СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ТЕСТА НА РАСТВОРЕНИЕ ТВЕРДЫХ КОМПОЗИЦИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ Российский патент 2016 года по МПК A61K38/46 G01N33/15 

Область изобретения

[001] Настоящее изобретение относится к способу измерения количества пищеварительных ферментов, которые высвобождаются из твердой композиции в среде растворения, с помощью флуоресцентной спектроскопии. Настоящее изобретение также относится к комбинированному способу измерения как растворения, так и резистентности к действию желудочного сока твердой композиции, содержащей панкрелипазу.

Предпосылки изобретения

[002] Твердая фармацевтическая композиция или лекарственная форма, такая как таблетка или капсула, обычно состоит из смеси активного ингредиента(ов) и наполнителя(ей). Воспроизводимость адсорбции активного ингредиента (лекарственного средства) из формы твердой композиции после перорального введения зависит от нескольких факторов, таких как высвобождение лекарственного средства из композиции и растворение или солюбилизация лекарственного средства в физиологических условиях. Ввиду критического характера высвобождения лекарственного средства из композиции и растворения или солюбилизации лекарственного средства, тест на растворение является весьма значимым для прогнозирования in-vivo эффективности лекарственного средства. Органы, утверждающие лекарственные средства, такие как FDA и ЕМА, часто требуют от фармацевтических компаний определения характеристик высвобождения лекарственного средства для любой новой фармацевтической композиции в целях получения утверждения. Данные тесты также могут являться необходимыми в качестве параметра качества USP для оценки качества фармацевтической композиции от партии к партии, для одобрения препаратов, отмены требований биоэквивалентности или подтверждения запросов в отношении отличных от рекомендуемых требований биоэквивалентности.

[003] Разработаны различные протоколы для проведения in-vitro тестов на растворение, и они регулярно применяются как для разработки препарата, так и для контроля качества. Тест на растворение лекарственного средства в основном проводят с использованием способов и устройств рекомендуемых справочников, таких как фармакопея США и Европейская фармакопея, например, USP 34 <711> и EP 7.2, 2.9.3. Обычно применяемыми в таких тестах средами растворения являются, например, вода и буферы, такие как фосфатные буферы или цитратные буферы. Различные типы приборов для растворения, основанные на разных способах перемешивания, доступны коммерчески и признаны в способах справочников. Данные приборы включают в себя: лопастную мешалку, корзинку, проточную ячейку и поршневой цилиндр. В то время как точные процедуры (протоколы) и приборы различаются, все способы теста на растворение лекарственного средства включают помещение фармацевтической композиции или лекарственной формы в среду растворения и применение определенного перемешивания среды растворения, чтобы активизировать распад и растворение испытываемого лекарственного средства.

[004] Среда растворения и способ обнаружения для определения количества высвобожденного лекарственного средства в среде растворения зависит от (выбирается в зависимости от) химической природы лекарственного средства, при этом физические факторы и факторы стабильности также имеют большое значение в принятии соответствующих вариантов выбора.

[005] Тест капсулы с отсроченным высвобождением панкрелипазы, включенный в монографию USP по определению высвобождения пищеварительных ферментов из фармацевтических лекарственных форм для перорального применения, таких как капсулы с отсроченным высвобождением панкрелипазы, основан на специфическом измерении активности липазы. Такой способ требует длительного времени анализа и характеризуется несколькими недостатками. Основным недостатком является нестабильность маркера-липазы в среде растворения, а точнее в буферной (pH 6,0) среде растворения энтеросолюбильного этапа; необходимо установить степень разрушения липазы, а затем в расчет растворения ввести поправочный коэффициент для учета потери липазной активности во время теста. Кроме того, сложность способа (как в подготовке реагентов/субстратов, так и определении аналитическим путем) значительно увеличивает изменчивость результатов и ухудшает воспроизводимость внутрилабораторных/межлабораторных результатов. Кроме того, анализ липазы обладает узким диапазоном линейности (8-16 единиц USP/мл): это представляет собой существенное ограничение, так как анализ охватывает только концентрацию в капсуле в диапазоне от 6400 до 12800 USP UI/капсула, и, следовательно, осуществить подход тестирования отдельной единицы не является возможным. Длительное время анализа в данном способе ограничивает возможность его применения для определения многоточечного профиля растворения.

[006] Не существует способа/процедуры, описывающих, как преодолеть данные недостатки для определения высвобождения пищеварительных ферментов из твердой композиции.

[007] Пищеварительные ферменты, такие как панкрелипаза и другие продуты панкреатических ферментов (PEP), можно вводить пациентам, страдающим от экзокринной недостаточности поджелудочной железы (EPI); при этом введение добавок из пищеварительных ферментов позволяет пациентам более эффективно переваривать пищу.

[008] Экзокринная недостаточность поджелудочной железы (EPI), от которой по оценкам FDA страдают более 200000 американцев, включает физиологическое расстройство, при котором индивиды не способны должным образом переваривать пищу в связи с недостатком пищеварительных ферментов, производимых их поджелудочной железой. Такая потеря пищеварительных ферментов приводит к таким расстройствам, как нарушенное пищеварение и нарушение всасывания питательных веществ, что приводят к недостаточности питания и другим вытекающим нежелательным физиологическим состояниям, связанным с этим. Данные расстройства являются общими для людей, страдающих от муковисцидоза (CF) и других состояний, нарушающих экзокринную функцию поджелудочной железы, таких как рак поджелудочной железы, панкреатэктомия и панкреатит. Недостаточность питания может представлять опасность для жизни при отсутствии лечения, особенно в случае младенцев и пациентов с CF, и данное расстройство может приводить к нарушению роста, ослаблению иммунного ответа и сокращению продолжительности жизни.

[009] Пищеварительные ферменты, такие как панкрелипаза и другие препараты ферментов поджелудочной железы (PEP), можно вводить для по меньшей мере частичного излечения EPI. Вводимые пищеварительные ферменты обеспечивают пациентов возможностью более эффективного переваривания пищи.

[0010] Ферменты поджелудочной железы, которые применялись при лечении EPI для восполнения утраченной пищеварительной функции, находятся в применении уже более 60 лет. Их использование до недавнего времени не подчинялось современным нормативным рекомендациям, регулирующим утверждение лекарственных средств, основанное на безопасности, эффективности и управлении производством. В последнее время заместительные терапии препаратами ферментов поджелудочной железы стали предметом инициатив регулирующих органов США и Европейских регулирующих органов, которые требуют, чтобы продаваемые препараты ферментов поджелудочной железы, дабы оставаться в торговом обороте, подвергались действующему процессу утверждения лекарственных средств. Zenpep®, Creon® и Pancreaze® являются тремя препаратами, которые успешно прошли процесс, установленный FDA, и одобрены для продажи в Соединенных Штатах. На других территориях/странах, где подобные инициативы продвигаются до сих пор или еще не реализованы, остается доступным разнообразие препаратов ферментов поджелудочной железы.

[0011] Для перорального введения были разработаны капсулы, содержащие пищеварительные ферменты, такие как панкрелипаза. Однако если пациент не может глотать капсулы, каждую капсулу можно открыть и нанести содержимое на небольшое количество пищи, как правило, мягкой, кислой пищи (такой как имеющееся в продаже яблочное пюре), и ввести перорально пациенту с помощью ложки. Альтернативно, такие лекарственные препараты можно вводить перорально младенцам и детям, применяя шприцевое устройство, содержащее содержимое, суспендированное в среде, поддающейся введению таким образом.

[0012] Препараты панкрелипазы обычно обозначены как содержащие три класса ферментов, липазу, амилазу и протеазу, уровни или активность которых перечислены. Данные ферменты катализируют гидролиз жиров до глицерина и жирных кислот, крахмала до декстрина и сахаров, а белков до аминокислот и производных веществ. Пищеварение, однако, является сложным процессом, включающим многие другие ферменты и субстраты, которые способствуют правильному функционированию пищеварения и получению полного набора продуктов переваривания. Другие ферменты, содержащиеся в панкрелипазе, включают среди прочего трипсин, карбоксипептидазы, эластазы, фосфолипазы и холестеразы, а также различные кофакторы и коферменты. Данные вещества естественным путем вырабатываются в поджелудочной железе и также способствуют правильному функционированию пищеварения.

[0013] Панкрелипазу обычно получают из поджелудочных желез свиней, хотя также могут использоваться другие источники, например, описанные в патентных документах США 6051220, 2004/0057944, 2001/0046493 и WO 2006044529, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте во всех отношениях.

