ПОВЫШЕНИЕ ИММУННОГО ОТКЛИКА У ВИДОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2017 года по МПК A61K39/102 A61K39/39 A61K47/48 A61K9/127 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение касается метода иммунной активации у особи вида крупного рогатого скота. В частности, настоящее изобретение включает методы вызова системного, неспецифического и антигенспецифического иммунных откликов, являющихся полезными для применения у животных и защиты против инфекционного заболевания.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Крупный рогатый скот является главной мишенью для многих типов вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций. Современные производственные факторы, такие как отъем, перевозка скота, плохая погода и пищевые потребности в мясном и молочном производстве также могут служить факторами риска, которые повышают частоту заболевания. Респираторное заболевание крупного рогатого скота (РЗ КРС), или комплекс респираторных заболеваний КРС, как его часто называют, встречается как у молочного, так и у мясного скота, и является одной из основных причин экономических убытков скотоводства во всем мире. Эти убытки возникают из-за заболеваемости, падежа, снижения привеса, затрат на лечение и предотвращение потери в производстве молока и отрицательное влияние на характеристики туши.

Считается, что патогенез РЗ КРС возникает из ряда стрессовых факторов среды и физиологии, упомянутых выше, в сочетании с возбудителями инфекций. Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, Pasteurella multocida и Histophilus somni (раньше Haemophilus somnus) считаются частью нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей КРС. Наоборот, нижние дыхательные пути являются относительно стерильной средой, которая поддерживается многими иммунологическими реакциями, имеющими целью предотвращение проникновения микроорганизмов. Если скот подвергается стрессовым факторам среды и физиологии, врожденная и приобретенная иммунные функции животного нарушаются, тем самым позволяя вышеупомянутым микроорганизмам размножаться и впоследствии заселять нижние дыхательные пути. Известно, что различные вирусы КРС оказывают иммунодепрессивное влияние в легких, например вирус инфекционного ринотрахеита КРС (infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV, IBR или BHV 1), вирус диареи КРС (bovine viral diarrhea virus, BVDV), респираторно-синцитиальный вирус КРС (bovine respiratory syncytial virus, BRSV) и вирус парагриппа типа 3 (parainfluenza type 3 virus, PI3). Однако Mannheimia haemolytica является намного более распространенным бактериальным патогеном среди случаев РЗ КРС.

Текущее предотвращение и лечение РЗ КРС состоит из введения антибиотиков стаду скота по прибытии на места откорма (то есть метафилактика), лечение антибиотиками больного скота и прививка против вирусов РЗ КРС и бактерий, включая М. haemolytica.

Есть различные причины того, что текущие программы прививки и фармакотерапия на сегодняшний день не являются оптимальными для контроля РЗ КРС у скота. Во-первых, защитная система организма играет главную роль в борьбе с инфекционным заболеванием у скота. Общепринятые способы лечения включают введение антибиотиков для лечения или контроля бактериальных инфекций. Однако нет в наличии утвержденных способов фармакотерапии вирусных инфекций. При РЗ КРС, в большинстве случаев, есть не только бактериальная инфекция, но и вирусная инфекция. Во-вторых, расписание прививок часто недостаточно оптимально. Для того чтобы респираторная вакцина была оптимально эффективной, препарат следует вводить за 2-4 недели до стресса или перевозки, что обычно неосуществимо в промышленном скотоводстве. Вакцины вводятся слишком рано или слишком поздно, чтобы быть оптимально эффективными.

Поэтому существует потребность в методе стимуляции иммунной системы и построения наступательного отклика для уменьшения или уничтожения болезнетворных организмов. Важно, чтобы этот метод являлся легким для введения, работал самостоятельно или в сочетании с вакцинами или добавками для повышения эффективности таких вакцин, имел продолжительное действие или не требовал дополнительных инъекций для повышения иммунитета. Настоящее изобретение предоставляет метод вызова неантигенспецифического иммунного отклика у видов крупного рогатого скота, который легок для введения, работает самостоятельно или в сочетании с вакцинами, вызывает защитный отклик против одного или больше возбудителей инфекций.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг.1.1 графически изображены данные по средней ректальной температуре соответственно дозе иммуномодулятора, введенного, как описано в Примере 1.

На Фиг.1.2 графически изображены данные по суточному привесу соответственно дозе иммуномодулятора, введенного, как описано в Примере 1.

На Фиг.1.3 графически изображены показатели поражения легких с поправкой на модель относительно дозы иммуномодулятора, введенного, как описано в Примере 1.

