СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЭТАНОЛА ФЕРМЕНТНЫМ ГИДРОЛИЗОМ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ Российский патент 2016 года по МПК C12P7/10 

Настоящее изобретение описывает способ производства биоэтанола или этанола, включающий предобработку лигнин-целлюлозного растительного сырья для отделения целлюлозы, а также включающий ферментативный гидролиз целлюлозы.

Заявитель, CIMV, является фирмой, специализирующейся на переработке и экономичном использовании лигнин-целлюлозного растительного сырья.

В этой связи заявитель подавал и является собственником различных патентных заявок и патентов, относящихся к способу производства бумажной пульпы, лигнинов, сахаров и уксусной кислоты путем фракционирования лигнин-целлюлозного растительного сырья в среде муравьиная кислота/уксусная кислота (WO-A1-00/68494).

Заявитель является также собственником патентных заявок и/или патентов, связанных со способом предобработки лигнин-целлюлозного растительного сырья для производства биоэтанола (WO-A2-2010/006840).

Такой способ предобработки делает возможным, в частности, получить из лигнин-целлюлозного растительного сырья (LVRM) в экономических индустриальных условиях, во-первых, субстрат, состоящий, в основном, из лишенной древесных волокон целлюлозы, предоставляющей оптимальные условия для последующего ферментативного гидролиза, и второй субстрат, представляющий сахарную патоку, полученную из гемицеллюлоз, гидролизаты которой избежали способа образования фурфурола.

Заявитель, следовательно, уже предлагал способ производства биоэтанола из лигнин-целлюлозного растительного сырья, включающий последовательные стадии предобработки LVRM, ферментативный анализ предобработанного материала и спиртовую ферментацию продуктов, полученных на стадии гидролиза.

Заявитель, в частности, предлагал способ производства биоэтанола из лигнин-целлюлозного растительного сырья, включающий последовательные стадии:

а) предобработку лигнин-целлюлозного растительного сырья для разделения целлюлозы, гемицеллюлоз и лигнинов, содержащихся в этом лигнин-целлюлозном растительном сырье, включающую следующие последовательные стадии, состоящие в:

(i) деструкции лигнин-целлюлозного растительного сырья путем выдерживания его в смеси, содержащей муравьиную кислоту и воду при температуре реакции между 95°С и 110°С;

(ii) затем, при атмосферном давлении и до любого гидролиза и последующего ферментативного действия, в отделении:

с одной стороны, твердой фазы, состоящей в основном из указанной целлюлозы, способной к дальнейшему гидролизу и ферментации для производства биоэтанола;

и с другой стороны, жидкой фазы, находящейся в основном в растворе воды, муравьиной кислоты, лигнинов и гемицеллюлоз;

b) ферментативный гидролиз указанной твердой фазы;

с) спиртовую ферментацию продуктов, полученных в указанной стадии гидролиза, способных к ферментации с получением биоэтанола.

Этот способ, в частности, описан в деталях в документе EP-2235254 (WO-A1-2009/092749), на содержание которого можно ссылаться, и который введен здесь в виде ссылки.

Этот способ предлагает подход, радикально отличный от известного до этого в данной области проведением разделения трех биополимеров путем сольволиза в среде кислота/вода, который предоставляет возможность отделить линейные нерекомбинированные низкомолекулярные лигнины с высокой добавочной ценностью до проведения любого способа гидролиза и затем ферментацию целлюлозы и гемицеллюлоз.

Этот способ позволяет достичь высоких уровней производительности, независимо от природы используемых растений; он поэтому особенно удачен для однолетних растений, открывая путь к новой экономической выгоде, особенно в случае соломы из зерновых и жмыха сахарного тростника или жмыха сахарного сорго, и указанная экономическая выгода добавляется к той, которая уже предложена заявителем в международной заявке WO-A1-00/68494, относящейся к способу производства бумажной пульпы, лигнинов, сахаров и уксусной кислоты фракционированием лигнин-целлюлозного растительного материала в среде муравьиная кислота/уксусная кислота.

Эти изобретения (CIMV способы) имеют целью улучшение индустриальных условий производства этанола или биоэтанола из LVRM и особенно гидролиз целлюлозы с получением ферментируемых сахаров.

Обычно в известном способе способы производства биоэтанола из LVRM принимают во внимание несколько параметров.

Среди этих параметров особенно идентифицируется тот факт, что лигнин может ингибировать фермент и что лигнин-целлюлозная матрица должна пройти предобработку для того, чтобы сделать целлюлозу и гемицеллюлозы гидролизуемыми.

