скомбинирована с другими микроорганизмами в HYTa, при необходимости, для подтверждения наличия HYTa или того, что HYTa присутствовал. Каждый из Bacillus subtilis (SILoSil^® BS), Bacillus thuringiensis штаммы HD-1 и HD-73 (SILoSil^® ВТ) и Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) был депонирован в ATCC _____ под номерами Патентных Депозитов ________, ______ и

'_______, соответственно.

Обработанные семя, сеянцы, листва и растения определяются аналогичным образом. В этих случаях микроорганизмы HYTa обнаруживаются на поверхностях обработанных семени, сеянцев, листвы и растений.

При использовании здесь, термин «состоящий в основном из» в применении к HYTa, HYTb и HYTc обозначает любой из HYTa, HYTb и/или HYTc сам по себе или в комбинации без дополнительных микроорганизмов.

Пример 1

В следующем примере сравнивается рост растений Персидского огурца с использованием HYTa, HYTb и хитозана в сравнении с контрольными, не получавшими обработки HYTa, HYTb и хитозаном.

Во время развития проростков Персидского огурца семена были инкубированы три часа в смеси из 1 литра воды и 250 граммов HYTc. Были смешаны пакет сфагнума и 250 граммов микронизированного 200 меш (диаметром приблизительно 75 микрон) хитина (HYTc) на пакет сфагнума. Семена были высажены в смесь сфагнум/хитин при 18-24°C. Развитие пятидневного растения, обработанного HYTc, было сравнимо с развитием 9-дневного необработанного растения.

Обработанные и контрольные сеянцы были пересажены в почву площадью 1 гектар, в теплицу. HYTa и контрольная почва обрабатывались так, как указано ниже в Таблице 6.

Таблица 6   HYT-A Контроль Азотное удобрение 150 кг 280 кг Карбонат калия 160 кг 250 кг Кальций 80 кг 130 кг Фосфор 200 кг 320 кг Магний 20 кг 45 кг Микроэлементы 10 литров 22 литра Фунгициды 0 20 литров Инсектициды 0 16 литров Садовое мыло, изготовленное из пальмового и оливкового масел 10 литров 0

Почву с обработанными HYTa сеянцами с течением времени обрабатывали 2 литрами HYTa и 7 литрами HYTb.

HYTa разбавляли 200 литрами воды и активировали в отсутствии HYTb или HYTc.

На вторую неделю в почву вносили один литр HYTa и три литра HYTb, а листву HYT - обработанных растений обрабатывали двумя литрами HYTb.

У них наблюдалось существенное повышение урожайности огурцов в сравнении с контрольными. С контрольных растений было собрано 3000 двадцатипятифунтовых коробок, а с обработанных HYT растений было собрано 4300 коробок. Соответственно, в данном примере показано существенное повышение урожая при использовании HYT и понижение количества потребовавшихся удобрений, инсектицидов, фунгицидов и иных компонентов.

Пример 2

Септориоз листьев и бурая пятнистость, а также инфекция помидоров Roma и помидоров beefsteak возбудителем Phytophthorainfestans могут лечиться по протоколу, представленному в Таблице 7. Все величины указаны из расчета на гектар.

Таблица 7   Начало В день Продолжительность Нанесение HYTa 3 литра 0 10 дней Опрыскивание HYTa 2 литра 0 10 дней Капельное HYTc 20 кг 2 кг 10 дней Опрыскивание HYTc 500 граммов 0 0 Капельное орошение HYTb 1 литр 1 литр 10 дней Опрыскивание

HYTa разбавлялся 200 литрами воды и активировался с HYTc.

Такая обработка приводила к контролированию этих инфекций.

Пример 3

10 акров помидоров Roma были обработаны 4 литрами HYTa, 10 литрами HYTb и 30 фунтами хитина.