[0014] Ферменты поджелудочной железы демонстрируют оптимальную активность в близких к нейтральным и слегка щелочным условиях. В условиях желудка ферменты поджелудочной железы могут инактивироваться с потерей в результате биологической активности. Следовательно, экзогенно вводимые ферменты, как правило, защищены от инактивации в желудке и остаются неизмененными во время их прохождения через желудок и в двенадцатиперстную кишку. Поэтому, желательно покрывать ферменты поджелудочной железы оболочкой. Панкреатические липазы наиболее чувствительны к инактивации в желудке и являются ключевыми ферментами в лечении нарушения всасывания. Липазная активность обычно контролируется для определения стабильности ферментной композиции, содержащей липазу. Полное содержание патентного документа США 7658918, выданного Ortenzi и соавт., явным образом включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте во всех отношениях и описывает стабильные композиции пищеварительных ферментов, а также объясняет, что определенные лекарственные препараты в виде частиц, вводимые перорально, предназначены для прохождения через желудок пациента и последующего высвобождения в кишечнике. Введение надлежащей дозы таких лекарственных препаратов в виде частиц пациентам, особенно младенцам и детям, должно осуществляться максимально точно.

[0015] К сожалению, не описан ни один способ измерения количества пищеварительных ферментов, высвобождаемых из твердой фармацевтической композиции или лекарственной формы, обладающий хорошей точностью и хорошей чувствительностью, и который готов к внедрению в разных лабораториях.

Краткое описание

[0016] Настоящее изобретение относится к способу измерения количества пищеварительных ферментов, высвобождаемых из твердой композиции в среде растворения, с помощью флуоресцентной спектроскопии. Настоящее изобретение также относится к комбинированному способу измерения как растворения, так и резистентности к действию желудочного сока твердых композиций, содержащих панкрелипазу.

Краткое описание фигур

[0017] Фигура 1. Профиль растворения гранул панкрелипазы (минитаблетки Zenpep®) - анализ протеаз (кривая, проведенная через точки средних значений).

[0018] Фигура 2. Профиль растворения гранул панкрелипазы (минитаблетки Zenpep®) - анализ липаз (кривая, проведенная через точки средних значений).

[0019] Фигура 3. Профиль растворения гранул панкрелипазы (минитаблетки Zenpep®) - анализ общего белка с помощью флуоресцентной спектроскопии (кривая, проведенная через точки средних значений).

[0020] Фигура 4a. Профили растворения гранул панкрелипазы (минитаблетки Zenpep®): фермент-специфичные измерения по сравнению с флуорометрическим определением содержания общего белка.

[0021] Фигура 4b. Профили растворения гранул панкрелипазы (минитаблетки Zenpep): анализ липаз по сравнению с флуорометрическим определением содержания общего белка.

[0022] Фигура 4c. Профили растворения гранул панкрелипазы (минитаблетки Zenpep®): анализ протеаз по сравнению с флуорометрическим определением содержания общего белка.

[0023] Фигура 5. Профиль растворения композиций панкрелипазы (Zenpep® и Creon®).

Подробное описание

[0024] Настоящее изобретение относится к способу измерения количества пищеварительных ферментов, высвобождаемых из твердой композиции в среде растворения, с помощью флуоресцентной спектроскопии. Количество измеряется как % пищеварительных ферментов, высвобождаемых из твердой композиции, или лекарственной формы, или единичной лекарственной формы.

[0025] В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению твердая композиция является составом, содержащим панкрелипазу, более конкретно она является композицией панкрелипазы с энтеросолюбильным покрытием, включающей фармацевтически неактивные наполнители.

[0026] В другом варианте осуществления способ включает этапы: (a) обеспечения высвобождения пищеварительных ферментов из твердой композиции панкрелипазы в среде растворения, (b) снятия показания флюоресценции для измерения в среде количества пищеварительных ферментов.

[0027] В другом варианте осуществления настоящего изобретения средой растворения является вода, раствор HCl, воспроизводимый желудочный сок, буферный раствор, воспроизводимый кишечный сок или водный или буферный раствор, содержащий по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество.

[0028] В другом варианте осуществления среда растворения состоит по меньшей мере из двух сред, которые применяются последовательно. С помощью настоящего способа также можно осуществлять двухэтапный тест на растворение. Первый этап является кислотным этапом, и среда растворения представляет собой водную среду, обладающую кислым pH, таким как pH в диапазоне от примерно 1 до примерно 4,5, или от примерно 1 до примерно 2, или примерно 1,2. Второй этап осуществляют во второй среде растворения, которая представляет собой водный буферный раствор, обладающий pH выше 5, или от примерно 5,5 до примерно 6,8, или примерно 6.

[0029] В способе согласно настоящему изобретению методика, применяемая для обнаружения пищеварительных ферментов, высвобождаемых из композиции в среде растворения, является флуоресцентной спектроскопией.

[0030] Молекулы обладают различными состояниями, называемыми энергетическими уровнями. Флуоресцентная спектроскопия в первую очередь связана с электронным и колебательным состояниями. Как правило, рассматриваемые образцы обладают основным электронным состоянием и возбужденным электронным состоянием более высокой энергии. В пределах каждого из данных электронных состояний существуют различные колебательные состояния. При флуоресцентной спектроскопии образец сначала возбуждается, поглощая фотон, от его основного электронного состояния до одного из различных колебательных состояний в возбужденном электронном состоянии. Затем молекула снова опускается до одного из различных колебательных уровней основного электронного состояния, испуская в данном процессе фотон. Так как молекулы могут опускаться на любой из нескольких колебательных уровней в основном состоянии, испускаемые фотоны будут обладать различными энергиями и, соответственно, частотами. Флуоресцентный ответ белка обусловлен присутствием аминокислот, содержащих ароматический фрагмент (триптофан, тирозин или фенилаланин). Флуоресцентный ответ белка обычно получают с помощью длины волны возбуждения 280 нм. Большинство испусканий флуоресценции в белках обусловлены возбуждением остатков триптофана, с небольшим участием тирозина и фенилаланина.

[0031] Флуорометрический способ, раскрытый в данном документе, основан на измерении содержания общего белка пищеварительных ферментов (панкрелипаза, API), высвобождаемых в среде растворения из композиции или лекарственной формы, содержащей указанные ферменты. Фраза "общий белок", применяемая в данном документе, указывает на все белки, которые высвобождаются готовой лекарственной формой, то есть все белки, присутствующие в исходной твердой композиции, такие как липазы, протеазы и амилазы. Для получения точного значения высвобожденного API, стандарт, предпочтительно применяемый в данном способе, получают с помощью той же партии тестируемой готовой лекарственной формы, но измельчая и высыпая ее в ту же среду растворения с получением 100% растворенного API. Растворение тестируемой навески измеряется как процент фракции по отношению к стандартному препарату.

[0032] Способ по настоящему изобретению можно применять к твердым композициям панкрелипазы, которые могут содержать фармацевтически неактивные наполнители, таким как любая подходящая лекарственная форма для перорального применения, которая содержит пищеварительные ферменты. Неограничивающие примеры подходящих лекарственных форм включают таблетки, капсулы, саше или единичные лекарственные формы. В конкретном варианте осуществления лекарственная форма является капсулой. Каждая лекарственная форма содержит гранулы пищеварительных ферментов (также называемые единицами) из API (лекарственное средство). В отношении настоящего изобретения гранулы пищеварительных ферментов являются частицами любого вида. Термин "гранула" включает гранулу, частицу, таблетку, сферу, минитаблетку, микротаблетку, микрочастицу, микросферу, минимикросферу, микрокапсулу и микропеллету. Гранула может иметь любой подходящий размер частицы или форму; в частности, обладать размером в диапазоне от примерно 50 до примерно 5000 мкм, более конкретно, она может обладать номинальным (например, средним) диаметром частиц в диапазоне от примерно 2 до примерно 5 мм, или менее примерно 2 мм, например, примерно 1-2 мм. "Минимикросферы", обладающие наименьшим медианным размером в 1,15 мм, или "микротаблетки", обладающие наибольшим медианным размером в 2,63 мм, также пригодны для настоящего способа. Гранулы могут обладать средним размером меньше 800 мкм, предпочтительно меньше 500 мкм, предпочтительно от примерно 400 мкм до примерно 600 мкм или от примерно 250 мкм до примерно 500 мкм. Данные гранулы могут обладать объемным диаметром (d(v,0,1) (определяется как диаметр, где 10% объемного распределения находится ниже данного значения, а 90% находится выше данного значения) не меньше 400 мкм и объемным диаметром d(v,0,9) (определяется как диаметр, где 90% объемного распределения находится ниже данного значения, а 10% находится выше данного значения) не больше 900 мкм.