Из-за их химического строения лигниновые полимеры нерастворимы и высокореактивны.

Как результат, присутствие лигнинов способствует упрочнению сетки целлюлоза-гемицеллюлозы, что затрудняет проникновение и действие ферментов, что требует присутствия воды.

Ферментативный гидролиз целлюлозы является рекомендованным подходом к получению ферментируемых сахаров по различным причинам, особенно по экономическим оценкам ферментативного гидролиза, сравнительно с химическим гидролизом.

Кроме того, в результате ферментативного гидролиза получаются новые экссудаты для обработки, и не возникает проблем коррозии.

На практике ферментативный гидролиз осуществляют внесением обрабатываемого растительного сырья в ферментный раствор, удостоверяясь, что суспензия гомогенна и что достигнуты оптимальные оговоренные условия, например для T. reesei целлюлаз температура между 45°С и 50°С и рН около 4,8.

Время действия фермента зависит от количества используемых ферментов и от специфической активности ферментов. Во время ферментативного гидролиза в основном высвобождаются редуцирующие сахара в форме глюкозы.

Ферменты, вызывающие деградацию целлюлозы, обычно называемые целлюлазами, различны по типам и источникам, и характеризуются, в основном, их активностью.

Стоимость целлюлаз относительно велика и часто оценивается как наиболее дорогостоящий фактор в производстве биоэтанола из LVRM.

В результате, значимые усилия направлены на определение механизма ферментативного гидролиза с целью его улучшения, это комплексный способ действия растворимых белков на нерастворимый и «устойчивый» субстрат.

Другим параметром, воздействующим на эффективность и стоимость способа ферментативного гидролиза, является время гидролиза, которое относительно длительно, от 48 до 72 часов.

Как только целлюлоза гидролизовалась до глюкозы ферментативным гидролизом, глюкозу ферментируют тем же образом, как, например, глюкозу, полученную из крахмала.

Остаются известные проблемы, специфические при использовании LVRM в качестве исходного субстрата, такие как возможное присутствие токсичных соединений и ингибиторов, образующихся из гемицеллюлоз и лигнина, а также возможность проведения ферментативного гидролиза и ферментации в одну стадию.

Ингибиторы, присутствующие в гидролизатах, образуются при деградации сахаров (до фурфурола), групп, присутствующих в гемицеллюлозах, и лигнина.

Присутствие ингибиторов зависит от природы LVRM и условий его предобработки.

В добавление к ингибированию ферментов фурфуролом были отмечены комбинированные эффекты различных ингибиторов.

Что касается одновременного способа ферментации и гидролиза, в соответствии с «ООФ» (Одновременное Осахаривание и Ферментация), который заключается в проведении ферментативного гидролиза и этанольной ферментации в одну стадию, основными достижениями его являются снижение инвестиций за счет исключения операций, необходимых при ферментативном гидролизе, проведенном заранее, и отсутствие ингибирования целлюлазы глюкозой, которая поглощается ферментными микроорганизмами, как только возникает.

Это приводит к повышению уровней и скоростей гидролиза и к общей производительности получения этанола или биоэтанола.

Более того, снижаются риски микробиологического загрязнения насыщенного глюкозой гидролизата.

Тем не менее, стало ясно, что выгоды от ООФ способа, особенно с экономической точки зрения, требуют оптимизации некоторых аспектов, в частности концентрации исходного сухого сырья, с тем, чтобы достичь высокой концентрации этанола.

С тем, чтобы преодолеть эти помехи, изобретение предлагает улучшение способа производства биоэтанола или этанола, включающее предобработку лигнин-целлюлозного растительного сырья, направленную на отделение целлюлозы, и ферментативный гидролиз целлюлозы, характеризующийся, прежде всего, частичным удалением лигнинов до стадии ферментативного гидролиза, с тем, чтобы достичь установленного ненулевого остаточного общего уровня Т (выраженного в весовых %) лигнинов, который заключен между двумя крайними значениями, т.е. уровня, находящегося в определенном интервале. При определении уровня Т лигнинов не принимали во внимание осажденные лигнины, а только оставшиеся (неотделенные) лигнины.

Было обнаружено, что не требуется полного удаления лигнинов для достижения наилучшего возможного выхода, т.е. уровня Т ферментативного гидролиза, равного 100%.

Более специфично, способ характеризуется тем, что он включает до стадии ферментативного гидролиза стадию частичного удаления лигнинов, с тем, чтобы достичь остаточного полного содержания лигнинов (Т), выраженного в весовых процентах, который не равен нулю и который заключен в интервале, определенном нижним (Лнижн) и верхним (Лверх) пределами, равными до 0,30% и 4%, соответственно.