На Фиг.2.1 графически изображены данные по средней ректальной температуре соответственно дозе иммуномодулятора, введенного, как описано в Примере 2.

На Фиг.2.2 графически изображены данные по суточному привесу соответственно дозе иммуномодулятора, введенного, как описано в Примере 2.

На Фиг.2.3 графически изображены показатели поражения легких с поправкой на модель относительно дозы иммуномодулятора, введенного, как описано в Примере 2.

На Фиг.3.1 графически изображены показатели поражения легких с поправкой на модель относительно дозы иммуномодулятора, введенного, как описано в Примере 3.

На Фиг.3.2 графически изображены показатели поражения легких с поправкой на модель относительно дня введения иммуномодулятора, как описано в Примере 3.

На Фиг.4.1 графически изображен процент защищенных животных по опытным группам, как описано в Примере 4.

На Фиг.4.2 графически изображен процент защищенных животных по опытным группам (<1% поражений легких и без поражений легких), как описано в Примере 4.

На Фиг.5.1 графически изображены измерения индекса экспрессии CD 25 EI (ось y) в клетках, инфицированных BHV-1, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.2 графически изображены измерения индекса экспрессии CD 25 EI (ось y) в клетках, инфицированных BRSV, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.3 графически изображены измерения индекса экспрессии CD 25 EI (ось y) в клетках, инфицированных BVDV типа 1, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.4 графически изображены измерения индекса экспрессии CD 25 EI (ось y) в клетках, инфицированных BVDV типа 2, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.5 графически изображены измерения индекса экспрессии IFNy (ось y) в клетках, инфицированных BHV-1, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.6 графически изображены измерения индекса экспрессии IFNy (ось y) в клетках, инфицированных BRSV, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.7 графически изображены измерения индекса экспрессии IFNy (ось y) в клетках, инфицированных BVDV типа 1, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.8 графически изображены измерения индекса экспрессии IFNy (ось y) в клетках, инфицированных BVDV типа 2, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.9 графически изображены измерения индекса экспрессии IL-4 (ось y) в клетках, инфицированных BHV-1, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.10 графически изображены измерения индекса экспрессии IL-4 (ось y) в клетках, инфицированных BRSV, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.11 графически изображены измерения индекса экспрессии IL-4 (ось y) в клетках, инфицированных BVDV типа 1, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.12 графически изображены измерения индекса экспрессии IL-4 (ось y) в клетках, инфицированных BVDV типа 2, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.13 графически изображены оценки титра антител сыворотки с поправкой на модель (ось y) в клетках, инфицированных BVDV типа 1, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.14 графически изображены оценки титра антител сыворотки с поправкой на модель (ось y) в клетках, инфицированных BVDV типа 2, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.15 графически изображены оценки титра антител сыворотки с поправкой на модель (ось y) в клетках, инфицированных BHV-1, по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x), как описано в Примере 5.

На Фиг.5.16 графически изображены итоги среднесуточного привеса с поправкой на модель, как описано в Примере 5.

На Фиг.6.1 графически изображены титры BHV1 у РСН для опытных групп, как описано в Примере 6.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Метод вызова иммунного отклика у особи вида крупного рогатого скота согласно настоящему изобретению включает введение до особи вида крупного рогатого скота эффективного количества иммуномодулирующей композиции для вызова иммунного отклику. Имммуномодулирующая композиция включает липосомное средство доставки и по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты. Кроме того, иммуномодулятор вызывает неантигенспецифический иммунный отклик, который эффективен сам по себе, или улучшает действие по меньшей мере одного биологического агента, такого как вакцина, при введении перед такой вакциной, введении вместе с такой вакциной, введении после вакцинации или смешивании с вакциной.

Методы предоставляют новые стратегии лечения для защиты видов КРС от инфекционных заболеваний и лечение популяций, имеющих инфекционное заболевание. Наконец, метод согласно настоящему изобретению предоставляет более быструю, продолжительную и лучшую защиту против заболевания, если иммуномодулятор применяется в комбинации с вакциной.

1. Композиция

а. Иммуномодулятор

В одном из вариантов реализации изобретения иммуномодулирующая композиция включает липосомное средство доставки и по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в патенте США №6693086 и включено сюда по ссылке.

