МИКРОВОЛНОВОЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСОВ, МЕЧЕННЫХ РАДИОАКТИВНЫМ ИЗОТОПОМ ГАЛЛИЯ Российский патент 2008 года по МПК G21G1/00 

Описание патента на изобретение RU2333557C2

Настоящее изобретение относится к способу получения комплексов, меченных радиоактивным изотопом галлия. Эти комплексы можно использовать в качестве диагностических средств, например для получения изображений с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ).

Получение изображений ПЭТ - это методика получения изображений с помощью ядерной томографии, в которой используют молекулы с радиоактивной меткой, испускающие позитроны. Когда позитрон встречает электрон, оба аннигилируют, и в результате высвобождается энергия в форме гамма-лучей, которые и детектируют сканеры ПЭТ. Используя природные вещества, которые играют в организме роль меченых молекул, ПЭТ не только дает информацию о структурах организма, но также информацию о физиологических функциях организма или определенных систем организма. Хорошо известная молекула-метка представляет собой, например, 2-фтор-2-деокси-D-глюкозу (ФДГ), которая подобна природной глюкозе, но имеет дополнительный атом 18F. Сканер ПЭТ детектирует гамма-излучение от этого атома фтора, и это дает информацию о метаболизме ФДГ в определенных областях или тканях организма, например в мозге или в сердце. Выбор молекулы-метки зависит от обследуемой области. В общем случае выбирают такую метку, которая аккумулируется в обследуемой области или избирательно поглощается определенным видом ткани, например раковыми клетками. В результате обследования получают либо серию динамических изображений, либо статическое изображение, получаемое после периода, в течение которого молекула с радиоактивной меткой участвует в исследуемом биохимическом процессе. Сканер определяет пространственное и временное распределение молекулы-метки. ПЭТ представляет собой также и количественный способ получения изображений, дающий возможность измерять местные концентрации молекул с радиоактивной меткой.

В качестве меток для ПЭТ обычно используют 11С, 18F, 15O, 13N или 76Br. Недавно были получены новые метки для ПЭТ на основе меченых радиоактивным изотопом комплексов металлов, включающих бифункциональный хелатобразующий агент и радиоактивный металл. Бифункциональные хелатобразующие агенты представляет собой хелатобразующие агенты, которые координируются с ионом металла и связаны с адресным переносчиком (targeting vector), который будет связываться с требуемым местом в организме пациента. Такой адресный переносчик может представлять собой пептид, который связывается с определенным рецептором, возможно связанным с определенным участком в организме или с определенным заболеванием. Адресный переносчик может представлять собой олигонуклеотид, специфичный, например, для активированного онкогена, и, следовательно, нацеленный на место локализации опухоли. Преимущество таких комплексов состоит в том, что бифункциональные хелатобразующие агенты можно метить различными радиоактивными металлами, например, 68Ga, 213Bi или 86Y. Таким образом, меченые радиоактивным изотопом комплексы с особыми свойствами могут быть "скроены" для конкретных приложений.

68Ga представляет особый интерес для получения меченых радиоактивным изотопом Ga комплексов металла, используемых в качестве меток для получения изображений с помощью ПЭТ. 68Ga получают при помощи генератора 68Ge/68Ga, а это означает, что циклотрон не нужен. 68Ga на 89% распадается с испусканием позитрона (2,92 МэВ), и его период полураспада (68 мин) достаточен для участия во многих биохимических процессах in vivo без нежелательной радиации. При степени окисления +III 68Ga образует стабильные комплексы с различными типами хелатобразующих агентов, и метки на основе 68Ga уже используют для получения изображений мозга, почек, костей, кровеносной системы, легких и опухолей.

Дж. Шумахер с соавторами [J.Schumacher et al., Canser res. 61, 2001, 3712-3717] описали синтез 68Ga-N,N'-[2-гидрокси-5-(этилен-β-карбокси)бензил]этилендиамин-N,N'-диуксусной кислоты (68Ga - HBED-CC). Полученный из генератора 68Ge/68Ga 68Ga и носитель Ga+3 взаимодействуют с хелатобразующим агентом HBED-CC в ацетатном буфере при 95°С в течение 15 минут. Не вошедший в состав комплекса 68Ga отделяют от комплекса при помощи катионообменной колонки. Сообщают, что общее время получения составляет 70 минут. Слишком долгое время получения меченого радиоактивным изотопом комплекса является недостатком этого способа. Вследствие добавления "холодного" носителя Ga+3 удельная активность реакции низка. Более того, меченные радиоактивным изотопом комплексы необходимо очищать после реакции их образования.

В WO-A-99/56791 описана реакция 68GaCl3, полученного из генератора 68Ge/68Ga, с тетрадентатным аминотритиолатным хелатобразующим агентом трис-(2-меркаптобензил)амином (S3N). Образование комплекса происходит при комнатной температуре в течение 10 минут. Недостаток описанного способа заключается в том, что меченый радиоактивным изотопом комплекс необходимо очищать при помощи жидкостной хроматографии перед тем, как использовать его для исследований in vivo. Другим недостатком способа является относительно длительное время реакции.