Протокол нанесения был следующим, из расчета на 10 акров:

Таблица 8 литров/фунтов/неделя W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7 *HYT- 3 0 0 0 1 0 0 **HYT- 2 0 0 0 1 0 0

*HYT- 6   5   5 0   **HYT- 4   2   2     *HYT-C 5       5     ** HYT-C 10   5   5     * Система орошения: Опрыскивание (листвы) ** Система орошения: Капельная Лента

Величины приведены в литрах для HYTa и HYTb и в фунтах для HYTc. Урожайность составила 46 тонн помидоров на акр в сравнении с 31 тоннами на акр для контроля. Это равно 36%-му повышению урожайности.

Пример 4

Нематода Корневых Наростов Meloidogyne spp. и белая гниль, вызванная Sclerotiniasclerotiorum, были признаны проблемами при выращивании моркови. На Фигуре 2А показы листва и корнеплоды моркови, полученные на такой почве.

Для обработки гектара применялся следующий протокол. Один кг HYTc вносился в почву в момент пересадки. Двумя неделями позже вносились 1 кг HYTc и 1,5 литра HYTa. Двумя неделями позже вносились 2 кг HYTc и 1 литр HYTb. Тридцатью днями позже вносились 1,5 кг HYTc, 1 литр HYTb и 1 литр HYTa.

После обработки корневые наросты, вызванные нематодной инфекцией, более не наблюдались на моркови. Белая гниль, вызванная белой плесенью, также не наблюдалась на моркови после обработки.

Пример 5

HYTa, HYTb и HYTc могут использоваться для устранения и взятия под контроль ROYA (Puccinia dracunculind) на Тархуне (Artemisia dracunculus L.). Всего на каждый гектар вносили 6 литров HYTa, 15 литров HYTb и 900 граммов HYTc.

Применялся следующий протокол:

Таблица 9 Продукт Дозировка Время Нанесение HYTa 2 литра 5 дней опрыскивание HYTb 5 литров 5 дней опрыскивание HYTc 300 5 дней опрыскивание

Протокол повторялся два раза. После такой обработки на обработанной листве понизилось повреждение, вызываемое ROYA.

Пример 6

В данном примере представлен обзор тестов, проведенных совместно с Международным Центром Селекции Кукурузы и Пшеницы и под его контролем (известен под названием «CIMMYT», далее обозначается этим сокращением) http://www.cimmyt.org/.

В данном примере представлены конечные данные по урожаю при различных обработках. Персонал CIMMYT осуществлял сбор образцов в соответствии с его научной методологией и информацией.

Эти тесты были разработаны для демонстрации следующих ключевых преимуществ использования HYTa самого по себе или в комбинации с HYTb: (1) способность поддерживать высокую скорость роста при различных режимах внесения удобрений и минеральных веществ, (2) улучшение показателей системы при использовании HYTa или HYTa в комбинации с HYTb и (3) способность восстанавливать качество почвы и повышать уровень плодородности при повторном использовании программ HYT.

Целью теста было определить влияние уровней обработки почвы и обработки соломы для двух различных типов среды почвы (соседского и аллювиального), исследовать эффективность различных форм, типов и доз минеральных удобрений в комбинации с HYT Agrinos для более эффективного использования этого сырья с целью повышения прибыльности производителя от выращивания пшеницы.

Области тестирования

Данные испытания проводились на сельскохозяйственном поле, принадлежащем собственнику, широко использующему в развитии улучшающие почву продукты, а также для получения товарных культур. Это сельскохозяйственное поле последние одиннадцать лет обрабатывалось Е2001 и родственными продуктами от Karl Co. SA de CV, Навохоа, Сонора, Мексика и, впоследствии, HYTa и HYTb.

Область испытаний была обозначена CIMMYT кодом купона Z 702 Module Agimos-CIMMYT и находилась в ирригационном районе №38, модуле 4, секции 15, оросительные баки 1049-0 и 1115-0.

Одна из главных характеристик продуктов HYT™ - способность улучшать (противодействовать деградации) сельскохозяйственные земли при продолжительном использовании. Чтобы продемонстрировать эту характеристику продукта HYT™, в испытания была включена область, не обрабатывавшаяся минеральными веществами, Е 2001 или любым продуктом HYT. Характеристики урожая растений в этой области полностью зависят от состояния почвы до высадки.

