СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСОВ Ga Российский патент 2016 года по МПК C07B59/00 A61K51/04 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способам получения комплексов, содержащих изотопы, в частности комплексов, используемых в качестве радиомаркеров, содержащих изотоп ²⁸Ga.

Известный уровень техники

Несмотря на обнадеживающие результаты недавних клинических исследований с использованием радиоактивной метки ⁶⁸Ga для визуализации ПЭТ в организме, короткий период полураспада изотопа (68 минут), который затрудняет широкое использование наряду с необходимостью оснащенного "фармацевтического производства" для процесса введения метки, по-прежнему осложняет его широкое применение в повседневной ядерной медицине.

Введение метки ⁶⁸Ga осуществляют формированием комплекса радиоактивного металла с подходящим хелатообразующим агентом в реакционной среде, в которую вводят радиоактивную дозу ⁶⁸Ga полученного элюированием генератора ⁶⁸Ga, заданное количество молекул, в которые должна быть введена метка (называемых далее как молекулы, функционализированные хелатирующим агентом, или предшественник) и подходящий буфер для обеспечения оптимального для комплексов pH.

Так называемый генератор ⁶⁸Ga представляет собой смолу, коммерчески доступную и содержащую германий, из которого при распаде германия образуется требуемый ⁶⁸Ga, поэтому элюирование смолы при соответствующих условиях pH и в присутствии молекул, функционализированных хелатирующими группами, обеспечивает формирование пригодного комплекса, содержащего ⁶⁸Ga; в зависимости от выбранных молекул, функционализированных хелатирующимим группами, может быть необходимо нагревание при 75-90°C.

Основные ограничения успешного введения метки обусловлены тем, что подходящий pH должен оставаться постоянным и конкуренцией металлических примесей с Ga-68 во время процесса комплексообразования.

С учетом вышесказанного выбор подходящего буфера, способного обеспечить стандартный pH, несомненно, является предметом непрерывных исследований специалистов в данной области введения метки ⁶⁸Ga и остается открытым.

Такой буфер должен быть нетоксичным, способным буферировать в диапазоне pH 3,5-5,0, не должен конкурировать с ионами галлия и предпочтительно иметь низкую способность образовывать комплексы с металлами.

Среди различных опубликованных буферов в основном используемыми буферами до сих пор являются HEPES (производные сульфокислоты) или ацетатные буферы; однако они позволяют работать только в строго определенном диапазоне pH (публикация Velikyan и др., Bioconjugate Chem, 2008, 19, 569-573) и не могут сохранять необходимую буферную емкость при незначительном изменении кислотности элюата.

Например, даже небольшое увеличение объема элюата, выходящего из генератора, вызывает изменение pH до значений, которые нарушают процесс комплексообразования, что приводит к высоким количествам свободного Ga-68. Это создает риск несоблюдения требований по свободному Ga-68, что делает обязательной конечную очистку. Более того, отсутствуют токсикологические данные для буфера HEPES: конечная очистка должна быть выполнена также в целях устранения или, по меньшей мере, снижения содержания HEPES до введения радиофармпрепарата. Недавно были предложены другие буферы (WO 2010/092114) в качестве эффективного раствора для комплексообразования Ga-68, например лактатный, тартратный и карбонатный буферы. Эти буферы включают по меньшей мере две функциональные группы, координирующие Ga-68, преодолевающие сомнения в том, что они могут помешать введению метки. Во всяком случае их использование было успешно протестировано с уменьшенными и очищенными фракциями элюата генератора, без исключения предварительного введения метки раствор Ga-68.