[0033] Все гранулы пищеварительных ферментов, более конкретно, гранулы ферментов панкрелипазы, пригодные для получения фармацевтических препаратов, могут быть покрыты энтеросолюбильным слоем. В вариантах осуществления, где панкрелипазные сердцевины окружены энтеросолюбильным покрытием, покрытие действует в качестве барьера, защищая лекарственное средство от кислой среды желудка, и в значительной степени препятствует высвобождению лекарственного препарата до достижения им тонкой кишки. Подходящие комбинации композиций энтеросолюбильных покрытий с другими композициями покрытий могут применяться для получения требуемого типа контроля над высвобождением лекарственного средства или терапевтическими эффектами. Энтеросолюбильное покрытие включает по меньшей мере один энтеросолюбильный полимер и дополнительные наполнители. Фраза "энтеросолюбильный полимер" означает полимер, который защищает пищеварительные ферменты от желудочного содержимого, например полимер, который является стабильным при кислом pH, но может быстро распадаться при более высоком pH, или полимер, скорость гидратации или эрозии которого достаточно медленная, чтобы гарантировать, что контакт желудочного содержимого с пищеварительными ферментами является относительно небольшим, пока он находится в желудке, в отличие от остальной части желудочно-кишечного тракта. Неограничивающими примерами полимеров, резистентных к действию желудочного сока, являются целлюлозы ацетатфталат, гидроксипропилметилцеллюлозы фталат, гидроксипропилметилцеллюлозы ацетата сукцинат, поливинилацетата фталат, сополимеры метакриловой кислоты, сложные эфиры метилметакрилата и шеллак. Данные полимеры имеются в продаже под различными торговыми названиями, например, Cellacefate® (целлюлозы ацетатфталат), Eudragit® L100, S100, L30D, FS30D, L100-55 (сополимеры метакриловой кислоты), Aquateric® (целлюлозы ацетатфталат), Aqoat® (гидроксипропилметилцеллюлозы ацетата сукцинат), НР55® (гидроксипропилметилцеллюлозы фталат). Предпочтительно энтеросолюбильное покрытие включает: 10-20 вес.% по меньшей мере одного энтеросолюбильного полимера; где каждый упомянутый вес.% основан на общем весе частиц с покрытием. Покрытие может дополнительно включать липофильное средство, такое как С6-С30 липофильные молекулы с низким молекулярным весом, которые выбирают из алифатических карбоновых кислот и спиртов, предпочтительно С14-С18 карбоновых кислот или спиртов, таких как стеариновая кислота, миристиновая кислота, миристиновый спирт или стеариловый спирт.Другими необязательными ингредиентами покрытия являются пластификаторы, антиадгезионные средства (такие как тальк, стеарат магния, коллоидный диоксид кремния и их комбинации; дополнительно, необязательно этилцеллюлоза с низкой вязкостью). Неограничивающие примеры подходящих пластификаторов включают триацетин, трибутилцитрат, триэтилцитрат, ацетилтри-н-бутилцитрат, диэтилфталат, дибутилсебацинат, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, касторовое масло, ацетилированные моно- и диглицериды, цетиловый спирт, миристиловый спирт и их смеси. Предпочтительным пластификатором является нефталатный пластификатор или его смеси.

[0034] Покрытые стабилизированные частицы пищеварительных ферментов затем можно составлять в капсулы. Особой лекарственной формой стабилизированных частиц пищеварительных ферментов является капсула, заполненная гранулами панкрелипазных ферментов с энтеросолюбильным покрытием. Капсулы, содержащие панкрелипазные ферменты с энтеросолюбильным покрытием, включающим гидроксипропилметилцеллюлозу с содержанием воды примерно 6 вес.% или меньше, являются конкретным вариантом осуществления лекарственной формы; более конкретно, с содержанием воды примерно 4 вес.% или меньше; еще более конкретно с содержанием воды примерно 2 вес.% или меньше.

[0035] Термин "пищеварительный фермент", применяемый в данном документе, обозначает фермент в пищеварительном тракте, который расщепляет компоненты пищи так, что они могут потребляться или поглощаться организмом. Неограничивающие примеры пищеварительных ферментов включают панкрелипазу (также упоминаемую как панкреатин), липазу, колипазу, трипсин, химотрипсин, химотрипсин В, панкреатопептидазу, карбоксипептидазу А, карбоксипептидазу В, гидролазу сложных эфиров глицерина, фосфолипазу, гидролазу сложных эфиров стерина, эластазу, кининогеназу, рибонуклеазу, дезоксирибонуклеазу, α-амилазу, папаин, химопапаин, глютеназу, бромелаин, фицин, β-амилазу, целлюлазу, β-галактозидазу, изомальтазу и их смеси. Их получают путем экстракции из поджелудочной железы или сока поджелудочной железы, или производят искусственно, или получают из источников помимо поджелудочной железы, таких как микроорганизмы, бактерии, плесени, грибы, растения или ткани других животных, генетически модифицированные микроорганизмы, грибы или растения.

[0036] Термины "панкрелипаза", или "панкрелипазные ферменты", или "панкреатин" означают смесь нескольких типов ферментов, включая амилазные, липазные и протеазные ферменты, или их смесь панкреатического происхождения. В продаже имеется панкрелипаза, например, от Nordmark Arzneimittel GmbH, Scientific Protein Laboratories LLC или Sigma Aldrich; а также могут применяться подобные экстракты, источниками которых являются свиньи, крупный рогатый скот или другие млекопитающие. Примеры коммерческих составов панкрелипазы включают Zenpep, Viokace, Ultrase, Creon, Pancreaze и Panzytrat; более конкретно, капсула Zenpep для перорального введения содержит гранулы с энтеросолюбильным покрытием (1,8-1,9 мм для 750, 3000, 5000 липазных единиц USP, 2,2-2,5 мм для 10000, 15000, 20000, 25000 и 40000 липазных единиц USP).

[0037] Термин "липаза" означает фермент, который катализирует гидролиз липидов до глицерина и простых жирных кислот.Примеры липаз, подходящих для настоящего изобретения, включают без ограничений липазу животных (например, липазу свиней), липазу бактерий (например, липазу из Pseudomonas и/или липазу из Burkholderia), липазу грибов, липазу растений, рекомбинантную липазу (например, полученную путем технологии рекомбинантной ДНК с помощью подходящей культивируемой клетки-хозяина, которую выбирают из любых клеток-хозяев из микроорганизмов, бактерий, дрожжей, грибов, растений, насекомых или млекопитающих, или рекомбинантные липазы, что включают аминокислотную последовательность, которая является гомологичной или практически идентичной встречающейся в природе последовательности, липазы, кодируемые нуклеиновой кислотой, которая является гомологичной или практически идентичной встречающейся в природе кодирующей липазу нуклеиновой кислоте, и т.д.), синтетическую липазу, химически модифицированную липазу и их смеси. Термин "липиды" в широком смысле включает встречающиеся в природе молекулы, в том числе жиры, воски, стерины, жирорастворимые витамины (такие как витамины A, D, Е и K), моноглицериды, диглицериды, триглицериды, фосфолипиды и т.д.

[0038] Термин "амилаза" относится к ферментам гликозидгидролазам, которые расщепляют крахмал, например, α-амилазы, β-амилазы, γ-амилазы, кислые α-глюкозидазы, амилазы слюны, такие как птиалин, и т.д. Амилазы, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают без ограничений амилазы животных, амилазы бактерий, амилазы грибов (к примеру амилазу из Aspergillus, например амилазу из Aspergillus oryzae), амилазы растений, рекомбинантные амилазы (например, получаемые путем технологии рекомбинантной ДНК с помощью подходящей культивируемой клетки-хозяина, которую выбирают из любых клеток-хозяев из микроорганизмов, бактерий, дрожжей, грибов, растений, насекомых или млекопитающих, или рекомбинантные амилазы, что включают аминокислотную последовательность, которая является гомологичной или практически идентичной встречающейся в природе последовательности, амилазы, кодируемые нуклеиновой кислотой, которая является гомологичной или практически идентичной встречающейся в природе кодирующей амилазу нуклеиновой кислоте, и т.д.), химически модифицированные амилазы и их смеси.

[0039] Термин "протеаза" относится, как правило, к ферментам (например, протеиназам, пептидазам или протеолитическим ферментам), которые разрушают пептидные связи между аминокислотами белков. Протеазы, как правило, идентифицируют по их каталитическому типу, например, пептидазы аспарагиновой кислоты, цистеиновые (тиол) пептидазы, металлопептидазы, сериновые пептидазы, треониновые пептидазы, щелочные или полущелочные протеазы, нейтральные пептидазы и пептидазы неизвестного каталитического механизма. Неограничивающие примеры протеаз, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают сериновые протеазы, треониновые протеазы, цистеиновые протеазы, протеазы аспарагиновой кислоты (например, плазмепсин), металлопротеазы и протеазы глутаминовой кислоты. В дополнение, протеазы, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают без ограничения протеазы животных, протеазы бактерий, протеазы грибов (например, протеаза из Aspergillus melleus), протеазы растений, рекомбинантные протеазы (например, получаемые путем технологии рекомбинантной ДНК с помощью подходящей культивируемой клетки-хозяина, которую выбирают из любых клеток-хозяев из бактерий, дрожжей, грибов, растений, насекомых или млекопитающих, или рекомбинантные протеазы, что включают аминокислотную последовательность, которая является гомологичной или практически идентичной встречающейся в природе последовательности, протеазы, кодируемые нуклеиновой кислотой, которая является гомологичной или практически идентичной встречающейся в природе кодирующей протеазу нуклеиновой кислоте, и т.д.), химически модифицированные протеазы и их смеси.