О. Угур с соавторами [O.Ugur et al., Nucl. Med. Biol. 29, 2002, 147-157] описали синтез меченого радиоактивным изотопом 68Ga аналога соматостатина - DOTA-DPhe1-Tyr3-октреотида (octreotide) (DOTATOC). Соединение получают взаимодействием 68GaCl3, полученного из генератора 68Ge/68Ga, с хелатобразующим агентом DOTATOC при 100°С в течение 15 минут. Недостаток этого способа заключается в том, что реакционную смесь необходимо нагревать до относительно высокой температуры. Хелатобразующий агент DOTA функционализирован пептидным адресным переносчиком, а пептиды и протеины, как известно, представляют собой вещества, чувствительные к нагреванию. Таким образом, при использовании описанного О. Угуром способа существует риск разложения чувствительных к нагреванию адресных переносчиков во время образования комплекса. Кроме того, недостаток описанного способа заключается в том, что комплекс необходимо очищать при помощи жидкостной хроматографии перед тем, как использовать его для исследований животных.

В US-A-5070346 описаны меченные радиоактивным изотопом 68Ga комплексы хелатобразующего агента тетраэтилциклогексил-бис-аминоэтантиола (ВАТ-ТЕСН). Комплексы синтезируют взаимодействием 68GaCl3, полученного из генератора 68Ge/68Ga, с ВАТ-ТЕСН при 75°С в течение 15 минут с последующим фильтрованием. Получение комплекса происходит в течение 40 минут. Из-за высокой температуры реакции этот способ не подойдет для бифункциональных хелатобразующих агентов, включающих чувствительный к нагреванию адресный переносчик, например пептид или протеин. Дополнительным недостатком этого способа является длительное время протекания реакции образования комплекса.

Вследствие относительно короткого периода полураспада 68Ga существует необходимость в быстром способе синтеза меченных радиоактивным 68Ga комплексов, которые можно использовать в качестве молекул-меток для получения изображений с помощью ПЭТ.

Было обнаружено, что использование активации микроволнами существенно улучшает эффективность и воспроизводимость образования комплекса 68Ga-хелатобразующий агент. Благодаря активации микроволнами время протекания химических реакций можно существенно сократить; т.е. реакция завершается в течение 2 и менее минут. Это является очевидным достижением, так как 10-минутное сокращение времени реакции сохраняет около 10% активности 68Ga. Более того, активация микроволнами также сокращает число побочных реакций и увеличивает радиохимический выход, что происходит вследствие повышенной селективности. Растворы радиоизотопов 66Ga3+, 67Ga3+ и 68Ga3+, которые получают в циклотроне или в генераторе, содержат так называемые псевдоносители, т.е. другие катионы металлов, например Fe3+, Al3+, Cu2+, Zn2+ и In3+. Так как все эти псевдоносители конкурируют с Ga3+ в реакции образования комплекса, то важно повысить селективность реакции внесения радиоактивной метки. Следовательно, активация микроволнами положительно влияет на внесение радиоактивных меток всеми изотопами Ga, а именно 66Ga, 67Ga и 68Ga.

Активацию микроволнами использовали в реакции нуклеофильного ароматического радиационного фторирования атомами 18F, и было обнаружено, что в этом случае при более коротком времени реакции получается сравнимый или более высокий выход, чем в случае термической обработки [S.Stone-Elander et al., Appi. Rad. Isotopes 44(5), 1993, 889-893]. Однако использование активации микроволнами для реакций внесения галлиевой радиоактивной метки еще не было описано.

Следовательно, в данном изобретении описан способ получения комплекса, меченного радиоактивным изотопом галлия, путем взаимодействия радиоизотопа Ga3+ с хелатобразующим агентом, отличающийся тем, что реакцию проводят с использованием активации микроволнами.

В соответствии с изобретением подходящими радиоизотопами Ga3+ являются 66Ga3+, 67Ga3+ и 68Ga3+, предпочтительно 68Ga3+ и 68Ga3+, и особенно предпочтительно 68Ga3+. 66Ga3+ и 68Ga3+ особенно подходят для синтеза меченых комплексов, пригодных для получения изображений с помощью ПЭТ, в то время как 67Са3+ особенно подходит для синтеза меченых комплексов, пригодных для использования в однопротонной эмиссионной компьютерной томографии (ОПЭКТ).

68Ga3+ можно получить в циклотроне путем облучения мишеней из элементарного цинка. Для того чтобы минимизировать количество образующегося 67Ga, толщину мишени необходимо поддерживать предпочтительно такой, чтобы энергия распавшегося протона составляла более 8 МэВ, а время облучения должно быть коротким, например менее 4 часов. Химическое разделение можно выполнить, используя методики экстракции растворитель-растворитель, применяя изопропиловый эфир и HCl, как описано в [L.C.Brown, Int. J. Appl. Radiat. lsot. 22, 1971, 710-713]. 68Ga имеет относительно длинный период полураспада - 9,5 часов, и наиболее вероятный из испускаемых позитронов имеет необычно высокую энергию - 4,2 МэВ.