Другая информация

- Типы сельскохозяйственных растений: пшеница

- Сорт: ATIL (твердая пшеница)

- Дата посева: 23 Декабря в сухую почву и влажную почву областей 2 и 1 Фигуры 3. Высадка была задержана до 14 Января следующего года вследствие наводнения, вызванного ирригационной проблемой на соседнем участке.

- Дата сбора урожая: 20-23 Мая (приблизительно спустя 4 месяца после высадки)

- Размер используемой области: 15 гектаров

- Минеральные удобрения: использовались в качестве основы подкормки, которая признана наилучшей практикой для деоссификации минеральных питательных веществ NPK, в общем принятой в регионе (BNFP= Наилучшая практика подкормки азотом).

Таблица 10 Минеральные подкормки и протоколы HYT™ Обработка Описание Первое внесение Второе внесение Третье внесение Обработка 1 Контрольная область; без удобрений 50% BNFP+
HYTa и HYTb 0 единиц NPK, 0 литров HYTa или HYTb 103 единицы N,
52 единицы Р, 1 литр HYTa 0 единиц NPK, 0 литров HYTa или HYTb 1 литр HYTa;
1 литр HYTb 0 единиц NPK, 0 литров HYTa или HYTb 1 литр HYTa; 1 литр HYTb Обработка 2 Обработка 3 HYTa+HYTb 1 литр HYTa 1 литр HYTa; 1 литр HYTb 1 литр HYTa; 1 литр HYTb Обработка 4 100% BNFP 149 единиц N, 52 единицы Р 61 единица N

Вдобавок к основным протоколам, описанным выше, для некоторых областей были проведены отдельные проверки и сборы урожаев с некоторым дополнительным компонентом, с целью получения дополнительных эталонных точек и расширения возможностей анализа. Разработанный тест был следующим:

TRT 5: Биологическая обработка HYT более 100% традиционной программы минеральных подкормок: первичное внесение: 1 литр HYT+103-52-0 (NPK), второе внесение 1 литр HYT+1 литр HYT В+61-0-0 (NPK), третье введение 1 литр HYT В. Данная последующая обработка была рекомендована CIMMYT для наблюдения показателей зерна пшеницы в зависимости от использования традиционной программы с более полной программой с минеральными подкорками азотом и HYT а+b. Для этой обработки была выделена лишь область в 4 ряда, информацию собирал лишь персонал CIMMYT.

Диаграмма испытуемой области показана на Фигуре 1, «TRT» обозначает описанную выше обработку.

Внешние факторы в испытуемой области

Некоторые области испытуемой зоны пострадали от внешних факторов. Результаты для этих областей были исключены из итоговых результатов урожая для надежного сравнения. См. Фигуру 2. Внешние факторы были такими:

Выделенная область 1 (Зона 1): Использовавшийся сорт пшеницы очень чувствителен к «Chahuistle». Вследствие близости областей 1 и 5 к высоковольтным электролиниям самолет не мог наносить продукт на эти области, поэтому на данных областях отмечалась высокая заболеваемость патогеном, что обусловило значительное понижение потенциальных показателей.

Выделенные области 1 и 2 (Зона 2) пострадали от наводнения вследствие ирригационных проблем на окружающих участках, что привело к задержке высадки на 20 дней и поражению «Chahuistle».

Выделенные области 9 и 10 (Зона 3) пострадали от неравномерного орошения вследствие топографии участков, что повлияло на неравномерность урожаев высоких и низких областей по причине неравномерного орошения, влияющего на средние показатели.

Таблица 11 Финальные данные по общему урожаю при различных обработках Участок метрических тонн на гектар Участок метрических тонн на гектар Область 1 4,1* Область 9 5,4/6,6* Область 2 4,1* Область 10 б,2* Область 3 7,8 Область 11 6,8 Область 4 8,3 Область 12 8,3 Область 5 4* Область 13 8,3 Область 6 7,1 Область 14 7,7 Область 7 7,4 Область 15 8,2 Область 8 7,9 Область 16 9,0 * на данный результат повлияли внешние факторы