[0040] Панкрелипазные ферменты композиций или пероральных лекарственных форм, анализируемых в настоящем изобретении, могут включать одну или несколько липаз (т.е. одну липазу, или две, или больше липаз), или одну или несколько амилаз (т.е. одну амилазу, или две, или больше амилаз), или одну или несколько протеаз (т.е. одну протеазу, или две, или больше протеаз), а также смеси данных ферментов в различных комбинациях и соотношениях.

[0041] Активность липазы в композициях или лекарственных формах, подлежащих анализу с помощью способа по настоящему изобретению, может составлять от примерно 650 до примерно 45000 ME (способ USP), от примерно 675 до примерно 825 ME, от примерно 2700 до примерно 3300 ME, от примерно 4500 до примерно 5500 ME, от примерно 9000 до примерно 11000 ME, от примерно 13500 до примерно 16500 ME, от примерно 18000 до примерно 22000 ME, от примерно 22500 до примерно 27500 ME, от примерно 36000 до примерно 44000 ME, включая все диапазоны и поддиапазоны между ними. Активность липазы может составлять примерно 750, примерно 3000, примерно 4200, примерно 5000, примерно 6000, примерно 10000, примерно 10500, примерно 15000, примерно 16800, примерно 20000, примерно 21000, примерно 24000, или примерно 25000, или примерно 40000 ME (способ USP), или кратную им величину. Активность амилазы в композициях или лекарственных формах может составлять от примерно 1600 до примерно 6575 ME (способ USP), от примерно 6000 до примерно 225000 ME, например, от примерно 6400 до примерно 26300 ME, от примерно 10700 до примерно 43800 ME, от примерно 21500 до примерно 87500 ME, от примерно 32100 до примерно 131300 ME, от примерно 42900 до примерно 175000 ME, от примерно 53600 до примерно 218700 ME, включая все диапазоны и поддиапазоны между ними. Активность протеаз в композициях или лекарственных формах может составлять от примерно 1250 до примерно 3850 ME (способ USP), от примерно 5000 до примерно 130000 ME, например, от примерно 5000 до примерно 15400 ME, от примерно 8400 до примерно 25700 ME, от примерно 16800 до примерно 51300 ME, от примерно 25000 до примерно 77000 ME, от примерно 33500 до примерно 102600 ME, от примерно 41800 ME до примерно 128300 ME, включая все диапазоны и поддиапазоны между ними. Комбинированные ферментные композиции включают следующее: (А) активность липазы может находиться в диапазоне от примерно 675 до примерно 825 ME, активность амилазы от примерно 1600 до примерно 6575 ME, и активность протеазы от примерно 1250 до примерно 3850 ME (способ USP); (В) активность липазы может находиться в диапазоне от примерно 2700 до примерно 3300 ME, активность амилазы от примерно 6400 до примерно 26300 ME, и активность протеазы от примерно 5000 до примерно 15400 ME (способ USP); (С) активность липазы может находиться в диапазоне от примерно 4500 до примерно 5500 ME, активность амилазы от примерно 10700 до примерно 43800 ME, и активность протеазы от примерно 8400 до примерно 25700 ME (способ USP); (D) активность липазы может находиться в диапазоне от примерно 9000 до примерно 11000 ME, активность амилазы от примерно 21500 до примерно 87500 ME, и активность протеазы от примерно 16800 до примерно 51300 ME (способ USP); (Е) активность липазы от примерно 13500 до примерно 16500 ME, активность амилазы от примерно 32100 до примерно 131300 ME, и активность протеазы от примерно 25000 до примерно 77000 ME (USP); (F) активность липазы может находиться в диапазоне от примерно 18000 до примерно 22000 ME, активность амилазы от примерно 42900 до примерно 175000 ME, и активность протеазы от примерно 33500 до примерно 102600 ME (USP); и (G) активность липазы может находиться в диапазоне от примерно 22500 до примерно 27500 ME, активность амилазы от примерно 53600 до примерно 218700 ME, и активность протеазы от примерно 41800 ME до примерно 128300 ME (USP). Также активность липазы в композициях или лекарственных формах, подлежащих анализу с помощью способа по настоящему изобретению, может находиться в диапазоне от примерно 5000 липазных единиц PriEur до примерно 40000 липазных единиц PhEur, она может составлять примерно 5000, или примерно 10000, или примерно 15000, или примерно 20000, или примерно 30000, или примерно 40000 липазных единиц PhEur.

[0042] В другом варианте осуществления настоящего изобретения также отдельные единицы, содержащие фракцию с перечисленными выше значениями активности амилазы, также можно анализировать с помощью настоящей методики.

[0043] В другом варианте осуществления настоящего изобретения также отдельные единицы, содержащие фракцию с перечисленными выше значениями активности амилазы, также можно анализировать с помощью настоящего способа.

[0044] Отношение активностей амилазы/липазы в композициях или лекарственных формах может находиться в диапазоне от примерно 1 до примерно 10, например, от примерно 2,38 до примерно 8,75 (ферментативный анализ выполняется в соответствии с USP). Данное отношение может находиться в диапазоне от примерно 1 до примерно 8, например, от примерно 1,86 до примерно 5,13 (ферментативный анализ выполняется в соответствии с USP), или отношение может составлять примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 6, примерно 7, примерно 8, примерно 9 или примерно 10.

[0045] Неактивные ингредиенты препарата включают кроскармеллозу натрия, гидрогенизированное касторовое масло, коллоидный диоксид кремния, микрокристаллическую целлюлозу, стеарат магния, гипромеллозы фталат, тальк и триэтилцитрат. Каждая доза препаратов Aptalis Pharma предоставляет пациентам и врачам постоянное количество основных панкреатических ферментов, липазы, протеазы и амилазы, благодаря их высокоустойчивому составу. Можно открывать капсулы и разделять содержимое для индивидуальной корректировки дозы.

[0046] Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения способ включает этапы: (а) обеспечения высвобождения пищеварительных ферментов из твердой композиции панкрелипазы в среде растворения, (b) снятия показания флюоресценции для обнаружения ферментов и измерения количества пищеварительных ферментов в среде. Тест на растворение проводят с использованием оборудования для растворения, описанного в справочниках способов USP или EMA, или с использованием всего такого оборудования и протоколов, которые известны и применяются специалистами данной области. Среду растворения выбирают из различных растворов, подходящих для тестирования растворения общего белка, таких как вода, растворы HCl, воспроизводимый желудочный сок, буферные растворы, воспроизводимый кишечный сок, водные или буферные растворы, содержащие поверхностно-активные вещества. Буферные растворы могут являться, например, фосфатными буферами или цитратными буферами.

[0047] В конкретном варианте осуществления среда растворения состоит по меньшей мере из двух сред растворения, которые применяются последовательно (два этапа). Первая среда растворения является водной средой с кислым pH от примерно 1 до 4,5, в частности, от примерно 1 до примерно 2, более конкретно с pH примерно 1,2 (кислотный этап), а вторая среда растворения является водным раствором с pH выше примерно 5,0, в частности, от примерно 5,5 до примерно 6,8, более конкретно с pH примерно 6 (буферный энтеросолюбильный этап).

[0048] В другом варианте осуществления настоящего изобретения первая среда растворения является водной средой с pH от примерно 1 до примерно 4,5, а вторая среда растворения является водным буферным раствором с pH выше примерно 5.

[0049] В другом варианте осуществления первая среда растворения является водной средой с pH от примерно 1 до примерно 4,5, а вторая среда растворения является водным буферным раствором с pH от примерно 5,5 до примерно 6,8.

[0050] В другом варианте осуществления настоящего изобретения первая среда растворения является водной средой с pH от примерно 1 до примерно 2, а вторая среда растворения является водным буферным раствором с pH выше примерно 5.

[0051] В другом варианте осуществления настоящего изобретения первая среда растворения является водной средой с pH от примерно 1 до примерно 2, а вторая среда растворения является водным буферным раствором с pH от примерно 5,5 до примерно 6,8.

[0052] В другом варианте осуществления настоящего изобретения первая среда растворения является водной средой с pH примерно 1,2, а вторая среда растворения является водным буферным раствором с pH примерно 6.

[0053] В дополнительном варианте осуществления способ включает этапы а) добавления твердой композиции панкрелипазы в первую среду растворения (кислотный этап), b) переноса суспензии во вторую среду растворения (энтеросолюбильный этап), с) обеспечения высвобождения пищеварительных ферментов, d) отбора аликвот среды растворения, е) снятия показания флуоресценции при 346 нм, f) расчета количества высвобожденных пищеварительных ферментов. Расчет выполняют, как описано в примерах.