Вторым важным ограничением является конкуренция металлических примесей, в основном трехвалентных и двухвалентных катионов, получающихся как из неподвижной фазы, так и за счет распада Ga-68 (Zn). Эти металлы связаны также как Ga-68 хелатирующими функциональными группами молекулы, что уменьшает число молекул, фактически доступных для введения метки. Это может привести к неполному комплексообразованию Ga-68, что снижает конечную радиохимическую чистоту препарата. В известном уровне техники иногда Ga-68, незакомплексованый хелатирующими функциональными группами молекулы в процессе введения метки, полностью связывают в комплексы добавлением после введения метки избытка хелатирующего агента с известным сродством к изотопу (например, ЭДТА хелатирующий агент), чтобы избежать высокого содержания свободных металлов и содействовать их устранению в случае введения радиофармацевтического препарата (WO 2010/141833 - пример 2). Частичное комплексообразование Ga-68 может быть выполнено по-иному, начиная с больших количеств молекул функционализированных хелатирующими группами. Однако увеличение количества предшественника хелатирующего агента дает нежелательное снижение удельной радиоактивности (отношение между количествами радиоактивного продукта и немеченого продукта), что может ухудшить результаты диагностики. В самом деле, из-за конкуренции меченой молекулы за тот же рецептор, присутствие немеченой молекулы может иметь отрицательный эффект на концентрацию радиоактивности в ткани-мишени. Таким образом, высокая SRA (удельная радиоактивность) может иметь решающее значение для обеспечения достаточной контрастности при визуализации ПЭТ между тканью-мишенью и ее окружением. В известном уровне техники наличие конкурирующих ионов металлов, как правило, уменьшают предварительной очисткой или фракционированием элюата до введения метки (как описано в WO 2010/092114), но эти стадии приводят к нежелательной потере исходной активности. Кроме того, если нельзя избежать стадий предварительного введение метки и конечной очистки, введение метки Ga-68 всегда будет основываться, в некоторой степени, на автоматизации с помощью модуля синтеза, что делает стратегию комплекта неосуществимой. Помимо необходимой технической компетентности, это требует длительного времени для введения метки, что неблагоприятно. В связи с коротким периодом полураспада радионуклида (t_1/2=68 минут) и ограниченной активности, обеспечиваемой генератором, любое улучшение с целью получения очень быстрого, прямого и с высоким выходом комплексообразования является весьма желательным.

Из всего сказанного очевидна необходимость в способе, обеспечивающем получение комплексов ⁶⁸Ga, решающем вышеуказанные проблемы.

Краткое изложение существа изобретения

Описан способ получения комплексов, содержащих ⁶⁸Ga, в котором в реакции комплексообразования используют буфер муравьиная кислота/формиат, возможно в присутствии соединений, способных поглощать катионы металлов.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение позволяет решить вышеуказанную проблему способом, в котором Ga-68 эффективно комплексуется с помощью молекул, функционализированных хелатирующими группами, в водном буфере муравьиная кислота/формиат.

Вышеуказанный буфер муравьиная кислота/формиат позволяет не только установить соответствующий pH, но и допускает изменение объема/кислотности элюата. По сути, его буферная емкость сосредотачивается при значениях pH, подходящих для комплексообразования Ga-68, и у него отсутствует способность к комплексообразованию металлов, так что он не затрудняет введение метки. Кроме того, этот буфер должен быть совместим с фармацевтическим применением, так как муравьиная кислота относится к классу 3 (растворители с низким, токсическим потенциалом) остаточных растворителей в фармакопее, для которых допускается предел 5 мг/мл (5000 м.д.). Обычно формиат предпочтительно является формиатом натрия, но и любая другая соль металла муравьиной кислоты может быть использована. Отношение муравьиная кислота/формиат, как правило, составляет 1-3,5. Кроме того, для решения проблемы наличия металлических примесей, вместо увеличения количества молекул, функционализированных хелатирующими группами (приводящего к снижению SRA), или предварительной обработки элюата генератора со стадиями, увеличивающими время и снижающими радиоактивность, что является обычной практикой в данной области, было установлено, что в способе может быть использовано комплексообразующее вещество для нейтрализации мешающих соединений, оставляя Ga-68 более свободным для взаимодействия с молекулами, функционализированными хелатирующими группами. Эти комплексообразующие вещества, если они присутствуют, выступают в качестве вспомогательных молекул, функционализированных хелатирующими группами, которые временно или постоянно снижают конкуренцию металлов в реакции с молекулами, функционализированными хелатирующими группами. Стоит заметить, что функция комплексообразующих веществ в настоящем изобретении противоположна функции комплексообразующих веществ, используемых в известном уровне техники, как описано выше. В самом деле, в соответствии с известными методиками в конце введения метки комплексообразующее вещество с особым сродством к галлию может быть добавлено для хелатирования непрореагировавшей части изотопа, в то время как в соответствии с настоящим изобретением комплексообразующее вещество способно свести к минимуму конкуренцию металлических примесей, добавленных в начале реакции. Очевидно, что комплексообразующие вещества, используемые в настоящем изобретении, должны связывать преимущественно конкурирующие металлы, а не ион Ga-68, чтобы избежать влияния на основную реакцию введения метки или образования побочных меченых соединений. Кроме того, согласно конкретному осуществлению изобретение относится также к способам комплексообразования радиоизотопов и, в частности, ⁶⁸Ga, в которых используются буферные растворы в сочетании с комплексообразующими веществами, как описано выше и далее. В соответствии с изобретением под молекулами, функционализированными хелатирующими группами, подразумевается любая молекула, способная к конъюгированию, функционализированная хелатирующими группами, способная образовывать комплексы с радиоактивными изотопами, такими как Ga-68.