67Ga3+ можно получить в циклотроне, а получаемый также в циклотроне 67GaCl3 доступен для приобретения. Период полураспада 67Ga составляет 78 часов.

68Ga можно получить в генераторе 68Ge/68Ga. Такие генераторы известны в данной области техники и описаны, например, в [C.Loc'h et al, J. Nucl. Med. 21, 1980, 171-173]. В общем случае 68Ge помещают в колонку, состоящую из органической смолы или неорганического оксида металла, например диоксида олова, оксида алюминия или диоксида титана. 68Ga элюируют из колонки водным раствором HCl и получают его в виде 68GaCl3. 67Ga3+ особенно предпочтителен в предлагаемом здесь способе, так как его можно получить без применения циклотрона, а его период полураспада (68 минут) достаточен для участия во многих биохимических процессах in vivo при получении изображений с помощью ПЭТ без длительного облучения.

Предпочтительные хелатобразующие агенты для использования в предлагаемом способе представляют собой такие агенты, которые содержат радиоактивные изотопы Ga3+ в физиологически приемлемой форме. Кроме того, предпочтительны также хелатобразующие агенты, которые образуют комплексы с радиоизотопами Ga3+, стабильные в течение времени, необходимого для диагностических исследований с использованием меченых комплексов.

Подходящие хелатобразующие агенты представляют собой, например, полиаминополикислотные хелатобразующие агенты, такие как DTPA, EDTA, DTPA-BMA, DOA3, DOTA, HP-DOA3, ТМТ или DPDP. Эти хелатобразующие агенты хорошо известны в качестве радиофармацевтических и радиодиагностических препаратов. Их использование и синтез описаны, например, в US-A-4647447, US-A-5362475, US-A-5534241, US-A-5358704, US-A-5198208, US-A-4963344, ЕР-А-230893, ЕР-А-130934, ЕР-А-606683, ЕР-А-438206, ЕР-А-434345, WO-A-97/00087, WO-A-96/40274, WO-A-96/30377, WO-A-96/28420, WO-A-96/16678, WO-A-96/11023, WO-A-95/32741, WO-A-95/27705, WO-A-95/26754, WO-A-95/28967, WO-A-95/28392, WO-A-95/24225, WO-A-95/17920, WO-A-95/15319, WO-A-95/09848, WO-A-94/27644, WO-A-94/22368, WO-A-94/08624, WO-A-93/16375, WO-A-93/06868, WO-A-92/11232, WO-A-92/09884, WO-A-92/08707, WO-A-91/15467, WO-A-91/10669, WO-A-91/10645, WO-A-91/07191, WO-A-91/05762, WO-A-90/12050, WO-A-90/03804, WO-A-89/00052, WO-A-89/00557, WO-A-8 8/01178, WO-A-86/02841 и WO-A-86/02005.

Подходящие хелатобразующие агенты включают макроциклические хелатобразующие агенты, например порфириноподобные молекулы и пентааза-макроциклы, как описано в [Zhang et al., Inorg. Chem. 37(5), 1998, 956-963], фталоцианины, краун-эфиры, например краун-эфиры с азотом, такие как сепульхраты (sepulchrates), криптаты и т.д., гемин (протопорфирин IX хлорид), гем и хелатобразующие агенты, имеющие квадратно-планарную симметрию.

В предлагаемом способе предпочтительно использовать макроциклические хелатобразующие агенты. В предпочтительном воплощении изобретения эти макроциклические хелатобразующие агенты включают по меньшей мере один атом сильного донора, такого как кислород и/или азот, как в полиаза- и полиоксомакроциклах. Предпочтительные примеры полиазамакроциклического хелатобразующего агента включают DOTA, TRITA, ТЕТА и НЕТА, причем DOTA особенно предпочтителен.

Особенно предпочтительные макроциклические хелатобразующие агенты включают функциональные группы, такие как карбоксигруппы или аминогруппы, которые не играют важной роли в координации Ga3+, а значит, их можно использовать для образования связей между хелатобразующими агентами и другими молекулами, например с адресными переносчиками. Примеры таких макроциклических хелатобразующих агентов, включающих функциональные группы, представляют собой DOTA, TRITA или НЕТА.

В следующем предпочтительном воплощении изобретения в предлагаемом способе используют бифункциональные хелатобразующие агенты. В контексте данного изобретения "бифункциональный хелатобразующий агент" означает хелатобразующий агент, связанный адресным переносчиком. Подходящие для используемых в предлагаемом способе бифункциональных хелатобразующих агентов адресные переносчики представляют собой химические или биологические фрагменты, которые связываются с требуемым местом в организме пациента, когда в организм вводят меченые радиоактивным изотопом галлия комплексы, включающие указанные адресные переносчики. Подходящие для используемых в предлагаемом способе бифункциональных хелатобразующих агентов адресные переносчики представляют собой протеины, гликопротеины, липопротеины, полипептиды, такие как антитела или фрагменты антител, гликополипептиды, липополипептиды, пептиды, такие как связывающие RGD пептиды, гликопептиды, липопептиды, углеводы, нуклеиновые кислоты, например ДНК и РНК, олигонуклеотиды, такие как антисмысловые олигонуклеотиды, или часть, фрагмент, производное или комплекс вышеперечисленных соединений или любых других подходящих химических соединений, таких как относительно маленькие органические молекулы, а особенно маленькие органические молекулы массой менее 2000 дальтон.