[0054] При выполнении тестов на растворение в отношении готовых лекарственных форм, USP требует расчет значений "Q". Данные значения Q коррелируют с указанными на этикетке активностями, и действующие критерии соответствия зафиксированы как 75% от указанной на этикетке активности липазы.

[0055] Флуорометрический способ по настоящему изобретению, несмотря на то, что не является специфичным для измерения ферментативной активности, показывает полную корреляцию с ферментативными профилями растворения, тем самым демонстрируя, что высвобождение общего белка строго коррелирует с высвобождением ферментов. Следовательно, значение "Q" можно рассчитать для настоящего способа следующим образом: значение Q" в способе растворения с флуорометрическим измерением:

где: % растворения является % высвобожденного API, рассчитанный как указано в методике анализа; показатель анализа липазы в навеске является активностью липазы в навеске; указанная на этикетке активность липазы: активность липазы, указанная на этикетке готовой лекарственной формы.

[0056] Несмотря на то, что флуорометрический способ, описываемый в данном документе, демонстрировал полную корреляцию с измерением ферментативной активности в ходе проведения буферного энтеросолюбильного этапа теста на растворение композиций панкрелипазы, и, следовательно, предложен как способ, заменяющий тест на ферментативную активность липазы, данный способ не может обнаруживать какую-либо проблему резистентности к действию желудочного сока, возникающую при растворении на кислотном этапе, поскольку флуорометрическое измерение общего белка не зависит от проникновения кислоты через мембрану, в отличие от анализа липазы. Активность липазы сильно снижается в том случае, если кислый сок проникает через защитную мембрану. Текущий тест USP (измерение активности липазы) накапливает в конце растворения на буферном энтеросолюбильном этапе эффекты потенциальной слабой резистентности к действию желудочного сока на кислотном этапе с явлением растворения и разрушения липазы, что возникает на буферном энтеросолюбильном этапе.

[0057] Следовательно, другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ измерения количества (%) пищеварительных ферментов, высвобождаемых из твердой композиции панкрелипазы в среде растворения, с помощью флуоресцентной спектроскопии, комбинированной с тестом на резистентность к действию желудочного сока, где резистентность к действию желудочного сока измеряется путем определения остаточной активности липазы препарата с помощью специального способа анализа липазы после воздействия кислой среды (кислотный этап). В данном варианте осуществления два теста (FL тест на растворение и GR тест на резистентность к действию желудочного сока) могут проводиться в любом порядке.

[0058] FL тест: тест на растворение, выполняемый в два этапа (кислотный и энтеросолюбильный). На первом кислотном этапе средой растворения является водная среда, обладающая кислым pH от примерно 1 до примерно 4,5, предпочтительно pH от примерно 1 до примерно 2, предпочтительно pH примерно 1,2 (кислотный этап); на втором энтеросолюбильном этапе средой растворения является водный буферный раствор, обладающий pH выше примерно 5, предпочтительно pH от примерно 5,5 до примерно 6,8, предпочтительно pH примерно 6 (буферный энтеросолюбильный этап). Тест на резистентность к действию желудочного сока выполняют в водной среде, обладающей кислым pH от примерно 1 до примерно 4,5, предпочтительно pH от примерно 1 до примерно 2, предпочтительно pH примерно 1,2. Флуорометрический тест измеряет пищеварительные ферменты (API или лекарственное средство), высвобождаемые в конце энтеросолюбильного этапа; в качестве критериев соответствия можно рассчитать значение Q при помощи отношения активности высвобожденной липазы навески / указанной на этикетке активности липазы.

[0059] GR тест: тест на резистентность к действию желудочного сока выполняют в условиях кислотного этапа теста на растворение (средой растворения является водный раствор, обладающий кислым pH от примерно 1 до примерно 4,5, в частности pH от примерно 1 до примерно 2, более конкретно pH примерно 1,2, где % резистентности к действию желудочного сока измеряют путем определения остаточной активности липазы препарата после воздействия кислой среды, при этом в случае способа анализа липазы критериями соответствия будут критерии, указанные для кислотного этапа лекарственных форм с отсроченным высвобождением в USP.

[0060] Из вышеприведенного описания и экспериментальной части можно увидеть, что настоящий флуориметрический способ анализа предусматривает несколько важных преимуществ.

[0061] Настоящее изобретение предусматривает простую и быструю методику, поскольку значительно уменьшено время, требуемое для подготовки реагентов, и при ферментном анализе не требуется никаких специальных аналитических знаний. Таким образом, передача способов анализа является очень легкой. Предлагаемый способ является проще и быстрее в осуществлении, чем анализ липазы, и время, требуемое для подготовки реагентов, значительно уменьшено.

[0062] Маркер (общий белок) является стабильным в среде растворения, и поэтому при расчете не требуется поправочный коэффициент для компенсации разрушения (который требуется в способе анализа липазы). Фактически, маркер, анализируемый при флуорометрическом измерении (общий белок), через 30 мин в буфере среды энтеросолюбильного этапа с pH 6 при 37°C показывает разрушение меньше 3%; тогда как ферментативная активность липазы, измеряемая с помощью текущего способа, в буфере среды энтеросолюбильного этапа с pH 6 при 37°C показывает примерно 11% разрушение.

[0063] Новый способ также является точным и обладает хорошей чувствительностью, так что предел количественного определения / диапазон линейности подходит также для тестирования отдельной единицы. Флуорометрический способ демонстрирует лучшие рабочие характеристики, чем ферментативный анализ липазы, с точки зрения рабочей концентрации, которая составляет 0,3 липазных USP единиц » 3 мкг панкрелипазы/мл; что составляет примерно 1/50 рабочей концентрации показателя анализа липазы; диапазон линейности составляет 10-200% рабочей концентрации; погрешность составляет не больше 2,0% как в отношении воспроизводимости, так и в отношении внутрилабораторной погрешности (что измерили согласно результатам растворения шести различных партий составов панкрелипазы, Zenpep®).

[0064] Более того, с помощью такого способа можно при тестировании получить многоточечный (>3) профиль растворения.

[0065] Также в экспериментальной части показано, что изобретенная флуорометрическая неспецифическая методика определения содержания общего белка эквивалентна, с точки зрения эффективности, двум фермент-специфическим анализам, основанным на активности протеазы и на активности липазы (способ действующего справочника), исходя из сравнения профилей растворения, полученных с применением трех способов измерения.

[0066] Следует понимать, что как приведенное выше общее описание, так и последующее подробное описание являются иллюстративными, а не ограничивающими для настоящего изобретения.

Примеры

Оборудование, материалы и способы

[0067] Оборудование: флуоресцентный спектрометр LS 50 В (Perkin Elmer), флуоресцентный спектрометр LS 55 (Perkin Elmer), спектрометр Lambda 20 UV-VIS (Perkin Elmer), система для потенциометрического титрования 786 Titrando (Metrohm), ванна для растворения VK-7025 (Vankel), ванна для растворения Premier 5100 (Distek), прибор 1 - корзинка USP (для кислотного этапа); прибор 2 - лопастная мешалка USP (для энтеросолюбильного этапа).

[0068] Реагенты для теста на растворение. Среда кислотного этапа (pH 1,2): помещают 2,00 г хлорида натрия в 800 мл очищенной воды и перемешивают до полной солюбилизации. Добавляют 7 мл 37% HCl и перемешивают. Доводят pH раствора до 1,20±0,05 с помощью 1 н. HCl или 1 н. NaOH. Разбавляют до 1000 мл очищенной водой; проверяют pH и при необходимости доводят до 1,20±0,05 с помощью 1 н. HCl или 1 н. NaOH.

[0069] Реагенты для теста на растворение. Среда энтеросолюбильного этапа (pH 6,0): помещают 9,20 г фосфата калия однозамещенного и 2,00 г хлорида натрия в 800 мл очищенной воды и перемешивают до полной солюбилизации. Доводят pH раствора до 6,00±0,05 с помощью 1 н. NaOH. Разбавляют до 1000 мл очищенной водой; проверяют pH и при необходимости доводят до 6,00±0,05 с помощью 1 н. HCl или 1 н. NaOH.

[0070] Все примеры осуществляют с использованием гранул панкрелипазы с энтеросолюбильным покрытием, это либо минитаблетки панкрелипазы (МТ), либо микротаблетки (МСТ), которые являются смесью исходного вещества панкрелипазы с наполнителями (например, кроскармеллоза натрия, гидрогенизированное касторовое масло, коллоидный диоксид кремния, микрокристаллическая целлюлоза и стеарат магния), покрытые энтеросолюбильным полимером фталатом гипромеллозы (НР55); данные МТ и МСТ содержатся в капсулах НРМС и продаются под названием Zenpep®. Специалисту в данной области будет очевидно, что в гранулах панкрелипазы с энтеросолюбильным покрытием могут применяться альтернативные энтеросолюбильные полимеры и наполнители.

