СПОСОБЫ СНИЖЕНИЯ ВИРУЛИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ СОДЕРЖАЩИХ PCV-2 КОМПОЗИЦИЙ И СОДЕРЖАЩИЕ PCV-2 КОМПОЗИЦИИ С ПОВЫШЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ Российский патент 2016 года по МПК A61K39/12 A61K39/295 C12P21/02 

Описание патента на изобретение RU2595395C2

Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США №61/309408, зарегистрированной 1 марта 2010 г., и предварительной заявки на патент США №61/239192, зарегистрированной 2 сентября 2009 г. Оба указанных документа полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. Все заявки являются собственностью одного и того же владельца.

Перечень последовательностей

В настоящую заявку в соответствии с 37 C.F.R. 1.821-1.825 включен перечень последовательностей. Перечень последовательностей, прилагаемый к рассматриваемой заявке, полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки.

Предпосылки создания изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам, предназначенным для снижения вирулицидной активности композиций, которые обычно обладают определенным уровнем вирулицидной активности, и к указанным композициям. Путем применения способов, предлагаемых в настоящем изобретении, можно снижать вирулицидную активность таких композиций по сравнению с вирулицидной активностью композиции, полученной без использования стадий, предлагаемых в настоящем изобретении. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам получения таких антигенных композиций, содержащих цирковирус свиней типа II (PCV-2), которые по данным анализа с использованием современных методов обнаружения обладают относительно небольшой вирулицидной активностью по сравнению с композициями, известными в данной области, или совсем не обладают такой активностью, прежде всего по сравнению с композициями, полученными без применения способа, предлагаемого в настоящем изобретении. Кроме того, настоящее изобретение относится к новой иммуногенной композиции, предпочтительно к содержащей PCV-2 композиции, которая получена согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, которая предпочтительно отличается тем, что обладает пониженной вирулицидной активностью по сравнению с аналогичными композициями, известными в данной области, или совсем не обладает такой активностью. Следующим объектом настоящего изобретения являются иммуногенные композиции, содержащие очищенный антиген PCV-2, предпочтительно очищенный антиген PCV-2, обладающий повышенной иммуногенностью.

Описание известного уровня техники

Цирковирус свиней типа 2 (PCV-2) представляет собой небольшой (диаметром 17-22 нм) ДНКовый не имеющий оболочки вирус с икосаэдральной структурой, который несет одноцепочечный кольцевой геном. Последовательность PCV-2 примерно на 80% идентична последовательности цирковируса свиней типа 1 (PCV-1). Однако в отличие от PCV-1, который, как правило, является невирулентным, у свиней, зараженных PCV-2, проявляется синдром, который обычно называют синдромом послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS). С клинической точки зрения PCVD характеризуется истощением, бледностью кожи, худосочностью, респираторным дистресс-синдромом, диареей, желтухой и разлитием желчи. У некоторых пораженных заболеванием свиней проявляется комбинация всех симптомов, в то время как у других свиней проявляются только один или два из указанных симптомов. При вскрытии трупа выявляют также микроскопические и макроскопические повреждения многих тканей и органов, причем наиболее часто повреждения встречаются в лимфоидных органах. Обнаружена выраженная корреляция между уровнем нуклеиновой кислоты или антигена PCV-2 и серьезностью микроскопических лимфоидных повреждений. Коэффициенты смертности у свиней, инфицированных PCV-2, могут достигать 80%. Помимо того, что он приводит к PMWS, PCV-2 ассоциирован с рядом других инфекционных заболеваний, включая псевдобешенство, репродуктивный и респираторный синдром свиней (PRRS), болезнь Глассера, стрептококковый менингит, сальмонеллез, послеотъемный колибактериоз, диетический гепатоз и суппуративную бронхопневмонию.

В настоящее время существует ряд вакцин, которые можно применять для уменьшения воздействия инфекций, вызываемых PCV-2, на свиней. В US №6703023 предложена вакцина на основе ДНК, предназначенная для профилактической обработки свиней против PMWS. В WO 03/049703 описана живая химерная вакцина, содержащая непатогенный вирус PCV-1, в котором белок ORF2 заменен на белок ORF2 патогенного PCV-2. В WO 99/18214 и WO 99/291717 предложены несколько штаммов PCV-2 и процедуры получения вакцины на основе убитого PCV-2. Получение субъединичных вакцин описано также в WO 99/18214 и WO 99/29717. Эффективная субъединичная вакцина на основе ORF2 описана также в WO 06/072065. Еще одна субъединичная вакцина описана также в WO 07/28823. Однако ни одна из вакцин, известных из существующего уровня техники, не содержит не обладающий вирулицидной активностью и/или очищенный антиген PCV-2, предпочтительно высокоочищенный антиген ORF2 PCV-2.

Иммуногенные композиции против PCV-2 и различные иммуногенные композиции против других патогенов часто обладают вирулицидным действием в отношении других антигенов. Действующие в настоящее время регуляторные стандарты (9 CFR 113.35) допускают наличие определенной вирулицидной активности у мультивалентных композиций, но эта вирулицидная активность не должна приводить к гибели более чем 0,7 log/мл живого вируса или менее чем 0,7 log/мл КОЕ живых бактерий при объединении с другими компонентами иммуногенной композиции. Композиции, обладающие вирулицидной активностью, которая превышает разрешенную активность, нельзя объединять с другими антигенами при создании мультивалентной вакцины.

Белок PCV-2, кодируемый открытой рамкой считывания 2, (т.е. белок ORF2), который имеет по данным анализа с использованием ДСН-ПААГ молекулярную массу примерно 30 кДа, применяли ранее в качестве антигенного компонента в вакцинах и иммуногенных композициях против PCV-2. Общепринятые методы получения ORF2 для применения в таких вакцинах и композициях, как правило, предусматривают амплификацию ДНК PCV-2, кодирующей ORF2, экспрессию белка ORF2 в клетке-хозяине и экстракцию белка ORF2 из клетки-хозяина посредством лизиса клеток. Затем выделенный содержащий ORF2 клеточный лизат используют в качестве антигенного компонента иммуногенной композиции или вакцины. В некоторых случаях содержащий ORF2 клеточный лизат отделяют от клеточного дебриса.

Таким образом, существует необходимость в разработке способа снижения вирулицидной активности содержащих PCV-2 иммуногенных композиций и входящих в них антигенов, которые могли бы удовлетворять регуляторным требованиям, благодаря чему можно было бы применять в составе эффективных мультивалентных композиций. Кроме того, необходимо разработать способы снижения или уменьшения вирулицидной активности и вирулицидного действия содержащих PCV-2 композиций в отношении вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS). Кроме того, все еще существует необходимость в разработке иммуногенных композиций, которые следует подвергать обработке с помощью способов, предлагаемых в настоящем изобретении, для того, чтобы снижать их вирулицидную активность до приемлемых стандартов и чтобы их можно было объединять с другими антигенами с получением мультивалентных иммуногенных композиций.

Краткое изложение сущности изобретения

При осуществлении настоящего изобретения на практике можно применять, если не указано иное, общепринятые методы молекулярной биологии, микробиологии, технологии рекомбинантной ДНК, химии белков и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе, см., например, Sambrook, Fritsch и Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, тома I, II и III, 2-е изд., 1989; DNA Cloning, тома I и II, под ред. D.N. Glover, 1985; Oligonucleotide Synthesis, под ред. M.J. Gait, 1984; Nucleic Acid Hybridization, под ред. В.D. Hames и S.J. Higgins, 1984, Animal Cell Culture, под ред. R.K. Freshney, 1986; Immobilized Cells and Enzymes, изд-во IRL Press, 1986; Perbal В., A Practical Guide to Molecular Cloning, 1984; серии Methods In Enzymology, под ред. S. Colowick и N. Kaplan, изд-во Academic Press, Inc.; Protein purification methods - a practical approach, под ред. E.L.V. Harris и S. Angal, изд-во IRL Press at Oxford University Press; и Handbook of Experimental Immunology, тома I-IV, под ред. D.M. Weir и С.С. Blackwell, изд-во Blackwell Scientific Publications, 1986.

Перед подробным описанием настоящего изобретения следует отметить, что настоящее изобретение не ограничено конкретными ДНК, полипептидными последовательностями или параметрами процессов, которые, естественно, можно варьировать. Следует также иметь в виду, что употребляемые в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают формы множественного числа, если из контекста ясно не следует иное. Так, например, ссылка на «антиген» относится также и к смеси двух или большего количества антигенов, ссылка на «эксципиент» относится также к смесям двух или большего количества эксципиентов и т.п.

Настоящее изобретение решает проблемы, присущие существующему уровню техники, и обеспечивает выраженное развитие уровня техники. В целом, в настоящем изобретении предложен способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых: I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, и II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2. Предпочтительно антиген PCV-2 применяют в качестве или в составе антигенной композиции на основе PCV-2.

Для целей настоящего изобретения понятие «первая жидкость» относится к жидкости, водной или иной жидкой среде, которую, как правило, применяют в сочетании с клетками, антигенами, иммуногенными композициями, вакцинами и т.п. Предпочтительно первая жидкость представляет собой среду, присутствующую в антигенной композиции, более предпочтительно первая жидкость предпочтительно содержит или предпочтительно состоит из среды для культуры клеток, которую применяют для получения рекомбинантных белков в культивируемых клетках-хозяевах. Культивируемыми клетками-хозяевами могут являться бактерии, дрожжи, клетки насекомых, клетки животных и клетки млекопитающих, при этом наиболее предпочтительными являются клетки насекомых и клетки млекопитающих. Так, первая жидкость может содержать или состоять из среды для культивирования бактерий, дрожжей, клеток насекомых, клеток животных или клеток млекопитающих. Предпочтительно среда для клеток представляет собой бессывороточную среду для клеток и наиболее предпочтительно культуральная среда представляет собой бессывороточную среду EX-CELL® 420 в том случае, когда применяют клетки насекомых. EX-CELL® 420 представляет собой полную среду, которая не содержит белок и содержит L-глутамин, она была разработана и оптимизирована для выращивания в бессывороточных условиях линий клеток насекомых Sf9 и Sf21.

Для целей настоящего изобретения понятие «вторая жидкость» относится к любой жидкости, которую, как правило, применяют в сочетании с клетками, антигенами, иммуногенными композициями, вакцинами и т.п., но которая отлична от первой жидкости. Предпочтительно вторая жидкость представляет собой водный раствор, еще более предпочтительно фармацевтически приемлемый раствор, и еще более предпочтительно буфер, такой как физиологический раствор или фосфатный буфер, и т.п.Наиболее предпочтительно вторая жидкость отличается тем, что она не обладает вирулицидностью в отношении любого живого вируса или любых живых бактерий (в настоящем описании, если специально не указано иное или не является очевидным из контекста, понятие «вирулицидный» включает бактерицидную активность) при культивировании или хранении живого вируса или живых бактерий в такой жидкости.

Понятие «часть» в контексте настоящего изобретения относится к любому количеству, которое не представляет собой полное количество. Например, часть жидкости может представлять собой количество, меньшее 100% объема жидкости, например, 90% жидкости, 80% жидкости, 70% жидкости и любое количество, которое больше 0 и меньше 100%.

Понятие «антиген PCV-2» относится к любой композиции, являющейся объектом изобретения, которая содержит по меньшей мере один антиген, способный индуцировать, стимулировать или усиливать иммунный ответ против инфекции, вызываемой PCV-2, при введении животному, предпочтительно свинье. Предпочтительно антиген PCV-2 представляет собой полный вирус PCV-2, предпочтительно находящийся в инактивированной форме, живой модифицированный или ослабленный вирус PCV-2, химерный вирус, который содержит по меньшей мере иммуногенную аминокислотную последовательность PCV-2, или любой другой полипептид или компонент, который содержит по меньшей мере иммуногенную аминокислотную последовательность PCV-2, предпочтительно ORF2. В контексте настоящего описания понятия «иммуногенный белок», «иммуногенный полипептид» или «иммуногенная аминокислотная последовательность» относятся к любой аминокислотной последовательности PCV-2, которая вызывает иммунный ответ у хозяина против PCV-2. Предпочтительно иммуногенный белок, иммуногенный полипептид или иммуногенная аминокислота PCV-2 представляет собой любую из указанных субстанций, которая описана или предложена в международной заявке на патент WO 2006/072065 (содержание и сущность которой включены в настоящее описание в качестве ссылки), или представляет собой любой другой полипептид PCV-2, известный в данной области. Например, репрезентативная последовательность ДНК ORF2 PCV-2 содержит нуклеотидную последовательность, депонированную в Genbank под регистрационным номером AF086834 (SEQ ID NO: 3) и SEQ ID NO: 4.

Однако специалистам в данной области должно быть очевидно, что указанную последовательность можно варьировать таким образом, чтобы различия в степени гомологии вариантов находились в пределах 1-10% и они все еще сохраняли антигенные характеристики, что позволяет применять их в иммуногенных композициях. Антигенные характеристики иммунологической композиции можно оценивать, например, с помощью эксперимента по контрольному заражению, описанного в примере 4 WO 06/072065. Кроме того, антигенные характеристики модифицированного антигена все еще сохраняются, если модифицированный антиген обеспечивает по меньшей мере 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% или более защитного иммунитета по сравнению с белком ORF2 PCV-2, кодируемым полинуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, которые приведены в WO 06/072065. Другими предпочтительными антигенами ORF2 PCV-2 являются:

I) полипептид, который содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, которые приведены в WO 06/072065;

II) любой полипептид, гомологичный и/или идентичный по меньшей мере на 80% полипептиду, указанному в подпункте I);

III) любой иммуногенный фрагмент полипептидов, указанных в подпунктах I) и/или II);

IV) иммуногенный фрагмент, указанный в подпункте III), который содержит по меньшей мере 5, предпочтительно 8, более предпочтительно 10 смежных аминокислот любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, которые приведены в WO 06/072065;

V) полипептид, кодируемый ДНК, которая содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, которые приведены в WO 06/072065;

VI) любой полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который по меньшей мере на 80% гомологичен и/или идентичен полинуклеотиду, указанному в подпункте V);

VII) любой иммуногенный фрагмент полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который указан в подпункте V) и/или VI);

VIII) иммуногенный фрагмент, указанный в подпункте VII), где полинуклеотид, кодирующий иммуногенный фрагмент, содержит по меньшей мере 30 смежных нуклеотидов, которые присутствуют в последовательностях, представленных в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, которые приведены в WO 06/072065.

Перечень последовательностей из WO 06/072065 идентичен перечню последовательностей, представленному в настоящем описании.

Предпочтительно любой из указанных выше иммуногенных фрагментов обладает антигенными характеристиками антигена ORF2 PCV-2, который кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, которые приведены в WO 06/072065.

Понятие «идентичность последовательностей», как известно в данной области, относится к степени родства между двумя или большим количеством полипептидных последовательностей или двумя или большим количеством полинуклеотидных последовательностей, а именно между референс-последовательностью и рассматриваемой последовательностью, подлежащей сравнению с референс-последовательностью. Идентичность последовательностей определяют путем сравнения данной последовательности с референс-последовательностью после оптимального выравнивания последовательностей для получения наиболее высокой степени сходства последовательностей, что определяют по совместимости отрезков указанных последовательностей. После выравнивания идентичность последовательностей оценивают по находящимся в одинаковых положениях основаниям (по типу «положение с положением»), например, последовательности являются «идентичными» в определенном положении, если в этом положении нуклеотиды или аминокислотные остатки идентичны. Общее количество таких идентичных положений затем делят на общее количество нуклеотидов или остатков в референс-последовательности, получая % идентичности последовательностей. В качестве иллюстрации: когда упоминается полинуклеотид, нуклеотидная последовательность которого по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% «идентична последовательности» нуклеотидной референс-последовательности, то подразумевается, что нуклеотидная последовательность данного полинуклеотида идентична референс-последовательности за исключением того, что данная полинуклеотидная последовательность может включать вплоть до 15, предпочтительно вплоть до 10, еще более предпочтительно вплоть до 5 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов нуклеотидной референс-последовательности. Другими словами, для того, чтобы полинуклеотид имел нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% нуклеотидной референс-последовательности, вплоть до 15%, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% нуклеотидов в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другой нуклеотид, или вплоть до 15% нуклеотидов, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% от общего количества нуклеотидов в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти мутации референс-последовательности могут иметь место на 5'- или 3'-конце нуклеотидной референс-последовательности или в любом положении между этими концами, либо находясь индивидуально среди нуклеотидов в референс-последовательности, либо в виде одной или нескольких смежных групп в референс-последовательности. Аналогично этому, когда упоминают полипептид, аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере, например на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% аминокислотной референс-последовательности, то подразумевают, что рассматриваемая аминокислотная последовательность полипептида идентична референс-последовательности за исключением того, что рассматриваемая полипептидная последовательность может включать вплоть до 15, предпочтительно вплоть до 10, еще более предпочтительно вплоть до 5 аминокислотных замен на каждые 100 аминокислот аминокислотной референс-последовательности. Другими словами, для получения данной полипептидной последовательности, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% идентична последовательности аминокислотной референс-последовательности, вплоть до 15%, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% аминокислотных остатков в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другую аминокислоту, или вплоть до 15% аминокислот, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти изменения референс-последовательности могут иметь место на амино- или карбоксиконце аминокислотной референс-последовательности или в любом положении между этими концевыми положениями, либо находясь индивидуально среди остатков в референс-последовательности, либо в виде одной или нескольких смежных групп в референс-последовательности. Предпочтительно положения остатков, которые являются неидентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Однако консервативные замены не включают в разряд совпадающих при определении идентичности последовательностей.

Для целей настоящего изобретения понятие «живой» применительно к вирусу или бактерии обозначает, что вирус или бактерия способен/способна размножаться в хозяине. Предпочтительным живым вирусом и предпочтительной живой бактерией для целей настоящего изобретения являются вирус PRRS и бактерия вида Mycoplasma hyopneumoniae соответственно. Однако, понятия «живой вирус» и «живая бактерия» относятся не только к вирусу PRRS и бактериям вида Mycoplasma hyopneumoniae соответственно.

Часть первой жидкости можно отделять от антигена PCV-2 путем замены части первой жидкости на вторую жидкость, где вторая жидкость отлична от первой жидкости (см. определение второй жидкости). Так, следующий объект настоящего изобретения относится к способу получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающемуся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2, при этом часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 путем замены части первой жидкости на вторую жидкость, где вторая жидкость отлична от первой жидкости. Предпочтительно замена части первой жидкости на вторую жидкость заключается в том, что осуществляют стадии, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 путем отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Так, еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2, при этом часть первой жидкости удаляют от антигена PCV-2 путем замены части первой жидкости на вторую жидкость, для чего осуществляют стадии, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 путем удаления части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2.

Часть первой жидкости можно отделять от антигена PCV-2 посредством фильтрации через фильтр. Однако можно использовать любой другой метод, известный специалисту в данной области, для отделения части любых жидкостей, включая первую, и при необходимости части второй жидкости от антигена PCV-2. Такой метод включает (но, не ограничиваясь только ими), например, центрифугирование и/или хроматографию. Однако, наиболее предпочтительной является фильтрация. Предпочтительным методом фильтрации для отделения части первой жидкости или любой другой жидкости, если это требуется, является ультра- и/или диафильтрация. Ультра- и диафильтрация представляют собой стандартные методы, известные специалисту в данной области, они подробно описаны, например, в Protein Purification Methods - A Practical Approach, под ред. E.L.V. Harris и S. Angel, изд-во Oxford University Press, 1995 (содержание и сущность указанной публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки). В частности, в качестве примера можно отметить, что в главе 3 данного учебника дано описание нескольких методов и типов оборудования, которые все может применять обычный специалист в данной области для целей настоящего изобретения. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2, при этом часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации. Предпочтительно часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 путем замены по меньшей мере части первой жидкости на вторую жидкость, для чего осуществляют стадии, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 путем отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2.

Как указано выше, предпочтительной для применения в любом из описанных способов второй жидкостью является буфер, предпочтительно физиологически приемлемый буфер, при этом наиболее предпочтительным является физиологический раствор. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2 путем замены на буфер, предпочтительно на физиологически приемлемый буфер, такой как физиологический раствор или фосфатный буфер, или т.п. Предпочтительно часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 посредством фильтрации, предпочтительно посредством диа- и/или ультрафильтрации. Более предпочтительно замена меньшей мере части первой жидкости на буфер, предпочтительно на физиологически приемлемый буфер, такой как физиологический раствор или фосфатный буфер, или т.п., заключается в том, что осуществляют стадии, на которых а) добавляют буфер, предпочтительно физиологически приемлемый буфер, такой как физиологический раствор или фосфатный буфер, или т.п., к первой жидкости, которая содержит антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 путем отделения части первой жидкости и жидкости, представляющей собой буфер, предпочтительно физиологически приемлемый буфер, такой как физиологический раствор или фосфатный буфер, или т.п., от антигена PCV-2, предпочтительно посредством фильтрации, еще более предпочтительно посредством диа- или ультрафильтрации.

Стадию концентрирования и стадию добавления жидкости в представленном в настоящем описании способе можно осуществлять практически одновременно или в альтернативном варианте стадию концентрирования и стадию добавления жидкости осуществляют последовательно. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2 путем замены части первой жидкости на вторую жидкость, осуществляя стадии, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, которая содержит антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 путем отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2, при этом стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно. Предпочтительно часть первой жидкости и, в случае добавления второй жидкости, смеси первой и второй жидкостей отделяют от антигена PCV-2 путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации.

Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости осуществляют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Например, в одном из объектов изобретения стадию добавления жидкости осуществляют перед стадией концентрирования, а в другом объекте изобретения стадию концентрирования осуществляют перед стадией добавления жидкости. Стадию добавления жидкости и стадию концентрирования вне зависимости от порядка их осуществления можно осуществлять несколько раз. Например, каждую из указанных стадий можно осуществлять по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере десять раз и вплоть до того количества раз, которое необходимо в конкретном случае. В одном из объектов изобретения, как стадию концентрирования, так и стадию добавления жидкости, каждую осуществляют по меньшей мере два раза. В другом объекте изобретения, как стадию концентрирования, так и стадию добавления жидкости, каждую осуществляют по меньшей мере три раза. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, где способ в целом заключается в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2 путем замены части первой жидкости на вторую жидкость, при этом замену осуществляют несколько раз. Предпочтительно замена части первой жидкости на часть второй жидкости заключается в том, что осуществляют стадии, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 путем отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2, при этом стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, например, два раза, три раза, 5 раз, 10 раз и т.д. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют два раза, наиболее предпочтительно три раза. Как указано выше, фильтрация является предпочтительным методом удаления части первой жидкости или, как это имеет место в описанном выше случае осуществления нескольких стадий, предпочтительным методом удаления части смеси первой и второй жидкостей от антигена PCV-2.

Фильтр может представлять собой любой обычно применяемый в данной области фильтр. Предпочтительно фильтр включает полупроницаемую мембрану. В другом предпочтительном варианте полупроницаемая мембрана имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2, и тем самым препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны, удерживая антиген PCV-2 на фильтре. Согласно другому объекту изобретения фильтр имеет средний размер пор, препятствующий прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно фильтр имеет средний размер пор, препятствующий прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно фильтр имеет средний размер пор, препятствующий прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц. В другом объекте изобретения полупроницаемая мембрана состоит из материала, выбранного из группы, включающей полисульфон, полиэфирсульфон и регенерированную целлюлозу. Однако можно применять любой другой материал, который позволяет отделять часть первой жидкости, а в случае процесса, включающего несколько стадий, отделять смесь первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Фильтр можно выбирать из группы, включающей картридж для ультрафильтрации с половолоконной мембраной, фильтр с мембраной в виде плоского листа или кассетный фильтр, при этом наиболее предпочтительным является картридж для ультрафильтрации с половолоконной мембраной. Таким образом, еще один объект настоящего изобретения относится к способу получения описанной выше содержащей PCV-2 антигенной композиции. Способ в целом заключается в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2 посредством осуществления стадии фильтрации, при этом фильтр предпочтительно представляет собой или содержит полупроницаемую мембрану. Предпочтительно полупроницаемая мембрана имеет средний размер пор, который меньше чем размер антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц. Как указано выше, стадия отделения, как правило, предусматривает замену части первой жидкости на часть второй жидкости путем осуществления стадий, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 путем отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2, при этом стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, например, два раза, три раза, 5 раз, 10 раз и т.д. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют два раза, наиболее предпочтительно три раза.

Стадию концентрирования в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, осуществляют таким образом, чтобы сконцентрировать антиген PCV-2 в 3-50 раз по сравнению с объемом первой жидкости. Более предпочтительно стадию концентрирования осуществляют таким образом, чтобы сконцентрировать антиген PCV-2 в 4-20 раз по сравнению с объемом первой жидкости. Наиболее предпочтительно стадию концентрирования осуществляют таким образом, чтобы сконцентрировать антиген PCV-2 в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ получения антигенной композиции на основе PCV-2, где способ в целом заключается в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2, при этом часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 и антиген PCV-2 концентрируют в 3-50 раз, предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости. Предпочтительно часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 путем замены части первой жидкости на вторую жидкость, осуществляя стадии, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 в 3-50 раз, предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз, по сравнению с объемом первой жидкости посредством отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза. В этом случае удаляют не только первую жидкость, но также и смесь первой и второй жидкостей. Предпочтительно каждую стадию добавления жидкости и осуществляют практически одновременно или последовательно со стадией концентрирования. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости выполняют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц.

Согласно следующему объекту изобретения вирулицидную активность содержащей PCV-2 антигенной композиции, полученной способами, предлагаемыми в настоящем изобретении, снижают по меньшей мере на 10% по сравнению с вирулицидной активностью жидкости, которую не подвергали обработке указанным способом. Более предпочтительно вирулицидную активность содержащей PCV-2 антигенной композиции снижают по меньшей мере на 50% по сравнению с вирулицидной активностью первой жидкости, которую не подвергали обработке указанным способом. Еще более предпочтительно вирулицидную активность содержащей PCV-2 антигенной композиции снижают по меньшей мере на 70% по сравнению с вирулицидной активностью первой жидкости, которую не подвергали обработке указанным способом.