В особенно предпочтительном воплощении изобретения в предлагаемом способе используют макроциклические бифункциональные хелатобразующие агенты. Предпочтительные макроциклические бифункциональные хелатобразующие агенты включают DOTA, TRITA или НЕТА, связанные с адресным переносчиком, предпочтительно с адресным переносчиком, выбранным из группы, состоящей из протеинов, гликопротеинов, липопротеинов, полипептидов, гликополипептидов, липополипептидов, пептидов, гликопептидов, липопептидов, углеводов, нуклеиновых кислот, олигонуклеотидов, или части, фрагмента, производного или комплекса вышеперечисленных соединений и малых органических молекул; особенно предпочтительно с адресным переносчиком, выбранным из группы, состоящей из пептидов и олигонуклеотидов.

Адресный переносчик может быть связан с хелатобразующим агентом посредством связующей группы или посредством молекулы-спейсера (spacer molecule). Примеры связующих групп представляют собой дисульфиды, сложные эфиры или амиды, примеры молекул-спейсеров представляют собой цепочкообразные молекулы, например лизин или гексиламин, или короткие спейсеры на основе пептидов. В предпочтительном воплощении изобретения связь между адресным переносчиком и хелатобразующей частью меченого радиоактивным изотопом галлия комплекса такова, что адресный переносчик может взаимодействовать с мишенью в организме, и при этом присутствие меченого изотопом галлия комплекса не блокирует его и не создает пространственных помех.

Предлагаемую активацию микроволнами можно подходящим образом выполнять путем использования микроволновой печи, предпочтительно путем использования мономодальной микроволновой печи. Соответствующую микроволновую активацию проводят при 80-120 Вт, предпочтительно при 90-110 Вт, а особенно предпочтительно приблизительно при 100 Вт. Соответствующий интервал времени активации микроволнами составляет от 20 с до 2 мин, предпочтительно от 30 с до 90 с, а особенно предпочтительно от 45 с до 60 с.

Контролировать температуру реакции целесообразно тогда, когда в предлагаемом способе используют чувствительные к температуре хелатобразующие агенты, например бифункциональные хелатобразующие агенты, включающие пептиды или протеины в качестве адресных переносчиков. Продолжительность микроволновой активации следует регулировать таким образом, чтобы температура реакционной смеси не достигала значений, при которых разлагаются хелатобразующий агент и/или адресный переносчик. Если используемые в предлагаемом способе хелатобразующие агенты включают пептиды или протеины, то, как правило, больше подходят более высокие температуры в течение более короткого времени, чем более низкие температуры в течение более длительного периода времени.

Активацию микроволнами можно проводить непрерывно или в виде нескольких циклов во время протекания реакции.

В предпочтительном воплощении изобретение обеспечивает способ получения меченой радиоактивным изотопом 68Ga метки для создания изображений при помощи ПЭТ путем взаимодействия 68Ga3+ с макроциклическим бифункциональным хелатобразующим агентом, включающим атомы сильных доноров, отличающийся тем, что реакцию проводят с использованием микроволновой активации.

В особенно предпочтительном воплощении описанного в предыдущем абзаце способа микроволновую активацию проводят от 30 с до 90 с при 110 Вт.

Если в предлагаемом по изобретению способе используют 68Ga3+, то предпочтительно получать его путем взаимодействия элюата из генератора 68Ge/68Ga с анионитом, где 68Ga3+ элюируют из указанного анионита. В предпочтительном воплощении изобретения анионит представляет собой анионит, включающий НСО3- в качестве противоионов.

Использование анионитов для обработки элюата 68Ga, полученного из генератора 68Ge/68Ga, описано в [J.Schuhmacher et al., Int. J.appl. Radiat. lsotopes 32, 1981, 31-36]. Для обработки полученного из генератора 68Ge/68Ga элюата 4,5 Н HCl 68Ga с целью уменьшения присутствующего в элюате 68Ge использовали анионит Bio-Rad AG 1×8.