[0071] Измерение липолитической активности осуществляют с помощью способа, основанного на методике анализа липазы из справочника, описанной в статье USP по панкрелипазе, который основан на титровании, посредством способа pH-стат, свободных жирных кислот, образующихся в результате гидролиза этерифицированных жирных кислот в используемом субстрате (оливковое масло). Он основан на следующем принципе: липаза катализирует гидролиз триглицеридов, что приводит к образованию свободных жирных кислот (FFA). Титрование образованных FFA в зависимости от времени обеспечивает определение ферментативной активности липазы, которая может выражаться в единицах: 1 ЕД=1 мкмоль образованных FFA в минуту. Реакция происходит за счет поддержания в экспериментальной системе стабильного значения pH, что предусматривает добавление NaOH (титранта) при изменениях значения pH по сравнению с фиксированным значением (pH-стат способ). Количество добавленного титранта в зависимости от времени соответствует количеству FFA, образованных посредством действия липазы на триглицериды. При условии работы с подходящим количеством субстрата и в экспериментальных условиях, где фермент является стабильным, можно получить линейную кинетику образования FFA в зависимости от времени. Наклон кривой {добавленный титрант = f (объем (мл)/время (минуты))} дает ферментативную активность липазы.

[0072] Измерение протеолитической активности проводят в соответствии с методикой из справочника, описанной в статье USP по панкрелипазе.

Пример 1. Получение стандартного раствора готовой лекарственной формы

[0073] Стандартный раствор получают с применением готовой лекарственной формы той же партии, которая имелась в лекарственной форме при анализе. Количество гранул панкрелипазы (минитаблетки или микротаблетки Zenpep®), эквивалентное 7000 липазных единиц USP, точно взвешивают в ступке. Добавляют 5-6 мл среды энтеросолюбильного этапа и растирают до получения полной дисперсии препарата. Суспензию переносят в мерную колбу на 500 мл. Ступку 2-3 раза промывают несколькими мл среды энтеросолюбильного этапа и переносят жидкость в мерную колбу на 500 мл. Среду энтеросолюбильного этапа добавляют в мерную колбу до конечного общего объема 500 мл и перемешивают смесь в течение 10 мин. Аликвоты, которые отбирают из среды растворения, дополнительно разводят 1:50 средой энтеросолюбильного этапа. При этом разведении конечная концентрация API составляет примерно 0,3 липазных единиц USP (около 3 мкг панкрелипазы/мл). Данное последнее разведение осуществляют в тесте на растворение - только конечная точка и в тесте на растворение - многоточечный (профиль растворения).

Пример 2. Тест на растворение

[0074] В каждый сосуд ванны для растворения, оснащенной прибором с корзинкой, добавляют 800 мл среды кислотного этапа; среду растворения уравновешивают при 37°C. Взвешивают количество гранул панкрелипазы (минитаблетки или микротаблетки Zenpep), эквивалентное 11200 липазным единицам USP (14 липазных единиц USP/мл), и таким образом получают шесть независимых образцов, которые помещают в корзинки. Прибор работает при 100 оборотах в минуту. Через 1 час корзинки вынимают из среды, промывают несколькими миллилитрами воды, а содержимое каждой корзинки переносят в соответствующий сосуд, содержащий 800 мл среды энтеросолюбильного этапа при 37°C, ванны для растворения, оснащенной прибором с лопастью. Прибор работает при 100 оборотах в минуту. Через 30 мин из каждого сосуда отбирают аликвоту среды растворения для измерения высвобожденного API. При определении профиля растворения на энтеросолюбильном этапе через 10, 12, 15, 18, 30 мин отбирают 2,5 мл аликвоты среды растворения; в течение теста не производят замену среды, при этом потерю объема учитывают при расчете с помощью поправочных коэффициентов ниже.

Пример 3. Определение пищеварительных ферментов (API, активный ингредиент), высвобождаемых в тесте на растворение с помощью флуоресцентной спектроскопии (анализ общего белка)

[0075] Каждую аликвоту среды растворения, отобранную из каждой корзинки, как описано в примере 2, разводят 1:50 средой энтеросолюбильного этапа. Считывают данные о разведенных растворах на флуоресцентном спектрометре со следующими рабочими параметрами: длина оптического пути кварцевой кюветы 1 см, длина волны возбуждения: 280 нм, длина волны излучения (измерение): 346 нм, щель для возбуждения: 6,0. Целевую концентрацию маркера (API=панкрелипаза; 100% высвобожденная) в конечной точке: 0,3 липазных единиц USP/мл или примерно 3 мкг панкрелипазы/мл; получают с помощью следующего расчета:

[0076] Количество высвобожденного API определяют по сравнению со стандартным раствором, полученным из готовой лекарственной формы той же партии, как описано в примере 1.

[0077] Для теста на растворение - расчет в конечной точке выполняют с помощью следующей формулы.

[0078] Для теста на растворение - многоточечный (профиль растворения) расчет выполняют с помощью следующей формулы:

,

где: E_SMP является показанием флуоресценции (излучение при 346 нм) образца, вычтенным из показания холостого раствора; E_STD является показанием флуоресценции (излучение при 346 нм) стандарта, вычтенным из показания холостого раствора; W_SMP является весом образца (мг); W_STD является весом стандарта (мг); V_SMP является объемом разведения образца (мл); V_STD является объемом разведения стандарта (мл); FC является поправочным коэффициентом (смотри таблицу 1).

Пример 4. Валидационное исследование анализа общего белка с помощью флуоресцентной спектроскопии

[0079] Рабочие характеристики флуорометрического определения содержания общего белка в API, высвобождаемом из композиции панкрелипазы (состав Zenpep®) в тесте на растворение, оценивают по следующим параметрам: специфичность, линейность, точность, погрешность, предел количественного определения, стабильность образца и стандартного раствора, демонстрация полноты экстракции при получении стандартного раствора, а результаты обобщены в таблице 2.

[0080] С помощью полученных данных валидации здесь показано, что предлагаемый флуорометрический способ определения содержания общего белка в тесте на растворение лекарственных форм панкрелипазы (состав Zenpep®) подходит для предусмотренного применения.

Пример 5. Профиль растворения гранул панкрелипазы (минитаблетки Zenpep^®) с помощью трех способов измерения: содержание общего белка с помощью флуоресцентной спектроскопии (неспецифический анализ), протеолитическая активность путем анализа протеазы (фермент-специфический анализ) и липолитическая активность путем анализа липазы (фермент-специфический анализ)

[0081] Тест на растворение выполняют в соответствии с описанным выше способом (смотри пример 2) путем отбора 2,5 мл аликвот через 10, 12, 15, 18 и 30 мин. В ходе теста замены среды не выполняют.Сравнение трех процессов выполняют в соответствии с подходом SUPAC (Guidance for Industry "SUPAC MR: Modified release solid oral dosage forms. Scale-up and postapproval changes: chemistry, manufacturing, and controls, in vitro dissolution testing, and in vivo bioequivalence documentation" Center for Drug Evaluation and Research (CDER), September 1997) для демонстрации сходства профилей растворения посредством критерия f2; для получения необходимого количества данных для каждого из трех способов измерения анализируют двенадцать независимых образцов (образец = количество гранул панкрелипазы, минитаблеток Zenpep®, эквивалентное 11200 ME) группами по три образца на серию измерений, в общей сложности четыре серии измерений.

Пример 5.1. Профиль растворения гранул панкрелипазы (минитаблетки Zenpep^®) с помощью анализа протеазы

[0082] Отдельные значения растворения и общее среднее в каждой тестируемой временной точке суммированы в таблице 3; средняя кривая показана на фигуре 1.

Пример 5.2. Профиль растворения гранул панкрелипазы (минитаблетки Zenpep^®) с помощью анализа липазы

[0083] Отдельные значения растворения и общее среднее в каждой тестируемой временной точке суммированы в таблице 4; средняя кривая показана на фигуре 2. При расчете для компенсации разрушения липазы в ходе теста на растворение применяют поправочный коэффициент 1,125.

Пример 5.3. Профиль растворения гранул панкрелипазы (минитаблетки Zenpep^®) с помощью флуориметрического определения содержания общего белка

[0084] Отдельные значения растворения и общее среднее в каждой тестируемой временной точке суммированы в таблице 5; средняя кривая показана на фигуре 3.

Пример 5.4. Сравнение профилей растворения, полученных с помощью трех способов измерения

[0085] Средние данные растворения гранул панкрелипазы (минитаблетки Zenpep®), измеренные в каждой временной точке с помощью трех способов анализа, суммированы в таблице 6.

[0086] Три профиля растворения демонстрируют почти полное перекрытие, как показано в графическом сравнении фигур 4a-c; в частности, проведенные через точки средних значений кривые анализа липазы и флуорометрического анализа полностью совпадают при наложении, тогда как проведенная через точки средних значений кривая протеазы отличается только в конечной точке, демонстрируя значение >100%. Кроме того, CV из каждой серии данных очень сходны среди трех способов измерений, при этом более низкие значения продемонстрированы с помощью флуорометрического анализа.