Для целей настоящего изобретения понятие «вирулицидная активность» обозначает способность жидкости, раствора или композиции в определенной степени инактивировать или убивать живой вирус или живые бактерии в том случае, когда жидкость, раствор или композицию смешивают с указанным живым вирусом или указанными живыми бактериями. Так, снижение вирулицидной активности жидкости, раствора или композиции по меньшей мере на 10% означает, что коэффициент выживаемости живого вируса или живой бактерии в жидкости, растворе или композиции, обработанной/обработанном с помощью любого из представленных в настоящем описании способов, на 90% выше по сравнению с коэффициентом выживаемости в жидкости, растворе или композиции, которую/который не обрабатывали никаким из представленных в настоящем описании способов. Согласно настоящему изобретению в качестве референс-вируса для определения вирулицидной активности используют вирус PRRS, предпочтительно вирус PRRS, имеющий регистрационный номер ATCC VR 2332. Для оценки вирулицидной активности в отношении бактерии предложено использовать бактерию вида Mycoplasma hyopneumonia, предпочтительно J-штамм Mycoplasma hyopneumonia.

Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, где способ в целом заключается в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2, в результате чего вирулицидную активность, предпочтительно в отношении вируса PRRS, содержащей PCV-2 антигенной композиции, полученной после стадии II), снижают по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, по сравнению с вирулицидной активностью первой жидкости. Предпочтительно часть первой жидкости, обладающей вирулицидной активностью, отделяют от антигена PCV-2 путем замены части первой жидкости на вторую жидкость. Предпочтительно замену производят путем осуществления стадий, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости, путем отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза. В этом случае отделяют не только первую жидкость, но также и смесь первой и второй жидкостей. Предпочтительно каждую стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости выполняют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц.

Согласно другому объекту изобретения способ дополнительно включает стадию сбора антигена PCV-2, полученного после отделения по меньшей мере части первой жидкости от антигена PCV-2.

В контексте настоящего описания понятия «сбор» или «собирать» означают сбор или выделение антигена PCV-2. Можно применять любой общепринятый метод, известный в данной области, для выделения антигена PCV-2 либо тогда, когда антиген получают с целью его применения в способах и композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, либо тогда, когда антиген PCV-2 подвергают обработке представленными в настоящем описании способами. Наиболее предпочтительная процедура сбора состоит в том, что часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 путем осуществления стадии фильтрации и антиген PCV-2 выделяют или собирают из продукта, удержанного фильтром. В более предпочтительном варианте антиген PCV-2 собирают или отбирают, или выделяют из продукта, удержанного полупроницаемой мембраной, имеющей указанный в настоящем описании размер пор. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2, при этом собирают антиген PCV-2, полученный после осуществления стадии II). Предпочтительно часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 путем замены части первой жидкости на вторую жидкость. Предпочтительно замену производят путем осуществления стадий, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости, путем отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза. В этом случае отделяют не только первую жидкость, но также и смесь первой и второй жидкостей. Предпочтительно каждую стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости выполняют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре, что требуется для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны или любого другого фильтра, применяемого согласно настоящему изобретению, препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц.

Антиген PCV-2, оставшийся после осуществления способов, предлагаемых в настоящем изобретении, предпочтительно после сбора из продукта, удержанного фильтром, смешивают с дополнительным компонентом, выбранным из группы, включающей фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, разбавители, эксципиенты и их комбинации. Предпочтительно дополнительный компонент представляет собой адъювант, еще более предпочтительно адъювант представляет собой полимер акриловой или метакриловой кислоты, и еще более предпочтительно адъювант представляет собой карбомер (непатентованное название высокомолекулярных синтетических полимеров акриловой кислоты).

В контексте настоящего описания понятия «фармацевтически приемлемый носитель» и «приемлемый для ветеринарии носитель» включают любой и все растворители, диспергирующие среды, материалы для нанесения покрытия, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые средства, агенты для придания изотоничности, замедляющие адсорбцию средства и т.п.

Понятие «адъюванты» в контексте настоящего описания может относиться к гидроксиду алюминия и фосфату алюминия, сапонинам, таким, например, как Quil A, QS-21 (фирма Cambridge Biotech Inc., Кэмбридж, шт.Массачусетс), GPI-0100 (фирма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бирмингем, шт.Алабама), эмульсии вода-в-масле, эмульсии масло-в-воде, эмульсии вода-в-масле-в-воде. Основой эмульсии может являться, в частности, легкое жидкое парафиновое масло (соответствующее Европейской фармакопеи); изопреноидное масло, такое как сквалан или сквален; масло, образовавшееся в результате олигомеризации алкенов, прежде всего изобутена или децена; эфиры кислот или спиртов, содержащие линейную алкильную группу, более конкретно растительные масла, этилолеат, ди(каприлат/капрат) пропиленгликоля, три(каприлат/капрат) глицерина или диолеат пропиленгликоля; эфиры разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности, эфиры изостеариновой кислоты. Масла применяют в сочетании с эмульгаторами для получения эмульсии. Эмульгаторы предпочтительно представляют собой неионогенные поверхностно-активные вещества, прежде всего сложные эфиры сорбитана, маннида (например, безводный маннитолеат), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рицинолеиновой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно являются этоксилированными, и блок-сополимеры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, в частности продукты типа плуроника (Pluronic), прежде всего L121 (см. Hunter и др., The Theory and Practical Application of Adjuvants, под ред. Stewart-Tull D.E.S., изд-во John Wiley and Sons, NY, сс.51-94, 1995 и Todd и др., Vaccine 15, 1997, сс.564-570). Например, можно применять SPT-эмульсию, описанную на с.147 в: «Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach», под ред. M. Powell и M. Newman, изд-во Plenum Press, 1995, и эмульсию MF59, описанную на с.183 в этой же публикации. Другими приемлемыми адъювантами среди прочего являются, но, не ограничиваясь только ими, система RIBI-адъювантов (фирма Ribi Inc.), блок-сополимеры (фирма CytRx, Атланта, шт.Джорджия), SAF-M (фирма Chiron, Эмеривилл, шт.Калифорния), монофосфорил-липид А, адъювант на основе амина липида авридина, термолабильный энтеротоксин E.coli (рекомбинантный или нерекомбинантный), токсин холеры, IMS 1314 или мурамил-дипептид. Из числа сополимеров малеинового ангидрида и алкенильных производных можно применять сополимеры EMA (фирма Monsanto), которые представляют собой сополимеры малеинового ангидрида и этилена. При растворении указанных полимеров в воде образуется кислый раствор, который необходимо нейтрализовать, предпочтительно до достижения физиологического значения рН, для получения раствора адъюванта, в который требуется включать непосредственно саму иммуногенную, иммунологическую композицию или композицию вакцины.

Другим примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного. Предпочтительными адъювантами являются полимеры акриловой или метакриловой кислоты, прежде всего, сшитые с простыми полиалкениловыми эфирами Сахаров или многоатомных спиртов. Эти соединения известны под названием карбомеры (Phameuropa, т.8, №2, июнь 1996 г.). Специалистам в данной области в качестве ссылки можно указать US 2909462, в котором описаны указанные акриловые полимеры, сшитые с полигидроксилированным соединением, которое имеет по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, при этом атомы водорода по меньшей мере трех гидроксильных групп замещены ненасыщенными алифатическими радикалами, которые имеют по меньшей мере 2 атома углерода. Предпочтительными являются радикалы, которые содержат от 2 до 4 атомов углерода, например, винильные, аллильные и другие ненасыщенные группы ряда этилена. Ненасыщенные радикалы могут сами содержать другие заместители, такие как метил. Наиболее предпочтительными являются продукты, поступающие в продажу под названием CARBOPOL® (фирма BF Goodrich, шт.Огайо). Их сшивают с аллилсахарозой или аллилпентаэритритолом. Среди них прежде всего следует упомянуть CARBOPOL® 974P, 934Р и 97 IP. Наиболее предпочтительным для применения является CARBOPOL® 97 IP.

Предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу. Наиболее предпочтительно адъювант добавляют в количестве примерно 1 мг на дозу.

Разбавители могут включать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и т.п.Агенты для придания изотоничности могут включать среди прочего хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают среди прочего альбумин и соли щелочных металлов и этилендиаминтетрауксусной кислоты.

В контексте настоящего изобретения понятие «консервант» относится к обладающему противомикробной активностью агенту, такому, например, как гентамицин, мертиолат и т.п. В частности, наиболее предпочтительно следует добавлять консервант при приготовлении мультидозовой композиции. Указанные обладающие противомикробной активностью агенты добавляют в концентрации, которая является эффективной для предупреждения загрязнения любыми микроорганизмами представляющей интерес композиции или для ингибирования роста любых микроорганизмов в представляющей интерес композиции.

Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2, где способ дополнительно включает стадию, на которой смешивают антиген PCV-2, оставшийся после осуществления стадии II), с дополнительным компонентом, выбранным из группы, включающей фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, разбавители, эксципиенты и их комбинации. Предпочтительно дополнительный компонент представляет собой адъювант, еще более предпочтительно адъювант представляет собой полимер акриловой или метакриловой кислоты и еще более предпочтительно адъювант представляет собой карбомер. Предпочтительно часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 путем замены части первой жидкости на вторую жидкость. Замену предпочтительно проводят, осуществляя стадии, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости посредством отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза. В этом случае отделяют не только первую жидкость, но также и смесь первой и второй жидкостей. Предпочтительно каждую стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно с осуществлением стадии концентрирования. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости выполняют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре, что требуется для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны или любого другого фильтра, применяемого согласно настоящему изобретению, препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц.

Антиген PCV-2, применяемый в описанных выше способах, может представлять собой любой из указанных выше антигенов PCV-2. Предпочтительно антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2, и еще более предпочтительно антиген, который применяют в INGELVAC CIRCOFLEX. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2, где антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2. Предпочтительно часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 путем замены части первой жидкости на вторую жидкость. Замену предпочтительно проводят, осуществляя стадии, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости посредством отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2.

Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза. В этом случае удаляют не только первую жидкость, но также и смесь первой и второй жидкостей. Предпочтительно каждую стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно с осуществлением стадии концентрирования. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости выполняют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре, что требуется для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны или любого другого фильтра, применяемого согласно настоящему изобретению, препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц.

Первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, можно получать любым известным в данной области методом. Предпочтительно первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, а также антиген PCV-2, можно получать с помощью любого из методов, описанных в Международной заявке на патент WO 2006/072065 (содержание и сущность указанного документа включены в настоящее описание в качестве ссылки). В частности, антиген PCV-2, рекомбинантно экспрессируемый in vitro в клетках-хозяевах, можно получать с использованием вирусного вектора, предпочтительно рекомбинантного бакуловирусного вирусного вектора, содержащего и экспрессирующего антиген PCV-2, предпочтительно ORF-2 PCV-2.

Векторы и методы получения и/или применения векторов (или рекомбинантов) для осуществления экспрессии антигена PCV-2, предпочтительно антигена ORF2 PCV-2, могут представлять собой те же векторы и методы (или аналогичные им), которые описаны в: US 4603112, 4769330, 5174993, 5505941, 5338683, 5494807, 4722848, 5942235, 5364773, 5762938, 5770212, 5942235, 382425, публикациях РСТ WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018, у Paoletti, «Applications of pox virus vectors to vaccination: An update», PNAS USA 93, октябрь 1996 г., сс.11349-11353, Moss, «Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety», PNAS USA 93, октябрь 1996 г., сс.11341-11348, Smith и др., US 4745051, (рекомбинантный бакуловирус). Methods in Molecular Biology 39, «Baculovirus Expression Protocols», под ред. Richardson С.D., изд-во Humana Press Inc., 1995, Smith и др., «Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector», Molecular and Cellular Biology, том 3, №12, декабрь 1983 г., сс.2156-2165; Pennock и др., «Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector». Molecular and Cellular Biology, том 4, №3, март 1984 г., сс.399-406; ЕРА 0370573, заявка на патент США №920197, зарегистрированная 16 октября 1986 г., публикация европейского патента №265785, US №4769331 (рекомбинантный вирус герпеса), Roizman, «The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors», PNAS USA 93, октябрь 1996 г., сс.11307-11312, Andreansky и др., «The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors», PNAS USA 93, октябрь 1996 г., сс.11313-11318, Robertson и др., «Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to В lymphocytes», PNAS USA 93, октябрь 1996 г., сс.11334-11340, Frolov и др., «Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications», PNAS USA 93, октябрь 1996 г., сс.11371-11377, Kitson и др., J. Virol. 65, 1991, сс.3068-3075; US №5591439, 5552143, WO 98/00166, «выданные» заявки на патент США, сер. номера 08/675556 и 08/675566, обе зарегистрированы 3 июля 1996 г. (рекомбинантный аденовирус), Grunhaus и др., 1992, «Adenovirus as cloning vectors». Seminars in Virology, том 3, 1993, сс.237-252, Ballay и др., EMBO Journal, том 4, сс.3861-3865, Graham, Tibtech 8, апрель 1990 г., сс.85-87, Prevec и др., J. Gen Virol. 70, 42434, PCT WO 91/11525, Feigner и др., J. Biol. Chem. 269, 1994, сс.2550-2561, Science, 259, 1993, сс.1745-1749, и McClements и др., «Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease», PNAS USA 93, октябрь 1996 г., сс.11414-11420 и U. S. №№5591639, 5589466 и 5580859, а также WO 90/11092, WO 93/19183, WO 94/21797, WO 95/11307, WO 95/20660, Tang и др., Nature и Furth и др.Б Analytical Biochemistry, см. среди прочего разделы, касающиеся векторов для экспрессии ДНК. См. также WO 98/33510; Ju и др., Diabetologia, 41, 1998, сс.736-739 (экспрессионная система на основе лентивирусов); Sanford и др., US №4945050; Fischbachet и др., (Intracel), WO 90/01543; Robinson и др., Seminars in Immunology, том 9, 1997, сс.271-283, векторные системы для ДНК); Szoka и др., US № (метод встраивания ДНК в живые клетки); McCormick и др., US №5677178 (применение цитопатических вирусов); и US №5928913 (векторы для доставки генов), а также другие процитированные в настоящем описании документы. Экспрессия антигена ORF2 PCV-2 в клетках насекомых описана, например, в WO 06/072065. Очищенный антиген ORF2 PCV-2, применяемый согласно настоящему изобретению, можно получать с помощью нескольких методов, известных в данной области. Предпочтительными являются представленные в данном описании методы. Антиген ORF2 PCV-2 можно получать рекомбинантным путем in vitro с помощью метода, заключающегося в том, что осуществляют стадии, на которых I) осуществляют заражение чувствительных клеток в культуре рекомбинантным вирусным вектором, содержащим кодирующую последовательность ORF2 PCV-2, где белок ORF2 PCV-2 экспрессируется рекомбинантным вирусным вектором, и II) после этого выделяют антиген ORF2 PCV-2 из культуры клеток. Антиген ORF2 PCV-2 выделяют путем сбора целых (т.е. интактных) SF -клеток, экспрессирующих антиген ORF2 PCV-2.

Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2, где антиген PCV-2 получают с использованием вирусного вектора, предпочтительно рекомбинантного бакуловирусного вирусного вектора, содержащего и экспрессирующего антиген PCV-2, предпочтительно ORF-2 PCV-2, и где антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2. Когда для продуцирования/получения антигена PCV-2 применяют вирусный вектор, прежде всего рекомбинантный бакуловирус, содержащий и экспрессирующий антиген PCV-2, то описанный выше способ дополнительно включает стадию инактивации вирусного вектора, предпочтительно рекомбинантного бакуловирусного вирусного вектора с помощью инактивирующего ДНК агента, предпочтительно в присутствии бинарного этиленимина (BEI) в концентрации от примерно 1 до примерно 20 мМ. Предпочтительно стадию инактивации осуществляют после удаления по меньшей мере части первой жидкости от антигена PCV-2, более предпочтительно после сбора антигена PCV-2. Еще более предпочтительно стадию инактивации осуществляют после отделения части первой жидкости от антигена PCV-2, которую осуществляют посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость. Когда замену части первой жидкости на вторую жидкость проводят путем осуществления стадий, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости посредством удаления части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2, то стадию инактивации осуществляют после стадии концентрирования. Когда стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза, то стадию инактивации осуществляют после последней стадии добавления жидкости и стадии концентрирования. Когда стадию концентрирования осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- и/или ультрафильтрации, с использованием фильтра, предпочтительно содержащего полупроницаемую мембрану, то стадию инактивации осуществляют после описанной выше стадии фильтрации, которую осуществляют предпочтительно с использованием полупроницаемой мембраны. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре, что требуется для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны или любого другого фильтра, применяемого согласно настоящему изобретению, препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц.

Для целей настоящего изобретения понятие «агент, инактивирующий ДНК» обозначает любой химический агент, который деактивирует ДНК, предпочтительно ДНК патогена, в результате чего патоген теряет способность вызывать активную инфекцию или становится неинфективным, или теряет способность к размножению, но все еще сохраняет способность индуцировать иммунный ответ у индивидуума. Предпочтительно агент, инактивирующий ДНК, представляет собой формалин.

Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2, где антиген PCV-2 получают с использованием вирусного вектора, предпочтительно рекомбинантного бакуловирусного вирусного вектора, содержащего и экспрессирующего антиген PCV-2, предпочтительно ORF-2 PCV-2, где способ дополнительно предусматривает стадию инактивации вирусного вектора, предпочтительно рекомбинантного бакуловирусного вирусного вектора, с помощью агента, инактивирующего ДНК, предпочтительно в присутствии бинарного этиленимина в концентрации от примерно 1 до примерно 20 мМ, и где антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2. Предпочтительно стадию инактивации осуществляют после удаления по меньшей мере части первой жидкости от антигена PCV-2, более предпочтительно после сбора антигена PCV-2. Еще более предпочтительно стадию инактивации осуществляют после отделения части первой жидкости от антигена посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость. Когда замену части первой жидкости на вторую жидкость проводят путем осуществления стадий, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, еще более предпочтительно в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости посредством удаления части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2, то стадию инактивации осуществляют после стадии концентрирования. Когда стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза, то стадию инактивации осуществляют после последней стадии добавления жидкости и стадии концентрирования. Когда стадию концентрирования осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- и/или ультрафильтрации, с использованием фильтра, предпочтительно содержащего полупроницаемую мембрану, то стадию инактивации осуществляют после описанной выше стадии фильтрации, которую осуществляют предпочтительно с использованием полупроницаемой мембраны. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре, что требуется для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны или любого другого фильтра, применяемого согласно настоящему изобретению, препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц.

В том случае, когда в способе, предлагаемом в изобретении, применяют агент, инактивирующий ДНК, то способ дополнительно предусматривает стадию, на которой добавляют агент, обладающий способностью нейтрализовать агент, инактивирующий ДНК, в количестве, эквивалентном количеству агента, инактивирующего ДНК, где агент, который нейтрализует агент, инактивирующий ДНК, представляет собой раствор тиосуольфата натрия, сконцентрированный до конечной концентрации, составляющей от примерно 1 до примерно 20 мМ, и где агент, инактивирующий ДНК, представляет собой BEI. Предпочтительно стадию инактивации осуществляют после отделения по меньшей мере части первой жидкости от антигена PCV-2.

В контексте настоящего описания понятие «агент, нейтрализующий инактивирующий агент» или «нейтрализующий агент» относится к любому агенту, обладающему способностью нейтрализовать перечисленные выше инактивирующие агенты, в результате чего инактивирующий агент теряет способность инактивировать ДНК. Предпочтительно агент, нейтрализующий инактивирующий агент, представляет собой тиосульфат натрия.

Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают антиген PCV-2, находящийся в первой жидкости, где антиген PCV-2 получают с использованием вирусного вектора, предпочтительно рекомбинантного бакуловирусного вирусного вектора, содержащего и экспрессирующего антиген PCV-2, предпочтительно ORF-2 PCV-2, и где антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2; II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2; III) инактивируют рекомбинантный бакуловирусный вирусный вектор с помощью агента, инактивирующего ДНК, предпочтительно в присутствии бинарного этиленимина в концентрации от примерно 1 до примерно 20 мМ; IV) добавляют нейтрализующий агент, который нейтрализует инактивирующий агент, в количестве, эквивалентном количеству инактивирующего агента, где нейтрализующий агент предпочтительно представляет собой раствор тиосульфата натрия, предпочтительно сконцентрированный до конечной концентрации, составляющей от примерно 1 до примерно 20 мМ, и где инактивирующий агент предпочтительно представляет собой BEI. Предпочтительно стадию инактивации и нейтрализации осуществляют после отделения по меньшей мере части первой жидкости от антигена PCV-2, более предпочтительно после сбора антигена PCV-2. Еще более предпочтительно стадию инактивации и нейтрализации осуществляют после отделения по меньшей мере части первой жидкости от антигена PCV-2 посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость. Когда замену части первой жидкости на вторую жидкость проводят путем осуществления стадий, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, еще более предпочтительно в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости посредством отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2, то стадию инактивации и нейтрализации осуществляют после стадии концентрирования. Когда стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза, то стадию инактивации и нейтрализации осуществляют после последней стадии добавления жидкости и стадии концентрирования. Когда стадию концентрирования осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- и/или ультрафильтрации, с использованием фильтра, предпочтительно содержащего полупроницаемую мембрану, то стадию инактивации и нейтрализации осуществляют после описанной выше стадии фильтрации, которую осуществляют предпочтительно с использованием полупроницаемой мембраны. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре, что требуется для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны или любого другого фильтра, применяемого согласно настоящему изобретению, препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц.

Следующим объектом настоящего изобретения является описанный выше способ, который дополнительно предусматривает стадии смешения полученного после осуществления стадий инактивации и нейтрализации антигена PCV-2 с дополнительным компонентом, выбранным из группы, включающей фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, разбавители, эксципиенты и их комбинации. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают антиген PCV-2, находящийся в первой жидкости, где антиген PCV-2 получают с использованием вирусного вектора, предпочтительно рекомбинантного бакуловирусного вирусного вектора, содержащего и экспрессирующего антиген PCV-2, предпочтительно ORF-2 PCV-2, и где антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2; II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2; III) инактивируют рекомбинантный бакуловирусный вирусный вектор с помощью агента, инактивирующего ДНК, предпочтительно в присутствии бинарного этиленимина в концентрации от примерно 1 до примерно 20 мМ; IV) добавляют нейтрализующий агент, который нейтрализует инактивирующий агент, предпочтительно в количестве, эквивалентном количеству инактивирующего агента, где нейтрализующий агент предпочтительно представляет собой раствор тиосульфата натрия, предпочтительно сконцентрированный до конечной концентрации, составляющей от примерно 1 до примерно 20 мМ, и где инактивирующий агент предпочтительно представляет собой BEI; и V) смешивают антиген PCV-2, полученный на стадии IV), с дополнительным компонентом, выбранным из группы, включающей фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, разбавители, эксципиенты и их комбинации. Предпочтительно антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2. Предпочтительно на стадии II) часть первой жидкости удаляют от антигена PCV-2 посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость. Замену предпочтительно проводят путем осуществления стадий, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, еще более предпочтительно в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости посредством удаления части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза. В этом случае отделяют не только первую жидкость, но также и смесь первой и второй жидкости. Предпочтительно каждую стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно с осуществлением стадии концентрирования согласно описанной выше процедуре. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости осуществляют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа-или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре, что требуется для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны или любого другого фильтра, применяемого согласно настоящему изобретению, препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц.

Согласно дополнительному объекту изобретения любой из описанных выше способов получения антигена PCV-2 с пониженной вирулицидной активностью может включать дополнительные стадии очистки для получения очищенного антигена PCV-2. При создании изобретения неожиданно было установлено, что антигенная или иммуногенная композиция, содержащая очищенный антиген PCV-2, предпочтительно в сочетании с адъювантом, не только обладает указанной в настоящем описании пониженной вирулицидной активностью, но также обладает повышенной иммуногенностью по сравнению с иммуногенной композицией, которая не содержит очищенный антиген PCV-2, более конкретно, которая содержит неочищенный или содержащий примеси антиген PCV-2.

Понятие «очищенный антиген PCV-2» означает, что присутствующий в препарате антиген PCV-2 очищен до уровня, составляющего более чем 50 мас.%, предпочтительно более чем 60 мас.%, предпочтительно более чем 70 мас., предпочтительно более чем 80 мас.%, предпочтительно более чем 85 мас.%, более предпочтительно более чем 90 мас.%, еще более предпочтительно более чем 95% мас., в пересчете на общее количество белка, содержащегося в иммуногенной композиции. Иными словами, если препарат содержит антиген PCV-2 с чистотой, составляющей 80 мас.%, то указанный препарат содержит не более чем 20 мас.% белков, отличных от PCV-2, где проценты даны в пересчете на общее содержание белка в иммуногенной композиции. Предпочтительно степень чистоты в препарате, т.е. в иммуногенной композиции, измеряют перед осуществлением смешения с адъювантом или другими эксципиентами или инактивирующим агентом. Однако, если адъювант, применяемый в конечной иммуногенной композиции, представляет собой адъювант не на белковой основе, то добавление адъюванта не должно оказывать никакого влияния на степень чистоты. Степень чистоты антигена PCV-2 можно оценивать с помощью стандартных методов, известных специалисту в данной области, например, с использованием красителя Imperial Protein Stain (фирма Pierce) после проведения разделения с использованием ДСН-ПААГ, осуществления газовой хроматографии, ЖХВР-анализа и т.д. Согласно настоящему изобретению предпочтительным методом оценки чистоты или степени чистоты антигена PCV-2 в препарате, т.е. в иммуногенной композиции, является окрашивание красителем Imperial Protein Stain (фирма Pierce), которое осуществляют следующим образом: Препараты, содержащие антиген PCV-2, разделяют с использованием NuPAGE 10% Бис-Трис-гелей (фирма Invitrogen) с использованием буферной системы NuPAGE MOPS (фирма Invitrogen). Гели разгоняют в денатурирующих условиях (все буферы содержат ДСН) и в восстанавливающих условиях (загрузочный буфер содержит 2-меркаптоэтанол). После загрузки гелей образцами гели разгоняют в течение 55 мин при постоянном напряжении 200 В. После завершения разделения гели окрашивают с помощью красителя Imperial Protein Stain (фирма Pierce) и удаляют краситель согласно инструкциям производителя.