Таблица 12 Результаты испытания Показатели       Тонн/Га* Глинистая* Аллювиальная* Среднее* 100% BNFP 7,45 7,40 7,4 (Обработка 4)       50% BNFP+HYTa и HYTb 7,40 7,20 7,8 (Обработка 2)       Контроль 7,90 8,30 8,2 (Обработка 1)       только HYTa и HYTb 8,30 6,50 8,7 (Обработка 3)       * результаты для областей, на которые повлияли внешние факторы, не включены

В сравнении со средним урожаем пшеницы, ожидаемым в регионе, повторное долгосрочное использование Е 2001 и HYT™ дало существенное повышение в 36% в сравнении с проведением только стандартных подкормок. См. Фигуру 3. Это наблюдалось без добавления дополнительных элементов NPK или HYT во время данного сельскохозяйственного цикла, свидетельствуя о том, что предшествующие внесения Е 2001 и HYT уже восстановили активность и биоразнообразие колоний благоприятных почвенных микроорганизмов, создавая высокие уровни органической материи и питательных веществ, имеющихся в почве.

При добавлении HYTa и HYTb в круговорот почва-растение повышается способность почвы предоставлять питательные вещества растениям, увеличивается способность к биологической фиксации азота. См. Фигуру 3.

Различные комбинации стандартных режимов подкормки сами по себе и в комбинации с HYTa и HYTb не улучшают результаты в сравнении с использованием HYTa и HYTb. Это может быть связано с наличием достаточного количества накопленных питательных веществ в виде биомассы в почве с предыдущих лет.

Если в почве и экосистеме достаточно доступных питательных веществ, доступных через биологическую фиксацию азота и/или вследствие высоких уровней биомассы в почве, добавление большего количества удобрения (NPK) дестабилизирует биологический баланс и воздействует на схемы поглощения питательных веществ из растений, возможно, изменяя емкость культивации, обусловленную внутренней программой питания, использующей ресурсы, доступные корням из почвы и активной биомассы.

Пример 7

Полевые эксперименты были проведены в Индии, Пантнагаре, в рамках проекта, озаглавленного «Агрономическое оценивание HYT (HYTa, HYTb и HYTc и препарата для опрыскивания листьев Suryamin). Детальные сведения приведены ниже.

Сельскохозяйственное растение ПШЕНИЦА Применяемая схема Со случайными блоками Повторений 3 Дата посева 19.11.2010 Сорт PBW-550 Общая площадь участка 6,0 м×4,0 м=24 м² Обработок 12

Детальные сведения об обработках

Т-1: Рекомендованная доза NPK

Т-2: Т-1+ внесение HYTa (активированного 72 ч) в почву @ 1 л в момент посева

Т-3: Т-1+ нанесение HYTb на листья @ 2 л во время начала цветения/разворачивания метелок

Т-4: Т-1+ внесение HYTc в почву @ 2 кг в момент посева

Т-5: Т-1+HYTa (активированного 72 ч) @ 1 литр +HYTc @ 2 кг/га, внесение в почву при посеве

Т-6: Т-1+ нанесение HYTb на листья @ во время начала цветения/разворачивания метелок +2 л+HYTc @ 2 кг/га, внесение в почву при посеве

Т-7: Т-1+HYTa (активированного 72 ч) @ 1 л+HYTb @ 2 л во время начала цветения/разворачивания метелок +HYTc @ 2 кг/га, внесение в почву при посеве

Т-8: 1/2 дозы NPK+HYTa (активированного 72 ч) @ 1 л + нанесение HYTb на листья @ 2 л+HYTc @ 2 кг/га, внесение в почву при посеве

Т-9: Т-1+внесение HYTa (активированного 72 ч) в почву @ 2 л/га + нанесение HYTb на листья @ 5 л+HYTc @ 5 кг/га при посеве

Т-10: 1/2 дозы NPK+HYTa (активированного 72 ч) @ 2 л + нанесение HYTb на листья @ 5 л+HYTc @ 5 кг/га, внесение в почву при посеве

Т-11: Т-1+1 л/га Shriram Suryamin, нанесение на листья при начале цветения

Т-12: Т-1+ по 1 л/га Shriram Suryamin, нанесение на листья при кущении и начале цветения.