[0087] Подход SUP AC, применяемый для оценки эквивалентности активности готовой лекарственной формы после и до изменений (критерий подобия f2 на профилях растворения сравниваемых препаратов), применяется для демонстрации эквивалентности нового предлагаемого способа флуорометрического определения общего белка в тесте на растворение состава Zenpep® с одним, применяемым в настоящее время (анализ липазы), и с другим фермент-специфическим измерением (анализ протеазы).

[0088] Для применения критерия подобия f2 к профилям растворения в руководстве FDA (Guidance for Industry "SUPAC MR: Modified release solid oral dosage forms. Scale-up and postapproval changes: chemistry, manufacturing, and controls, in vitro dissolution testing, and in vivo bioequivalence documentation" Center for Drug Evaluation and Research (CDER), September 1997; Guidance for Industry - dissolution testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), August 1997) указаны некоторые условия, которые должны выполняться:

a. в каждом временном интервале нужно использовать средние значения растворения (n=12) обеих кривых,

b. следует рассматривать только одно измерение сверх 85% показателя растворения,

c. средняя разница в любой временной точке отбора образца не должна превышать 15% между профилями растворения,

d. нужно обеспечить использование средних данных, процентный коэффициент вариации в более ранней временной точке не должен превышать 20%, а в других временных точках не должен превышать 10%.

[0089] Требования a, b и c выполняются в настоящих данных растворения; однако значения CV, превышающие допустимые (d), наблюдались в первые три временные точки (10, 12, 15 мин) для всех оцениваемых способов измерений. Наблюдаемую высокую вариабельность в данных временных точках можно объяснить очень низкой концентрацией анализируемого вещества в первой временной точке отбора образца (10 мин) и свойственной составу вариабельностью в узком диапазоне затраченного времени в отношении дополнительных временных точек в 12 и 15 мин, принимая во внимание, что в условиях теста на растворение 100% высвобождение состава получают за очень короткое время (30 мин).

[0090] На основании вышеприведенного рассмотрения критерий f2 применяется в любом случае, исходя из того, что наблюдаемая сходная вариабельность в трех способах измерений существенно не изменяла полученных кривых, проведенных через точки средних значений, показывая полное перекрытие. Затем выполняется дополнительная оценка с учетом последних трех временных точек (15-18-30 мин) с целью проверить, будет ли критерий f2 расходиться с данными, которые полностью удовлетворяют требованиям SUPAC.

Пример 5.4.1. Сравнение: флуориметрическое определение содержания в сравнении с анализом липазы

[0091] Критерий f2 для профилей растворения флуорометрического определения в сравнении с анализом липазы (эталон) при рассмотрении всех временных точек показал сходство между двумя кривыми 87,4%, тогда как при выполнении расчета в последних трех временных точках сходство составляло 83,3%.

Пример 5.4.2. Сравнение: флуориметрическое определение содержания общего белка в сравнении с анализом протеазы

[0092] Критерий f2 для профилей растворения флуорометрического определения в сравнении с анализом протеазы (эталон) при рассмотрении всех временных точек показал сходство между двумя кривыми 72,3%, тогда как при выполнении расчета в последних трех временных точках сходство составляло 68,6%. В целом значения f2, превышающие 50 (50-100), гарантируют подобие или эквивалентность двух кривых и, следовательно, эффективность теста. Исходя из результатов, полученных при сравнении профилей растворения посредством критерия f2, можно, таким образом, утверждать, что флуорометрическое определение содержания общего белка во всех отношениях эквивалентно фермент-специфическим способам при измерении высвобождения API в тесте на растворение составов панкрелипазы (составы Zenpep®).

Пример 6. Сравнение данных валидации

[0093] Для полноты сравнения нового флуориметрического теста и известного принятого анализа ферментативной активности липазы (способ USP) включена таблица 7.

(а): целевая концентрация для анализа липазы=12 липазных единиц/мл; (b): целевая концентрация для FL анализа=0,3 липазной единицы/мл (3 мкг DS/мл); (с): 1 партия DP, шесть независимых образцов/анализ; (d): 6 партий DP, шесть независимых образцов/измерение для каждой партии

Пример 7. Тест на растворение с помощью флуориметрической спектроскопии на гранулах панкрелипазы.

[0094] Флуориметрический способ, который описан в приведенных выше примерах, проводят также с другими составами панкрелипазы, присутствующими на рынке под названием Creon® с различными концентрациями дозировок. Результаты сравниваются с результатами, полученными для гранул панкрелипазы, присутствующих на рынке как Zenpep®, и приводятся на фигуре 5. Различия в поведении согласуются с различными концентрациями составов и различными площадями поверхности частиц двух составов (Zenpep®, Creon®). Для различных концентраций Zenpep® применяются два размера гранул, при этом более мелкие (со средним диаметром около 1,8 мм), демонстрирующие более быстрые профили растворения, применяются для заполнения капсул 5000 UI, тогда как более крупные (со средним диаметром около 2,4) применяются для заполнения капсул 20000 UI. Гранулы Creon® имеют средний диаметр примерно 1 мм, но значительно более неравномерные, чем гранулы Zenpep®, обеспечивая тем самым более быстрые профили растворения, чем Zenpep®, но менее воспроизводимые от навески к навеске (для всех концентраций Creon® используют одинаковые гранулы).

Пример 8. Тест на растворение, комбинированный с тестом на резистентность к действию желудочного сока: FL-тест плюс GR-тест

FL-тест: тест на растворение с флуориметрическим измерением

[0095] 800 мл среды кислотного этапа помещают в каждый сосуд ванны для растворения, оснащенной прибором с корзинкой (прибор 1-корзинка USP); среду растворения (кислотный этап) уравновешивают при 37°C. Взвешивают количество гранул панкрелипазы, соответствующее 11200 липазным единицам USP (10 капсул минитаблеток или микротаблеток Zenpep®), и переносят в каждую корзинку прибора 1. Прибор работает при 100 оборотах в минуту. Через 1 час корзинки вынимают из среды, промывают несколькими миллилитрами воды, а содержимое каждой корзинки переносят в сосуды для растворения, содержащие 800 мл среды энтеросолюбильного этапа при 37°C, ванны для растворения, оснащенной прибором с лопастью (прибор 2 USP). Прибор работает при 100 оборотах в минуту. Через 30 мин 10 мл часть тестируемого раствора удаляют, переносят в пробирку для теста и уравновешивают при комнатной температуре. Для получения надлежащей концентрации (около 0,3 единицы USP/мл) выполняют дополнительное разведение средой энтеросолюбильного этапа. Растворы хранят в ледяной/водяной ванне и перед снятием показаний встряхивают вручную. На флуоресцентном спектрометре снимают показания о разведенных растворах со следующими рабочими параметрами: длина оптического пути кварцевой кюветы 1 см, длина волны возбуждения:=280 нм; длина волны излучения (измерение)=346 нм; щель для возбуждения: 6,0.

[0096] Целевая концентрация маркера (API = панкрелипаза; 100% высвобождена) в разведенном тестируемом растворе составляет 0,3 липазных единиц USP/мл.

[0097] Стандартный раствор получают, как описано в примере 1, и хранят в ледяной/водяной ванне, перемешивая до снятия показаний.

[0098] Количество высвобождения лекарственного средства из твердой композиции панкрелипазы рассчитывают следующим образом.

[0099] Расчеты выполняют для нерасфасованных минитаблеток/микротаблеток.

[00100] Расчеты выполняют для капсул.

Где: LC - снятые показания флуоресценции (излучение при 346 нм) образца; LS: снятые показания флуоресценции (излучение при 346 нм) стандарта; PS - вес стандарта (мг); PC - вес образца (мг); US - активность стандарта (липазных USP единиц/мг, показатель анализа липазы в навеске); PM - средний вес содержимого капсулы (мг/капсула); UL - указанное на этикетке содержание липазы в отдельной единице дозирования (единиц USP/капсулу); VC - объем разведения образца (мл); VS - объем разведения стандарта (мл).

GR тест: тест на резистентность к действию желудочного сока (с анализом липазы)

[00101] 800 мл кислой среды помещают в каждый сосуд (прибор 1-корзинка USP) ванны для растворения, оснащенной прибором с корзинкой, а затем среду растворения уравновешивают при 37°C. Взвешивают количество гранул панкрелипазы, соответствующее 11200 липазным единицам USP (10 капсул минитаблеток или микротаблеток Zenpep®), и переносят в каждую корзинку прибора 1. Прибор работает при 100 оборотах в минуту. Через 1 час корзинки вынимают из среды и промывают образцы путем кратковременного погружения (около 5 секунд) корзинок в 1000 мл стакан, содержащий 900 мл холодной очищенной воды при 4°C, и данный процесс повторяют три раза без замены промывочной жидкости. Содержимое каждой корзинки количественно переносят в керамическую ступку, добавляют 5-6 мл холодной очищенной воды. Образец измельчают до получения его полной дисперсии, количественно собирают в 200 мл мерную колбу и лунку ступки промывают. Данную операцию повторяют 2-3 раза. До конечного общего объема добавляют очищенную воду. Осуществляют дополнительное разведение холодной очищенной водой для получения надлежащей концентрации (около 14 единиц USP/мл, что является теоретической максимальной концентрацией, доступной при условии 100% резистентности препарата к действию желудочного сока). Раствор образца получают непосредственно перед титрованием и хранят при перемешивании в ледяной/водяной ванне.