В противоположность этому понятие «неочищенный» или «содержащий примеси» антиген PCV-2 относится к неочищенному препарату, содержащему антиген PCV-2. Антиген PCV-2, как правило, получают in vitro в клеточной культуре. Таким образом, понятие «неочищенный антиген PCV-2» относится к смеси антигена PCV-2 и клеточной культуры или материалу клеточной культуры, используемой для получения антигена PCV-2. Кроме того, понятие «неочищенный антиген PCV-2» обозначает также частично очищенный антиген PCV-2, предпочтительно имеющий степень чистоты менее чем 50 мас.%, более предпочтительно менее чем 40 мас.%, еще более предпочтительно мене чем 30 мас.%, еще более предпочтительно менее чем 20 мас.%, в пересчете на общее содержание белка, включенного в иммуногенную композицию.

Кроме того, понятия «повышенная иммуногенность» или «улучшенная иммуногенность» в контексте настоящего изобретения означают, что иммунный ответ, вызываемый иммуногенной композицией, которая содержит представляющий интерес антиген, является более высоким по сравнению с ответом, вызываемым иммуногенной референс-композицией, содержащей другой антиген или антиген с другой степенью чистоты, где указанный иммунный ответ представляет собой клеточнозависимый и/или антитело-обусловленный иммунный ответ. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения понятие «повышенная иммуногенность» или «улучшенная иммуногенность» означает, что антитело-обусловленный иммунный ответ, вызываемый иммуногенной композицией, которая содержит представляющий интерес антиген, является более высоким по сравнению с ответом, вызываемым иммуногенной референс-композицией, которая содержит другой антиген или антиген с другой степенью чистоты. В данном случае антитело-обусловленный иммунный ответ означает, что производство антител, специфических в отношении представляющего интерес антигена, возрастает по сравнению с производством антител, вызываемых иммуногенной референс-композицией, содержащей другой антиген или антиген с другой степенью чистоты.

Понятие «повышенный» означает, что клеточнозависимый и/или антитело-обусловленный иммунный ответ повышен по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 75%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 100% по сравнению с клеточнозависимым и/или антитело-обусловленным иммунным ответом, вызываемым иммуногенной референс-композицией, которая содержит другой антиген или антиген с другой степенью чистоты.

Обычному специалисту в данной области должно быть известно, каким образом можно оценивать клеточнозависимый и/или антитело-обусловленный иммунный ответ. В частности, такому специалисту в данной области должно быть очевидно, что можно сравнивать клеточнозависимый иммунный ответ, вызываемый представляющей интерес иммуногенной композицией, с клеточнозависимым иммунным ответом, вызываемым референс-композицией, или антитело-обусловленный иммунный ответ, вызываемый представляющей интерес иммуногенной композицией, с таким же ответом, вызываемым референс-композицией, но нельзя сравнивать клеточнозависимый иммунный ответ, вызываемый представляющей интерес иммуногенной композицией, с антитело-обусловленным иммунным ответом, вызываемым референс-композицией, или наоборот. Кроме того, клеточнозависимый иммунный ответ можно оценивать, например, путем измерения активации цитотоксических T-клеток, вызываемой представляющей интерес иммуногенной композицией или представляющим интерес антигеном. Антитело-обусловленный иммунный ответ можно оценивать, например, путем измерения титра антигенспецифических антител, образовавшихся в случае введения животному иммуногенной композиции, которая содержит такой антиген. Клеточнозависимый и/или антитело-обусловленный иммунный ответ можно оценивать, например, с использованием мышиной модели. Согласно настоящему изобретению мышиную модель используют в референс-методе.

Понятие «иммуногенная композиция» означает (но, не ограничиваясь только ей) соответствующую композицию, которая содержит по меньшей мере один антиген, вызывающий клеточнозависимый и/или антитело-обусловленный иммунный ответ у хозяина против представляющего интерес антигена. Как правило, «иммунный ответ» включает (но, не ограничиваясь только ими) одно или несколько из следующих воздействий: производство или активацию антител, В-клеток, T-клеток-хелперов, T-клеток-супрессоров и/или цитотоксических Т-клеток и/или гамма-дельта Т-клеток, направленных специфически на антиген или антигены, включенные в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно у хозяина должен вырабатываться терапевтический или защитный иммунный ответ, такой как повышение устойчивости к новой инфекции и/или снижение клинической серьезности заболевания. В таком случае иммуногенная композиция рассматривается как «вакцина». Такая защита может проявляться в виде снижения или отсутствия симптомов, которые обычно возникают у инфицированного хозяина, в виде более короткого промежутка времени, требуемого для восстановления, и/или в наличии пониженного вирусного титра у инфицированного хозяина.

Дополнительную очистку антигена PCV-2 можно осуществлять с помощью процедур хроматографии, предпочтительно с помощью двухстадийной процедуры хроматографии. В том случае, когда антиген PCV-2 собран в виде вирусоподобных частиц (ВПЧ), одна из стадий, предпочтительно первая стадия, предпочтительно представляет собой вытеснительную хроматографию (гель-фильтрацию), которую можно осуществлять, например, с использованием в качестве матрицы Sephacryl S300. Для лабораторных целей наиболее предпочтительно применяют колонки, упакованные HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR. Однако можно применять любые другие матрицы для гель-фильтрации, известные специалисту в данной области, которые позволяют отделять ВПЧ ORF2 PCV-2 от культурального фильтрата или супернатанта. Пригодные для этой цели матрицы описаны, например, в: Protein purification methods - a practical approach, под ред. E.L.V. Harris и S. Angel, изд-во IRL Press Oxford, 1995. Гель-фильтрацию можно осуществлять, например, загружая на колонку неочищенный препарат, содержащий антиген PCV-2, при скорости потока 1,0 мл/мин и элюируя колонку взятым в количестве, равном 1,5 объемам колонки, буфером, содержащим 20 мМ Трис, рН 6,5, 5 мМ ДТТ. Однако, антиген ORF2 PCV-2 можно очищать также с помощью аффинной хроматографии, например, посредством избирательного связывания с иммобилизованным обладающим специфичностью в отношении ORF2 PCV-2 антителом, или любым другим методом, известным специалисту в данной области.

Таким образом, предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2 и III) очищают продукт, собранный на стадии II), который содержит антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2, с помощью хроматографического метода. Предпочтительно осуществляют гель-фильтрацию согласно представленному в настоящем описании методу, предпочтительно согласно методу, описанному в примере 3. Предпочтительно после осуществления гель-фильтрации получают иммуногенную композицию, имеющую степень чистоты более чем 80 мас.%, предпочтительно более чем 90 мас.%, по отношению к общему количеству белка, содержащегося в иммуногенной композиции до смешения с адъювантом. Степень чистоты можно оценивать с помощью окрашивания красителем Imperial Protein Stain (фирма Pierce) после осуществления разделения с использованием ДСН-ПААГ на 10%-ных Бис-Трис-гелях NuPAGE (фирма Invitrogen) с использованием буферной системы NuPAGE MOPS (фирма Invitrogen).

Таким образом, предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающемуся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2 и III) очищают продукт, собранный на стадии II), который содержит антиген PCV-2, с помощью вытеснительной хроматографии (гель-фильтрации).

Для достижения более высокой степени чистоты можно осуществлять вторую стадию хроматографии, которая, однако, должна быть отличной от первой. Например, если первая стадия очистки/стадия хроматографии представляет собой вытеснительную хроматографию (гель-фильтрацию), то вторая стадия должна быть отличной от нее, например, она может представлять собой аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию и т.д. Предпочтительно, если первая стадия очистки антигена,PCV-2, предпочтительно очистки антигена ORF2 PCV-2, представляет собой вытеснительную хроматографию (гель-фильтрацию), то вторая стадия может представлять собой ионообменную хроматографию, предпочтительно анионообменную хроматографию (АОХ). Предпочтительной матрицей для анионообменной хроматографии для целей очистки антигена PCV-2, предпочтительно ORF2 PCV-2, является Q Sepharose. Для маломасштабного производства, при работе с объемами, составляющими примерно 50 мл, наиболее предпочтительными являются колонки, упакованные 5 мл HiTrap Q Sepharose HP. Анионообменную хроматографию можно осуществлять, например, согласно методу, описанному в примере 3. В целом метод заключается в следующем. Примерно 50 мл пула фракций «мертвого» объема, полученных после стадии гель-фильтрации, можно загружать на АОХ-колонку при скорости потока 3,0 мл/мин. После стадии отмывки с использованием, например, 20 мМ Трис, рН 6,5, 5 мМ ДТТ, для удаления несвязанного продукта можно осуществлять элюцию белка посредством одной стадии с использованием взятого в количестве, равном 8 объемам колонки, следующего буфера (20 мМ Трис, рН 6,5, 5 мМ ДТТ, 1,0 М NaCl). Продукт, полученный после осуществления АОХ, можно загружать снова на колонку с Q Sepharose и осуществлять элюцию согласно описанному выше методу для увеличения выхода. Такая двухстадийная процедура (гель-фильтрация с последующей анионообменной хроматографией) позволяет эффективно отделять антиген ORF2 PCV-2 от большей части других белковых компонентов, присутствующих в продукте, собранном после культивирования.

Таким образом, предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2 и III) очищают продукт, собранный на стадии II), который содержит антиген PCV-2, с помощью двух хроматографических стадий. Предпочтительно первая хроматографическая стадия отлична от второй хроматографической стадии. Если первая стадия представляет собой вытеснительную хроматографию (гель-фильтрацию), то вторая стадия может представлять собой ионообменную хроматографию, предпочтительно анионообменную хроматографию (АОХ). Предпочтительно в любом из описанных выше способах, включающих одну или несколько стадий очистки для получения очищенного антигена PCV-2, предпочтительно белка ORF-2 PCV-2, часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость. Замена предпочтительно заключается в том, что осуществляют стадии, на которых: а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, которая содержит антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2, предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз, по сравнению с объемом первой жидкости посредством отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза. В этом случае отделяют не только первую жидкость, но также и смесь первой и второй жидкостей. Предпочтительно каждую стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно с осуществлением стадии концентрирования. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости выполняют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре, что требуется для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны или любого другого фильтра, применяемого согласно настоящему изобретению, препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц. В предпочтительных вариантах описанный выше способ получения содержащей антиген PCV-2 композиции дополнительно включает стадии, на которых I) получают антиген PCV-2, содержащийся в первой жидкости, где антиген PCV-2 получают с использованием вирусного вектор, предпочтительно рекомбинантного бакуловирусного вирусного вектора, содержащего и экспрессирующего антиген PCV-2, предпочтительно ORF-2 PCV-2, и где антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 Rev-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2; II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2; III) инактивируют рекомбинантный бакуловирусный вирусный вектор с помощью агента, инактивирующего ДНК, предпочтительно в присутствии бинарного этиленимина в концентрации от примерно 1 до примерно 20 мМ; IV) добавляют нейтрализующий агент, который нейтрализует инактивирующий агент, предпочтительно в количестве, эквивалентном количеству инактивирующего агента, где нейтрализующий агент предпочтительно представляет собой раствор тиосульфата натрия, предпочтительно сконцентрированный до конечной концентрации, составляющей от примерно 1 до примерно 20 мМ, и где инактивирующий агент предпочтительно представляет собой BEI; и V) смешивают антиген PCV-2, полученный на стадии IV), с дополнительным компонентом, выбранным из группы, включающей фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, разбавители, эксципиенты и их комбинации. Путем дополнительной очистки, предпочтительно с применением стратегии двухстадийной очистки, включая стадию предварительной фильтрации, получают иммуногенную композицию, имеющую степень чистоты, составляющую более чем 80 мас.%, предпочтительно более чем 85 мас.%, еще более предпочтительно более чем 90 мас.%, наиболее предпочтительно более чем 95 мас.%, по отношению к общему количеству белка, содержащегося в иммуногенной композиции до смешения с каким-либо адъювантом.

Содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная с помощью представленного в настоящем описании способа, приводит к снижению менее чем на 1 log TCID50/мл живого вируса или менее чем на 1 log КОЕ/мл живой бактерии после смешения живого вируса или живой бактерии с содержащей антиген PCV-2 композицией и инкубации в течение 2 или более часов, предпочтительно в течение более чем 4 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 12 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 24 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 2 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 4 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 7 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 2 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 4 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 2 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 3 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 4 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 6 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 9 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 12 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 18 месяцев, наиболее предпочтительно в течение более чем 2 лет. Более предпочтительно содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная с помощью представленного в настоящем описании способа, приводит к снижению менее чем на 0,9 log TCID50/мл живого вируса или менее чем на 0,9 log КОЕ/мл живой бактерии после смешения живого вируса или живой бактерии с композицией на основе антигена PCV-2 и инкубации в течение 2 или более часов, предпочтительно в течение более чем 4 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 12 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 24 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 2 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 4 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 7 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 2 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 4 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 2 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 3 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 4 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 6 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 9 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 12 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 18 месяцев, наиболее предпочтительно в течение более чем 2 лет. Еще более предпочтительно содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная с помощью представленного в настоящем описании способа, приводит к снижению менее чем на 0,7 log TCID50/мл живого вируса или менее чем на 0,7 log КОЕ/мл живой бактерии после смешения живого вируса или живой бактерии с композицией на основе антигена PCV-2 и инкубации в течение 2 или более часов, предпочтительно в течение более чем 4 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 12 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 24 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 2 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 4 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 7 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 2 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 4 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 2 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 3 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 4 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 6 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 9 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 12 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 18 месяцев, наиболее предпочтительно в течение более чем 2 лет. Еще более предпочтительно содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная с помощью представленного в настоящем описании способа, приводит к снижению менее чем на 0,5 log TCID50/мл живого вируса или менее чем на 0,5 log КОЕ/мл живой бактерии после смешения живого вируса или живой бактерии с композицией на основе антигена PCV-2 и инкубации в течение 2 или более часов, предпочтительно в течение более чем 4 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 12 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 24 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 2 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 4 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 7 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 2 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 4 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 2 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 3 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 4 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 6 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 9 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 12 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 18 месяцев, наиболее предпочтительно в течение более чем 2 лет. Еще более предпочтительно содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная с помощью представленного в настоящем описании способа, приводит к снижению менее чем на 0,3 log TCID50/мл живого вируса или менее чем на 0,3 log КОЕ/мл живой бактерии после смешения живого вируса или живой бактерии с композицией на основе антигена PCV-2 и инкубации в течение 2 или более часов, предпочтительно в течение более чем 4 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 12 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 24 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 2 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 4 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 7 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 2 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 4 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 2 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 3 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 4 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 6 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 9 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 12 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 18 месяцев, наиболее предпочтительно в течение более чем 2 лет. Живой вирус может представлять собой любой живой вирус, но предпочтительно живой вирус представляет собой вирус PRRS, предпочтительно вирус PRRS, имеющий регистрационный номер ATCC VR 2332. Живая бактерия может представлять собой любую бактерию, но предпочтительно она представляет собой бактерию Mycoplasma hyopneumonia, предпочтительно J-штамм Mycoplasma hyopneumonia. Величину TCID50/мл можно определять с помощью стандартного титрационного анализа in vitro, который позволяет определять количество живого вируса. Величину КОЕ/мл можно определять с помощью стандартного титрационного анализа in vitro, который позволяет определять количество живой бактерии. Понятие «на мл» предпочтительно относится к 1 мл жидкости. Такой очищенный антиген PCV-2 не только обладает указанной в настоящем описании пониженной вирулицидной активностью, но он обладает также повышенной иммуногенностью по сравнению с указанным в настоящем описании неочищенным антигеном PCV-2, предпочтительно такой очищенный антиген PCV-2 усиливает клеточнозависимый и/или антитело-обусловленный иммунный ответ по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 75%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 100% по сравнению с клеточнозависимым и/или антитело-обусловленным иммунным ответом, вызываемым иммуногенной референс-композицией, содержащей неочищенный антиген PCV-2.

Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых: I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) удаляют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2, где содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная после осуществления стадии II), вызывает снижение менее чем на 1 log TCID50 (предпочтительно на 1 мл), предпочтительно менее чем на 0,9 log TCID50 (предпочтительно на 1 мл), еще более предпочтительно менее чем 0,7 log TCID50 (предпочтительно на 1 мл), еще более предпочтительно менее чем 0,5 log TCID50 (предпочтительно на 1 мл), наиболее предпочтительно менее чем на 0,3 log TCID50 (предпочтительно на 1 мл) живого вируса, предпочтительно живого PRRSV, или менее чем на 1 log КОЕ (предпочтительно на 1 мл), предпочтительно менее чем на 0,9 log КОЕ (предпочтительно 1 мл), еще более предпочтительно менее чем на 0,7 log КОЕ (предпочтительно на 1 мл), еще более предпочтительно менее чем на 0,5 log КОЕ (предпочтительно на 1 мл), наиболее предпочтительно менее чем на 0,3 log КОЕ (предпочтительно на 1 мл) живой бактерии, предпочтительно бактерии Mycoplasma hyopneumoniae, после смешения и инкубации живого вируса, предпочтительно PRRSV, или живой бактерии, предпочтительно бактерии Mycoplasma hyopneumoniae, с содержащей PCV-2 антигенной композицией в течение 2 или более часов, предпочтительно в течение более чем 4 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 12 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 24 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 2 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 4 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 7 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 2 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 4 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 2 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 3 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 4 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 6 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 9 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 12 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 18 месяцев, наиболее предпочтительно в течение более чем 2 лет. Предпочтительно часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость. Замена предпочтительно заключается в том, что осуществляют стадии, на которых: а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, которая содержит антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2, предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз, по сравнению с объемом первой жидкости посредством отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза. В этом случае отделяют не только первую жидкость, но также и смесь первой и второй жидкостей. Предпочтительно каждую стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно с осуществлением стадии концентрирования. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости выполняют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре, что требуется для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны или любого другого фильтра, применяемого согласно настоящему изобретению, препятствует прохождению через фильтр по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц. Когда антиген PCV-2 получают с использованием вирусного вектора, предпочтительно рекомбинантного бакуловирусного вирусного вектора, содержащего и экспрессирующего антиген PCV-2, предпочтительно, ORF-2 PCV-2, то процесс дополнительно заключается в том, что III) инактивируют рекомбинантный бакуловирусный вирусный вектор с помощью агента, инактивирующего ДНК, предпочтительно в присутствии бинарного этиленимина в концентрации от примерно 1 до примерно 20 мМ; IV) добавляют нейтрализующий агент, который нейтрализует инактивирующий агент, в количестве эквивалентном количеству инактивирующего агента, где нейтрализующий агент предпочтительно представляет собой раствор тиосульфата натрия, предпочтительно сконцентрированный до конечной концентрации, составляющей от примерно 1 до примерно 20 мМ, и где инактивирующий агент предпочтительно представляет собой BEI. Предпочтительно стадию инактивации и нейтрализации осуществляют после отделения по меньшей мере части первой жидкости от антигена PCV-2, более предпочтительно после сбора антигена PCV-2. Еще более предпочтительно стадию инактивации и нейтрализации осуществляют после отделения по меньшей мере части первой жидкости от антигена PCV-2 посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость. Когда замену части первой жидкости на вторую жидкость проводят путем осуществления стадий, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, еще более предпочтительно в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости посредством отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2, то стадию инактивации и нейтрализации осуществляют после стадии концентрирования. Когда стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза, то стадию инактивации и нейтрализации осуществляют после последней стадии добавления жидкости и стадии концентрирования. Когда стадию концентрирования осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- и/или ультрафильтрации, с использованием фильтра, предпочтительно содержащего полупроницаемую мембрану, то стадию инактивации и нейтрализации осуществляют после описанной выше стадии фильтрации, которую осуществляют предпочтительно с использованием полупроницаемой мембраны. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре, что требуется для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны или любого другого фильтра, применяемого согласно настоящему изобретению, препятствует прохождению через фильтр по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц. Предпочтительно дополнительную очистку для получения указанного в настоящем описании очищенного антигена PCV-2 можно проводить путем осуществления дополнительной стадии очистки III), на которой очищают посредством хроматографии содержащий антиген PCV-2 продукт, собранный на стадии II), который получают после отделения части первой жидкости. Для достижения более высокой степени чистоты можно осуществлять вторую стадию хроматографии, которая, однако, должна быть отличной от первой. Например, если первая стадия очистки/стадия хроматографии представляет собой вытеснительную хроматографию (гель-фильтрацию), то вторая стадия должна быть отличной от нее, например, она может представлять собой аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию и т.д. Предпочтительно, если первая стадия очистки антигена PCV-2, предпочтительно очистки антигена ORF2 PCV-2, представляет собой вытеснительную хроматографию (гель-фильтрацию), то вторая стадия может представлять собой ионообменную хроматографию, предпочтительно анионообменную хроматографию (АОХ). Предпочтительной матрицей для анионообменной хроматографии для целей очистки антигена PCV-2, предпочтительно ORF2 PCV-2, является Q Sepharose. Для маломасштабного производства, при работе с объемами, составляющими примерно 50 мл, наиболее предпочтительными являются колонки, упакованные 5 мл HiTrap Q Sepharose HP. Анионообменную хроматографию можно осуществлять, например, согласно методу, описанному в примере 3. В целом метод заключается в следующем. Примерно 50 мл пула фракций «мертвого» объема, полученных после стадии гель-фильтрации, можно загружать на АОХ-колонку при скорости потока 3,0 мл/мин. После стадии отмывки с использованием, например, 20 мМ Трис, рН 6,5, 5 мМ ДТТ, для удаления несвязанного продукта можно осуществлять элюцию белка посредством одной стадии с использованием взятого в количестве, равном 8 объемам колонки, следующего буфера (20 мМ Трис, рН 6,5, 5 мМ ДТТ, 1,0 М NaCl). Продукт, полученный после АОХ, можно загружать снова на колонку с Q Sepharose и осуществлять элюцию согласно описанному выше методу для увеличения выхода. Такая двухстадийная процедура (гель-фильтрация с последующей анионообменной хроматографией) позволяет эффективно отделять антиген ORF2 PCV-2 от большей части других белковых компонентов, которые присутствуют в продукте, собранном после культивирования.

Содержащую PCV-2 антигенную композицию, полученную согласно описанному выше способу, или антиген PCV-2, применяемый на стадии I) описанного выше способа, можно объединять по меньшей мере с одним дополнительным антигеном, предпочтительно вирусным или бактериальным антигеном, и еще более предпочтительно, вирусным или бактериальным антигеном, выделенным из по меньшей мере одного другого болезнетворного организма, вызывающего заболевание у свиней. Дополнительный антиген может представлять собой любой из антигенов, описанных в международной заявке на патент WO 2007/094893 (содержание и сущность указанной заявки включены в настоящее описание в качестве ссылки). В целом, дополнительные антигены могут представлять собой антигены любых других болезнетворных организмов, вызывающих заболевание у свиней. Предпочтительно «другие болезнетворные организмы» выбирают из группы, включающей: Actinobacillus pleuropneumonia (1); аденовирус (2); альфавирус, такой как вирус восточного энцефаломиелита свиней (3); Bordetella bronchiseptica (4); Brachyspira spp. (5), предпочтительно В. hyodyentheriae (6); В. piosicoli (7), Brucella suis, предпочтительно биовары 1, 2 и 3 (8); вирус классической свиной лихорадки (9); Clostridium spp. (10), предпочтительно Cl. difficile (11), Cl. perfringens типов А, В и С (12), Cl. novyi (13), Cl. septicum (14), Cl. tetani (15); коронавирус (16), предпочтительно свиной респираторный коронавирус (17); Eperythrozoonosis suis (18); Erysipelothrix rhsiopathiae (19) Escherichia coli (20); Haemophilus parasuis, предпочтительно подтипов 1,7 и 14 (21); вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита (22); вирус японского энцефалита (23); Lawsonia intracellularis (24); Leptospira spp. (25), предпочтительно Leptospira australis (26); Leptospira canicola (27); Leptospira grippotyphosa (28); Leptospira icterohaemorrhagicae (29) и Leptospira interrogans (30); Leptospira pomona (31); Leptospira tarassovi (32); Mycobacterium spp. (33), предпочтительно M avium (34), M. intracellulare (35) и M. bovis (36); Mycoplasma hyopneumoniae (37); Pasteurella multocida (38); свиной цитомегаловирус (39); свиной парвовирус (40); вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (41); вирус псевдобешенства (42); ротавирус (43); Salmonella spp. (44), предпочтительно S. thyhimurium (45) и S. choleraesuis (46); Staph. hyicus (47); Staphylococcus spp. (48), предпочтительно Streptococcus spp. (49), предпочтительно Strep. suis (50); герпесвирус свиней (51); вирус свиного гриппа (52); вирус свиной чумы (53); вирус свиной чумы (54); вирус везикулярного стоматита (55); вирус везикулярной экзантемы свиней (56); Leptospira Hardjo (57) и/или Mycoplasma hyosynoviae (58).

Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают антиген PCV-2, содержащийся в первой жидкости; II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2; и объединяют антиген PCV-2 по меньшей мере с одним дополнительным антигеном, предпочтительно вирусным или бактериальным антигеном, и более предпочтительно вирусным или бактериальным антигеном из по меньшей мере одного другого болезнетворного организма, вызывающего заболевание у свиней. Предпочтительно антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2. Предпочтительно часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость. Замена предпочтительно заключается в том, что осуществляют стадии, на которых: а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, которая содержит антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2, предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз, по сравнению с объемом первой жидкости посредством удаления части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза. В этом случае удаляют не только первую жидкость, но также и смесь первой и второй жидкостей. Предпочтительно каждую стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно с осуществлением стадии концентрирования. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости выполняют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре, что требуется для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны или любого другого фильтра, применяемого согласно настоящему изобретению, препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц. Дополнительную очистку с целью получения очищенного антигена PCV-2 можно осуществлять согласно описанной выше процедуре.