Биологический урожай, урожаи зерна и соломы показаны ниже в Таблице 13.

Таблица 13 Влияние различных органических продуктов HYT на биологический урожай, урожаи зерна и соломы для пшеницы Обработки Биологический урожай (100 кг/га) Урожай зерна (100 кг/га) Урожай соломы (100 кг/га) T-1: Рек.NPK 82,63 32,00 50,63 Т-2: T₁+HYT-A @ 1,0 л/га 85,43 33,99 51,50 Т-3: T₁+HYT-B @ 2,0 л/га 87,50 35,30 52,20 Т-4: T₁+HYT-C @ 2,0 кг/га 76,40 31,33 45,07 T-5: T₁+HYT-A+C 87,63 37,90 49,73 Т-6: T₁+HYT-B+С 84,53 34,80 49,73 Т-7: T₁+HYT-A+В+С 86,93 35,80 51,93 T-8: 1/2 NPK+HYT-A+В+С 56,90 27,13 29,77 T-9: T₁+HYT-A+B+C (большая доза) 88,60 40,27 48,33 Т-10: 1/2 NPK+HYT-A+В+С (большая доза) 58,37 28,30 30,07 Т-11: Т₁+Suryamin (одно опрыскивание) 82,87 32,93 49,93 T-12: T₁+Suryamin (два опрыскивания) 83,57 33,17 50,40 S.Em (5%) 4,33 0,92 4,27 CD (5%) 12,68 2,71 12,54

В Таблице 14 сравниваются результаты урожаев зерна при различных обработках разными компонентами и комбинациями HYT.

Таблица 14   Урожай зерна, превышающий 32 кг/гектар CD 2,71 Стандартное отклонение 0,92 Контроль 0     HYTa 1,99 NS * HYTb 3,3 * * HYTc -0,67 NS NS HYTa+с 5,9 * * HYTb+с 2,8 * *

HYTa+b+с (1 л/2 л/2 кг) 3,8 * * HYTa+b+с (высокая доза а, b и 8,27 * * NS= Статистически незначимо в сравнении с контролем *= Статистически значимо в сравнении с контролем

Как видно, при раздельном применении HYTa и HYTb повышали урожай зерна на 1,99 и 3,3 кг на гектар, соответственно, в то время как использование только HYTc понижало урожай. При комбинировании HYTa с HYTc повышение урожая составило 5,9 кг на гектар, что превышает сумму результатов раздельного использования. При использовании HYTb и HYTc наблюдалось повышение в 2,8 кг на гектар, а при использовании HYTa, HYTb и HYTc наблюдалось повышение в 3,8 кг на гектар. Самое большое повышение выхода зерна наблюдалось при использовании HYTa, HYTb и HYTc в наивысших показанных дозах. Это дало более чем 25%-ное повышение урожая зерна в сравнении с контролем, а именно на 8,3 кг на гектар.

Пример 8

В данном примере представлены результаты выращивания кабачков на неплодородной почве.

В этих экспериментах сеянцы кабачков высаживались в 5-галлонные горшки с неплодородным песком «Superstition». Комбинации HYT А, В и С вносились так, как указано в Таблице 15 Сеянцы были высажены 21 Декабря, сбор урожая начался 20 Января и продолжался до 27 Февраля следующего года.

Таблица 15 Дата Объемы обработок 16 Декабря 200 мл активированного HYT А, 10 мл HYT В и 200 г HYT С на горшок. 23 Декабря 10 мл HYT В на горшок. 30 Декабря 5 мл HYT В на горшок. 5 Января 5 мл HYT А и 5 мл HYT В на горшок. 19 Января 10 мл HYT В на горшок. 27 Января 10 мл HYT А и HYT В на горшок.

3 Февраля 10 мл HYT В на горшок. 10 Февраля 10 мл HYT А и HYT В 17 Февраля Внесли по 5 мл HYT А и 5 мл HYT В в каждый горшок. 25 Февраля Внесли по 5 мл HYT В в каждый горшок. 1 Марта Внесли по 5 мл HYT А и 5 мл HYT В в каждый горшок.