[00102] Стандартный раствор получают следующим образом: точно взвешивают количество USP панкреатин липазы RS, или рабочего стандарта панкрелипазы, соответствующее 6000 единицам USP, и добавляют в керамическую ступку, добавляют примерно 5-6 мл очищенной воды, а затем измельчают. Жидкость из ступки выливают в 500 мл мерную колбу и ступку также промывают. Данную операцию повторяют 2-3 раза. Очищенную воду добавляют до конечного общего объема. Стандартный раствор получают непосредственно перед титрованием и хранят при перемешивании в ледяной/водяной ванне.

[00103] Конечная концентрация стандартного раствора составляет примерно 12,0 липазных единиц USP/мл.

[00104] Для анализа липазы: 30 мл эмульсии субстрата (при 37°C±0,1°C) выливают в сосуд с рубашкой на титраторе и перемешивают с помощью магнитной мешалки, поддерживая температуру при 37°C±0,1°C. Добавляют 0,1 н. NaOH для доведения pH до 9,20-9,23 потенциометрически. Добавляют 1,0 мл образца или стандартного раствора с последующим добавлением 0,1 н. NaOH в течение 5 мин для поддержания pH на уровне 9,0.

[00105] Расчеты выполняют с помощью следующей формулы:

где: VMC - объем 0,1 н. NaOH, потребляемый за минуту образцом (мл/мин); AVMS - средний объем 0,1 н. NaOH, потребляемый за минуту стандартом (мл/мин); PC - вес образца (мг), PS - вес стандарта (мг); DC - разведение образца (мл); DS - разведение стандарта (мл); US - активность стандарта (липазных USP единиц/мг); UC - показатель анализа липазы в навеске (липазных единиц USP/мг).

[00106] Критерии соответствия согласно USP, <711> растворение - формы с отсроченным высвобождением (кислотный этап), таблица приемки 3:

Уровень 1 - критерии соответствия: GR% должен превышать или равняться 90% для каждой отдельной единицы;

Уровень 2 - критерии соответствия: среднее значение GR 12 единиц (6 единиц на уровне 1, 6 единиц на уровне 2) составляет не меньше 90%, и ни в одной отдельной единице не ниже 75%;

Уровень 3 - критерии соответствия: среднее значение GR 24 единиц (6 единиц на уровне 1, 6 единиц на уровне 2, 12 единиц на уровне 3) составляет не меньше 90%, и ни в одной отдельной единице не ниже 75%.

[00107] На основании всех вышеизложенных данных и обсуждений флуорометрическое измерение содержания общего белка в качестве маркера высвобожденных пищеварительных ферментов в тесте на растворение гранул панкрелипазы является достоверной и выгодной альтернативой действующему, принятому в справочниках способу измерения, основанному на анализе активности липазы.

Изобретение относится к способу измерения количества пищеварительных ферментов, высвобождаемых из твердой композиции в среде растворения, посредством флуоресцентной спектроскопии. Сущность способа заключается в том, что твердую композицию панкрелипазы добавляют в первую среду растворения, обладающую рН от примерно 1 до примерно 4,5, затем переносят суспензии во вторую среду растворения, обладающую рН от примерно 5 до примерно 6,8. Далее обеспечивают высвобождение пищеварительных ферментов, производят отбор аликвот среды растворения и снятие показания флуоресценции, рассчитывают количество высвобожденных пищеварительных ферментов. 18 з.п. ф-лы, 5 ил., 6 табл., 12 пр.

1. Способ измерения количества пищеварительных ферментов, высвобождаемых из твердой композиции панкрелипазы в среде растворения, включающий применение флуоресцентной спектроскопии для измерения количества пищеварительных ферментов, высвобождаемых из твердой композиции в среде растворения, где среда растворения является водой, раствором HCl, воспроизводимым желудочным соком, буферным раствором, воспроизводимым кишечным соком, водным или буферным раствором, содержащим по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, где среда растворения состоит по меньшей мере из двух сред, которые применяют последовательно, где способ включает этапы (а) добавления твердой композиции панкрелипазы в первую среду растворения, обладающую рН от примерно 1 до примерно 4,5, (b) переноса суспензии во вторую среду растворения, обладающую рН от примерно 5 до примерно 6,8, (с) обеспечения высвобождения пищеварительных ферментов, (d) отбора аликвот среды растворения, (е) снятия показания флуоресценции, (f) расчета количества высвобожденных пищеварительных ферментов.

2. Способ по п. 1, где снятие показания флуоресценции осуществляют при 346 нм.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что твердая композиция панкрелипазы является композицией панкрелипазы с энтеросолюбильным покрытием.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первая среда растворения является водной средой, обладающей рН от примерно 1 до примерно 4,5, а вторая среда растворения является водным буферным раствором, обладающим рН выше примерно 5.

5. Способ по п. 1 или 4, отличающийся тем, что первая среда растворения является водной средой, обладающей рН от примерно 1 до примерно 2.

6. Способ по п. 1 или 4, отличающийся тем, что вторая среда растворения является водным буферным раствором, обладающим рН от примерно 5,5 до примерно 6,8.

7. Способ по п. 1 или 4, отличающийся тем, что первая среда растворения является водной средой, обладающей рН примерно 1,2, а вторая среда растворения является водным буферным раствором, обладающим рН примерно 6.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что композиции панкрелипазы характеризуются в целом примерно 750, примерно 3000, примерно 4200, примерно 5000, примерно 6000, примерно 10000, примерно 10500, примерно 15000, примерно 16800, примерно 20000, примерно 21000, примерно 24000 или примерно 25000, или примерно 40000 липазных единиц USP или кратной им величиной, или примерно 5000, или примерно 10000, или примерно 15000, или примерно 20000, или примерно 30000, или примерно 40000 липазных единиц PhEur или кратной им величиной.

9. Способ по п. 1, комбинированный с тестом на резистентность к действию желудочного сока, где резистентность к действию желудочного сока измеряют путем определения остаточной активности липазы композиции в водной среде, обладающей рН от примерно 1 до примерно 4,5, с помощью способа анализа липазы.

10. Способ по п. 1, комбинированный с тестом на резистентность к действию желудочного сока, где резистентность к действию желудочного сока измеряют путем определения остаточной активности липазы композиции в водной среде, обладающей рН от примерно 1 до примерно 2, с помощью способа анализа липазы.

11. Способ по п. 1, комбинированный с тестом на резистентность к действию желудочного сока, где резистентность к действию желудочного сока измеряют путем определения остаточной активности липазы композиции в водной среде, обладающей рН примерно 1,2, с помощью способа анализа липазы.

12. Способ по п. 9, отличающийся тем, что измерение количества пищеварительных ферментов, высвобождаемых из твердой композиции в среде растворения, посредством флуоресцентной спектроскопии проводят либо до, либо после теста на резистентность к действию желудочного сока.

13. Способ по п. 9, отличающийся тем, что измерение количества пищеварительных ферментов, высвобождаемых из твердой композиции в среде растворения, посредством флуоресцентной спектроскопии проводят в среде растворения, которая состоит по меньшей мере из двух сред, которые применяют последовательно.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что первая среда растворения является водной средой, обладающей кислым рН от примерно 1 до примерно 4,5.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что первая среда растворения является водной средой, обладающей рН от примерно 1 до примерно 2.

16. Способ по п. 13, отличающийся тем, что вторая среда растворения является водным буферным раствором, обладающим рН выше примерно 5.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что вторая среда растворения является водным раствором, обладающим рН от примерно 5,5 до примерно 6,8.

18. Способ по п. 15 или 17, отличающийся тем, что первая среда растворения является водной средой, обладающей рН примерно 1,2, а вторая среда растворения является водным буферным раствором, обладающим рН примерно 6.

19. Способ по п. 9, отличающийся тем, что композиции панкрелипазы характеризуются в целом примерно 750, примерно 3000, примерно 4200, примерно 5000, примерно 6000, примерно 10000, примерно 10500, примерно 15000, примерно 16800, примерно 20000, примерно 21000, примерно 24000, примерно 25000 или примерно 40000 липазных единиц USP или кратной им величиной, или примерно 5000, или примерно 10000, или примерно 15000, или примерно 20000, или примерно 30000, или примерно 40000 липазных единиц PhEur или кратной им величиной.