Предпочтительные варианты способа получения описанной выше содержащей PCV-2 антигенной композиции дополнительно включают стадии, на которых I) получают антиген PCV-2, содержащийся в первой жидкости, где антиген PCV-2 получают с использованием вирусного вектора, предпочтительно рекомбинантного бакуловирусного вирусного вектора, содержащего и экспрессирующего антиген PCV-2, предпочтительно ORF-2 PCV-2, и где антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2; II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2; III) инактивируют рекомбинантный бакуловирусный вирусный вектор с помощью агента, инактивирующего ДНК, предпочтительно в присутствии бинарного этиленимина в концентрации от примерно 1 до примерно 20 мМ; IV) добавляют нейтрализующий агент, который нейтрализует инактивирующий агент, в количестве, эквивалентном количеству инактивирующего агента, где нейтрализующий агент предпочтительно представляет собой раствор тиосульфата натрия, предпочтительно сконцентрированный до конечной концентрации, составляющей от примерно 1 до примерно 20 мМ, и где инактивирующий агент предпочтительно представляет собой BEI; и V) смешивают антиген PCV-2, полученный на стадии IV), с дополнительным компонентом, выбранным из группы, включающей фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, разбавители, эксципиенты и их комбинации.

В другом варианте способа по меньшей мере один дополнительный антиген представляет собой вирусный антиген, предпочтительно антиген, полученный из вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней. Еще более предпочтительно антиген, полученный из вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней, представляет собой живой вирус и еще более предпочтительно модифицированный живой вирус, еще более предпочтительно модифицированный живой ослабленный вирус. Еще более предпочтительно антиген модифицированного живого вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней, представляет собой модифицированный живой штамм вируса, имеющий регистрационный номер АТСС VR 2332, и еще более предпочтительно представляет собой модифицированный живой вирус (MLV) PRRS, применяемый в вакцине INGELVAC®. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают антиген PCV-2, содержащийся в первой жидкости; II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2; и объединяют антиген PCV-2 с антигеном из вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней. Предпочтительно антиген, полученный из вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней, представляет собой живой вирус и еще более предпочтительно модифицированный живой вирус, еще более предпочтительно модифицированный живой ослабленный вирус. Еще более предпочтительно антиген модифицированного живого вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней, представляет собой модифицированный живой штамм вируса, имеющий регистрационный номер ATCC VR 2332, и еще более предпочтительно представляет собой MLV PRRS, применяемый в вакцине INGELVAC®. Предпочтительно антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2. Предпочтительно часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость. Замена предпочтительно заключается в том, что осуществляют стадии, на которых: а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, которая содержит антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2, предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз, по сравнению с объемом первой жидкости посредством отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза. В этом случае удаляют не только первую жидкость, но также и смесь первой и второй жидкостей. Предпочтительно каждую стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно с осуществлением стадии концентрирования. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости выполняют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре, что требуется для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны или любого другого фильтра, применяемого согласно настоящему изобретению, препятствует прохождению через фильтр по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц. Дополнительную очистку с целью получения очищенного антигена PCV-2 можно осуществлять согласно описанной выше процедуре.

В другом объекте настоящего изобретения по меньшей мере один дополнительный антиген представляет собой бактериальный антиген, предпочтительно из Mycoplasma hyopneumoniae. Предпочтительно антиген из Mycoplasma hyopneumoniae представляет собой бактерии, и более предпочтительно бактерии Mycoplasma hyopneumoniae представляет собой INGELVAC® MYCOFLEX. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают антиген PCV-2, содержащийся в первой жидкости; II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2; и объединяют антиген PCV-2 с бактериальным антигеном, предпочтительно Mycoplasma hyopneumoniae. Предпочтительно антиген Mycoplasma hyopneumoniae представляет собой бактерии, и более предпочтительно бактерии Mycoplasma hyopneumoniae представляет собой INGELVAC® MYCOFLEX. Предпочтительно антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2. Предпочтительно часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость. Замена предпочтительно заключается в том, что осуществляют стадии, на которых: а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, которая содержит антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2, предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз, по сравнению с объемом первой жидкости посредством удаления части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза. В этом случае удаляют не только первую жидкость, но также и смесь первой и второй жидкостей. Предпочтительно каждую стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно с осуществлением стадии концентрирования. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости выполняют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре, что требуется для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны или любого другого фильтра, применяемого согласно настоящему изобретению, препятствует прохождению через фильтр по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц. Дополнительную очистку с целью получения очищенного антигена PCV-2 можно осуществлять согласно описанной выше процедуре.

В другом объекте настоящего изобретения по меньшей мере один дополнительный антиген включает вирусный антиген, предпочтительно описанный выше антиген вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней, и бактериальный антиген, предпочтительно описанный выше антиген Mycoplasma hyopneumoniae. Предпочтительно антиген вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней представляет собой живой вирус, более предпочтительно модифицированный живой вирус и еще более предпочтительно модифицированный живой штамм вируса, имеющий регистрационный номер АТСС VR 2332, и еще более предпочтительно представляет собой MLV PRRS, применяемый в вакцине INGELVAC®. Предпочтительно антиген Mycoplasma hyopneumoniae представляет собой бактерии, и более предпочтительно бактерии Mycoplasma hyopneumoniae представляет собой INGELVAC® MYCOFLEX. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают антиген PCV-2, содержащийся в первой жидкости; II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2; и объединяют антиген PCV-2 с вирусным антигеном, предпочтительно с описанным выше антигеном вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней, и с бактериальным антигеном, предпочтительно с описанным выше антигеном Mycoplasma hyopneumoniae. Предпочтительно антиген вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней представляет собой живой вирус, более предпочтительно модифицированный живой вирус и еще более предпочтительно модифицированный живой штамм вируса, имеющий регистрационный номер АТСС VR 2332, и еще более предпочтительно представляет собой MLV PRRS, применяемый в вакцине INGELVAC®. Предпочтительно антиген Mycoplasma hyopneumoniae представляет собой бактерии и более предпочтительно бактерии Mycoplasma hyopneumoniae представляет собой INGELVAC® MYCOFLEX. Предпочтительно антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2. Предпочтительно часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость. Замена предпочтительно заключается в том, что осуществляют стадии, на которых: а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, которая содержит антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2, предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз, по сравнению с объемом первой жидкости посредством отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза. В этом случае удаляют не только первую жидкость, но также и смесь первой и второй жидкостей. Предпочтительно каждую стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно с осуществлением стадии концентрирования. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости выполняют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре, что требуется для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны или любого другого фильтра, применяемого согласно настоящему изобретению, препятствует прохождению через фильтр по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц. Дополнительную очистку с целью получения очищенного антигена PCV-2 можно осуществлять согласно описанной выше процедуре.

В настоящем изобретении предложены не только способы получения содержащих PCV-2 антигенных композиций, но также и содержащая PCV-2 антигенная композиция. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является содержащая PCV-2 антигенная композиция, отличающаяся тем, что содержащая PCV-2 антигенная композиция приводит к снижению менее чем на 1 log TCID50/мл живого вируса или менее чем на 1 log КОЕ/мл живой бактерии после смешения живого вируса или живой бактерии с содержащей PCV-2 антигенной композицией и инкубации в течение 2 или более часов, предпочтительно в течение более чем 4 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 12 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 24 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 2 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 4 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 7 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 2 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 4 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 2 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 3 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 4 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 6 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 9 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 12 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 18 месяцев, наиболее предпочтительно в течение более чем 2 лет. Более предпочтительно содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная с помощью представленного в настоящем описании способа, приводит к снижению менее чем на 0,9 log TCID50/мл живого вируса или менее чем на 0,9 log КОЕ/мл живой бактерии после смешения живого вируса или живой бактерии с композицией на основе антигена PCV-2 и инкубации в течение 2 или более часов, предпочтительно в течение более чем 4 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 12 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 24 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 2 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 4 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 7 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 2 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 4 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 2 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 3 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 4 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 6 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 9 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 12 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 18 месяцев, наиболее предпочтительно в течение более чем 2 лет. Еще более предпочтительно содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная с помощью представленного в настоящем описании способа, приводит к снижению менее чем на 0,7 log TCID50/мл живого вируса или менее чем на 0,7 log КОЕ/мл живой бактерии после смешения живого вируса или живой бактерии с содержащей антиген PCV-2 композицией и инкубации в течение 2 или более часов, предпочтительно в течение более чем 4 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 12 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 24 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 2 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 4 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 7 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 2 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 4 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 2 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 3 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 4 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 6 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 9 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 12 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 18 месяцев, наиболее предпочтительно в течение более чем 2 лет. Еще более предпочтительно содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная с помощью представленного в настоящем описании способа, приводит к снижению менее чем на 0,5 log TCID50/мл живого вируса или менее чем на 0,5 log КОЕ/мл живой бактерии после смешения живого вируса или живой бактерии с композицией на основе антигена PCV-2 и инкубации в течение 2 или более часов, предпочтительно в течение более чем 4 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 12 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 24 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 2 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 4 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 7 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 2 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 4 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 2 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 3 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 4 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 6 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 9 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 12 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 18 месяцев, наиболее предпочтительно в течение более чем 2 лет. Еще более предпочтительно антигенная композиция на основе PCV-2, полученная с помощью представленного в настоящем описании способа, приводит к снижению менее чем на 0,3 log TCID50/мл живого вируса или менее чем на 0,3 log КОЕ/мл живой бактерии после смешения живого вируса или живой бактерии с композицией на основе антигена PCV-2 и инкубации в течение 2 или более часов, предпочтительно в течение более чем 4 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 12 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 24 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 2 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 4 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 7 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 2 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 4 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 2 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 3 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 4 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 6 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 9 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 12 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 18 месяцев, наиболее предпочтительно в течение более чем 2 лет. Живой вирус может представлять собой любой живой вирус, но предпочтительно живой вирус представляет собой вирус PRRS, предпочтительно вирус PRRS, имеющий регистрационный номер ATCC VR 2332. Живая бактерия может представлять собой любую бактерию, но предпочтительно она представляет собой бактерию Mycoplasma hyopneumonia, предпочтительно J-штамм Mycoplasma hyopneumonia. Величину TCID50/мл можно определять с помощью стандартного титрационного анализа in vitro, который позволяет определять количество живого вируса. Величину КОЕ/мл можно определять с помощью стандартного титрационного анализа in vitro, который позволяет определять количество живой бактерии. Понятие «на мл» предпочтительно относится к 1 мл жидкости.

Согласно следующему объекту изобретения описанная выше содержащая PCV-2 антигенная композиция содержит дополнительный компонент, выбранный из группы, включающей фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, разбавители, эксципиенты и их комбинации. Предпочтительно дополнительный компонент представляет собой адъювант, еще более предпочтительно адъювант представляет собой полимер акриловой или метакриловой кислоты, и еще более предпочтительно адъювант представляет собой карбомер. Предпочтительно адъювант добавляют в количестве, составляющем от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве, составляющем от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. И еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве, составляющем от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве, составляющем от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу. Наиболее предпочтительно адъювант добавляют в количестве, составляющем примерно 1 мг на дозу.

В настоящем изобретении предложены не только способы получения содержащих PCV-2 антигенных композиций и/или описанные выше содержащие PCV-2 антигенные композиции, но изобретение относится также к содержащей PCV-2 антигенной композиции, которую можно получать с помощью любого из представленных в настоящем описании способов. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является содержащая PCV-2 антигенная композиция, которая получена с помощью способа, заключающегося в том, что осуществляют стадии, на которых: I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) удаляют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2. Предпочтительно антиген PCV-2 применяют в качестве или в составе содержащей PCV-2 антигенной композиции. Понятие «содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная с помощью представленных в настоящем описании способов» относится также и к содержащей PCV-2 антигенной композиции, которую можно получать с помощью представленного в настоящем описании способа. Таким образом, следующий объект настоящего изобретения относится к содержащей PCV-2 антигенной композиции, которую получают путем отделения части первой жидкости от антигена PCV-2 посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость, где вторая жидкость отлична от первой жидкости. Таким образом, следующий объект настоящего изобретения относится к содержащей PCV-2 антигенной композиции, которую получают с помощью способа, заключающегося в том, что осуществляют стадии, на которых: I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2, при этом часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость, где вторая жидкость отлична от первой жидкости. Предпочтительно замена части первой жидкости на вторую жидкость заключается в осуществлении стадий, на которых: а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, которая содержит антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 путем отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2.

Согласно следующему объекту изобретения содержащую PCV-2 антигенную композицию предпочтительно получают с помощью способа, в котором часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 путем осуществления стадии фильтрации с использованием фильтра. Однако, для отделения части первой и второй жидкости от антигена PCV-2 можно применять также любые другие методы, известные специалисту в данной области, например, центрифугирование и/или хроматографию. Однако наиболее предпочтительной является фильтрация. Предпочтительными методами фильтрации для удаления части первой жидкости являются ультра- и/или диафильтрация. Стадию концентрирования и стадию добавления жидкости в представленном в настоящем описании способе можно осуществлять практически одновременно или в альтернативном варианте стадию концентрирования и стадию добавления жидкости можно осуществлять последовательно. Таким образом, следующий объект настоящего изобретения относится к содержащей PCV-2 антигенной композиции, которую получают с помощью способа, заключающегося в том, что осуществляют стадии, на которых: I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2, при этом часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость, где вторая жидкость отлична от первой жидкости. Предпочтительно замена части первой жидкости на вторую жидкость заключается в осуществлении стадий, на которых: а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, которая содержит антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 путем отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2, при этом стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости осуществляют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Например, согласно следующему объекту изобретения стадию добавления жидкости осуществляют перед стадией концентрирования, а согласно альтернативному объекту изобретения стадию концентрирования осуществляют перед стадией добавления жидкости.

Следующий объект настоящего изобретения относится к содержащей PCV-2 антигенной композиции, которую можно получать с помощью представленного в настоящем описании способа, в котором стадию добавления жидкости и стадию концентрирования можно осуществлять несколько раз независимо от порядка их осуществления. Например, каждую из указанных стадий можно осуществлять по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере 10 раз и вплоть до любого необходимого количества раз. Согласно одному из объектов изобретения стадию концентрирования и стадию добавления жидкости каждую осуществляют по меньшей мере два раза. Согласно другому объекту изобретения стадию концентрирования и стадию добавления жидкости каждую осуществляют по меньшей мере три раза.

Согласно следующему объекту настоящего изобретения содержащую PCV-2 антигенную композицию получают с помощью описанного выше способа, в котором фильтрация является предпочтительным методом отделения части первой жидкости или, как это имеет место в описанном выше случае нескольких стадий отделения части смеси первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. В качестве фильтра можно использовать любой обычно применяемый в данной области фильтр. Предпочтительно фильтр включает полупроницаемую мембрану. В еще одном предпочтительном варианте полупроницаемая мембрана имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре. Согласно следующему объекту изобретения фильтр имеет средний размер пор, который препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно фильтр имеет средний размер пор, который препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно фильтр имеет средний размер пор, который препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц. Согласно еще одному объекту изобретения полупроницаемая мембрана состоит из материала, выбранного из группы, включающей полисульфон, полиэфирсульфон и регенерированную целлюлозу. Однако можно использовать любой другой материал, который позволяет отделять часть первой жидкости и в случае стадии многократного повторения процесса отделять часть смеси первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Согласно еще одному объекту изобретения фильтр выбирают из группы, включающей картридж для ультрафильтрации с половолоконной мембраной, фильтр с мембраной в виде плоского листа или кассетный фильтр, при этом наиболее предпочтительным является картридж для ультрафильтрации с половолоконной мембраной.

Таким образом, еще один объект настоящего изобретения относится к содержащей PCV-2 антигенной композиции, которую получают с помощью представленных в настоящем описании способов, в которых фильтр предпочтительно представляет собой или содержит полупроницаемую мембрану. Предпочтительно полупроницаемая мембрана имеет средний размер пор, который меньше чем размер антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны препятствует прохождению по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц. Как указано выше, стадия удаления, как правило, предусматривает замену части первой жидкости на часть второй жидкости путем осуществления стадий, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 путем отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2, при этом стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, например, два раза, три раза, 5 раз, 10 раз и т.д. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют два раза, наиболее предпочтительно три раза.

Стадию концентрирования в предлагаемом в настоящем изобретении способе получения содержащей PCV-2 антигенной композиции осуществляют таким образом, чтобы сконцентрировать антиген PCV-2 в 3-50 раз по сравнению с объемом первой жидкости. Более предпочтительно стадию концентрирования осуществляют таким образом, чтобы сконцентрировать антиген PCV-2 в 4-20 раз по сравнению с объемом первой жидкости. Наиболее предпочтительно стадию концентрирования осуществляют таким образом, чтобы сконцентрировать антиген PCV-2 в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная с помощью описанного выше способа, согласно которому антиген PCV-2 концентрируют в 3-50 раз, предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости. Предпочтительно часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 путем замены части первой жидкости на вторую жидкость, осуществляя стадии, на которых а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, содержащей антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 в 3-50 раз, предпочтительно в 4-20 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз, по сравнению с объемом первой жидкости посредством отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Предпочтительно стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно с осуществлением стадии концентрирования. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости осуществляют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны препятствует прохождению через фильтр по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц.

Предпочтительно дополнительную очистку для получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, которая содержит представленный в настоящем описании очищенный антиген PCV-2, можно проводить путем осуществления дополнительной стадии очистки III), на которой очищают с помощью хроматографии (с применением любого из представленных в настоящем описании методов) содержащий антиген PCV-2 продукт, собранный на стадии II), который получают после отделения части первой жидкости. Для достижения более высокой степени чистоты можно осуществлять вторую стадию хроматографии, которая, однако, должна быть отличной от первой. Например, если первая стадия очистки/стадия хроматографии представляет собой вытеснительную хроматографию (гель-фильтрацию), то вторая стадия должна быть отличной от нее, например, она может представлять собой аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию и т.д. Предпочтительно, если первая стадия очистки антигена PCV-2, предпочтительно очистки антигена ORF2 PCV-2, представляет собой вытеснительную хроматографию (гель-фильтрацию), то вторая стадия может представлять собой ионообменную хроматографию, предпочтительно анионообменную хроматографию (АОХ). Предпочтительной матрицей для анионообменной хроматографии для целей очистки антигена PCV-2, предпочтительно ORF2 PCV-2, является Q Sepharose. Для маломасштабного производства, при работе с объемами, составляющими примерно 50 мл, наиболее предпочтительными являются колонки, упакованные 5 мл HiTrap Q Sepharose HP. Анионообменную хроматографию можно осуществлять, например, согласно методу, описанному в примере 3. В целом метод заключается в следующем. Примерно 50 мл пула фракций пустого объема, полученных после стадии гель-фильтрации, можно загружать на АОХ-колонку при скорости потока 3,0 мл/мин. После стадии отмывки с использованием, например, 20 мМ Трис, рН 6,5, 5 мМ ДТТ, для удаления несвязанного продукта можно осуществлять элюцию белка посредством одной стадии с использованием взятого в количестве, равном 8 объемам колонки, следующего буфера (20 мМ Трис, рН 6,5, 5 мМ ДТТ, 1,0 М NaCl). Продукт, полученный после АОХ, можно загружать снова на колонку с Q Sepharose и осуществлять элюцию согласно описанному выше методу для увеличения выхода. Такая двухстадийная процедура (гель-фильтрация с последующей анионообменной хроматографией) позволяет эффективно отделять антиген ORF2 PCV-2 от большей части других белковых компонентов, которые присутствуют в продукте, собранном после культивирования.

Согласно еще одному объекту изобретения вирулицидную активность содержащей PCV-2 антигенной композиции, полученной с помощью представленных в настоящем описании способов, снижают по меньшей мере на 10% по сравнению с вирулицидной активностью жидкости, которую не подвергали обработке указанным способом. Более предпочтительно вирулицидную активность содержащей PCV-2 антигенной композиции, снижают по меньшей мере на 50% по сравнению с вирулицидной активностью первой жидкости, которую не подвергали обработке указанным способом. Еще более предпочтительно вирулицидную активность содержащей PCV-2 антигенной композиции, снижают по меньшей мере на 70% по сравнению с вирулицидной активностью первой жидкости, которую не подвергали обработке указанным способом.

Таким образом, еще один объект настоящего изобретения относится к содержащей PCV-2 антигенной композиции, полученной с помощью способа, который заключается в том, что осуществляют стадии, на которых I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2, при этом вирулицидную активность, предпочтительно в отношении вируса PRRS, содержащей PCV-2 антигенной композиции, полученной после осуществления стадии II), снижают по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90% по сравнению с вирулицидной активностью первой жидкости. Предпочтительно часть первой жидкости, обладающей вирулицидной активностью, отделяют от антигена PCV-2 путем замены части первой жидкости на вторую жидкость. Предпочтительно замена части первой жидкости на вторую жидкость заключается в том, что осуществляют стадии, на которых: а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, которая содержит антиген PCV-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-50 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости путем отделения части первой и второй жидкости от антигена PCV-2. Предпочтительно стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно с осуществлением описанной выше стадии концентрирования. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости осуществляют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны препятствует прохождению через фильтр по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде целого вируса или в виде вирусоподобных частиц. Дополнительную очистку для получения очищенного антигена PCV-2 можно осуществлять согласно описанной выше процедуре.

Следующий объект настоящего изобретения относится к содержащей PCV-2 антигенной композиции, полученной с помощью представленного в настоящем описании способа, где содержащая PCV-2 антигенная композиция приводит к снижению менее чем на 1 log TCID50 (предпочтительно на 1 мл), предпочтительно менее чем на 0,9 log TCID50 (предпочтительно на 1 мл), еще более предпочтительно менее чем на 0,7 log TCID50 (предпочтительно на 1 мл), еще более предпочтительно менее чем на 0,5 log TCID50 (предпочтительно на 1 мл), наиболее предпочтительно менее чем на 0,3 log TCID50 (предпочтительно на 1 мл) живого вируса, предпочтительно живого PRRSV, или менее чем на 1 log КОЕ (предпочтительно на 1 мл), предпочтительно менее чем на 0,9 log КОЕ (предпочтительно на 1 мл), еще более предпочтительно менее чем на 0,7 log КОЕ (предпочтительно на 1 мл), еще более предпочтительно менее чем на 0,5 log КОЕ (предпочтительно на 1 мл), наиболее предпочтительно менее чем на 0,3 log КОЕ (предпочтительно на 1 мл) живой бактерии, предпочтительно Mycoplasma hyopneumoniae, после смешения живого вируса, предпочтительно PRRSV, или живой бактерии, предпочтительно Mycoplasma hyopneumoniae с содержащей PCV-2 антигенной композицией и инкубации в течение 2 или более часов, предпочтительно в течение более чем 4 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 12 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 24 ч, еще более предпочтительно в течение более чем 2 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 4 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 7 дней, еще более предпочтительно в течение более чем 2 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 4 недель, еще более предпочтительно в течение более чем 2 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 3 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 4 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 6 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 9 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 12 месяцев, еще более предпочтительно в течение более чем 18 месяцев, и наиболее предпочтительно в течение более чем 2 лет. Живой вирус может представлять собой любой живой вирус, но предпочтительно живой вирус представляет собой вирус PRRS, предпочтительно вирус PRRS, имеющий регистрационный номер ATCC VR 2332. Живая бактерия может представлять собой любую бактерию, но предпочтительно она представляет собой бактерию Mycoplasma hyopneumoniae, предпочтительно J-штамм Mycoplasma hyopneumoniae. Величину TCID50 на 1 мл можно оценивать с помощью стандартного титрационного анализа in vitro, который позволяет определять количество живого вируса. Величину КОЕ на 1 мл также можно оценивать с помощью стандартного титрационного анализа in vitro, который позволяет определять количество живой бактерии. Понятие «на 1 мл» предпочтительно относится к 1 мл жидкости.

Следующим объектом настоящего изобретения является содержащая PCV-2 антигенная композиция, которую получают с помощью описанного выше способа, дополнительно включающего стадию сбора антигена PCV-2, оставшегося после осуществления стадии II). Этот сбор можно осуществлять любым пригодным методом. Наиболее предпочтительная процедура сбора заключается в том, что отделяют часть первой жидкости от антигена PCV-2 посредством осуществления стадии фильтрации и антиген PCV-2 выделяют или собирают из остатка на фильтре.

Согласно следующему объекту изобретения содержащую PCV-2 антигенную композицию, полученную с помощью любого из представленных в настоящем описании способов, смешивают с дополнительным компонентом, выбранным из группы, включающей фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, разбавители, эксципиенты и их комбинации. Предпочтительно дополнительный компонент представляет собой адъювант, еще более предпочтительно адъювант представляет собой полимер акриловой или метакриловой кислоты и еще более предпочтительно адъювант представляет собой карбомер.

Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная с помощью описанного выше способа, который дополнительно включает стадию смешения антигена PCV-2, полученного с помощью представленного в настоящем описании способа, с дополнительным компонентом, выбранным из группы, включающей фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, разбавители, эксципиенты и их комбинации. Предпочтительно дополнительный компонент представляет собой адъювант, еще более предпочтительно адъювант представляет собой полимер акриловой или метакриловой кислоты и еще более предпочтительно адъювант представляет собой карбомер. Предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу. Наиболее предпочтительно адъювант добавляют в количестве примерно 1 мг на дозу.

Согласно следующему объекту изобретения описанная выше содержащая PCV-2 антигенная композиция включает белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная с помощью описанного выше способа, где антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2.

Как указано выше, антиген PCV-2, который применяют в способе, представленном в настоящем описании, можно получать с помощью любого метода, известного в данной области. Предпочтительно антиген PCV-2 получают с использованием вирусного вектора, предпочтительно рекомбинантного бакуловирусного вирусного вектора, содержащего и экспрессирующего антиген PCV-2, предпочтительно ORF-2 PCV-2. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антиген PCV-2 получают согласно процедурам, описанным в WO 2006/072065 (сущность и содержание указанной заявки было включено выше в настоящее описание в качестве ссылки). Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная с помощью описанного выше способа, где антиген PCV-2 получают с использованием вирусного вектора, предпочтительно рекомбинантного бакуловирусного вирусного вектора, содержащего и экспрессирующего антиген PCV-2, предпочтительно ORF-2 PCV-2, и где антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV-2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2.