Результаты представлены в Таблице 16.

Таблица 16 Обработка Урожай (г/горшок) Контроль 0 HYTa 251,6 HYTb 137,9 HYTc 62,6 HYTa+HYTb 472,1 HYTa+HYTc 0 HYTb+HYTc 0 HYTa+HYTb+HYTc 62,3 Стат. А ** В ** С NS A*B NS A*C ** В*С NS NS - не значимо при Р 0,05. *, ** - статистически значимо при Р<0,05 и Р<0,01, соответственно.

Как видно, наблюдалось существенное повышение урожая кабачков цуккини при раздельном использовании HYTa и HYTb и при использовании HYTa и HYTb в комбинации.

Пример 9

Для обработки дынь применялся следующий протокол.

Таблица 17 ПРОДУКТ СТАДИЯ ▶ НАЧАЛО ЦВЕТЕНИЕ СОЗРЕВАНИЕ 15 ДНЕЙ СПУСТЯ ГОТОВНОСТЬ К СБОРУ HYT-a НАНЕСЕНИЕ ▼ Доза (кг или л/га)                                 в землю 3 0,3 0,25       1     0,5   0,25 0,25       HYT-b на листья     1   1   1   1   1   1       в землю 3 1 1       3     2   2 2      

Результаты представлены в Таблице 18 и на Фигуре 4.

Таблица 18 ПРИ ОБРАБОТКЕ HYTa И HYTb СОБРАНО ИНФОРМАЦИЯ, НА ГА РАЗМЕР ШТУК ФУНТОВ КОРОБОК   ШТУК ФУНТОВ КОРОБОК 9 299 1289,860 33   7407 31958,395 823 12 838 2859,835 70   20790 71007,580 1733 15 543 1719,652 36   13593 43059,160 906 18 241 604,131 13   6074 15266,914 337 ИТОГО 1921 64731 53   47864 161292 3799   БЕЗ ОБРАБОТКИ СОБРАНО ИНФОРМАЦИЯ, НА ГА РАЗМЕР ШТУК ФУНТОВ КОРОБОК   ШТУК ФУНТОВ КОРОБОК 9 181 727936 20   4481 18026,691 498 12 493 1650,330 41   12247 41030,815 1021 15 463 1489,587 31   11568 37168,321 771 18 176 465,597 10   4432 11725,728 246 ИТОГО 1313 4333 102   32728 107952 2536 ПРОЦЕНТНОЕ ПОВЫШЕНИЕ НА ГА 46,25% 49,41% 49,81%

Пример 10

Тыквы выращивались согласно протоколу ниже.

Таблица 19 ПРОДУКТ НАНЕСЕНИЕ ДОЗА НА ГЕКТАР 03/07 03/10 03/18 04/04 04/11 04/18 Hyt-a В почву 2                           Hyt-b На листья   1 1 3 1 1   В почву 1 1 1   1 1

Результаты представлены в Таблице 19.

Таблица 20 РАЗМЕР КОРОБОК/ГА РАЗНИЦА В КОЛИЧЕСТВЕ КОРОБОК/ГА РАЗНИЦА В % КОНТРОЛЬ ОБРАБОТАННЫЕ X 188 228 40 17,54% XX 63 145 82 56,55% XXX 47 95 48 50,52 BRUCE 29 30 1 3,33%

Пример 11

Испытание HYTa и HYTb было проведено в Норвегии на картофеле. Исследуемые препараты с HYTa и HYTb и без них вносились совместно с 50 или 100 кг Азотного удобрения/га. Пестициды использовались в обычных количествах.

При начале колошения (14 Июня) на декар вносились 0,2 литра HYTa и 0,6 литров HYTb. После последнего внесения навоза (20 Июля) на декар вносились 0,2 литра HYTa, 0,2 литра HYTb и 50 граммов HYTc. Результаты представлены на Фигуре 5.

При использовании HYTa и HYTb наблюдалось повышение урожая на 17% в сравнении с контролем. Помимо этого растения, обработанные HYTa и HYTb, в меньшей степени поражались фитофторозом в сравнении с контрольными.