Было обнаружено, что использование анионитов, включающих НСО3- в качестве противоионов, особенно подходит для очистки и концентрации исходящего из генератора элюата. Можно уменьшить не только количество присутствующего в элюате 68Ge, но и количество так называемых псевдоносителей, т.е. катионов других металлов, например Fe3+, Al3+, Cu2+, Zn2+ и In3+, которые элюируются из генератора вместе с 68Ga3+. Так как эти псевдоносители конкурируют с 68Ga3+ в последующей реакции образования комплекса, то особенно важно уменьшить количество этих катионов настолько, насколько это возможно, до реакции введения радиоактивной метки. Дополнительным преимуществом стадии анионообменной очистки является то, что концентрацию 68Ga3+, которая после элюирования находится в интервале от пикомолярной до наномолярной, можно повысить до наномолярного-микромолярного уровня. Следовательно, можно существенно уменьшить количество хелатобразующего агента в последующей реакции образования комплекса, что значительно повышает удельную радиоактивность. Этот результат важен для получения меченых радиоактивным изотопом 68Ga меток для ПЭТ, которые включают бифункциональный хелатобразующий агент; т.е. хелатобразующий агент, связанный с адресным переносчиком, так как повышение удельной радиоактивности дает возможность уменьшить количество таких меток, вводимых в организм пациента.

Следовательно, другим предпочтительным воплощением предлагаемого в изобретении способа является способ получения меченного радиоактивным изотопом 68Ga комплекса путем взаимодействия 68Ga3+ с хелатобразующим агентом с активацией микроволнами, в котором 68Ga3+ получают путем приведения в контакт злюата из генератора 68Ge/68Ga с анионитом, предпочтительно с анионитом, включающим НСО3- в качестве противоионов, и элюирования 68Ga3+ из указанного анионита.

Генераторы 68Ge/68Ga известны в данной области техники, см., например [C.Loc'h et al., J.Nucl. Med. 21, 1980, 171-173] или [J.Schuhmacher et al., Int. J.appl. Radiat. Isotopes 32, 1981, 31-36]. 68Ge можно получить в циклотроне при облучении, например, Ga2(SO4)3 протонами с энергией 20 МэВ. Он также имеется в продаже, например, в виде 68Ge в 0,5 М HCl. В общем случае 68Ge подают в колонку, состоящую из органической смолы или неорганического оксида металла, такого как диоксид олова, оксид алюминия или диоксид титана. 68Ga элюируют из колонки водным раствором HCl, при этом получают 68GaCl3.

Подходящие для роли генератора 68Ge/68Ga колонки состоят из неорганических оксидов, таких как оксид алюминия, диоксид титана или диоксид олова, или из органических смол, таких как смолы, включающие фенольные гидроксильные группы (US-A-4264468) или пирогаллол [J.Schuhmacher et al., Int. J.appl. Radiat Isotopes 32, 1981, 31-36]. В предпочтительном воплощении предлагаемого способа используют генератор 68Ge/68Ga, включающий колонку, включающую диоксид титана.

Концентрация водного раствора HCl, используемого для элюирования 68Ga из колонки-генератора 68Ge/68Ga, зависит от материала колонки. Удобно использовать для элюирования 68Ga 0,05-5 М HCl. В предпочтительном воплощении изобретения элюат получают из генератора 68Ge/68Ga, включающего колонку, включающую диоксид титана, и элюируют 68Ga при помощи 0,05-0,1 М HCl, предпочтительно приблизительно 0,1 М HCl.

В предпочтительном воплощении предлагаемого способа используют сильный анионит, включающий НСО3- в качестве противоионов, предпочтительно сильный анионит, включающий НСО3- в качестве противоионов. В дополнительном предпочтительном воплощении изобретения этот анионит включает функциональные группы четвертичного амина. В другом дополнительном предпочтительном воплощении изобретения, этот анионит представляет собой сильную анионообменную смолу на основе полистирола-дивинилбензола. В особенно предпочтительном воплощении изобретения используемый в предлагаемом способе анионит представляет собой сильную анионообменную смолу, включающую НСО3- в качестве противоионов, функциональные группы четвертичного амина и смолу на основе полистирола-дивинилбензола.

В предлагаемом способе для элиюрования 68Ga из анионита можно использовать воду.

Примеры

Пример 1

Сравнение внесения радиоактивной метки изотопом 68Ga в DOTA-D-Phe1-Tyr3 - октреотид (DOTA-TOC) при использовании традиционного нагревания и активации микроволнами.

1а) Внесение радиоактивной метки изотопом 68Ga в DOTA-TOC при использовании традиционного нагревания

К элюату из генератора 68Ge/68Ga добавляли ацетат натрия (36 мг на 1 мл), чтобы довести рН элюата до примерно 5,5; смесь хорошо перемешивали. К реакционной смеси добавляли DOTA-TOC (20 нмоль) и нагревали ее при 96°С в течение 25 мин. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и подавали в колонку из твердого полимерного электролита С-18 (С-18 SPE-column) (HyperSEP S C18), которую затем промывали 2 мл Н2О, и элюировали продукт смесью этанол-вода 50:50 (1 мл).

Реакционную смесь и продукт анализировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя гелевые фильтрационные колонки Vydac RP и Fast Desalting HR 10/10 FPLC.

Аналитический радиохимический выход составил 67%.

Изолированный радиохимический выход составил 34%.

Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (МС-ИЭР) была выполнена на платформе Fisons (Micromass, Manchester, UK) с использованием позитивного режима получения данных и регистрации [М+2Н]2+. DOTATOC регистрировали при m/z=711,26, а аутентичный Ga-DOTATOC регистрировали при m/z=746,0 (по расчетам m/z=746,5).