Согласно следующему объекту настоящего изобретения содержащую PCV-2 антигенную композицию получают с помощью описанного выше способа, который дополнительно включает стадию инактивации рекомбинантного бакуловирусного вирусного вектора с помощью агента, инактивирующего ДНК, предпочтительно в присутствии бинарного этиленимина в концентрации от примерно 1 до примерно 20 мМ. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию, на которой добавляют агент, который нейтрализует агент, инактивирующий ДНК, в количестве эквивалентном количеству агента, инактивирующего ДНК, где агент, нейтрализующий агент, инактивирующий ДНК, представляет собой раствор тиосульфата натрия, сконцентрированный до конечной концентрации, составляющей от примерно 1 до примерно 20 мМ, и где инактивирующий ДНК агент представляет собой BEI. Предпочтительно стадию инактивации осуществляют после отделения по меньшей мере части первой жидкости от антигена PCV-2.

Согласно следующему объекту настоящего изобретения содержащую PCV-2 антигенную композицию получают с помощью описанного выше способа, который дополнительно включает стадии смешения антигена PCV-2, полученного после осуществления стадий инактивации и нейтрализации. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная с помощью описанного выше способа, включающего стадии, на которых I) получают антиген PCV-2, присутствующий в первой жидкости; II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2; III) инактивируют рекомбинантный бакуловирусный вирусный вектор с помощью агента, инактивирующего ДНК, предпочтительно в присутствии бинарного этиленимина в концентрации от примерно 1 до примерно 20 мМ; IV) добавляют агент, который нейтрализует агент, инактивирующий ДНК, в количестве, эквивалентном количеству агента, инактивирующего ДНК, где нейтрализующий агент представляет собой раствор тиосульфата натрия, сконцентрированный до конечной концентрации, составляющей от примерно 1 до примерно 20 мМ, и где инактивирующий агент предпочтительно представляет собой BEI; и предпочтительно осуществляют стадию V), заключающуюся в том, что смешивают антиген PCV-2, полученный на стадии IV), с дополнительным компонентом, выбранным из группы, включающей фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, разбавители, эксципиенты и их комбинации.

Согласно следующему объекту настоящего изобретения описанная выше содержащая PCV-2 антигенная композиция, предпочтительно полученная согласно описанным выше способам, дополнительно содержит по меньшей мере один другой антиген, предпочтительно вирусный или бактериальный антиген, и более предпочтительно вирусный или бактериальный антиген из по меньшей мере одного другого болезнетворного организма, вызывающего заболевание у свиней. Согласно еще одному объекту изобретения по меньшей мере один дополнительный антиген представляет собой вирус респираторного и репродуктивного синдрома свиней. Еще более предпочтительно вирус респираторного и репродуктивного синдрома свиней представляет собой живой вирус и еще более предпочтительно представляет собой модифицированный живой вирус. Еще более предпочтительно модифицированный живой вирус респираторного и репродуктивного синдрома свиней представляет собой модифицированный живой штамм вируса, имеющий регистрационный номер ATCC VR 2332, и еще более предпочтительно представляет собой MLV PRRS INGELVAC®. Согласно следующему объекту настоящего изобретения по меньшей мере один дополнительный антиген представляет собой Mycoplasma hyopneumoniae. Предпочтительно антиген Mycoplasma hyopneumoniae представляет собой бактерии, и более предпочтительно бактерии Mycoplasma hyopneumoniae представляет собой MYCOFLEX INGELVAC®. Согласно следующему объекту настоящего изобретения описанная выше содержащая PCV-2 антигенная композиция, предпочтительно полученная согласно описанным выше способам, дополнительно содержит антиген вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней, предпочтительно модифицированный живой вирус респираторного и репродуктивного синдрома свиней, еще более предпочтительно вирус респираторного и репродуктивного синдрома свиней, имеющий регистрационный номер АТСС VR 2332, или вирус респираторного и репродуктивного синдрома свиней, применяемый в MLV PRRS INGELVAC® или в АТР PRRS INGELVAC®. Согласно следующему объекту настоящего изобретения описанная выше содержащая PCV-2 антигенная композиция, предпочтительно полученная согласно описанным выше способам, дополнительно включает Mycoplasma hyopneumoniae, предпочтительно бактерин Mycoplasma hyopneumoniae, и еще более предпочтительно MYCOFLEX INGELVAC® или бактерин Mycoplasma hyopneumoniae, применяемый в MYCOFLEX INGELVAC®. Согласно следующему объекту настоящего изобретения представленная в настоящем описании содержащая PCV-2 антигенная композиция включает вирус респираторного и репродуктивного синдрома свиней, предпочтительно любой из описанный выше, и Mycoplasma hyopneumoniae, предпочтительно любую из описанных выше.

В том случае, когда содержащую PCV-2 антигенную композицию, включающую описанный выше по меньшей мере один дополнительный антиген из по меньшей мере одного болезнетворного организма, вызывающего заболевание у свиней, предпочтительно вирус респираторного и репродуктивного синдрома свиней и/или антиген Mycoplasma hyopneumoniae, получают с помощью представленного в настоящем описании способа, то способ заключается в том, что осуществляют стадии, на которых: I) получают антиген PCV-2, содержащийся в первой жидкости; II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2; и объединяют антиген PCV-2 по меньшей мере с одним дополнительным антигеном, предпочтительно вирусным или бактериальным антигеном, и более предпочтительно вирусным или бактериальным антигеном из по меньшей мере одного другого болезнетворного организма, вызывающего заболевание у свиней. Предпочтительно антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2, более предпочтительно рекомбинантный белок ORF-2 PCV - 2, и еще более предпочтительно вирусоподобные частицы белка ORF-2. Предпочтительно часть первой жидкости отделяют от антигена PCV-2 посредством замены части первой жидкости на вторую жидкость. Предпочтительно замена части первой жидкости на вторую жидкость заключается в том, что осуществляют стадии, на которых: а) добавляют вторую жидкость к первой жидкости, которая содержит антиген Rev-2, и б) концентрируют антиген PCV-2 предпочтительно в 3-50 раз, еще более предпочтительно в 4-50 раз, и еще более предпочтительно в 7-10 раз по сравнению с объемом первой жидкости путем отделения части первой и второй жидкостей от антигена PCV-2. Предпочтительно стадию добавления жидкости и стадию концентрирования осуществляют несколько раз, предпочтительно два раза, еще более предпочтительно три раза. В таких случаях отделяют не только первую жидкость, но также и смесь первой и второй жидкостей. Предпочтительно каждую стадию добавления жидкости осуществляют практически одновременно или последовательно с осуществлением стадии концентрирования, как описано выше. Когда стадию концентрирования и стадию добавления жидкости выполняют последовательно, то порядок осуществления стадий не имеет значения. Кроме того, стадию концентрирования предпочтительно осуществляют путем фильтрации, предпочтительно путем диа- или ультрафильтрации, с использованием фильтра, который предпочтительно содержит полупроницаемую мембрану. Полупроницаемая мембрана предпочтительно имеет средний размер пор, который меньше размера антигена PCV-2 и препятствует прохождению по меньшей мере 90% антигена PCV-2 через поры полупроницаемой мембраны и удерживает антиген PCV-2 на фильтре для сбора или выделения. Предпочтительно средний размер пор полупроницаемой мембраны иди любого другого фильтра препятствует прохождению через фильтр по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 75 до 400 кДа, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Такой размер пор является предпочтительным в том случае, когда антиген PCV-2 получают в виде цельного вируса или в виде вирусоподобных частиц.

В настоящем изобретении, как оно представлено выше в настоящем описании, предложены новые способы получения антигена PCV-2 и иммуногенных композиций, содержащих антиген PCV-2, где антиген PCV-2 обладает пониженной вирулицидной активностью и/или повышенной иммуногенностью (как они определены в настоящем описании), где способ включает стадии, на которых: I) получают первую жидкость, содержащую антиген PCV-2, II) отделяют по меньшей мере часть первой жидкости от антигена PCV-2. Кроме того, в настоящем изобретении предложены также антиген PCV-2, а также иммуногенные композиции, содержащие указанный антиген PCV-2, который обладает пониженной вирулицидной активностью и/или повышенной иммуногенностью (каждое из указанных понятий определено в настоящем описании). Согласно следующему объекту изобретения антиген PCV-2, а также иммуногенные композиции, содержащие очищенный антиген PCV-2, который обладает пониженной вирулицидной активностью и/или повышенной иммуногенностью, можно получать другим путем с помощью следующего способа (II). Очищенный антиген PCV-2, предлагаемый в изобретении, предпочтительно очищенный антиген ORF2 PCV-2, можно получать путем очистки препарата вируса PCV-2, в частности, путем очистки цельного вируса. Препараты цельного вируса описаны, например, в WO 99/18214 или WO 03/049703. Кроме того, очищенный антиген PCV-2 можно получать также путем очистки рекомбинантно экспрессированного антигена PCV-2, предпочтительно путем очистки рекомбинантного антигена ORF2 PCV-2. Экспрессионные системы для получения рекомбинантного антигена PCV-2, предпочтительно для получения рекомбинантных антигенов ORF2 PCV-2, хорошо известны в данной области и включают (но, не ограничиваясь только ими) бактериальные экспрессионные системы, дрожжевые экспрессионные системы, экспрессионные системы на основе клеток насекомых или млекопитающих. Векторы и методы создания и/или применения векторов (или рекомбинантов) для осуществления экспрессии антигенов PCV-2 представлены в соответствующем разделе в настоящем описании.

Предпочтительными клетками являются клетки, чувствительные к заражению соответствующим рекомбинантным вирусным вектором, содержащим ДНК ORF2 PCV-2 и экспрессирующим белок ORF2 PCV-2. Предпочтительно клетки представляют собой клетки насекомых, и более предпочтительно они включают клетки насекомых, которые поступают в продажу под товарным знаком клетки насекомых SF+ (фирма Protein Sciences Corporation, Мериден, шт.Коннектикут). В предпочтительных клеточных культурах содержание клеток составляет примерно 0,3-2,0×106 клеток/мл, более предпочтительно примерно 0,35-1,9×106 клеток/мл, еще более предпочтительно примерно 0,4-1,8×106 клеток/мл, еще более предпочтительно примерно 0,45-1,7×106 клеток/мл, и наиболее предпочтительно примерно 0,5-1,5×106 клеток/мл.

К предпочтительным вирусным векторам относится бакуловирус, такой как BaculoGold (фирма BD Biosciences Pharmingen, Сан-Диего, шт.Калифорния), прежде всего в том случае, когда клетками-продуцентами служат клетки насекомых. Хотя предпочтительной является бакуловирусная экспрессионная система, специалистам в данной области должно быть очевидно, что для целей настоящего изобретения, а именно, для экспрессии антигена ORF2 PCV-2, можно применять и другие экспрессионные системы, включая описанные выше системы.

Специалисты в данной области могут также выбрать соответствующие среды для роста, при этом предпочтительными средами для роста являются бессывороточная среда, такая как Excell 420 (фирма JRH Biosciences, Inc., Ленекса, шт.Канзас) и т.п.

Рекомбинантный вирусный вектор, содержащий последовательности ДНК ORF2 PCV-2, предпочтительно характеризуется множественностью заражения (MOI), составляющей примерно 0,03-1,5, более предпочтительно примерно 0,05-1,3, еще более предпочтительно примерно 0,09-1,1, и наиболее предпочтительно примерно 0,1-1,0, при его применении для заражения чувствительных клеток. Предпочтительно указанные выше величины MOI соответствуют 1 мл жидкости, содержащей культуру клеток. Предпочтительно в способе, представленном в настоящем описании, осуществляют заражение 0,3-2,0×106 клеток/мл, более предпочтительно примерно 0,35-1,9×106 клеток/мл, еще более предпочтительно примерно 0,4-1,8×106 клеток/мл, еще более предпочтительно примерно 0,45-1,7×106 клеток/мл, и наиболее предпочтительно примерно 0,5-1,5×106 клеток/мл рекомбинантным вирусным вектором, который содержит ДНК ORF2 PCV-2 и экспрессирует белок антигена ORF2 PCV-2, характеризующимся MOI (множественностью заражения), составляющей примерно 0,03-1,5, более предпочтительно примерно 0,05-1,3, еще более предпочтительно примерно 0,09-1,1, и наиболее предпочтительно примерно 0,1-1,0.

Затем зараженные клетки инкубируют в течение периода времени вплоть до десяти дней, более предпочтительно от примерно двух дней до примерно десяти дней, еще более предпочтительно от примерно четырех дней до примерно девяти дней, и наиболее предпочтительно от примерно пяти дней до примерно восьми дней. Предпочтительно инкубацию проводят при температуре, составляющей примерно 22-32°C, более предпочтительно примерно 24-30°C, еще более предпочтительно примерно 25-29°C, еще более предпочтительно примерно 26-28°C, и наиболее предпочтительно примерно 27°C. Предпочтительно после осуществления инокуляции осуществляют наблюдение за клетками SF с целью выявления характерных индуцированных бакуловирусом изменений. Такое наблюдение может включать мониторинг тенденций изменения плотности клеток и снижения жизнеспособности в течение определенного периода времени после осуществления заражения. При создании изобретения было установлено, что пик вирусного титра имеет место через 3-5 дней после заражения, а пик производства антигена ORF2 PCV-2 имеет место в период между 5 и 8 днем после заражения, и/или когда жизнеспособность клеток снижается до уровня, составляющего менее 10%.

Антиген ORF2 PCV-2 можно очищать из собранного продукта с помощью стандартных методов, известных специалисту в данной области, например, с помощью методов, описанных в «Protein purification methods - a practical approach», под ред. E.L.V. Harris и S. Angal, изд-во IRL Press at Oxford University Press. Такие методы включают (но, не ограничиваясь только ими) разделение с помощью центрифугирования и/или фильтрации, осаждения, вытеснительной хроматографии (гель-фильтрация), аффинной хроматографии, металлхелатирующей хроматографии, ионообменной хроматографии, ковалентной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий и т.д.

Процесс выделения антигена PCV-2, предпочтительно антигена ORF2 PCV-2, предпочтительно начинают с отделения клеточного дебриса от экспрессированного антигена ORF2 PCV-2 посредством осуществления стадии разделения. Предпочтительные методы, применяемые на стадиях разделения, включают фильтрацию, центрифугирование при скоростях вплоть до примерно 20000xg, центрифугирование в непрерывном потоке, хроматографическое разделение методом ионообменной хроматографии или гель-фильтрации и обычные методы на основе иммуноаффинности. Указанные методы известны специалистам в данной области, они описаны, например, в «Protein purification methods - a practical approach», под ред. E.L.V. Harris и S. Angel, изд-во IRL Press Oxford, 1995. Наиболее предпочтительными методами разделения являются центрифугирование при скоростях вплоть до примерно 20000×g и фильтрация. Предпочтительными методами фильтрации являются микрофильтрация без выхода концентрата («тупиковая» микрофильтрация) и фильтрация в тангенциальном потоке (или перекрестнопоточная фильтрация), включая фильтрацию через половолоконные фильтры и фильтрацию без выхода концентрата. Среди перечисленных методов предпочтительной является микрофильтрация без выхода концентрата. Предпочтительные размеры пор при осуществлении микрофильтрации без выхода концентрата составляют примерно 0,30-1,35 мкм, более предпочтительно примерно 0,35-1,25 мкм, еще более предпочтительно примерно 0,40-1,1 мкм, и наиболее предпочтительно примерно 0,45-1,0 мкм. Можно считать, что для целей настоящего изобретения можно использовать любую общепринятую фильтрационную мембрану, при этом предпочтительными являются полиэфирсульфоновые мембраны. На стадии фильтрации удаляют любые низкомолекулярные виды нуклеиновых кислот.

Дополнительную очистку антигена PCV-2, предпочтительно антигена ORF2 PCV-2 можно осуществлять с помощью хроматографических процедур, предпочтительно двухстадийной хроматографической процедуры. Однако процесс очистки можно начинать также с применения хроматографической процедуры в том случае, когда загружаемый продукт не содержит клеточный дебрис.

В том случае, когда антиген PCV-2 собран в виде вирусоподобных частиц (ВПЧ), то в качестве первой стадии предпочтительно применяют вытеснительную хроматографию (гель-фильтрацию), которую можно осуществлять, например, с использованием матрицы из Sephacryl S300. В лабораторных условиях наиболее предпочтительно применяют колонки, упакованные HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR. Однако можно использовать любые другие известные специалистам в данной области матрицы для вытеснительной хроматографии, которые позволяют отделять ВПЧ ORF2 PCV-2 от фильтрата культуры или супернатанта. Пригодные матрицы описаны, например, в «Protein purification methods - a practical approach», под ред. E.L.V. Harris и S. Angel, изд-во IRL Press Oxford, 1995. Гель-фильтрацию можно осуществлять, например, загружая на колонку неочищенный содержащий антиген PCV-2 препарат при скорости потока 1,0 мл/мин и элюируя колонку буфером, содержащим 20 мМ Трис, рН 6,5, 5 мМ ДТТ, взятым в количестве, равном 1,5 объема колонки. Однако антиген ORF2 PCV-2 можно очищать также с помощью аффинной хроматографии, например, посредством избирательного связывания с иммобилизованным специфическим для ORF2 PCV-2 антителом, или с помощью любого другого метода, известного специалисту в данной области.

Так, согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения иммуногенную композицию, содержащую очищенный антиген PCV-2, предпочтительно очищенный антиген ORF2 PCV-2, и адъювант, можно получать с помощью способа, заключающегося в том, что осуществляют стадии, на которых:

а) экспрессируют антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2, в клетке-хозяине;

б) собирают культуру клеток, получая антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2;

в) очищают собранный продукт, содержащий антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2, с помощью вытеснительной хроматографии (гель-фильтрации);

г) смешивают очищенный антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2, с адъювантом.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения гель-фильтрацию осуществляют согласно представленному в настоящем описании методу, предпочтительно согласно методу, описанному в примере 3. Предпочтительно после осуществления вытеснительной хроматографии получают иммуногенную композицию, имеющую степень чистоты более чем 80 мас.%, предпочтительно более чем 90 мас.%, по отношению к общему количеству белка, содержащегося в иммуногенной композиции до смешения с адъювантом. Степень чистоты можно оценивать с помощью окрашивания красителем Imperial Protein Stain (фирма Pierce) после осуществления ДСН-ПААГ на 10%-ных Бис-Трис-гелях NuPAGE (фирма Invitrogen) с использованием буферной системы NuPAGE MOPS (фирма Invitrogen).

Для достижения более высокой степени чистоты можно осуществлять вторую стадию хроматографии, которая, однако, должна быть отличной от первой. Например, если первая стадия очистки/стадия хроматографии представляет собой вытеснительную хроматографию (гель-фильтрацию), то вторая стадия должна быть отличной от нее, например, она может представлять собой аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию и т.д.

Предпочтительно, если первая стадия очистки антигена PCV-2, предпочтительно очистки антигена ORF2 PCV-2, представляет собой вытеснительную хроматографию (гель-фильтрацию), то вторая стадия может представлять собой ионообменную хроматографию, предпочтительно анионообменную хроматографию (АОХ). Предпочтительной матрицей для анионообменной хроматографии для целей очистки антигена PCV-2, предпочтительно ORF2 PCV-2, является Q Sepharose. Для маломасштабного производства, при работе с объемами, составляющими примерно 50 мл, наиболее предпочтительными являются колонки, упакованные 5 мл HiTrap Q Sepharose HP. Анионообменную хроматографию можно осуществлять, например, согласно методу, описанному в примере 3. В целом метод заключается в следующем. Примерно 50 мл пула фракций «мертвого» объема, полученных после стадии гель-фильтрации, можно загружать на АОХ-колонку при скорости потока 3,0 мл/мин. После стадии отмывки с использованием, например, 20 мМ Трис, рН 6,5, 5 мМ ДТТ, для удаления несвязанного продукта можно осуществлять элюцию белка посредством одной стадии с использованием взятого в количестве, равном 8 объемам колонки, следующего буфера (20 мМ Трис, рН 6,5, 5 мМ ДТТ, 1,0 М NaCl). Продукт, полученный после АОХ, можно загружать снова на колонку с Q Sepharose и осуществлять элюцию согласно описанному выше методу для увеличения выхода. Такая двухстадийная процедура (гель-фильтрация с последующей анионообменной хроматографией) позволяет эффективно отделять антиген ORF2 PCV-2 от большей части других белковых компонентов, которые присутствуют в продукте, собранном после культивирования.

Так, согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения иммуногенную композицию, содержащую очищенный антиген PCV-2, предпочтительно очищенный антиген ORF2 PCV-2, и адъювант, можно получать с помощью способа, заключающегося в том, что осуществляют стадии, на которых:

а) экспрессируют антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2, в клетке-хозяине;

б) собирают культуру клеток, получая антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2;

в) очищают собранный продукт, содержащий антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2, с помощью вытеснительной хроматографии (гель-фильтрации) и последующей анионообменной хроматографии; и

г) смешивают очищенный антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2, с адъювантом.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения гель-фильтрацию и анионообменную хроматографию осуществляют согласно представленным в настоящем описании методам, предпочтительно согласно методам, описанным в примере 3. Предпочтительно применение двухстадийной стратегии очистки позволяет получать иммуногенную композицию, имеющую степень чистоты более чем 90 мас.%, предпочтительно более чем 95 мас.%, по отношению к общему количеству белка, содержащегося в иммуногенной композиции до смешения с адъювантом. Степень чистоты можно оценивать с помощью окрашивания красителем Imperial Protein Stain (фирма Pierce) после осуществления ДСН-ПААГ на 10%-ных Бис-Трис-гелях NuPAGE (фирма Invitrogen) с использованием буферной системы NuPAGE MOPS (фирма Invitrogen).

Как указано выше, процесс выделения антигена PCV-2, предпочтительно антигена ORF2 PCV-2, начинают с отделения клеточного дебриса от экспрессированного антигена ORF2 PCV-2 посредством осуществления стадии разделения. Предпочтительно стадия разделения включает микрофильтрацию через фильтр с размером пор, составляющим от примерно 0,6 мкм до примерно 2 мкм, предпочтительно с размером пор, составляющим от примерно 0,8 мкм до примерно 1,2 мкм.

Так, иммуногенную композицию, содержащую очищенный антиген PCV-2, предпочтительно очищенный антиген ORF2 PCV-2, и адъювант, можно получать с помощью способа, заключающегося в том, что осуществляют стадии, на которых:

а) экспрессируют антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2, в клетке-хозяине;

б) собирают культуру клеток, получая антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2;

в) фильтруют собранный продукт, полученный после осуществления стадии б), через фильтр с размером пор от 0,6 до 2,0 мкм;

г) очищают полученный после осуществления стадии в) фильтрат, содержащий антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2, с помощью вытеснительной хроматографии (гель-фильтрации) и необязательно последующей анионообменной хроматографии; и

г) смешивают очищенный антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2, с адъювантом.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения микрофильтрацию, вытеснительную хроматографию и анионообменную хроматографию осуществляют согласно представленным в настоящем описании методам, предпочтительно согласно методам, описанным в примере 3. Предпочтительно применение двухстадийной стратегии очистки, включая стадию предварительной фильтрации, позволяет получать иммуногенную композицию, имеющую степень чистоты более чем 90 мас.%, предпочтительно более чем 95 мас.%, по отношению к общему количеству белка, содержащегося в иммуногенной композиции до смешения с адъювантом. Степень чистоты можно оценивать с помощью окрашивания красителем Imperial Protein Stain (фирма Pierce) после осуществления ДСН-ПААГ на 10%-ных Бис-Трис-гелях NuPAGE (фирма Invitrogen) с использованием буферной системы NuPAGE MOPS (фирма Invitrogen).

Иммуногенные композиции, содержащие очищенный антиген PCV-2, предпочтительно представленный в настоящем описании очищенный антиген ORF2 PCV-2, предпочтительно те композиции, которые можно получать с помощью представленных в настоящем описании способов, отличаются тем, что они обладают повышенной иммуногенностью по сравнению с иммуногенной композицией, которая не содержит такой очищенный антиген PCV-2 или очищенный антиген ORF2 PCV-2.

В том случае, когда для получения антигена PCV-2, предпочтительно антигена ORF2 PCV-2, применяют вирусные векторы, такие как рекомбинантный поксивирус, аденовирус или бакуловирус, то рекомендуется инактивировать вирусную нуклеиновую кислоту путем соответствующей инактивирующей обработки. Такую инактивацию можно осуществлять в любое время в процессе очистки антигена PCV-2, предпочтительно антигена ORF2 PCV-2. Так, инактивацию можно осуществлять сразу после сбора жидкости клеточной культуры, содержащей антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2, или после осуществления микрофильтрации антигена PCV-2, предпочтительно антигена ORF2 PCV-2, если предусмотрено осуществление микрофильтрации, до или после стадии очистки, например, до или после гель-фильтрации, и до или после анионообменной хроматографии, если предусмотрено ее осуществление.

Для целей настоящего изобретения можно применять любой пригодный метод инактивации. Так, инактивацию можно осуществлять с помощью химических и/или физических обработок. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения отбирают определенный объем собранной жидкости и доводят температуру до уровня, составляющего примерно 32-42°C, более предпочтительно 34-40°C, и наиболее предпочтительно 35-39°C. Предпочтительные методы инактивации предусматривают добавление циклизованного бинарного этиленимина (BEI), предпочтительно в концентрации, составляющей от примерно 1 до примерно 20 мМ, предпочтительно от примерно 2 до примерно 10 мМ, еще более предпочтительно от примерно 2 до примерно 8 мМ, еще более предпочтительно от примерно 3 до примерно 7 мМ, наиболее предпочтительно примерно 5 мМ. Например, инактивация включает добавление раствора гидробромида 2-бромэтиленамина (ВЕА), предпочтительно в концентрации примерно 0,4М, который был циклизован с получением 0,2 М бинарного этиленимина (BEI) в 0,3 н. NaOH, к жидкостям с достижением конечной концентрации BEI, составляющей примерно 5 мМ. Затем предпочтительно жидкости непрерывно перемешивают в течение 2-96 ч, и инактивированные собранные жидкости можно хранить в замороженном состоянии при температуре -40°C или ниже, или при температуре примерно 1-7°C. После завершения инактивации добавляют раствор тиосульфата натрия, предпочтительно в концентрации 1,0 М, для нейтрализации всех оставшихся количеств BEI. Предпочтительно раствор тиосульфата натрия добавляют в количестве, эквивалентном количеству BEI, добавленного перед этим для осуществления инактивации. Например, в том случае, когда BEI добавляют до конечной концентрации 5 мМ, то для нейтрализации всего остаточного количества BEI добавляют 1,0 М раствор тиосульфата натрия до достижения конечной концентрации, составляющей 5 мМ.