Предпочтительные хелатирующие агенты для комплексообразования GA-68 в соответствии с изобретением могут быть выбраны из: DOTA и его производных, НОТА и его производных, PCTA и его производных. В общем, также может быть использован любой хелатирующий агент, способный образовывать достаточно стабильный каркас вокруг Ga³⁺, в частности любой алифатический, макроциклический или линейный амин или макроциклический амин с третичными аминами. Под молекулой, способной к конъюгированию, подразумевается молекула, способная связываться с мишенью в биологическом процессе, представляющем диагностический или терапевтический интерес, преимущественно аминокислота, пептид, преимущественно включающий 4-15 или 4-10 аминокислот, полипептид, белок, витамин, моносахарид полисахарид или антитело, нуклеиновая кислота или аптамер. Среди молекул, способных к конъюгированию, пригодных для изобретения, можно упомянуть (как пример, а не как ограничивающий перечень):

- Молекулы, конъюгирующие VEGF рецепторы.

- Аналоги бомбезина или молекулы, конъюгирующие GRP рецепторы.

- Молекулы, конъюгирующие рецепторы соматостатина.

- RDG пептиды или молекулы конъюгирующие αvβ3 и αvβ5.

- Аннексии V или молекулы, конъюгирующие в процессах апоптоза.

- Молекулы, конъюгирующие рецепторы эстрогена.

- Молекулы, конъюгирующие атероматозные бляшки.

- Конъюгирующие молекулы, указанные в Topics in Current Chemistry, vol. 222, 260-274, Fundamentals of Receptor-based Diagnostic Metallopharmaceuticals (Теоретические основы использования диагностических металлсодержащих препаратов на основе рецепторов).

Комплексообразующие вещества, если они присутствуют, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из:

- глицина и других хелатирующих аминокислот (например, метионин, цистеин и т.д.);

- краунэфиров и азотсодержащих краунэфиров;

- гетероциклических органических соединений, например, 1,10-фенантролин, 2,2′-бипиридин;

- каликсаренов;

- полидентатных хелатирующих агентов, например, белков, полисахаридов и полинуклеиновых кислот;

- природных хелатирующих агентов, например, катехинов, таннина, порфирина;

- в основном линейных или макроциклических хелатирующих агентов (например, подандов или криптандов).

Обычно используют микромолярные или, более предпочтительно, наномолярные количества комплексообразующего вещества, предпочтительно менее 100 наномолей, например в диапазоне 20-25 наномолей. Важно отметить, что комплексообразующие вещества, как объяснено выше, могут быть преимущественно использованы также в реакции комплексообразования, в которой используются другие буферы. Поэтому другим осуществлением настоящего изобретения является способ, включающий реакцию комплексообразования радиоактивных изотопов, в частности ⁶⁸Ga, в котором комплексообразующие вещества, определенные выше, добавляют в реакционный буфер. Предпочтительно реакцию комплексообразования осуществляют при pH 3-4,5, более предпочтительно 3,2-4,2, наиболее предпочтительно 3,4-4,0. Комплексы, полученные вышеописанным способом, также являются осуществлением настоящего изобретения, они могут включать муравьиную кислоту/формиат с содержанием менее 10 мг/мл и комплексообразующего вещества (если используется) менее 100 нмоль, поскольку указанный коммерческий генератор (состоящий из колонки смолы с сорбированным германием) элюируют элюентом, включающим кислоту (обычно HCl) непосредственно в виалу, содержащую формиатный буфер и основание. Молекулу, функционализированную хелатирующими группами (обычно в присутствии комплексообразующего вещества, как, например, фенантролина), добавляют в виалу, и реакционную виалу нагревают в течение короткого промежутка времени; конечный раствор собирают и проверяют HPLC с обращенной фазой и ITLC (MeOH/ацетат аммония 1 M 1/1). Порядок добавления также может быть обратным.