Предпочтительно, остаточный полный уровень лигнинов (Т) заключен в интервале, определенном нижним (Лнижн) и верхним (Лверх) пределами, равными до 0,35% и 3,5%, соответственно.

Более предпочтительно, остаточный полный уровень лигнинов (Т) равен приблизительно 1,65%.

Такую обработку целлюлозы с удалением лигнинов с тем, чтобы достичь содержания лигнинов, рекомендованного выше, проводят, например, введением стадии обработки гидроксидом натрия с последующей стадией промывки, с целью удаления оставшегося гидроксида натрия перед стадией ферментативного гидролиза.

Согласно другой характеристике способа в соответствии с изобретением, для достижения условий подкисления до ферментативного гидролиза, в частности, до приблизительно рН 5, проводят «повторное подкисление» смеси кислотой с определенной рК_а, особенно слабыми органическими кислотами, такими как уксусная и/или муравьиная кислота, и/или другой слабой кислотой, такой как лимонная кислота.

В соответствии с одной характеристикой способа стадию «повторного подкисления» смеси проводят уксусной кислотой и/или муравьиной кислотой и/или лимонной кислотой.

В соответствии с одной характеристикой способа стадию «повторного подкисления» смеси проводят смесью уксусной кислоты и муравьиной кислоты, которая содержит 0,2% весовых муравьиной кислоты и 0,4% весовых уксусной кислоты по отношению к сухому целлюлозному материалу.

После указанной стадии повторного подкисления рН смеси составляет предпочтительно между 4 и 6, предпочтительно между 4,5 и 5,5.

Более предпочтительно рН смеси после указанной стадии повторного подкисления равно 5.

В соответствии с одной характеристикой способа стадию частичного удаления лигнинов проводят при температуре между 80°С и 85°С.

В соответствии с одной характеристикой способа стадию частичного удаления лигнинов проводят при атмосферном давлении.

Был продемонстрирован неожиданный факт, что использование таких кислот позволяет достичь максимальной степени гидролиза, в отличие от, например, применения сильной кислоты, такой как серная кислота.

Далее, в контексте с CIMV способами, упомянутыми выше, промышленное использование уксусной кислоты и/или муравьиной кислоты особенно успешно, поскольку эти кислоты уже применяются и присутствуют в промышленном цикле получения целлюлозы из LVRM.

Среди других достижений изобретения было продемонстрировано, что общая эффективность способа производства этанола или биоэтанола близка, или практически равна, выходу теоретически максимальной степени этанола из LVRM, и что, в добавок, эта эффективность одинакова, вне зависимости от того, применяется ли сначала стадия ферментативного гидролиза в соответствии с изобретением или проводится одновременный гидролиз и способ ферментации (ООФ способ).

Такая одинаковая эффективность обусловлена тем, что ферментативный гидролиз в соответствии с изобретением не приводит к получению ингибиторов ферментации.

Кроме того, было продемонстрировано, что успехи способа, соответствующего изобретению (общий уровень лигнинов и особенно условия повторного подкисления), неизменны, т.е. они имеют тоже природу и значения, независимо от используемых целлюлаз, в частности, являются ли они целлюлазами с более высокой или более низкой эффективностью.

Примеры тестовых результатов:

Примеры тестируемых ферментов и их активность.

  Активность ферментного раствора в ед/мл     целлюлаза   КСИЛАНАЗА Бета-глюкозидаза Эндо Экзо Cellic Ctec 42 3827 11+/-5 281+/-40 Accelle-rase 1500 7 392 12+/-6 66+/-9 AB (EL 2009060L) 8 32 1+/-0,5 13+/-2 AB (EL 2009096L) 0 77 2+/-1 25+/-3

Используемый в тестах фермент: Cellic Ctec и Cellic Ctec 2 («новое поколение» фермента с активностью, на 40% выше, чем в 1-ом поколении).

Условия гидролиза: температура 50°С, рН между 4,5 и 5, концентрация фермента, равная 42 ед/г.

Влияние щелочной экстракции на степень гидролиза целлюлозы: смотри фиг.1, на которой:

Сырая пульпа: пульпа, обозначаемая как «CIMV» после экстракции, освобождения от лигнинов и промывки;

Пульпа после щелочной экстракции: сырая пульпа, обработанная при рН 12 и 85°С в течение 1 часа.