Перед смешением очищенного антигена PCV-2, предпочтительно антигена ORF2 PCV-2, с адъювантом рекомендуется также проводить диализ очищенного антигена PCV-2, предпочтительно антигена ORF2 PCV-2, в противотоке забуференного фосфатом физиологического раствора, рН 7,4, или любого другого физиологического буфера.

Описанные выше способы позволяют получать антиген PCV-2, обладающий, как указано в настоящем описании, пониженной вирулицидной активностью, а также повышенной иммуногенностью, в том случае, когда антиген PCV-2 имеет степень чистоты более чем 50 мас.%, предпочтительно более чем 70 мас.%, еще более предпочтительно более чем 80 мас.%, еще более предпочтительно более чем 85 мас.%, еще более предпочтительно более чем 90 мас.%, наиболее предпочтительно более чем 95 мас.% по отношению к общему количеству белка, содержавшегося в иммуногенной композиции до смешения с каким-либо адъювантом. Однако, очищенный антиген PCV-2, который можно получать с помощью указанного способа II, можно также смешивать и применять в сочетании с адъювантом, предпочтительно с любым из перечисленных в настоящем описании адъювантов. Предпочтительным адъювантом является карбопол, предпочтительно в концентрации, составляющей примерно 0,1-10 мг/мл, более предпочтительно в концентрации 0,5-5 мг/мл, наиболее предпочтительно примерно 1 мг/мл конечной иммуногенной композиции.

Еще раз следует отметить, что настоящее изобретение относится не только к любому из представленных в настоящем описании способов, включая альтернативный способ II, но оно относится также и к антигену PCV-2, предпочтительно к очищенному антигену PCV-2, наиболее предпочтительно к очищенному белку ORF-2 PCV-2, который можно получать с помощью любого из представленных в настоящем описании способов, включая альтернативный способ II. Кроме того, в настоящем изобретении предложены также содержащий PCV-2 антигенные композиции, которые содержат антиген PCV-2, предпочтительно очищенный антиген PCV-2, наиболее предпочтительно очищенный белок ORF-2 PCV-2, которые можно получать с помощью любого из представленных в настоящем описании способов, включая альтернативный способ II. Количество антигена PCV-2, прежде всего очищенного антигена ORF-2 PCV-2, в конечной иммуногенной композиции должно составлять от примерно 0,25 до примерно 400 мкг на дозу конечной иммуногенной композиции. Предпочтительно конечная иммуногенная композиция должна включать антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2, в количестве, составляющем от примерно 2 до примерно 200 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 3 до примерно 150 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 4 до примерно 100 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 5 до примерно 80 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 6 до примерно 60 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 7 до примерно 50 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 8 до примерно 40 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 8 до примерно 32 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 8 до примерно 24 мкг/дозу, и наиболее предпочтительно от примерно 8 до примерно 16 мкг/дозу.

Иммуногенные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, включая те, которые можно получать с помощью способа II, содержат один или несколько дополнительных антигенов из другого болезнетворного организма. Такие «другие болезнетворные организмы» указаны выше. Предпочтительно дополнительный антиген представляет собой вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней. Еще более предпочтительно антиген вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней представляет собой живой вирус, и еще более предпочтительно модифицированный живой вирус. Еще более предпочтительно антиген модифицированного живого вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней представляет собой штамм модифицированного живого вируса, имеющий регистрационный номер АТСС VR 2332, и еще более предпочтительно представляет собой MLV PRRS INGELVAC®. В другом объекте настоящего изобретения дополнительный антиген представляет собой Mycoplasma hyopneumoniae. Предпочтительно антиген Mycoplasma hyopneumoniae представляет собой бактерин, и более предпочтительно бактерин Mycoplasma hyopneumoniae представляет собой MYCOFLEX INGELVAC®. Наиболее предпочтительными являются комбинации, включающие как антиген вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней, так и антиген Mycoplasma hyopneumoniae.

Благодаря повышенной иммуногенности иммуногенной композиции, включающей очищенный антиген PCV-2, предпочтительно очищенный антиген ORF2 PCV-2, предлагаемый в настоящем изобретении, иммуногенные композиции можно применять для уменьшения количества случаев возникновения или снижения серьезности клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с PCV-2, у животных по сравнению с животными, которых не обрабатывали иммуногенной композицией.

Понятие « уменьшения количества случаев возникновения или снижения серьезности клинических симптомов» означает, что количество случаев возникновения или серьезность любых таких симптомов снижается у животных, которым вводят вакцину, по сравнению с «контрольной группой» животных в том случае, когда обе группы животных инфицируют или подвергают контрольному заражению патогеном, из которого был(и) выведен(ы) обладающий(ие) иммунологической активностью компонент(ы) вакцины, и когда контрольной группе не вводят вакцину или иммуногенную композицию. В этом контексте понятие «снижение» или «уменьшение» означает уменьшение по меньшей мере на 10%, предпочтительно на 25%, еще более предпочтительно на 50%, наиболее предпочтительно более чем на 100% в вакцинированной группе по сравнению с невакцинированной контрольной группой.

В контексте настоящего описания понятие «клинические симптомы» или «клинические признаки» относится к признакам заражения патогеном, которые непосредственно проявляются у живого животного в виде симптомов. Репрезентативные примеры зависят от выбранного патогена, но они могут включать такие проявления, как выделения из носа, летаргия, кашель, повышенная температура, прибавление или потеря веса, обезвоживание, диарея, опухание, хромота и т.п. Клинические признаки, вызываемые PCV-2, могут включать истощение, бледность кожи, худосочность, респираторный дистресс-синдром, диарею, желтуху и разлитие желчи.

Уменьшения количества случаев возникновения или серьезности клинических признаков, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV-2, у животного можно достигать путем введения только одной дозы указанной иммуногенной композиции животному, нуждающемуся в таком лечении. Однако иммуногенную композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить также в виде двух доз или большего количества доз с интервалом от 2 до 4 недель между введением первой дозы и любой последующей дозы. Таким образом, согласно следующему варианту осуществления изобретения иммуногенную композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, которая содержит очищенный антиген PCV-2, предпочтительно очищенный антиген ORF2 PCV-2, можно вводить животному, нуждающемуся в этом, в виде одной, двух или большего количества доз.

В частности, еще одним объектом настоящего изобретения является иммуногенная композиция, которая включает описанную выше содержащую PCV-2 антигенную композицию, где иммуногенная композиция после введения животному уменьшает лимфоидное истощение и воспаление у животного по меньшей мере на 80% по сравнению с животным, которому не вводили иммуногенную композицию. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является иммуногенная композиция, которая включает описанную выше содержащую PCV-2 антигенную композицию, и где иммуногенная композиция уменьшает лимфоидное истощение и воспаление по меньшей мере на 80% у животного, которому вводили иммуногенную композицию, по сравнению с животным, которому не вводили иммуногенную композицию.

Еще одним объектом настоящего изобретения является иммуногенная композиция, которая включает описанную выше содержащую PCV-2 антигенную композицию, где иммуногенная композиция после введения животному уменьшает повреждения легких у животного по меньшей мере на 80% по сравнению с животным, которому не вводили иммуногенную композицию. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является иммуногенная композиция, которая включает описанную выше содержащую PCV-2 антигенную композицию, и где иммуногенная композиция уменьшает повреждения легких по меньшей мере на 80% у животного, которому вводили иммуногенную композицию, по сравнению с животным, которому не вводили иммуногенную композицию.

Еще одним объектом настоящего изобретения является иммуногенная композиция, содержащая описанную выше содержащую PCV-2 антигенную композицию, где иммуногенная композиция индуцирует защитный иммунный ответ против PCV-2 после введения одной дозы иммуногенной композиции. Объем иммуногенной композиции, которая включает содержащую PCV-2 антигенную композицию, может представлять собой любую величину, 1, 2, 3, 4, 5 мл или выше. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения в 2 мл иммуногенной композиции содержится одна доза антигена PCV-2. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является описанная выше иммуногенная композиция, где иммуногенная композиция, которая включает содержащую PCV-2 антигенную композицию, индуцирует защитный иммунный ответ против PCV-2 после введения одной дозы иммуногенной композиции. Согласно следующему объекту изобретения в 2 мл иммуногенной композиции содержится одна доза антигена PCV-2.

В контексте настоящего описания «защитный иммунный ответ» относится к уменьшению количества случаев возникновения или уменьшению серьезности клинических, патологических или гистопатологических признаков или симптомов, вызываемых заражением представляющим интерес патогеном, вплоть до и включая полное предупреждение таких признаков или симптомов.

Понятие «патологический» применительно к признакам обозначает признаки заражения, которые можно обнаруживать с помощью микроскопа или на молекулярном уровне, с помощью биохимических анализов или невооруженным глазом при осуществлении аутопсии. В случае PCV-2 патологические признаки могут включать микроскопические и макроскопические повреждения нескольких типов тканей и органов, при этом наиболее распространенной областью повреждений являются лимфоидные органы.

Понятие «гистопатологический» применительно к признакам относится к признакам изменений в ткани, возникающих в результате заражения.

Понятия «клинические симптомы» или «клинические признаки» определены выше.

Еще одним объектом настоящего изобретения является представленная в настоящем описании иммуногенная композиция, которая включает содержащую PCV-2 антигенную композицию и антиген PRRSV, предпочтительно любой из указанных в настоящем описании антигенов PRRSV, где иммуногенная композиция индуцирует защитный иммунный ответ против вируса PRRS после введения одной дозы иммуногенной композиции. И в этом случае также можно получать дозу, содержащуюся в любом объеме, но в предпочтительных вариантах осуществления изобретения в 2 мл иммуногенной композиции содержится одна доза антигена PRRS и одна доза антигена PCV-2. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является описанная выше иммуногенная композиция, которая включает PRRSV и содержащую PCV-2 антигенную композицию, где иммуногенная композиция индуцирует иммунный ответ против PRRS после введения одной дозы иммуногенной композиции. Согласно следующему объекту в 2 мл иммуногенной композиции содержится одна доза антигена PRRSV и одна доза антигена PCV-2.

Следующим объектом настоящего изобретения является иммуногенная композиция, которая включает описанную выше содержащую PCV-2 антигенную композицию и описанный выше антиген Mycoplasma hyopneumoniae, где иммуногенная композиция индуцирует защитный иммунный ответ против Mycoplasma hyopneumoniae после введения одной дозы иммуногенной композиции. И в этом случае также можно получать дозу, содержащуюся в любом объеме, но в предпочтительных вариантах осуществления изобретения в 2 мл иммуногенной композиции содержится одна доза антигена Mycoplasma hyopneumoniae и одна доза антигена PCV-2. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является описанная выше иммуногенная композиция, где иммуногенная композиция индуцирует защитный иммунный ответ против Mycoplasma hyopneumoniae после введения одной дозы иммуногенной композиции, которая содержит описанную выше содержащую PCV-2 антигенную композицию и антиген Mycoplasma hyopneumoniae. Согласно следующему объекту в 2 мл иммуногенной композиции содержится одна доза антигена Mycoplasma hyopneumoniae.

Согласно следующему объекту настоящего изобретения приготавливают описанную выше иммуногенную композицию, рассчитанную на введение одной дозы в объеме 2 мл.

Следующим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения одного или нескольких клинических симптомов, вызываемых заражением PCV-2, у животного по сравнению с животным, которому не вводили иммуногенную композицию. В целом, способ заключается в том, что осуществляют стадию, на которой вводят животному любую из иммуногенных композиций, которые содержат описанную выше содержащую PCV-2 антигенную композицию. Предпочтительно после введения одной дозы иммуногенной композиции происходит уменьшение одного или нескольких клинических симптомов, вызываемых заражением PCV-2. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения одного или нескольких клинических симптомов, вызываемых заражением Rev-2, у животного по сравнению с животным, которому не вводили иммуногенную композицию, включающую описанную выше антигенную композицию, которая содержит PCV-2. В целом, способ заключается в том, что осуществляют стадию, на которой вводят животному любую из иммуногенных композиций, которые включают описанную выше содержащую PCV-2 антигенную композицию, в результате чего происходит уменьшение одного или нескольких клинических симптомов, вызываемых заражением PCV-2, предпочтительно после введения одной дозы иммуногенной композиции, которая включает описанную выше содержащую PCV-2 антигенную композицию.

Следующим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения одного или нескольких клинических симптомов, вызываемых заражением PRRS, у животного по сравнению с животным, которому не вводили иммуногенную композицию. В целом, способ заключается в том, что осуществляют стадию, на которой вводят животному любую из иммуногенных композиций, которые включают описанную выше содержащую PCV-2 антигенную композицию и описанный выше вирус PRRS. Предпочтительно после введения одной дозы иммуногенной композиции, содержащей описанную выше антигенную композицию на основе PCV-2 и описанный выше вирус PRRS, происходит уменьшение одного или нескольких клинических симптомов заражения PRRS. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения одного или нескольких клинических симптомов, вызываемых заражением PRRS, у животного по сравнению с животным, которому не вводили описанную выше иммуногенную композицию, которая включает описанную выше содержащую PCV-2 антигенную композицию и описанный выше вирус PRRS. Клинические признаки, вызываемые заражением вирусом репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV), включают (но, не ограничиваясь только ими) отсутствие аппетита, повышенную температуру, выкидыш, кратковременное обесцвечивание, пролонгированный анэструз, кашель, респираторные признаки, мастит, агалактию, летаргию, появление мумифицированных поросят, рождения мертвого плода, рождение ослабленных поросят, снижение показателя (процента) опороса, преждевременный опорос, диарею, истощение, чихание, выделения из глаз, бледную кожу, смертность и комбинации указанных признаков.

Следующим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения одного или нескольких клинических симптомов, вызываемых заражением Mycoplasma hyopneumoniae, у животного по сравнению с животным, которому не вводили иммуногенную композицию, которая включает описанную выше содержащую PCV-2 антигенную композицию и описанный выше антиген Mycoplasma hyopneumoniae. В целом, способ заключается в том, что осуществляют стадию, на которой вводят животному любую из описанных выше иммуногенных композиций. Предпочтительно после введения одной дозы иммуногенной композиции, которая включает описанную выше содержащую PCV-2 антигенную композицию и описанный выше антиген Mycoplasma hyopneumoniae, происходит уменьшение одного или нескольких клинических симптомов, вызываемых заражением Mycoplasma hyopneumoniae. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения одного или нескольких клинических симптомов, вызываемых заражением Mycoplasma hyopneumoniae, у животного по сравнению с животным, которому не вводили иммуногенную композицию, включающую описанную выше антигенную композицию, которая содержит PCV-2, и описанный выше антиген Mycoplasma hyopneumoniae. Клинические признаки заболевания, вызываемого заражением Mycoplasma hyopneumoniae (М. hyo), включают (но, не ограничиваясь только ими) сухой кашель, ухудшенную продуктивность и повреждения легких.

Иммуногенная композиция, содержащая очищенный антиген PCV-2, предпочтительно описанный выше антиген ORF2 PCV-2, обладает повышенной иммуногенностью. Следовательно, предлагаемая в настоящем описании иммуногенная композиция позволяет вызывать улучшенный иммунный ответ у животного, которому вводили такую иммуногенную композицию. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ повышения иммунного ответа у животного против PCV-2, заключающийся в том, что осуществляют стадию, на которой: вводят животному, нуждающемуся в этом, описанную выше иммуногенную композицию, которая содержит очищенный антиген PCV-2, предпочтительно очищенный белок ORF-2 PCV-2. Согласно предпочтительному объекту изобретения антиген PCV-2, предпочтительно антиген ORF2 PCV-2, применяемый в таком способе, очищают до уровня, составляющего более чем 50 мас.%, предпочтительно более чем 60 мас.%, еще более предпочтительно более чем 70 мас.%, еще более предпочтительно более чем 80 мас.%, еще более предпочтительно более чем 90 мас.%, наиболее предпочтительно более чем 95 мас.% по отношению к общему количеству белка, содержащегося в иммуногенной композиции. Степень чистоты можно оценивать с помощью окрашивания красителем Imperial Protein Stain (фирма Pierce) после осуществления ДСН-ПААГ на 10%-ных Бис-Трис-гелях NuPAGE (фирма Invitrogen) с использованием буферной системы MOPS NuPAGE (фирма Invitrogen). PCV-2 и предпочтительно ORF2 PCV-2 можно очищать с помощью обычных методов, хорошо известных специалисту в данной области.

Описание чертежа

Представленный ниже чертеж является составной частью настоящего описания и он включен с целью дополнительной иллюстрации определенных объектов настоящего изобретения. Изобретение должно стать более понятным после изучения указанного чертежа в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов осуществления изобретения, представленных в настоящем описании.

На чертеже представлены результаты анализа методом гель-электрофореза с использованием 10%-ного Бис-Трис/MOPS-геля в случае пилотного масштаба конфигурации ультрафильтрации, которые демонстрируют присутствие ORF2 после процесса фильтрации. Полосы загружали следующими продуктами: (1) маркер; (2) n/a; (3) n/a; (4) 24 - 180/181 Pre cone - 20 мкл; (5) 25 - 180/181 l × антигены - 20 мкл; (6) 26 - 180/181 смыв с фильтра - 20 мкл; (7) 27 - PCV 504 Preconc - 8 мкл; (8) 28 - PCV 504 Perm - 20 мкл; (9) 29 - PCV 504 IX - 20 мкл; (10) 092704PD - 20 мкл; (11) маркер.

Подробное описание изобретения

В представленных ниже примерах описаны предпочтительные материалы и процедуры, применяемые согласно настоящему изобретению. Однако следует иметь в виду, что эти примеры даны только для иллюстрации и их не следует рассматривать как ограничивающие общий объем изобретения.

Пример 1

В данном примере описаны процессы получения в лабораторном масштабе и в пилотном масштабе концентрированного антигена ORF2 PCV-2, обладающего пониженной вирулицидной активностью по сравнению с антигеном, полученным с помощью процессов получения, которые не включают стадии, предлагаемые в настоящем изобретении. Более конкретно, необходимо оценить влияние воздействий, предлагаемых в настоящем изобретении, на вирулицидную активность антигена ORF2 PCV-2 в отношении вируса PRRS.

Материалы и методы

Производство антигена:

Лабораторный масштаб:

PCV SUB037 H1-F, 18,94 кг

PCV 1025, 20,6 кг

PCV 180/181, 20,0 кг

PCV SUB 504PD, 40 кг

Пилотный масштаб:

PCV SUB 506PD, 362 кг

PCV SUB 507PD, 384 кг

PCV SUB512PD, 430 кг

PCV SUB 513PD, 405 кг

Картриджи для ультрафильтрации: фирма GE Healthcare, система очистки паром на месте (Steam-In-Place (SIP)), картриджи с половолоконными мембранами;

UFP-100-E-55-STM: 100000 NMWC (предельная номинальная молекулярная масса), трубка диаметром 1 мм; применяется в UF-002 в X109, лабораторный масштаб.

UFP-300-E-55-STM: 300000 NMWC, трубка диаметром 1 мм; применяется в UF-002 в X109, лабораторный масштаб.

UFP-100-E-65-MSM: 100000 NMWC, трубка диаметром 1 мм; применяется в UF-B2614, в APU-1, пилотный масштаб.

UFP-300-E55-SMO: 300000 NMWC, трубка диаметром 1 мм; применяется в UF-2713 в VP-1, пилотный масштаб.

Перечисленное ниже оборудование использовали при оценке осуществимости подхода и разработке начального процесса:

Таблица 1 Оборудование Стадия процесса Процедура Оборудование Название Ультрафильтрация Концентрирование антигена Концентратор Flex-Stand UF-002 в C109, лабораторный масштаб UF Skid UF-B2614 в APU-1, пилотный масштаб UF Skid UF-2713 в VP-1, пилотный масштаб

Процесс производства:

Конфигурация ультрафильтрации (UF): лабораторный масштаб

При осуществлении процесса концентрирования с помощью концентратора GE Healthcare (фирма Amersham) Flex Stand, объем 30 л, UF skid №002 использовали баллоны для кислот вместимостью 50 л, которые содержали профильтрованный инактивированный нейтрализованный продукт, включающий ORF2 PCV-2, который получали в корпусе P.

В процессах начального концентрирования применяли периодическую схему диафильтрации (диафильтрация «партий»), для чего примерно 20 кг продукта, содержащего антиген, переносили в UF Skid (устройство для UF) и концентрировали через половолоконный картридж 100000 NMWC (UFP-100-E-55-STM). В процессах концентрирования с применением 100000 NMWC-картриджа использовали лоты SUB037PD и PC VI 025 продукта, содержащего ORF2 PCV-2, полученные от фирм PD и Manufacturing соответственно.

Эти две исходные партии продукта концентрировали примерно в 4 раза по отношению к первоначальному объему и затем доводили (Q.S.) в питающем баке до первоначального внесенного объема. Сконцентрированный продукт обрабатывали указанным образом, осуществляя в общей сложности по 2 цикла концентрирования на каждый номер лота, при этом продукт, полученный после третьего и конечного цикла концентрирования, собирали в виде концентрата и партию доводили (Q.S.) до 1-кратного первоначального объема. Отбирали образцы перед осуществлением концентрирования, на каждой стадии концентрирования и на каждой стадии доведения до требуемого объема (Q.S,-стадии). В процессе осуществления каждой стадии концентрирования отбирали образцы прошедшего через фильтр продукта.

При осуществлении еще двух последовательных циклов антиген ORF2 PCV-2 концентрировали без промывки физиологическим раствором. Отбирали образцы сконцентрированного примерно в 4 раза продукта и затем продукта в конечной концентрации. Примерно 20 кг содержащего антиген продукта переносили в сборник UF Skid и концентрировали через половолоконный 300000 NMWC-картридж (UFP-300-E-55-STM). Добавляли вторую партию объемом 20 л в сборник, содержащий концентрат, полученный из первой партии объемом 20 л. Этот продукт концентрировали до конечного объема. В процессах концентрирования с применением 300000 NMWC-картриджа использовали лоты пула PCV 180/181 и SUB504PD ORF2 PCV-2, полученные на фирмах Manufacturing и PD соответственно. Отбирали образцы перед осуществлением концентрирования и на каждой стадии концентрирования. В процессе осуществления каждой стадии концентрирования отбирали образцы прошедшего через фильтр продукта.

Конфигурация ультрафильтрации (UF): пилотный масштаб

В процессах производства в пилотном масштабе использовали лоты SUB506PD, 512PD и 513PD. Объемы антигена до осуществления концентрирования составляли от примерно 350 л до 430 л. Лоты SUB506PD и SUB513PD переносили в DSP 2602 (устройство для последующей обработки) и концентрировали с помощью UF-B2614 в APU-1 с использованием 100000 NMWC-фильтра (UFP-100-65-E-MSM), имеющего площадь поверхности 4,2 м2. SUB512PD переносили в DSP 2701 и концентрировали с помощью UF-2713 с использованием 300000 NMWC-фильтра (UFP-300-E-SMO), имеющего площадь поверхности 2,1 м2. Для каждого лота собирали конечный сконцентрированный продукт и хранили при 4°C для анализа.

Результаты и выводы

Конфигурация ультрафильтрации (UF): лабораторный масштаб

Промежутки времени, требуемые для концентрирования с использованием 100000 NMWC-фильтра (100 кДа) и 300000 NMWC-фильтра (300 кДа), оказались сопоставимыми, и эта процедура оказалась пригодной с точки зрения полномасштабного процесса. Продолжительность фильтрации при использовании фильтра 100 кДа, требуемая для концентрирования в 4 раза при работе с объемами примерно от 18 до 26 л, составляла от 14 до 32 мин, при этом наименьшая продолжительность была связана со стадиями отмывки физиологическим раствором (таблица 2). Продолжительность фильтрации при использовании фильтра 300 кДа, требуемая для концентрирования в 3,2 раза и в 7 раз в случае PCV 180/181 и в 21,5 раза в случае SUB504PD при работе с продуктом объемом примерно 40 л, который последовательно концентрировали, используя объемы по 20 л, была следующей: 25 мин при концентрировании в 3,2 раза, 23 мин при концентрировании в 7 раз и 32 мин при концентрировании в 21,5 раз. Следует ожидать небольших вариаций указанной продолжительности вследствие того, что требуется определенное время для достижения в процессе концентрирования целевого трансмембранного давления (ТМР), составляющего 10,25 фунтов/кв. дюйм.

Величины потока при рассматриваемом процессе составляли от 27,43 л/м2ч до 32,00 л/м2ч при обработке лота PCV 180/181, где величина 32,00 л/м2ч была обусловлена смещением пика в сторону конца процесса концентрирования. Величины потока для продукта SUB 504PD составляли 28,57 л/м2ч при концентрировании первых 20 л и 35,71 л/м2ч при концентрировании вторых 20 л. (таблицы 3 и 4).

Таблица 2 Характеристики процесса Лот № Исходный объем для концентрирования Кратность концентрирования Время, требуемое для концентрирования (мин) PCV 037 QS-0 (100 кДа) 18,94 4,17 24 PCV 037 QS-1 (100 кДа) 18,76 4,75 16 PCV 037 QS-2 (100 кДа) 19,05 4,70 14 PCV 1025 QS-0 (100 кДа) 20,59 4,39 28 PCV 1025 QS-1 (100 кДа) 20,24 4,65 29 PCV 1025 QS-2 (100 кДа) 18,71 3,6 17 PCV 180/181 conc-1 (300 кДа) 20 3,50 25 PCV 180/181 conc-2(300 кДа) 26,01 7,00 23 SUB504PD (300 кДа) 24,72 21,50 32

Таблица 3 Характеристики процесса PCV 180/181: 300000 NMWC-фильтр Время TMP Проходящий через фильтр поток (мл/мин) Поток (л/м2ч) Conc-1 9:55 9 N/A N/A Conc-2 10:23 12,5 N/A N/A Conc-2 10:30 12,5 960 27,43 Conc-2 10:33 14,5 960 27,43 Conc-2 10:36 10,5 1120 32,00 Conc-2 10:39 11 810 23,14

Таблица 4 Характеристики процесса SUB504PD: 300000 NMWC-фильтр Время ТМР Проходящий через фильтр поток (мл/мин) Поток (л/м2ч) Conc-1 15:29 9,5 1000 28,57 Conc-2 16:00 10,25 1250 35,71

Было установлено, что изменение эффективности, происходящее после осуществления фильтрации, оставалось на прежнем уровне, когда сконцентрированный продукт снова доводили (Q.S.) до 1 × объема, как в случае восстановленного продукта SUB 037, так и восстановленного продукта PCV 1025. Величины содержания сконцентрированного антигена смещали границы анализа за валидированную границу, составляющую 64 мкг, что видно из данных, представленных в таблицах с 5 по 8, в которых дано сравнение содержаний антигена с ожидаемыми на основе расчета значениями. Данные о количестве прошедшего через фильтр продукта при осуществлении концентрирования с использованием антигенов из лотов SUB 037, PCV 180/181 и SUB 504PD свидетельствовали о том, что в результате фильтрации не происходило значительной потери продукта. Все количества прошедшего антигена были ниже предела обнаружения применяемого метода анализа. В случае антигена PCV 1025 не осуществляли сбор прошедшего через фильтр антигена.