Например, коммерческий генератор может быть элюирован элюентом, содержащим кислоту (обычно HCl) непосредственно в виалу, содержащую молекулу, функционализированную хелатирующими группами (предпочтительно в присутствии комплексообразующего вещества, как, например, фенантролина). Формиатный буфер и основание добавляют в виалу и реакционную смесь нагревают в течение короткого промежутка времени. Кислый элюат обычно образован водным раствором сильной кислоты как, например, HCl, в то время как основание представляет собой водный раствор сильного основания, как, например, NaOH. В целом, использование формиатного буфера гарантирует подходящее значение pH, даже если происходит изменение кислотности элюата и таким образом уменьшается количество незакомплексованного Ga-68 из-за слишком низкого или слишком высокого pH, приводящего к высокому содержанию свободного ⁶⁸Ga³⁺ или гидроксидов ⁶⁸Ga соответственно. Кроме того, добавление комплексообразующего вещества, позволяет снизить количество молекул, функционализированных хелатирующими группами, необходимое для полного комплексообразования Ga-68.

Эти два аспекта позволили заявителю достичь подходящей степени комплексообразования, преимущественно по меньшей мере 92%, 95% и 97%, и, следовательно, достаточной чистоты (по меньшей мере, 92%, 95% и 97%) без какой-либо предварительной или конечной очистки. Так как полученные результаты подтверждают возможность прямого введения метки Ga-68, которое не требует обработки или очистки, рецептура может быть использована в производстве конкретного набора.

Поэтому в соответствии с конкретным осуществлением изобретение относится также к набору, включающему:

- силиконизированную виалу, содержащую молекулу с хелатирующими функциональными группами, и выбранное комплексообразующее вещество;

- силиконизированную виалу или шприц, содержащий подходящую ультрачистую смесь муравьиная кислота/формиат натрия.

Кроме того, изобретение также относится к отдельной виале, содержащей молекулу, функционализированную хелатирующими группами, выбранное комплексообразующее вещество и подходящую ультрачистую смесь муравьиная кислота/формиат натрия.

Пример 1

⁶⁸GaDOTAпептид, меченный 3 мл элюата, HCl 0,6 M

Коммерческий генератор с 30 мКи (поставляемый IDB), имеющий стационарную фазу SnO₂, элюируют 3 мл элюата, ультрачистой HCl 0,6 М, непосредственно в виалу, содержащую 200 мкл ультрачистого формиатного буфера 1,5 M и 400 мкл ультрачистого NaOH 4,5 M. Затем добавляют 30 мкг DOTA-пептида и 4,5 мкг 1,10-фенантролина и реакционную виалу нагревают при 95°C в течение 7 минут. Продукт проверяют HPLC с обращенной фазой и ITLC (MeOH/ацетат аммония 1 М. 1/1) и радиохимическая чистота составляет 98% в обоих анализах.

Пример 2

⁶⁸GaDOTAпептид, меченный 3,2 мл элюата, HCl 0,6 M

Коммерческий генератор с 30 мКи (поставляемый IDB), имеющий стационарную фазу SnO₂, элюируют 3,2 мл элюата, ультрачистой HCl 0,6 М, непосредственно в виалу, содержащую 200 мкл ультрачистого формиатного буфера 1,5 M и 400 мкл ультрачистого NaOH 4,5 M. Затем добавляют 30 мкг DOTA-пептида и 4,5 мкг 1,10-фенантролина и реакционную виалу нагревают при 95°C в течение 7 минут. Продукт проверяют HPLC с обращенной фазой и ITLC (MeOH/ацетат аммония 1 М. 1/1) и радиохимическая чистота составляет 97% в обоих анализах.

Пример 3:

⁶⁸GaDOTAпептид, меченный 3 мл элюата, HCl 0,6 M

Коммерческий генератор с 30 мКи (поставляемый IDB), имеющий стационарную фазу SnO₂, элюируют 3 мл элюата, ультрачистой HCl 0,6 М, непосредственно в виалу, содержащую 200 мкл ультрачистого формиатного буфера 1,5 M и 400 мкл ультрачистого NaOH 4,5 M. Затем добавляют 30 мкг DOTA-пептида и 15 мкг 12-краун-4 и реакционную виалу нагревают при 95°C в течение 7 минут. Продукт проверяют HPLC с обращенной фазой и ITLC (MeOH/ацетат аммония 1 М. 1/1) и радиохимическая чистота составляет 98% и 96% соответственно.