1б) Внесение радиоактивной метки изотопом 68Ga в DOTA-TOC при использовании активации микроволнами

Реакционную смесь готовили точно так же, как описано в примере 1а), и переносили в пробирку из стекла Pyrex для активации микроволнами в течение 1 мин при 100 Вт. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и помещали в колонку из твердого полимерного электролита С-18 (HyperSEP S С18), которую затем промывали 2 мл Н2О, и элюировали продукт смесью этанол-вода 50:50 (1 мл).

Реакционную смесь и продукт анализировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя гелевые фильтрационные колонки Vydac RP и Fast Desalting MR 10/10 FPLC.

Аналитический радиохимический выход составил более 98%.

Изолированный радиохимический выход составил 70%.

Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (МС-ИЭР) была выполнена на платформе Fisons (Micromass, Manchester, UK) с использованием позитивного режима получения данных и регистрации [М+2Н]2+. DOTATOC регистрировали при m/z=711,26, а аутентичный Ga-DOTATOC регистрировали при m/z=746,0 (по расчетам m/z=746,5).

1в) результаты сравнения

В случае активации микроволнами количество радиоактивного вещества и удельная активность продукта увеличились на 21%. Изолированный радиохимический выход увеличился в 2 раза по сравнению с результатами, полученными для традиционного нагревания. Так как радиохимический выход реакционной смеси в случае активации микроволнами был более 98%, то в дальнейшей очистке не было необходимости, и для применения in vivo была использована неочищенная реакционная смесь.

Пример 2

Внесение радиоактивной метки изотопом 68Ga в DOTA, связанный с олигонуклеотидами

На первой стадии с DOTA связывали четыре различных антисмысловых олигонуклеотида, специфичных к активированному K-ras онкогену человека:

- 17-мерный фосфодиэфирный олигонуклеотид со связующим гексиламином на 5'-конце;

- 17-мерный фосфодиэфирный олигонуклеотид со связующим гексиламином на 3'-конце;

- 17-мерный фосфоротиоатный олигонуклеотид со связующим гексиламином на 5'-конце;

- 2'-O-метил фосфодиэфир со связующим гексиламином на 5'-конце.

2а) Конъюгация DOTA с олигонуклеотидами

К раствору EDC (13 мг, 68 μмоль) в H2O (250 μл) добавляли DOTA (32 мг, 66 μмоль) и сульфо-NHS (14 мг, 65 μмоль) в H2O (250 μл), перемешивали на льду в течение 30 минут, а затем нагревали до комнатной температуры для получения DOTA-сульфо-NHS. К раствору олигонуклеотида (70-450 nмоль) в 1М карбонатном буфере (рН=9) добавляли по каплям 100-кратный избыток раствора DOTA-NHS, а затем охлаждали на льду. Смесь оставляли при комнатной температуре на 10 часов. Сначала реакционную смесь очищали гель-фильтрацией в колонках NAP 5, элюировали водой и к 1 мл получившегося элюата добавляли 100 мкл 1М ТЕАА (триэтиламмонийацетатного буфера). Затем получившийся элюат подавали в колонку из твердого полимерного электролита С-18 (Supeico), и промывали колонку 50 мМ ТЕАА (5 мл), 50 мМ раствором ТЕАА, содержащим 5% ацетонитрила (3 мл), и элюировали DOTA-олигонуклеотид смесью вода-ацетонитрил 50:50 (1 мл). Фракцию вода-ацетонитрил сушили, используя вакуумную центрифугу. Продукты анализировали при помощи масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Анализ в негативном режиме после прямого введения дал следующие результаты: 1. DOTA-фосфодиэфир: МС (И-ЭР) m/z: 662,27 [М-8Н]8-; 756,36 [М-7Н]7-; 882,91 [М-6Н]6-. Воспроизведение данных дало М=5303,71; 2. DOTA-фосфоротиоат: МС (И-ЭР) m/z: 656,58 [М-8Н]9-; 738,56 (М-7Н]8-. Воспроизведение данных дало М=5917,35; 3. DOTA-2'-O-метилфосфодиэфир: МС (И-ЭР) m/z: 674,02 [М-6Н]9-; 770,19 [М-8Н]8-; 885,00 [М-7Н]7-. Воспроизведение данных дало М=6148,84.

2б) Внесение радиоактивной метки изотопом 68Ga

К элюату из генератора 68Ge/68Ga добавляли ацетат натрия (36 мг на 1 мл), чтобы довести рН элюата до примерно 5,5; смесь хорошо перемешивали. К смеси добавляли DOTA-олигонуклеотид (10-100 нмоль) и переносили ее в пробирку из стекла Pyrex для активации микроволнами в течение 1 мин при 100 Вт. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, а затем добавляли 1 мл 150 мМ ТЕАА в Н2O. Смесь помещали в колонку из твердого полимерного электролита С-18 (Supelco), которую затем промывали 50 мМ ТЕАА (1 мл), 50 мМ ТЕАА, содержащего 5% ацетонитрила (1 мл). Продукт элюировали смесью этанол-вода 50:50 (1 мл) или вода-ацетонитрил 50:50 (1 мл). Реакционную смесь анализировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя гелевые фильтрационные колонки Vydac RP и Fast Desalting HR 10/10 FPLC. Аналитический радиохимический выход находился в интервале от 50% до 70%, изолированный радиохимический выход находился в интервале от 30% до 52%. Большие количества более сильных элюентов могут повысить изолированный радиохимический выход.