Таблица 5 Изменение содержания антигена PCV-2 (в мкг) при использовании лота SUB 037 Лот №/объем Содержание антигена до концентрир. Содержание антигена после концентрир. Коэффициент концентрирования Рассчит. содержание антигена Отличие от рассчит. содержания антигена увеличение/снижение по сравнению с рассчит. эффективностью (RP) SUB 037 (18,94 кг), 4,7× 100 кДа, PDX 56 137,6 4,7 263,2 -125,6 Снижение Сконцентрир. и восстан. с помощью физ. раствора: QS-1 56 61,6 1 56 5,6 Увеличение Сконцентрир. и восстан. с помощью физ. раствора: QS-2 56 62,7 1 56 6,7 Увеличение Сконцентрир. и восстан. с помощью физ. раствора: QS-3 56 55,8 1 56 -0,2 снижение SUB 037, прошедшие через фильтр продукты 1, 2, 3 -- 0 нет уменьшения

Таблица 6 Изменение содержания антигена PCV-2 (в мкг) при использовании лота PCV 1025 Лот №/объем Содержание антигена до концентрир. Содержание антигена после концентрир. Коэффициент концентрирования Рассчит. содержание антигена Отличие от рассчит. содержания антигена увеличение/снижение по сравнению с рассчит. RP 1025 (20,46 кг), 4,5× 100 кДа, PDX 70,88 288,64 4,5 318,96 -30,32 Снижение Сконцентрир. и восстан. с помощью физ. раствора: QS-1 N/A (образец не брали) N/A 1 N/A N/A Образец не брали Сконцентрир. и восстан. с помощью физ. раствора: QS-2 70,88 66,24 1 70,88 -4,64 Снижение Сконцентрир. и восстан. с помощью физ. раствора: QS-3 70,88 76,00 1 70,88 5,12 увеличение 1025, прошедший через фильтр продукт -- N/A N/A

Таблица 7 Изменение содержания антигена PCV-2 (в мкг) Лот №/объем Содержание антигена до концентрир. Содержание антигена после концентрир. Коэффициент концентрирования Рассчит. содержание антигена Отличие от рассчит. содержания антигена Увеличение/снижение по сравнению с рассчит. RP 180/181 (40,3 кг), 3,5× 300 кДа, PDX 43,36 90,8 3,5 151,76 -60,96 Снижение 180/181 7,2× 43,36 247,04 7,2 312,19 -65,15 снижение 180/181 Прошедший через фильтр продукт -- 0 нет снижения N/A

Таблица 8 Изменение содержания антигена PCV-2 (в мкг) Лот №/объем Содержание антигена до концентрир. Содержание антигена после концентрир. Коэффициент концентрирования Рассчит. содержание антигена Отличие от рассчит. содержания антигена Увеличение/снижение по сравнению с рассчит. RP SUB 504 (40,43 кг), 4,3× 300 кДа, PDX 22,24 68,16 4,3 95,63 -27,47 Снижение SUB 504 20× 22,24 448,48 20 444,8 3.68 Увеличение SUB 504 Прошедший через фильтр продукт -- 0 нет снижения

Осуществляли ДСН-ПААГ продуктов из лотов PCV 180/181 и SUB 504PD на фирме R&D. Представленная на чертеже зона ORF-2, соответствующая молекулярной массе примерно 27 кДа, согласовалась со схемой зон референс-образца в полосе 10. Ранее было установлено, что этот размер зоны должен соответствовать ORF-2. Для прошедшего через фильтр продукта из лота SUB 504PD после концентрирования путем фильтрации через 300 кДа-фильтр отсутствовала зона в положении, соответствующем 27 кДа. При использовании фильтра с таким размером пор не было выявлено потери белка ORF-2. Гель-электрофорез осуществляли в восстанавливающих условиях.

Осуществляли тестирование вирулицидной активности антигена до концентрирования, сконцентрированного антигена, восстановленного антигена и прошедшего через фильтр продукта с точки зрения применимости в вакцине против вируса PRRS. В случае лота SUB 037 первоначальные результаты контроля качества (QC) оказались неудовлетворительными для продукта до концентрирования и сконцентрированного продукта (фильтр 100 кДа), который восстанавливали до 1 × объема с помощью физиологического раствора. Однако, когда сконцентрированный продукт включали в состав вакцин, то использование концентрации вплоть до 80% от уровня включения в вакцину приводило к тому, что уровень снижения указанной вирулицидной активности становился удовлетворительным, он находился гораздо ниже допустимого уровня потери титра вируса PRRS, составлявшего 0,7 log/мл. Прошедший через фильтр продукт из лота SUB 037 характеризовался уровнями вирулицидной активности, находящимися вблизи границы неудовлетворительных уровней (см. таблицу 9).

Было установлено, что продукт из PCV 1025 до концентрирования обладал неудовлетворительными характеристиками с точки зрения вирулицидной активности в отношении PRRSV, снижение титра PRRSV составляло 1,5 log/мл. Три восстановленных с помощью физиологического раствора сконцентрированных (фильтр 100 кДа) продукта удовлетворяли требованиям, два из них приводили к снижению титра PRRSV на 0,5 log/мл и 0,6 log/мл соответственно, а один из восстановленных концентратов удовлетворял им, поскольку он не приводил к изменениям титра PRRSV (в таблице 10: «нет изменений»). Для этого лота не проводили тестирование образцов продуктов, прошедших через фильтр (см. таблицу 10).

Было установлено, что предназначенный для вакцины продукт из лота PCV 180/181, до концентрирования обладал неудовлетворительной вирулицидной активностью в отношении PRRSV в 2 из 3 приготовленных вакцинах. Процент уровней включения антигена составлял от 37,0 до 55,5%. Было установлено, что вакцина с наиболее высоким % включения продукта до его концентрирования обладала удовлетворительными характеристиками.

Было установлено, что вакцины приготовленные из 1 × продукта (концентрат, восстановленный до 1 × объема с помощью физиологического раствора) обладали удовлетворительной вирулицидной активностью в отношении вируса PRRS. Процент уровней включения антигена составлял от 44 до 66% (см. таблицу 11).

Было установлено, что в случае лота SUB 504PD вакцины, приготовленные из антигена до его концентрирования, при уровне включения в вакцину 79,5%, обладали удовлетворительной вирулицидной активностью в отношении вируса PRRS. Вакцины, приготовленные из сконцентрированного в 4,3 раза антигена, при уровне включения в вакцину 23,5-35% и из сконцентрированного в 21,5 раза антигена при уровне включения в вакцину 3,5-5,5%, также оказались удовлетворительными. И, наконец, было установлено, что антиген из промывочной жидкости, прошедшей через фильтр, при его включении в вакцину с уровнем включения 72% обладал удовлетворительной вирулицидной активностью в отношении вируса PRRS.

Таблица 9 Вирулицидная активность SUB 037 Образец № Изменение эффективности log/мл Насыщающие/ненасыщающие условия SUB 037, до концентр. (18,94 кг), 4,7× 100 кДа, PDX 1,4 Ненасыщающие Содержание антигена до конц. 56/после конц. 137,6 Концентрированный и восстановленный с помощью физ. раствора-1 0,8 Ненасыщающие Концентрированный и восстановленный с помощью физ. раствора-2 1,3 Ненасыщающие Концентрированный и восстановленный с помощью физ. раствора-3 1,3 Ненасыщающие SUB 037, прошедший через фильтр продукт-1 0,6 Насыщающие SUB 037, прошедший через фильтр продукт-2 1,0 ненасыщающие SUB 037, прошедший через фильтр продукт-3 0,5 Насыщающие Вакцина: 20% включение Ames** -0,2 Насыщающие Образец № Изменение эффективности log/мл Насыщающие/ненасыщающие условия Вакцина: 40% включение Ames** -0,2 Насыщающие Вакцина: 60% включение Ames** 0,2 Насыщающие Вакцина: 80% включение Ames** 0,1 Насыщающие

Таблица 10 Вирулицидная активность PCV 1025 Образец № Изменение эффективности Log/мл Насыщающие/ненасыщающие условия PCV 1025, до концентр. (20,46 кг) 4,5× 100 кДа PDX 1,5 Ненасыщающие Содержание антигена до конц. 70,8/после конц. 288,64 Концентрированный и восстановленный с помощью физ.раствора-1 0,6 Насыщающие Концентрированный и восстановленный с помощью физ.раствора-2 Нет изменений Насыщающие Концентрированный и восстановленный с помощью физ. раствора-3 0,5 Насыщающие 1025, прошедший через фильтр продукт-1 Нет изменений N/A

Таблица 11 Вирулицидная активность PCV 180/181 Образец № % включения в вакцину Изменение эффективности Log/мл Насыщающие/ненасыщающие условия PCV 180/181 (49,3 кг) 3,5× 300 кДа PDX N/A N/A N/A Содержание антигена до конц. 43,36 мкг/ содержание антигена (1) 90,88 мкг/ содержание антигена (2) 247,04 мкг Преконцентрат вакцины 37,0 Снижение на 1,2 log/мл Ненасыщающие Содержание антигена 16 мкг / фактическое 8,8 мкг Преконцентрат вакцины 44,5 Снижение на 1,2 log/мл ненасыщающие Содержание антигена 19,2 мкг / фактическое 8,8 мкг Преконцентрат вакцины 55,5 Увеличение на 0,8 log/мл Насыщающие Содержание антигена 24 мкг / фактическое 15,36 мкг 7 × концентрированный, восстановлен до 1 × вакцины 44,0 Увеличение на 0,6 log/мл Насыщающие Содержание антигена 16 мкг / фактическое 8,48 мкг 7 × концентрированный, восстановлен до 1 × вакцины 53,0 Нет изменений Насыщающие Содержание антигена 19,24 мкг / фактическое 12,32 мкг 7 × концентрированный, восстановлен до 1 × вакцины 66,0 Увеличение на 0,3 log/мл насыщающие Содержание антигена 24 мкг / фактическое 14,08 мкг

Таблица 12 Вирулицидная активность SUB 504PD Образец № % включения в вакцину Изменение эффективности Log/мл Насыщающие /ненасыщающие условия SUB 504PD (~40 кг), 4,3× 300 кДа, PDX N/A N/A N/A Содержание антигена до конц. 22,24 мкг/ содержание антигена (1) 68,16 мкг/ содержание антигена (2) 448,48 мкг Преконцентрат вакцины 79,5 Снижение на 0,3 log/мл насыщающие Содержание антигена 16 мкг / фактическое 10,24 мкг 4,3 × вакцины 23,5 Увеличение на 0,1 log/мл насыщающие Содержание антигена 16 мкг / фактическое 18,56 мкг 4,3 × вакцины 28,0 Увеличение на 0,7 log/мл Насыщающие Содержание антигена 19,2 мкг / фактическое 3,04 мкг 4,3 × вакцины 35,0 Увеличение на 0,1 log/мл Насыщающие Содержание антигена 24 мкг / фактическое 5,28 мкг 21,5 × вакцины 3,5 Снижение на 0,1 log/мл Насыщающие Содержание антигена 16 мкг / фактическое 10,08 мкг 21,5 × вакцины 4,5 Увеличение на 0,1 log/мл Насыщающие Содержание антигена 19,2 мкг / фактическое 15,2 мкг 21,5 × вакцины 5,5 Увеличение на 0,3 log/мл Насыщающие Содержание антигена 24 мкг / фактическое 3,36 мкг Смыв с фильтра 72,0 Увеличение на 0,7 log/мл Насыщающие Содержание антигена 16 мкг / фактическое 12,96 мкг

Таблица 13 Характеристики процесса SUB 506: 100000 NMWC-фильтр Время TMP (фунты/кв. дюйм) Проходящий поток (мл/мин) Поток (л/м2ч) 13:25 12 800 11,43 13:59 11,5 3300 47,14 15:09 12,5 3800 54,29 15:29 12 2100 30,00

Таблица 14 Характеристики процесса SUB 513: 100000 NMWC-фильтр Время TMP (фунты/кв. дюйм) Проходящий поток (мл/мин) Поток (л/м2ч) 6:49 11,5 2600 37,14 8:06 11,5 2700 38,57

Таблица 15 Характеристики процесса SUB 512: 300000 NMWC-фильтр Время TMP (фунты/кв. дюйм) Проходящий поток (мл/мин) Поток (л/м2ч) 15:25 16 5000 142,86 18:00 13 800 22,86 20:03 17,5 3500 100,00 21:05 17,5 3000 85,71 21:47 18 2500 71,43 21:59 12,5 4000 114,29

Обсуждение

Вакцина против цирковируса свиней типа 2 на основе убитого бакуловирусного вектора представляет собой широко применяемый в мире продукт, который производится фирмой Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., Сент-Джозеф, шт.Миссури, и который применяется в продукте INGELVAC CIRCOFLEX®. При сборе содержащие вирус жидкости предварительно фильтровали в асептических условиях через один или несколько фильтров (префильтров) с размером пор 2-15 мкм, а затем осуществляли окончательную фильтрацию через фильтр с размером пор 0,8-1,0 мкм. К собранным жидкостям добавляли маточный раствор BEI (бинарный этиленимин) до достижения конечной концентрации BEI, составляющей 5 мМ. Жидкости непрерывно перемешивали в течение периода времени, составляющего от минимум 72 ч до максимум 96 ч, и затем их можно хранить в замороженном состоянии при температуре ≤40°C или при 4°C±3°C. Для нейтрализации всех остаточных количеств BEI добавляли 1,0 М раствор тиосульфата натрия до достижения конечной концентрации, составляющей 5 мМ.

После нейтрализации антиген смешивали с 0,5%-ным раствором карбопола до достижения концентрации 20 об.%, при этом концентрацию белка ORF2 PCV-2 в конечном продукте регулировали путем добавления физиологического раствора для того, чтобы удовлетворить минимальным требованиям к относительной эффективности, превышающей или равной 1,0. После получения нерасфасованного продукта партию можно хранить при 4°C или заполнять контейнеры.

После осуществления нейтрализации продукт, содержащий ORF2 PCV-2, концентрировали посредством ультрафильтрации через половолоконный картридж. Сконцентрированный продукт подвергали дополнительной обработке путем диафильтрации в противотоке двух объемов физиологического раствора. Были определены предпочтительные размеры пор для предельных номинальных молекулярных масс при ультрафильтрации (nominal molecular weight cut-off, NMWC), такие поры имели фильтры для 100000 NMWC и 300000 NMWC, каждый фильтр имел диаметр просвета трубки 1,0 мм. Были включены оба размера пор для обеспечения гибкости процесса производства в случае перерыва поставок картриджей фильтров фирмой-производителем. Результаты анализа с помощью гель-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) и данные об эффективности свидетельствовали об отсутствии различий в содержании белка антигена или эффективности между вариантами, полученными при использовании фильтров с указанными двумя размерами пор.

Пример 2

В этом примере проведено сравнение относительных выходов ORF2 при использовании способов, предлагаемых в настоящем изобретении, и известных из существующего уровня техники методов. Следует иметь в виду, что в данном примере представлен лишь один из многочисленных возможных способов получения ORF2 PCV-2 для применения в предлагаемых в настоящем изобретении способах и композициях.

Материалы и методы

В каждую из четырех вращающихся колб вместимостью по 1000 мл вносили по 300 мл бессывороточной среды для насекомых Excell 420 (фирма JRH Biosciences, Inc., Ленекса, шт.Канзас), засеянной Sf+-клетками из расчета примерно 1,0×106 клеток/мл. Мастер-культуру клеток обозначили как SF+ (Spodoptera frugiperdd) Master Cell Stock, пассаж 19, лот №N112-095W. Клетки, которые применяли для создания SF+ Master Cell Stock, получали от фирмы Protein Sciences Corporation, Inc., Мериден, шт.Коннектикут. В данном примере применяли линию SF+-клеток, полученную при пассажах с номерами от 19 по 59. Для целей настоящего изобретения можно применять также и другие пассажи, но для перехода к промышленному производству, по-видимому, необходимо осуществлять по меньшей мере 19 пассажей, а пассажи с номером, превышающим 59, могут оказывать влияние на экспрессию, хотя это вопрос не изучали. Более подробно процедура заключалась в следующем. Исходные культуры SF+-клеток после хранения в жидком азоте выращивали в среде Excell 420 в виде суспензионной культуры в стерильных вращающихся колбах при постоянном перемешивании. Культуры выращивали во вращающихся колбах вместимостью от 100 до 250 мл, содержащих от 25 до 150 мл бессывороточной среды Excell 420. После размножения клеток до достижения плотности клеток 1,0-8,0×106 клеток/мл их распределяли по новым сосудам с плотностью посева 0,5-1,5×106 клеток/мл. Последующие размножающиеся культуры выращивали во вращающихся колбах вместимостью вплоть до 36 л или в биореакторах из нержавеющей стали вместимостью вплоть до 300 л в течение периода времени, составляющего 2-7 дней, при 25-29°C.

После посева колбы инкубировали при 27°C в течение четырех часов. После этого каждую колбу засевали рекомбинантным бакуловирусом, содержащим ген ORF2 PCV-2 (SEQ ID NO: 4). Рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген ORF2 PCV-2, создавали следующим образом: ген ORF2 PCV-2 из Северо-американского штамма PCV-2 амплифицировали с помощью ПЦР так, чтобы он содержал 5'-последовательность Козака (SEQ ID NO: 1) и 3'-сайт EcoR1 (SEQ ID NO: 2), клонировали в векторе pGEM-T-Easy (фирма Promega, Мэдисон, шт.Висконсин). Затем его последовательно вырезали и субклонировали в векторе-переносчике pVL1392 (фирма BD Biosciences Pharmingen, Сан-Диего, шт.Калифорния). Субклонированная часть представлена в настоящем описании в SEQ ID NO: 7. Плазмиду pVL1392, содержащую ген ORF2 PCV-2, обозначили как N47-064Y и затем ее применяли в сочетании с бакуловирусной ДНК BaculoGold® (фирма BD Biosciences Pharmingen) для котрансфекции клеток насекомых Sf+ (фирма Protein Sciences, Мериден, шт.Коннектикут) с получением рекомбинантного бакуловируса, содержащего ген ORF2 PCV-2. Последовательность созданной новой конструкции обозначили в настоящем описании как SEQ ID NO: 8. Рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген ORF2 PCV-2, очищали из бляшек и размножали затравочный мастер-вирус (Master Seed Virus, MSV) на клетках линии SF+, разделяли на аликвоты и хранили при -70°C. MSV идентифицировали как содержащий ORF2 PCV-2 бакуловирус с помощью ПЦР-RFLP (ПЦР с изучением полиморфизма длин рестрикционных фрагментов) с использованием специфических в отношении бакуловируса праймеров. Клетки насекомых, инфицированные содержащим ORF2 PCV-2 бакуловирусом для создания MSV или рабочего затравочного вируса (Working Seed Virus), экспрессировали антиген ORF2 PCV-2, что выявляли с помощью непрямого флуоресцентного анализа антител с использованием поликлональной сыворотки или моноклональных антител. Кроме того, идентичность содержащего ORF2 PCV-2 бакуловируса подтверждали с помощью N-концевого аминокислотного секвенирования. В соответствии с 9 C.F.R. 113.27 (с), 113.28 и 113.55 проверяли также чистоту содержащего ORF2 PCV-2 бакуловирусного MSV. Каждый рекомбинантный бакуловирус, высеянный во вращающиеся колбы, характеризовался различной множественностью заражения (MOI). Колба 1 была засеяна 7,52 мл посевного материала с MOI 0,088; колба 2 была засеяна 3,01 мл посевного материала с MOI 0,36; колба 3 была засеяна 1,5 мл посевного материала с MOI 0,18 и колба 4 была засеяна 0,75 мл посевного материала с MOI 0,09.

После посева бакуловируса колбы инкубировали при 27±2°C в течение 7 дней и в течение этого периода времени их содержимое перемешивали со скоростью 100 об/мин. Колбы были снабжены вентилируемыми крышками, пропускающими воздух. В течение 7 последующих дней из каждой колбы отбирали образцы через каждые 24 ч. После экстракции каждый образец центрифугировали, разделяли дебрис и супернатант и затем подвергали микрофильтрации через мембрану с размером пор 0,45-1,0 мкм.

Результаты и выводы

Затем в полученных образцах определяли количественно содержание ORF2 с помощью ELISA. Анализ методом ELISA осуществляли с использованием иммобилизованного очищенного на белке G поликлонального свиного антитела к PCV-2 в виде IgG (разведенного в соотношении 1:250 в ЗФР), разведенного в соотношении 1:6000 в 0,05 М карбонатном буфере (рН 9,6). Затем 100 мкл антитела вносили в лунки титрационного микропланшета, запечатывали и инкубировали в течение ночи при 37°C. Затем планшет отмывали трижды промывочным раствором, который содержал 0,5 мл Твин 20 (фирма Sigma, Сент-Луис, шт.Миссури), 100 мл 10 × D-ЗФР (фирма Gibco Invitrogen, Карлсбад, шт.Калифорния) и 899,5 мл дистиллированной воды. Затем в каждую лунку добавляли по 250 мкл блокирующего раствора (5 г обезжиренного сухого молока Carnation (фирма Nestle, Глендал, шт.Калифорния) в 10 мл D-ЗФР, объем которого доводили (q.s.) до 100 мл дистиллированной водой). Следующая стадия заключалась в отмывке тест-планшета и последующем добавлении предварительно разведенного антигена. Предварительно разведенный антиген приготавливали путем добавления по 200 мкл раствора для разведения (0,5 мл Твин 20 в 999,5 мл D-ЗФР) в каждую лунку планшета для разведения. После этого образец разводили в соотношении 1:240 и в соотношении 1:480, и затем по 100 мкл каждого из этих разведенных образцов добавляли в одну из верхних лунок планшета для разведения (т.е. в одну верхнюю лунку вносили 100 мкл разведения 1:240, а в другую вносили 100 мкл разведения 1:480). Затем осуществляли серийные разведения содержимого остальных лунок планшета путем взятия по 100 мкл содержимого из каждой последующей лунки и переноса его в следующую лунку планшета. Содержимое каждой лунки перемешивали перед осуществлением последующего переноса. Отмывку тест-планшета осуществляли путем трехкратной отмывки планшета промывочным буфером. После этого планшет запечатывали и инкубировали в течение 1 ч при 37°C перед осуществлением следующей 3-кратной отмывки промывочным буфером. В качестве идентифицирующего антитела применяли моноклональное антитело к ORF2 PCV . Его разводили в соотношении 1:300 раствором для разведения и затем добавляли в лунки по 100 мкл разведенного идентифицирующего антитела. После этого планшет запечатывали и инкубировали в течение 1 ч при 37°C перед осуществлением трехкратной отмывки промывочным буфером. Затем приготавливали разбавитель для конъюгата путем добавления кроличьей сыворотки здорового животного (фирма Jackson Immunoresearch, Вест Грове, шт.Пенсильвания) к раствору для разбавления до достижения концентрации 1%. Конъюгат козье антимышиное антитело (H+1)-HRP (фирма Jackson Immunoresearch) разводили в разбавителе для конъюгата в соотношении 1:10000. После этого в каждую лунку добавляли по 100 мкл разведенного конъюгата антитела. После этого планшет запечатывали и инкубировали в течение 45 мин при 37°C перед осуществлением трехкратной отмывки промывочным буфером. В каждую лунку добавляли по 100 мкл субстрата (субстрат для пероксидазы TMB, фирма Kirkgaard and Perry Laboratories (фирма KPL), Гейтерсберг, шт.Мэриленд), смешанного с равным объемом субстрата В для пероксидазы (фирма KPL). Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем во все лунки добавляли по 100 мкл 1 н. раствора HCl для прекращения реакции. После этого осуществляли прочитывание планшетов с помощью ридера для ELISA.

Результаты этого анализа представлены в приведенной ниже таблице 17.

Таблица 17 День Колба Содержание ORF2 в дебрисе (мкг) Содержание ORF2 в супернатанте (мкг) 3 1 47,53 12 3 2 57,46 22 3 3 53,44 14 3 4 58,64 12 4 1 43,01 44 4 2 65,61 62 4 3 70,56 32 4 4 64,97 24 5 1 31,74 100 5 2 34,93 142 5 3 47,84 90 5 4 55,14 86 6 1 14,7 158 6 2 18,13 182 6 3 34,78 140 6 4 36,88 146 7 1 6,54 176 7 2 12,09 190 7 3 15,84 158 7 4 15,19 152

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при увеличении времени инкубации уровень экспрессии ORF2, обнаруженный в супернатанте центрифугированных клеток и среде, становится больше, чем уровень экспрессии, обнаруженный в дебрисе центрифугированных клеток и среде. Следовательно, если обеспечивать экспрессию ORF2 по меньшей мере в течение 5 дней и выделять продукт из супернатанта, а не обеспечивать экспрессию по меньшей мере в течение 5 дней и выделять ORF2 из клеток, то это позволяет существенно повышать выход ORF2, что представляет собой существенное преимущество по сравнению с существующими в настоящее время методами.