Пример 4:

⁶⁸GaDOTAпептид, меченный 3 мл элюата, HCl 0,6 M

Коммерческий генератор с 30 мКи (поставляемый IDB), имеющий стационарную фазу SnO₂, элюируют 3 мл элюата, ультрачистой HCl 0,6 М, непосредственно в виалу, содержащую 30 мкг DOTA-пептида и 15 мкг 12-краун-4. Затем добавляют 200 мкл ультрачистого формиатного буфера 1,5 M и 400 мкл ультрачистого NaOH 4,5 M и реакционную виалу нагревают при 95°C в течение 7 минут. Продукт проверяют HPLC с обращенной фазой и ITLC (MeOH/ацетат аммония 1 М. 1/1) и радиохимическая чистота составляет 98% и 96% соответственно.

Изобретение относится к способу получения комплексов ⁶⁸Ga. Способ включает реакцию комплексообразования между молекулой, функционализированной хелатирующими группами, и ⁶⁸Ga в буфере муравьиная кислота/водный раствор формиата при необходимости в присутствии соединения, способного связывать в комплексы катионы металлов. Соединение, способное связывать в комплексы катионы металлов, если его используют, добавляют в начале реакции комплексообразования. Также предложены реакционный набор и виала. Изобретение позволяет быстро и с высоким выходом получить комплексы ⁶⁸Ga. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 4 пр.

1. Способ получения комплексов ⁶⁸Ga, в котором реакцию комплексообразования между молекулой, функционализированной хелатирующими группами, и ⁶⁸Ga проводят в буфере муравьиная кислота/водный раствор формиата при необходимости в присутствии соединения, способного связывать в комплексы катионы металлов, причем соединение, способное связывать в комплексы катионы металлов, если его используют, добавляют в начале реакции комплексообразования.

2. Способ по п.1, в котором указанную молекулу, функционализированную хелатирующими группами, выбирают из DOTA и его производных, NOTA и его производных, РСТА и его производных, и указанный формиат является формиатом натрия.

3. Способ по п.1 или 2, в котором отношение муравьиная кислота/формиат в меченой смеси составляет 1-3,5.

4. Способ по п.1, в котором указанное соединение, способное связывать в комплексы катионы металлов, выбирают из группы, состоящей из: глицина и других хелатирующих аминокислот, краун-эфиров и азотсодержащих краун-эфиров, гетероциклического органического соединения, каликсаренов, полидентатного хелатирующего агента, природных хелатирующих агентов, например катехинов, таннина, порфирина, линейных или макроциклических хелатирующих агентов.

5. Способ по п.1, в котором реакцию комплексообразавания осуществляют в диапазоне рН 3-4,5.

6. Способ по п.5, в котором рН реакции составляет 3,2-4,2.

7. Способ по п.5, в котором рН реакции составляет 3,4-4,0.

8. Способ по любому из пп.1-7, в котором:
- коммерческий генератор ⁶⁸Ga элюируют элюатом, содержащим кислоту, непосредственно в виалу, содержащую буфер муравьиная кислота/водный раствор формиата и основание;
- молекулу, функционализированную хелатирующими группами, добавляют в виалу, и реакционную виалу нагревают в течение короткого промежутка времени;
- собирают продукт.

9. Способ по любому из пп.1-7, в котором:
- коммерческий генератор ⁶⁸Ga элюируют элюатом, содержащим кислоту, непосредственно в виалу, содержащую молекулу, функционализированную хелатирующими группами;
- буфер муравьиная кислота/водный раствор формиата и основание добавляют в виалу, и реакционную виалу нагревают в течение короткого промежутка времени;
- собирают продукт.

10. Способ по п.8 или 9, в котором элюат, содержащий кислоту, представляет собой водный раствор HCl, в то время как основание представляет собой водный раствор NaOH.

11. Реакционный набор для получения комплексов ⁶⁸Ga, включающий:
- виалу, содержащую молекулу, функционализированную хелатирующими группами, и соединение, способное связывать в комплексы катионы металлов;
- виалу или шприц, содержащий подходящую ультрачистую смесь муравьиная кислота/формиат натрия.

12. Реакционный набор по п.11, в котором указанная виала является силиконизированной виалой.

13. Виала, включающая молекулу, функционализированную хелатирующими группами, выбранное соединение, способное связывать в комплексы катионы металлов, и подходящую ультрачистую смесь муравьиная кислота/формиат натрия.

14. Виала по п.13, которая является силиконизированной виалой.