Пример 3

Внесение радиоактивной метки изотопом 68Ga в DOTA, связанный с пептидами

На первой стадии с DOTA связывали четыре различных пептида:

- вазоактивный кишечный пептид (VIP); 28 аминокислотных остатков;

- Y-фрагмент нейропептида 18-36 (NPY); 19 аминокислотных остатков;

- фрагмент панкреастатина 37-52 (Р); 16 аминокислотных остатков; и

- ангиотензин II (А); 8 аминокислотных остатков.

3а) Конъюгация DOTA с пептидами

Конъюгацию осуществляли так же, как описано в 2а), но использовали пептиды (0,5-3 μмоль) вместо олигонуклеотидов.

Реакционные смеси и продукты анализировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя гелевые фильтрационные колонки Vydac RP и Fast Desalting HR 10/10 FPLC.

Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (МС-ИЭР) была выполнена на платформе Fisons (Micromass, Manchester, UK) с использованием позитивного режима получения данных и регистрации [M+2H]2+, [М+4Н]4+ и [М+6Н]5+.

VIP регистрировали при m/z=832,07 [М+4Н]4+. (DOTA)2-VIP регистрировали при m/z=1025,00 [М+4Н]4+. (DOTA)3-VIP регистрировали при m/z=1122,0 [М+4H]4+. (DOTA)4-VIP регистрировали при m/z=1218,00 [М+4Н]4+. NPY регистрировали при m/z=819,31 [М+3Н]3+. DOTA-NPY регистрировали при m/z=948,18 [М+3Н]3+. Р регистрировали при m/z=909,55 [M+2H]2+. DOTA-P регистрировали при m/z=1103,02 [М+2Н]2+. А регистрировали при m/z=524,1 [М+2H]2+, a DOTA-A регистрировали при m/z=717,20 [М+2H]2+.

3б) Внесение радиоактивной метки изотопом 68Ga

Внесение радиоактивной метки изотопом 68Ga осуществляли так же, как описано в 2б), используя DOTA-пептиды в количестве 10-20 нмоль.

Реакционную смесь анализировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя гелевые фильтрационные колонки Vydac RP и Fast Desalting HR 10/10 FPLC. Аналитический радиохимический выход находился в интервале от 80% до 90%, изолированный радиохимический выход находился в интервале от 60% до 70%. Большие количества более сильных элюентов могут повысить изолированный радиохимический выход.

Похожие патенты RU2333557C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАЛЛИЯ-68, ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ, А ТАКЖЕ УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ УКАЗАННОГО СПОСОБА 2004
  • Великиан Ирина
  • Лангстром Бенгт
  • Бейер Герд Й.
RU2343965C2
Способ получения комплексов на основе изотопа галлий-68 2020
  • Кондратенко Юлия Андреевна
  • Антуганов Дмитрий Олегович
  • Кочина Татьяна Александровна
RU2760273C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВНОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ ДЛЯ СИНТЕЗА ПРЕПАРАТОВ ГАЛЛИЯ-68 2013
  • Ларенков Антон Алексеевич
  • Брускин Александр Борисович
  • Кодина Галина Евгеньевна
RU2522892C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСОВ Ga 2012
  • Фугацца Лоренца
  • Филаннино Мариа Аццурра
  • Марьяни Маурицио Франко
RU2605090C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСОВ Ga 2012
  • Фугацца Лоренца
  • Филаннино Мариа Аццурра
  • Марьяни Маурицио Франко
RU2779132C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРОВ Ga ВЫСОКОЙ ЧИСТОТЫ 2011
  • Ларенков Антон Алексеевич
  • Брускин Александр Борисович
  • Кодина Галина Евгеньевна
RU2464043C1
ОКТАПЕПТИД ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ, РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ СОМАТОСТАТИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ 2011
  • Назаренко Анна Борисовна
  • Рабинович Эдуард Зиновьевич
  • Овчинников Михаил Владимирович
  • Кодина Галина Евгеньевна
  • Брусникин Александр Борисович
RU2457215C1
Радиофармацевтический препарат для диагностики рака предстательной железы методом позитронной эмиссионной томографии и способ его получения 2022
  • Орлова Анна Марковна
  • Толмачев Владимир Максимилианович
  • Тимофеев Василий Владимирович
  • Рыжкова Дарья Викторовна
  • Абузайед Айман Тарек Мохамед
  • Ринне Сара Софи
  • Розенстрём Ульрика Хелена
  • Лунмарк Фанни Кристин
RU2796106C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ МЕТАЛЛ-ПОЛИМЕРНЫХ КОМПЛЕКСОВ РАДИОИЗОТОПА ГАЛЛИЯ-68 2015
  • Гаврилова Ирина Иосифовна
  • Назарова Ольга Владимировна
  • Панарин Евгений Федорович
  • Красиков Валерий Дмитриевич
  • Буров Сергей Владимирович
  • Горшков Николай Иванович
  • Шатик Сергей Васильевич
  • Токарев Александр Владимирович
  • Челушкин Павел Сергеевич
RU2588144C1
НАБОР ДЛЯ МЕЧЕНИЯ РАДИОАКТИВНЫМИ ИЗОТОПАМИ 2015
  • Воутерс Людовик
  • Кайсен Жоффруа
  • Люксан Андрэ
  • Леонард Марк
  • Вокшия Сэмюэл
RU2724894C2