Предложены варианты микробной композиции и комбинации для повышения урожайности растений. Микробная композиция содержит HYTa и HYTb, либо HYTa и HYTc, либо HYTa, HYTb и HYTc. Комбинация состоит из HYTa и HYTb, либо HYTa и HYTc, либо HYTa, HYTb и HYTc. При этом HYTa представляет собой консорциум микроорганизмов, депонированный в АТСС с депозитным обозначением РТА-10973, HYTb является жидкой фракцией, полученной ферментацией хитинсодержащих членистоногих с помощью HQE (АТСС РТА-10861), HYTc является твердой фракцией, полученной ферментацией хитинсодержащих членистоногих с помощью HQE. Предложены также варианты активированного HYTa, полученного инкубацией HYTa в присутствии HYTb либо HYTc в течение 24-168 ч. Указанные варианты композиций, комбинации или активированного HYTa используют в способе повышения урожайности растений путем обработки почвы, семени, сеянца или листвы растения. 10 н. и 18 з.п. ф-лы, 5 ил., 20 табл., 11 пр.

1. Микробная композиция для повышения урожайности растений, содержащая HYTa и HYTb, где указанный HYTa представляет собой консорциум микроорганизмов, полученный из образцов плодородной почвы, депонированный в Американской коллекции типовых культур (АТСС) с депозитным обозначением РТА-10973, a HYTb представляет собой жидкую фракцию, полученную ферментацией хитинсодержащих членистоногих с помощью HQE (АТСС РТА-10861).

2. Микробная композиция для повышения урожайности растений, содержащая HYTa и HYTc, где указанный HYTa представляет собой консорциум микроорганизмов, полученный из образцов плодородной почвы, депонированный в Американской коллекции типовых культур (АТСС) с депозитным обозначением РТА-10973, a HYTc представляет собой твердую фракцию, полученную ферментацией хитинсодержащих членистоногих с помощью HQE (АТСС РТА-10861).

3. Микробная композиция для повышения урожайности растений, содержащая HYTa, HYTb и HYTc, где указанный HYTa представляет собой консорциум микроорганизмов, полученный из образцов плодородной почвы, депонированный в Американской коллекции типовых культур (АТСС) с депозитным обозначением РТА-10973, где указанный HYTb представляет собой жидкую фракцию, полученную ферментацией хитин-содержащих членистоногих с помощью HQE (АТСС РТА-10861), а указанный HYTc представляет собой твердую фракцию, полученную ферментацией хитинсодержащих членистоногих с помощью HQE (АТСС РТА-10861).

4. Активированный HYTa для повышения урожайности растений, полученный инкубацией HYTa в присутствии HYTb в течение 24-168 часов, где указанный HYTa представляет собой консорциум микроорганизмов, полученный из образцов плодородной почвы, депонированный в Американской коллекции типовых культур (АТСС) с депозитным обозначением РТА-10973, а указанный HYTb представляет собой жидкую фракцию, полученную ферментацией хитин-содержащих членистоногих с помощью HQE (АТСС РТА-10861).

5. Способ повышения урожайности растений, включающий обработку почвы, семени, сеянца или листвы растения с HYTa (АТСС РТА-10973), активированным HYTa по п.4, или композицией по любому из пп.1-3.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что он дополнительно включает обработку почвы, семени, сеянца или листвы растений, по меньшей мере, одним из числа HYTa, HYTb или HYTc.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что он дополнительно включает обработку почвы, семени, сеянца или листвы растений, по меньшей мере, двумя или несколькими из числа HYTa, HYTb или HYTc.

8. Способ по п.5, отличающийся тем, что он дополнительно включает обработку почвы, семени, сеянца или листвы растений с помощью HYTa, HYTb и HYTc.

9. Способ по п.5, отличающийся тем, что обработка почвы производится для того, чтобы получить обработанную почву.

10. Способ по п.5, отличающийся тем, что дополнительно включает обработку обработанной почвы или листвы растений в обработанной почве, по меньшей мере, одним или несколькими из числа HYTa, HYTb или HYTc.