Влияние уровня остаточного лигнина на гидролиз целлюлозной пульпы: смотри фиг.2.

Влияние рК_а кислоты, используемой для подкисления («повторного подкисления») при рН 5 на гидролиз целлюлозной пульпы:

  Уксусная кислота Уксусная + муравьиная кислота Муравьиная кислота Серная кислота % гидролиза
после 24 ч 95 80 78 45

Способ производства биоэтанола из лигнин-целлюлозного растительного сырья включает предобработку указанного сырья, ферментативный гидролиз и спиртовую ферментацию продуктов, полученных после гидролиза, способных к ферментации с получением биоэтанола. Предобработка включает деструкцию сырья путем выдерживания его в присутствии смеси, содержащей муравьиную кислоту и воду, при 95°С-110°С, выдерживание при атмосферном давлении для последующего разделения на твердую фазу, содержащую целлюлозу, и на жидкую фазу, содержащую в основном раствор, состоящий из воды, муравьиной кислоты, лигнинов и гемицеллюлоз. До ферментативного гидролиза осуществляют частичное удаление лигнинов обработкой NaOH с последующим промыванием для удаления остаточного NaOH, для достижения остаточного общего содержания лигнинов (Т), отличного от нуля и заключенного в интервале, определяемом нижним (Лнижн) и верхним (Лверх) пределами, равными 0,30 вес.% и 4 вес.%, соответственно. Перед ферментативным гидролизом осуществляют повторное подкисление смеси уксусной кислотой и/или муравьиной кислотой и/или лимонной кислотой, причем после повторного подкисления рН смеси составляет 4-6. Изобретение обеспечивает максимальную степень гидролиза. 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.

1. Способ производства биоэтанола из лигнин-целлюлозного растительного сырья, включающий последовательные стадии:
a) предобработку лигнин-целлюлозного растительного сырья для разделения целлюлозы, гемицеллюлоз и лигнинов, содержащихся в этом лигнин-целлюлозном растительном сырье, включающую следующие последовательные стадии, состоящие из:
(i) деструкции лигнин-целлюлозного растительного сырья путем выдерживания его в присутствии смеси, содержащей муравьиную кислоту и воду, при температуре реакции между 95°С и 110°С;
(ii) затем выдерживания при атмосферном давлении до стадий гидролиза и последующей ферментации, для разделения:
с одной стороны, на твердую фазу, в основном состоящую из указанной целлюлозы, способной к последующему гидролизу и ферментации для получения биоэтанола;
с другой стороны, на жидкую фазу, содержащую в основном раствор, состоящий из воды, муравьиной кислоты, лигнинов и гемицеллюлоз;
b) частичное удаление лигнинов обработкой гидроксидом натрия с последующей стадией промывания для удаления остаточного гидроксида натрия;
c) ферментативный гидролиз указанной твердой фазы;
d) спиртовую ферментацию продуктов, получающихся на указанной стадии гидролиза, которые способны к ферментации с получением биоэтанола,
отличающийся тем, что стадия b) частичного удаления лигнинов позволяет достичь остаточного общего содержания лигнинов (Т), выраженного в весовых процентах, который отличается от нуля и который заключен в интервале, определяемом нижним (Лнижн) и верхним (Лверх) пределами, равными 0,30% и 4%, соответственно, при этом
перед стадией ферментативного гидролиза для достижения условий подкисления способ включает стадию повторного подкисления смеси, которую проводят уксусной кислотой и/или муравьиной кислотой и/или лимонной кислотой, причем после указанной стадии повторного подкисления рН смеси находится в интервале между 4 и 6.

2. Способ по п.1, характеризующийся общим остаточным содержанием лигнинов (Т), заключенным в интервале, определяемом нижним (Лнижн) и верхним (Лверх) пределами, равными 0,35% и 3,5%, соответственно.

3. Способ по п.2, характеризующийся общим остаточным содержанием лигнинов (Т), равным приблизительно 1,65%.

4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанную стадию повторного подкисления смеси проводят смесью уксусной кислоты и муравьиной кислоты, которая содержит 0,2 весовых % муравьиной кислоты и 0,4 весовых % уксусной кислоты.

5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что после указанной стадии повторного подкисления рН смеси находится в интервале между 4,5 и 5,5.

6. Способ по п.5, характеризующийся тем, что после указанной стадии повторного подкисления рН смеси равно 5.

7. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанную стадию частичного удаления лигнинов проводят при температуре между 80°С и 85°С.

8. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанную стадию частичного удаления лигнинов проводят при атмосферном давлении.