Реферат патента 2008 года МИКРОВОЛНОВОЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСОВ, МЕЧЕННЫХ РАДИОАКТИВНЫМ ИЗОТОПОМ ГАЛЛИЯ

Изобретение относится к способу получения комплексов, меченных радиоактивным изотопом галлия. Эти комплексы можно использовать в качестве диагностических средств, например для получения изображений с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ). Способ получения меченного радиоактивным изотопом галлия комплекса состоит в обеспечении реакции взаимодействия радиоактивного изотопа 68Ga3+ с хелатобразующим агентом с использованием активации микроволнами. Изобретение позволяет повысить эффективность и воспроизводимость образования комплекса 68Ga-хелатобразующий агент. 14 з.п. ф-лы.

Формула изобретения RU 2 333 557 C2

1. Способ получения меченного радиоактивным изотопом галлия комплекса путем взаимодействия радиоактивного изотопа Ga3+ с хелатобразующим агентом, отличающийся тем, что реакцию проводят с использованием активации микроволнами.2. Способ по п.1, где радиоактивный изотоп Ga3+ выбирают из группы, состоящей из 66Ga3+, 67Ga3+ и 68Ga3+.3. Способ по п.2, где радиоактивный изотоп Ga3+ представляет собой 38Ga3+.4. Способ по п.1, где хелатобразующий агент представляет собой макроциклический хелатобразующий агент.5. Способ по п.1, где хелатобразующий агент включает атомы сильных доноров, предпочтительно атомы О и N.6. Способ по п.1, где хелатобразующий агент представляет собой бифункциональный хелатобразующий агент.7. Способ по п.1, где хелатобразующий агент представляет собой бифункциональный хелатобразующий агент, включающий адресный переносчик, выбранный из группы, состоящей из протеинов, гликопротеинов, липопротеинов, полипептидов, гликополипептидов, липополипептидов, пептидов, гликопептидов, липопептидов, углеводов, нуклеиновых кислот, олигонуклеотидов или части, фрагмента, производного или комплекса вышеперечисленных соединений и малых органических молекул.8. Способ по п.7, где адресный переносчик представляет собой пептид или олигонуклеотид.9. Способ по п.1, где активацию микроволнами проводят при 80-120 Вт, предпочтительно при 90-110 Вт.10. Способ по п.1, где активацию микроволнами проводят в течение от 20 с до 2 мин, предпочтительно от 30 до 90 с.11. Способ по п.3, где 68Ga3+ получают путем приведения в контакт элюата из генератора 68Ge/68Ga с анионитом и элюирования 68Ga3+ из указанного анионита.12. Способ по п.11, где генератор 68Ge/68Ga включает колонку, включающую диоксид титана.13. Способ по п.11, где анионит включает НСО3- в качестве противоионов.14. Способ по п.11, где анионит представляет собой сильный анионит.15. Способ по пп.6-14 для получения меток ПЭТ, меченных радиоактивным изотопом 68Ga.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2008 года RU2333557C2

РАДИОАКТИВНЫЙ ИММУНОРЕАГЕНТ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ, КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОБРАЖЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО НОВООБРАЗОВАНИЯ В ОРГАНИЗМЕ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОБРАЖЕНИЯ И КОМПЛЕКСООБРАЗУЮЩИЙ АГЕНТ 1992
  • Джон Л.Тоунер
  • Дэвид А.Хилборн
  • Брюс Дж.Мюррей
  • Тимоти З.Хауссейн
  • Роберт А.Сноу
  • Асис К.Саха
  • Ричард Филион
  • Клайд В.Ширман
  • Чандра Шах
RU2122431C1
МЕЧЕНЫЕ РАДИОАКТИВНЫМ ИЗОТОПОМ ПЕПТИДЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ 1996
  • Дин Ричард Т.
  • Пирсон Дэниел Э.
  • Листер-Джеймс Джон
  • Сивителло Эдгар Р.
RU2171117C2
WO 9533757 A1, 14.12.1995
WO 9956791 A1, 11.11.1999.

RU 2 333 557 C2

Авторы

Великиан Ирина

Лангстром Бенгт

Даты

2008-09-10Публикация

2004-04-08Подача