11. Способ по п.5, отличающийся тем, что производится обработка листвы растений для получения обработанной листвы.

12. Способ по п.5, отличающийся тем, что он дополнительно включает обработку обработанной листвы растений или почвы, содержащей растение с обработанной листвой, с одним или несколькими из числа HYTa, HYTb или HYTc.

13. Способ по п.5, отличающийся тем, что растения, сеянцы или семена присутствуют в почве до этапа обработки.

14. Способ по п.5, отличающийся тем, что производится обработка растений, сеянцев или семян, которые после этого переносятся в почву.

15. Активированный HYTa для повышения урожайности растений, полученный инкубацией HYTa в присутствии HYTc в течение 24-168 часов, где указанный HYTa представляет собой консорциум микроорганизмов, полученный из образцов плодородной почвы, депонированный в Американской коллекции типовых культур (АТСС) с депозитным обозначением РТА-10973, а указанный HYTc представляет собой твердую фракцию, полученную ферментацией хитин-содержащих членистоногих с помощью HQE (АТСС РТА-10861).

16. Комбинация для повышения урожайности растений, состоящая преимущественно из HYTa и HYTb, где указанный HYTa представляет собой консорциум микроорганизмов, полученный из образцов плодородной почвы, депонированный в Американской коллекции типовых культур (АТСС) с депозитным обозначением РТА-10973, а указанный HYTb представляет собой жидкую фракцию, полученную ферментацией хитин-содержащих членистоногих с помощью HQE (АТСС РТА-10861).

17. Комбинация для повышения урожайности растений, состоящая преимущественно из HYTa и HYTc, где указанный HYTa представляет собой консорциум микроорганизмов, полученный из образцов плодородной почвы, депонированный в Американской коллекции типовых культур (АТСС) с депозитным обозначением РТА-10973, а указанный HYTc представляет собой твердую фракцию, полученную ферментацией хитин-содержащих членистоногих с помощью HQE (АТСС РТА-10861).

18. Комбинация для повышения урожайности растений, состоящая преимущественно из HYTa, HYTb и HYTc, где указанный HYTa представляет собой консорциум микроорганизмов, полученный из образцов плодородной почвы, депонированный в Американской коллекции типовых культур (АТСС) с депозитным обозначением РТА-10973, указанный HYTb представляют собой жидкую фракцию, полученную ферментацией хитин-содержащих членистоногих с помощью HQE (АТСС РТА-10861), а указанный HYTc представляет собой твердую фракцию, полученную ферментацией хитин-содержащих членистоногих с помощью HQE (АТСС РТА-10861).

19. Способ повышения урожайности растений, включающий обработку почвы, семени, сеянца или растительной листвы с комбинацией по любому из пп.16-18.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что дополнительно включает обработку почвы, семени, сеянца или листвы растений, по меньшей мере, с одним из числа HYTa, HYTb или HYTc.

21. Способ по п.19, отличающийся тем, что он дополнительно включает обработку почвы, семени, сеянца или листвы растений, по меньшей мере, с двумя или несколькими из числа HYTa, HYTb или HYTc.

22. Способ по п.19, отличающийся тем, что он дополнительно включает обработку почвы, семени, сеянца или листвы растений с помощью HYTa, HYTb и HYTc.

23. Способ по п.19, отличающийся тем, что обработка почвы производится для того, чтобы получить обработанную почву.

24. Способ по п.19, отличающийся тем, что он дополнительно включает обработку обработанной почвы или листвы растений в обработанной почве, по меньшей мере, одним или несколькими из числа HYTa, HYTb или HYTc.

25. Способ по п.19, отличающийся тем, что производится обработка листвы растений для получения обработанной листвы.

26. Способ по п.19, отличающийся тем, что он дополнительно включает обработку обработанной листвы растений или почвы, содержащей растение с обработанной листвой, с одним или несколькими из числа HYTa, HYTb или HYTc.

27. Способ по п.19, отличающийся тем, что растения, сеянцы или семена присутствуют в почве до этапа обработки.

28. Способ по п.19, отличающийся тем, что производится обработка растений, сеянцев или семян, которые после этого переносятся в почву.