Пример 3

Очистку ORF2 осуществляли с помощью процесса микрофильтрации и последующей двухстадийной хроматографии. Собранный продукт, который получали согласно процедуре, описанной в примере 1, фильтровали через микрофильтрационную мембрану, имеющую размер пор 1,2 мкм. Затем полученный в результате микрофильтрации продукт очищали с помощью вытеснительной хроматографии (гель-фильтрации) с использованием HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR-колонки. Исходный образец, представляющий собой 20 мл фильтрата, содержащего ORF2 PCV-2, вносили на HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR-колонку при скорости потока 1,0 мл/мин и элюировали буфером А (20 мМ Трис, рН 6,5, 5 мМ ДТТ), взятым в объеме, равном 1,5 объемам колонки. В процессе осуществления элюции отбирали фракции объемом по 8 мл. Фракции №№10-16 (миллититры элюата 10-16), полученные при осуществлении вытеснительной хроматографии, объединяли и использовали в качестве исходного образца при осуществлении анионообменной хроматографии (АОХ). Эти фракции представляют собой «мертвый» объем разделяющей колонки, который образуется, когда ORF2 PCV-2 элюируется благодаря высокой молекулярной массе белка ORF2 PCV-2. Этот метод позволяет эффективно отделять ORF2 от большинства других белковых компонентов образца, содержащего антиген.

АОХ осуществляли с использованием 5 мл HiTrap Q Sepharose HP-колонки. Примерно 48 мл пула фракций «мертвого» объема, полученных после эксперимента с применением вытеснительной хроматографии, вносили на HiTrap Q Sepharose HP-колонку для АОХ при скорости потока 3,0 мл/мин. После стадии отмывки с использованием загрузочного буфера А (20 мМ Трис, рН 6,5, 5 мМ ДТТ) для удаления несвязанного продукта, белок элюировали, осуществляя одну стадию хроматографирования с использованием буфера Б (20 мМ Трис, рН 6,5, 5 мМ ДТТ, 1,0 М NaCl) в количестве, равном 8 объемам колонки, и собирали фракции объемом 5 мл. Пиковые фракции №8 и №9 собирали и объединяли. Продукт, прошедший через колонку при осуществлении АОХ, вносили на колонку с Q Sepharose и осуществляли элюцию согласно описанной выше процедуре. Полученные после осуществления второго погона фракции №№7, 8 и 9 объединяли с фракциями, полученными после первого погона. Третий погон с использованием продукта, прошедшего через колонку, не приводил к появлению значительной пиковой фракции в элюате, поэтому после этого погона не осуществляли отбор фракций.

Пул фракций объемом примерно 25 мл подвергали в течение ночи при 4°C диализу в противотоке 2 л забуференного фосфатом физиологического раствора, рН 7,4 (фирма Gibco). После диализа чистота ORF2 составляла >95% по данным ДСН-ПААГ-анализа.

Пример 4

Приготавливали растворы гидробромида 2-бромэтиламина (BEA), гидроксида натрия (NaOH) и тиосульфата натрия (Na2S2O3). Раствор BEA получали, отвешивая 1,63 г BEA (фирма Sigma, B65705, лот 05316EE) и растворяя в 20 мл очищенной воды (dH2O, дистиллированная вода, в настоящем описании обозначена как «вода»). Конечная концентрация ВЕА в этом растворе составляла 0,4 М. Раствор NaOH получали, отвешивая 0,33 г NaOH (фирма JTBaker, 3722-01, лот E01470) и растворяя в 20 мл воды. Конечная концентрация NaOH в этом растворе составляла 0,41 М. Раствор тиосульфата натрия (Na2S2O3) получали, отвешивая 25 г Na2S2O3 (фирма Sigma S7026, лот 106K0178) и растворяя в 100 мл воды. После растворения раствор фильтровали через 0,2 мкм фильтр типа Bottle-Top с целью стерилизации. Конечная концентрация Na2S2O3 в этом растворе составляла 1,0 М.

Для получения бинарного этиленимина (BEI) 20 мл 0,4 М раствора BEA смешивали с 20 мл 0,41 М раствора NaOH, при этом начальное значение рН составляло 12,5-14,0. Смесь инкубировали при 37°C в течение 1 ч и снова проверяли значение рН. После инкубации значение рН составляло 7,0-7,5, и это свидетельствовало об успешном превращении BEA в BEI в результате реакции циклизации. Согласно расчету конечная концентрация BEI должна была составлять 0,2 М (20 мл 0,4 М BEA циклизовали с использованием избытка основания (0,41 М) в объеме 40 мл).

Реакции инактивации осуществляли следующим образом (данные приведены из расчета на 100 мл продукта, предназначенного для инактивации): Предназначенные для инактивации продукты смешивали с 2,5 мл свежеприготовленного BEI. Реакционные смеси, предназначенные для инактивации, инкубировали в течение 72 ч при 37°C при непрерывном перемешивании растворов. Через 72 ч реакционные смеси нейтрализовали путем добавления 0,5 мл 1,0 М раствора тиосульфата натрия. После полного смешения тиосульфата с растворами (перемешивание в течение ~15 мин) инактивированные и нейтрализованные продукты хранили при 4°C до смешения с адъювантом.

Пример 5

Приготовление тест-образцов:

Для оценки иммуногенности высокоочищенного антигена ORF2 (степень чистоты более 90%) по сравнению с неочищенным или имеющим меньшую степень очистки антигеном ORF2 приготавливали партии нескольких тест-образцов объемом по 5 мл:

Таблица 18 Тест-образцы Тест-образец № Описание 1 Высокоочищенный антиген ORF2, инактивированный с помощью BEI и смешанный с карбополом, взятым в концентрации 1 мг/мл 2 Высокоочищенный антиген ORF2, смешанный с дебрисом клеток насекомых, инактивированный с помощью BEI и смешанный с карбополом, взятым в концентрации 1 мг/мл 3 Дебрис клеток насекомых (контроль-«пустышка») 4 Антиген ORF2 PCV-2, не фильтрованный, неочищенный, смешанный с карбополом, взятым в концентрации 1 мг/мл 5 Антиген ORF2 PCV-2, не фильтрованный, неочищенный, инактивированный с помощью BEI и смешанный с карбополом, взятым в концентрации 1 мг/мл 6 Антиген ORF2 PCV-2, неочищенный, инактивированный с помощью BEI и смешанный с карбополом, взятым в концентрации 1 мг/мл

Тест-образец №1 получали следующим образом. Антиген ORF2 PCV-2 получали согласно процедуре, описанной в примере 1, и очищали до достижения высокой степени чистоты согласно процедуре, описанной в примере 3. Высокоочищенный антиген ORF2 PCV-2 инактивировали с помощью BEI согласно процедуре, описанной в примере 4. После инактивации с помощью BEI содержание антигена ORF2 PCV-2 доводили до уровня, составляющего примерно 32-32,5 мкг/мл тест-образца, и смешивали с Carbopol® 97 IP (фирма BF Goodrich, шт.Огайо, США), взятым в количестве 1 мг на 1 мл тест-образца.

Тест-образец №2 получали следующим образом. Антиген ORF2 PCV-2 получали согласно процедуре, описанной в примере 1, и очищали до достижения высокой степени чистоты согласно процедуре, описанной в примере 3. Высокоочищенный антиген ORF2 PCV-2 инактивировали с помощью BEI согласно процедуре, описанной в примере 4. После инактивации с помощью BEI антиген ORF2 PCV-2 смешивали с дебрисом клеток насекомых и карбополом. Конечный тест-образец содержал примерно 2,06×106 клеток насекомых, примерно 32-32,5 мкг антигена ORF2 PCV-2 и 1 мг Carbopol® 971P на 1 мл тест-образца.

Тест-образец №3 получали путем смешения примерно 2,06×106 клеток насекомых с 1 мг Carbopol® 971P на 1 мл тест-образца. Перед смешением клетки насекомых инактивировали с помощью BEI согласно процедуре, описанной в примере 3.

Тест-образец №4 получали следующим образом. Антиген ORF2 PCV-2 получали согласно процедуре, описанной в примере 1. Содержание антигена ORF2 PCV-2 в супернатанте доводили до уровня, составляющего примерно 32-32,5 мкг/мл тест-образца, и смешивали с Carbopol® 971P, взятым в количестве 1 мг на 1 мл тест-образца.

Тест-образец №5 получали следующим образом. Антиген ORF2 PCV-2 получали согласно процедуре, описанной в примере 1. Затем осуществляли инактивацию супернатанта с помощью BEI согласно процедуре, описанной в примере 3. После инактивации с помощью BEI антиген ORF2 PCV-2 смешивали с дебрисом клеток насекомых и карбополом. Конечный тест-образец содержал примерно 2,06×106 клеток насекомых, примерно 32-32,5 мкг антигена ORF2 PCV-2 и 1 мг Carbopol® 971P на 1 мл тест-образца.

Тест-образец №6 получали следующим образом. Антиген ORF2 PCV-2 получали согласно процедуре, описанной в примере 1. Затем супернатант, полученный согласно процедуре, описанной в примере 1, фильтровали через лабораторный фильтр с размером пор 1,2 мкм. Ранее было установлено, что этот размер пор достаточен для отфильтровывания интактных и разрушенных клеток насекомых, но он не препятствует прохождению антигена ORF2 PCV-2 через фильтр. После этого фильтрат инактивировали с помощью BEI согласно процедуре, описанной в примере 3. После инактивации с помощью BEI содержание антигена ORF2 PCV-2 доводили до уровня, составляющего примерно 32-32,5 мкг/мл тест-образца, и смешивали с 1 мг Carbopol® 971P.

Тестирование иммуногенности каждого тест-образца

Клиническая фаза:

150 самок мышей линии Balb/C получали от фирмы Jackson Laboratories (США) и давали им акклиматизироваться в течение семи дней. Из каждой клетки произвольно отбирали по одной мыши, у которой в день 0 брали кровь, получая в общей сложности 26 образцов. В общей сложности десяти мышам инокулировали подкожно по 0,1-0,2 мл фосфатного буфера Дульбекко.

В общей сложности двадцати мышам инокулировали подкожно по 0,1-0,2 мл каждого из тест-образцов (тест-образцы №№1-6). В каждой клетке находилось по пять мышей, и все мыши в одной клетке входили в одну и ту же группу обработки. В день 21 у всех мышей брали последние образцы крови. Каждому образцу крови давали свернуться, и сыворотку собирали центрифугированием. Все образцы помещали в отдельные пробирки и хранили при -80°C±10°C до анализа. Мышей уничтожали путем кремирования.

Тестирование образцов:

Иммуногенность каждого тест-образца оценивали путем измерения вызываемого каждым тест-образцом специфического в отношении PCV-2 гуморального иммунного ответа с помощью специфического в отношении PCV-2 ELISA, разработанного для внутреннего использования на фирме. Степень иммуногенности каждого тест-образца представлена в таблице 2 в виде относительных величин иммуногенности (RI). Указанная относительная величина иммуногенности представляет собой величину титра специфического в отношении ORF2 антитела, измеренного у иммунизированного животного, для стандартизованного количества антигена ORF2, использованного для иммунизации.

Для измерения уровня специфических в отношении PCV-2 антител можно применять вместо разработанного для внутреннего использования ELISA также и ELISA, описанный у Nawagitgul P. и др., Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9, 2002, сс.33-40, сущность и содержание указанной публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки. Измеренные с помощью указанного анализа величины также можно использовать для расчета относительных величин иммуногенности (см. ниже).

Аликвоту образца сыворотки из каждой мыши объединяли с аликвотами сыворотки, взятыми у мышей-соседей по клетке, с получением в целом 26 образцов в день 21. Аликвоты всех образцов сыворотки, полученных в день 0, объединяли с получением одного образца. В качестве эталона использовали двукратное разведение исходного продукта (1:2) и его добавляли в каждую соответствующую лунку в трех повторностях. Добавляли в трех повторностях положительные и отрицательные контроли. Каждый образец серийно разводили в соотношении 1:2 и добавляли в планшет в трех повторностях, начиная с разведения 1:200. Считывали конечную абсорбцию при длине волны 450 нм, используя подвергаемый ежемесячной калибровке планшет-ридер SoftMax™, и осуществляли электронную регистрацию всех необработанных значений ОП «захватывали» и анализировали с помощью программы Statlia (фирма Brendan Scientific) для расчета величин относительной иммуногенности (RI).

Результаты:

Рассчитанная величина RI для всех полученных после иммунизации антител продемонстрировала, что препарат очищенного PCV-2 ORF2 вызывал наиболее сильный серологический (гуморальный) ответ на высокоочищенный антиген ORF2 PCV-2. Применение препарата очищенного ORF2 PCV-2 в сочетании с дебрисом клеток насекомых приводило к снижению относительной иммуногенности (т.е. иммуногенности) ORF2 по сравнению с применением только высокоочищенного ORF2 PCV-2. Применение только клеток насекомых вообще не приводило к гуморальному иммунному ответу на антиген ORF2 PCV-2. В тест-образцах 4-6, которые также не содержали высоко очищенный антиген ORF2 PCV-2, также было обнаружено снижение относительной иммуногенности по сравнению с применением только высокоочищенного ORF2 PCV-2.

Похожие патенты RU2595395C2

название год авторы номер документа
КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА PCV/MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE/PRRS (PCV/MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE/PRRS COMBINATION VACCINE) 2013
  • Нитцель Грегори П.
  • Гэлвин Джефри Е.
  • Гаррет Джон Кейт
  • Кьюловик Джеймс Р.Ii
  • Рикер Трейси Л.
  • Сматцер Меган Мари
RU2644256C2
КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА PCV/MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE 2013
  • Нитцель Грегори П.
  • Гэлвин Джефри Е.
  • Гаррет Джон Кейт
  • Кьюловик Джеймс Р.Ii
  • Рикер Трейси Л.
  • Сматцер Меган Мари
RU2615443C2
ВАКЦИНА ПРОТИВ РСV-2 2006
  • Руринк Франк
  • Ван Вунсел Петер
RU2389506C2
РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНТИГЕНЫ ЦИРКОВИРУСА СВИНЕЙ ТИПА 2 (PCV-2) ДЛЯ КОМПОЗИЦИЙ ВАКЦИН, ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 2014
  • Ди-Алмэида Марсия-Рожерия
  • Жуниор Абеларду-Силва
  • Фьетту Жулиана-Лопеш-Ранжел
  • Брессан Густву-Коста
  • Салгадо Рафаэл-Локателли
  • Онуфре Тьягу-Соза
  • Фаусту Мариана-Кошта
  • Видигал Педру-Маркуш-Перейра
  • Калкш Стефани-Патарели
  • Кришпим Жузиселли-Соза
  • Амазилиш-Силва-Лейте Роберта
  • Андраде-Тейшейра Жаксон-Ди
  • Фьялу-Гонзага Наталья
  • Жакел-Зилш Тьягу
  • Лину-Ди-Соза Луиш
  • Да-Круш-Соза Аманда-Мартинш
  • Ди-Мораиш-Монтейру Антонью
RU2687001C2
СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ СВИНЕЙ ПРОТИВ СВИНОГО ЦИРКОВИРУСА 2008
  • Ву Стивен Киту
RU2493254C9
ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ СВИНЕЙ ПРОТИВ ЦИРКОВИРУСА ТИПА 3 И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ 2016
  • Хауз Бен
RU2744193C2
ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ СВИНЕЙ ПРОТИВ ЦИРКОВИРУСА ТИПА 3 И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ 2016
  • Хауз, Бен
RU2771533C2
ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ СВИНЕЙ ПРОТИВ ЦИРКОВИРУСА ТИПА 3 И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ 2022
  • Хауз, Бен
RU2803427C1
ПОЛИВАЛЕНТНЫЕ ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ PCV2 И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ТАКИХ КОМПОЗИЦИЙ 2006
  • Руф Майкл
  • Хейс Филлип
  • Айхмайер Марк
  • Нитцель Грег
  • Шэффер Меррилл
RU2577129C2
ПОЛИВАЛЕНТНЫЕ ИММУННОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ PCV2 И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ТАКИХ КОМПОЗИЦИЙ 2006
  • Руф Майкл
  • Хейс Филлип
  • Айхмайер Марк
  • Нитцель Грег
  • Шэффер Меррилл
RU2577127C9

Иллюстрации к изобретению RU 2 595 395 C2

Реферат патента 2016 года СПОСОБЫ СНИЖЕНИЯ ВИРУЛИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ СОДЕРЖАЩИХ PCV-2 КОМПОЗИЦИЙ И СОДЕРЖАЩИЕ PCV-2 КОМПОЗИЦИИ С ПОВЫШЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ

Представленная группа изобретений касается способа получения антигенной композиции, содержащей цирковирус свиней типа 2 (PCV-2), антигенной композиции, иммуногенной композиции, способа уменьшения симптомов вызываемой PCV-2 инфекции у животного и способа повышения иммуногенности иммуногенной композиции. Представленный способ получения антигенной композиции включает получение жидкости, содержащей белок PCV-2. Выделение антигена PCV-2 из вирусной культуры, путем отделения клеточного дебриса от экспрессированного антигена PCV-2 с помощью стадии, включающей микрофильтрацию через фильтр с размером пор от приблизительно 0,6 мкм до приблизительно 2 мкм. Отделение части жидкости от антигена PCV-2 посредством замены части этой среды на фармацевтически приемлемый раствор путем добавления фармацевтически приемлемого раствора к указанной жидкости и концентрирование антигена PCV-2 путем отделения среды и раствора с использованием фильтра со средним размером пор, которые предотвращают прохождение по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа. В рзультате антиген очищен до степени чистоты, составляющей более чем 50 мас.% в пересчете на общее содержание белка. Заявленный способ обеспечивает снижение вирулицидной активности получаемой композиции, благодаря чему такую композицию можно применять в составе мультивалентных композиций. 5 н. и 27 з.п. ф-лы, 1 ил., 17 табл., 5 пр.

Формула изобретения RU 2 595 395 C2

1. Способ получения содержащей PCV-2 антигенной композиции, включающий стадии, на которых:
I) получают жидкость, содержащую белок, синтезированный в результате рекомбинантной экспрессии открытой рамки считывания 2 (ORF-2) PCV2, инактивированный бакуловирусный вектор, нейтрализующий агент и среду для культивирования клеток-хозяев, продуцирующих этот белок, причем указанный антиген PCV-2 представляет собой рекомбинантный белок ORF-2, полученный рекомбинантно in vitro способом, включающим стадии:
(i) инфицирования восприимчивых клеток в клеточной культуре рекомбинантным бакуловирусным вектором, содержащим последовательность, кодирующую PCV-2 ORF2, при этом белок PCV-2 ORF2 экспрессируется рекомбинантным бакуловирусным вектором,
(ii) с последующим выделением антигена PCV-2 ORF2 из вирусной культуры, причем клеточный дебрис отделяется от экспрессированного антигена PCV-2 ORF2 с помощью стадии разделения, включающей микрофильтрацию через фильтр с размером пор от приблизительно 0,6 мкм до приблизительно 2 мкм, и
(iii) инактивации рекомбинантного бакуловирусного вектора с помощью инактивирующего ДНК агента;
II) отделяют по меньшей мере часть указанной жидкости от антигена PCV-2, посредством замены части этой среды на фармацевтически приемлемый раствор, причем замена указанной жидкости на указанный раствор заключается в том, что осуществляют стадии, на которых:
а) добавляют фармацевтически приемлемый раствор к указанной жидкости;и
б) концентрируют антиген PCV-2 путем отделения среды и раствора с использованием фильтра со средним размером пор, которые предотвращают прохождение по меньшей мере 90% белков с молекулярной массой от 50 до 500 кДа;
III) дополнительно осуществляют стадию, на которой собирают антиген PCV-2 после осуществления стадии II) и очищают продукт, собранный после осуществления стадии II), который содержит антиген PCV-2, с помощью хроматографического метода.

2. Способ по п. 1, в котором стадия I) дополнительно включает: (iv) добавление определенного количества нейтрализующего агента, которое нейтрализует инактивирующий агент, причем это количество нейтрализующего агента эквивалентно количеству инактивирующего агента.

3. Способ по п. 1, в котором стадию концентрирования и стадию добавления фармацевтически приемлемого раствора осуществляют практически одновременно.

4. Способ по п. 1, в котором стадию концентрирования и стадию добавления фармацевтически приемлемого раствора осуществляют по меньшей мере два раза.

5. Способ по п. 1, в котором на стадии концентрирования концентрируют антиген в 3-50 раз по сравнению с объемом культуральной среды.

6. Способ п. 1, в котором вирулицидную активность содержащей PCV-2 антигенной композиции снижают по меньшей мере на 10% по сравнению со средой, которую не подвергали обработке согласно заявляемому способу.

7. Способ по п. 1, в котором содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная путем осуществления стадий I) - II), вызывает уменьшение менее чем на 1 log TCID50/мл живого вируса или менее чем на 1 log КОЕ/мл живой бактерии после смешения живого вируса или живой бактерии с содержащей PCV-2 антигенной композицией в течение 2 или более часов.

8. Способ по п. 1, в котором содержащая PCV-2 антигенная композиция, полученная путем осуществления стадий I) - II), вызывает уменьшение менее чем на 0,7 log TCID50/мл живого вируса или менее чем на 0,7 log КОЕ/мл живой бактерии после смешения живого вируса или живой бактерии с содержащей PCV-2 антигенной композицией в течение 2 или более часов.

9. Способ по п. 1, в котором антиген PCV-2 очищают до достижения степени чистоты антигена PCV-2, составляющей более чем 50 мас.% в пересчете на общее содержание белка.

10. Способ по п. 1, дополнительно заключается в том, что осуществляют стадию, на которой смешивают антиген PCV-2, оставшийся после осуществления стадии II), с дополнительным компонентом, выбранным из группы, включающей фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, разбавители, эксципиенты и их комбинации.

11. Способ по п. 10, в котором дополнительный компонент представляет собой адъювант.

12. Способ по п. 11, в котором адъювант представляет собой карбомер.

13. Способ по п. 1, в котором антиген PCV-2 представляет собой белок ORF-2 PCV-2.

14. Способ по п. 1, в котором антиген PCV-2 представляет собой вирусоподобные частицы белка ORF-2.

15. Способ по п. 1, где способ дополнительно заключается в том, что осуществляют стадию, на которой объединяют содержащую PCV-2 антигенную композицию по меньшей мере с одним дополнительным антигеном.

16. Способ по п. 15, в котором по меньшей мере один дополнительный антиген включает антиген вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней и/или антиген Mycoplasma hyopneumoniae.

17. Антигенная композиция, предназначенная для получения иммуногенной композиции для индукции защитного иммунного ответа против PCV-2 и полученная с помощью способа по одному из пп. 1-16, в которой антиген PCV-2 очищен до достижения степени чистоты, составляющей более чем 50 мас.% в пересчете на общее содержание белка.

18. Антигенная композиция по п. 17, где содержащая PCV-2 антигенная композиция вызывает уменьшение менее чем на 1 log TCID50/мл живого вируса или менее чем на 1 log КОЕ/мл живой бактерии после смешения живого вируса или живой бактерии с содержащей PCV-2 антигенной композицией в течение по меньшей мере 2 ч.

19. Антигенная композиция по п. 18, где содержащая PCV-2 антигенная композиция вызывает уменьшение менее чем на 0,7 log TCID50/мл живого вируса или менее чем на 0,7 log КОЕ/мл живой бактерии после смешения живого вируса или живой бактерии с содержащей PCV-2 антигенной композицией в течение по меньшей мере 2 ч.

20. Антигенная композиция по п. 18 или 19, в которой живой вирус представляет собой вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS).

21. Иммуногенная композиция для индукции защитного иммунного ответа против PCV-2 на основе антигенной композиции, полученной с помощью способа по пп. 1-16, содержащая от примерно 0,25 до примерно 400 мкг/дозу антигена и при необходимости адъювант.

22. Иммуногенная композиция по п. 21, где иммуногенная композиция дополнительно содержит ослабленный живой вирус или ослабленную живую бактерию из по меньшей мере одного другого болезнетворного организма, вызывающего заболевание у свиней.

23. Иммуногенная композиция по п. 22, в которой ослабленный живой вирус представляет собой вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS).

24. Иммуногенная композиция по п. 23, где иммуногенная композиция дополнительно содержит бактерии Mycoplasma hyopneumoniae.

25. Иммуногенная композиция по п. 24, где адъювант представляет собой карбомер.

26. Иммуногенная композиция по пп. 21-25, где иммуногенная композиция индуцирует защитный иммунный ответ против PCV-2 после введения одной дозы иммуногенной композиции.

27. Иммуногенная композиция по пп. 21-25, где введение иммуногенной композиции снижает лимфоидное истощение и воспаление по меньшей мере на 80% у животного по сравнению с животным, которому не вводили иммуногенную композицию.

28. Иммуногенная композиция по пп. 21-25, где иммуногенная композиция индуцирует защитный иммунный ответ против Mycoplasma hyopneumoniae после введения одной дозы иммуногенной композиции.

29. Иммуногенная композиция по п. 21, где в 2 мл иммуногенной композиции содержится 1 доза антигена PCV-2.

30. Способ уменьшения одного или нескольких клинических симптомов вызываемой PCV-2 инфекции у животного по сравнению с животным, которому не вводили иммуногенную композицию, включающий стадию, на которой вводят животному иммуногенную композицию по одному из пп. 21-29.

31. Иммуногенная композиция по одному из пп. 21-25, предназначенная для уменьшения одного или нескольких клинических симптомов инфекции, вызываемой PCV-2, у животного по сравнению с животным, которому не вводили иммуногенную композицию.

32. Способ повышения иммуногенности иммуногенной композиции в отношении цирковируса свиней, включающий стадии, на которых:
а) экспрессируют антиген PCV-2 в клетке-хозяине;
б) получают содержащую PCV-2 антигенную композицию с помощью способа по пп. 1-16, в результате осуществления которого антиген PCV-2 очищают до достижения степени чистоты более 50 мас.% в пересчете на общее содержание белка, включенного в композицию;
в) смешивают очищенный антиген PCV-2 с адъювантом.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2016 года RU2595395C2

WO 2006072065 A2, 06.07.2006
WO 2007076520 A2, 05.07.2007
С.Н.КАРТАШОВ и др., Иммуногистохимическое исследование лимфоузлов при цирковирусной инфекции свиней, Ветеринарная патология, 2008, N4, стр.26-31.

RU 2 595 395 C2

Авторы

Кэролайн Энн Колер

Гуосон Чжао

Али Кхазраеназмпур

Бернд Колин Айхенмюллер

Марк Айхмейер

Грегори Хайуик

Меррилл Шэффер

Даты

2016-08-27Публикация

2010-09-02Подача