Подходящее липосомное средство доставки включает липидную композицию, способную доставлять молекулы нуклеиновой кислоты в ткани субъекта, который лечится. Липосомное средство доставки предпочтительно способно оставаться стабильным в субъекте в течение времени, достаточного для доставки молекулы нуклеиновой кислоты и/или биологического агента. В одном варианте реализации липосомное средство доставки стабильно в субъекте-реципиенте по меньшей мере в течение около 5 минут. В другом варианте реализации липосомное средство доставки стабильно в субъекте-реципиенте по меньшей мере в течение около 1 часа. В еще одном варианте реализации липосомное средство доставки стабильно в субъекте-реципиенте по меньшей мере в течение около 24 часов.

Липосомное средство доставки согласно настоящему изобретению включает липидную композицию, способную сливаться с плазматической мембраной клетки для доставки молекулы нуклеиновой кислоты в клетку. В одном варианте реализации при доставке комплекса нуклеиновая кислота:липосома согласно настоящему изобретению есть по меньшей мере около 1 пикограмма (пг) белка, выраженного на миллиграмм (мг) общего тканевого белка на микрограмм (мкг) нуклеиновой кислоты, которая доставляется. В другом варианте реализации трансфекционная эффективность комплекса нуклеиновая кислота:липосома составляет по меньшей мере около 10 пг белка, выраженного на мг общего тканевого белка на мкг нуклеиновой кислоты, которая доставляется; а в еще одном варианте реализации по меньшей мере около 50 пг белка, выраженного на мг общего тканевого белка на мкг нуклеиновой кислоты, которая доставляется. Трансфекционная эффективность комплекса может составлять лишь 1 фемтограмм (фг) белка, выраженного на мг общего тканевого белка на мкг нуклеиновой кислоты, которая доставляется, с более предпочтительными высшими количествами.

Предпочтительное липосомное средство доставки имеет диаметр около 100-500 нанометров (нм), в другом варианте реализации около 150-450 нм, а в еще одном варианте реализации около 200-400 нм.

Подходящие липосомы включают любые липосомы, такие как те, что обычно используются, например, в методах доставки генов, известных специалистам в данной области. Предпочтительные липосомные средства доставки включают многослойные везикулярные (MLV) липиды и экструзионные липиды. Способы приготовления MLV хорошо известны из уровня техники. Более предпочтительные липосомные средства доставки включают липосомы, имеющие поликатионный липидный состав (то есть катионные липосомы) и/или липосомы, имеющие холестериновый остов, конъюгированный с полиэтиленгликолем. Примеры катионных липосомных композиций включают, но не ограничиваются, N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмоний-хлорид (DOTMA) и холестерин, N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмонийхлорид (DOTAP) и холестерин, 1-[2-(олеоилокси)этил]-2-олеил-3-(2-гидроксиэтил)имидазолинийхлорид (DOTIM) и холестерин, диметил-диоктадециламмонийбромид (DDAB) и холестерин и их комбинации. Наиболее предпочтительная липосомная композиция для использования в качестве средства доставки включает DOTIM и холестерин.

Подходящая молекула нуклеиновой кислоты включает любую нуклеотидную последовательность, такую как кодирующая или некодирующая последовательность, и ДНК или РНК. Кодирующие последовательности нуклеиновых кислот кодируют по меньшей мере часть белка или пептида, тогда как некодирующая последовательность не кодирует ни одной части белка или пептида. В соответствии с настоящим изобретением, "некодирующие" нуклеиновые кислоты могут включать регулирующие области транскрипционного блоку, такие как область промотора. Термин "пустой вектор" может употребляться взаимозаменяемо с термином "некодирующий", и, в частности, касается последовательности нуклеиновой кислоты в отсутствие части, кодирующей белок, такой как плазмидный вектор без генной вставки. Экспрессия белка, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты, не является необходимой для вызова неантигенспецифического иммунного отклика; поэтому молекула нуклеиновой кислоты не обязательно должна быть функционально связана с последовательностью контроля транскрипции. Однако можно получить дополнительные преимущества (то есть антигенспецифический и повышенный иммунитет), включив в композицию последовательность нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), кодирующую иммуноген и/или цитокин.

Комплексообразование липосомы с молекулой нуклеиновой кислоты может быть осуществлено при помощи стандартных методов из уровня техники, или как описано в патенте США №6693086 и включено сюда по ссылке. Подходящая концентрация молекулы нуклеиновой кислоты для добавления в липосому включает концентрацию, эффективную для доставки достаточного количества молекулы нуклеиновой кислоты до субъекта, так что вызывается системный иммунный отклик. В одном варианте реализации от около 0.1 мкг до около 10 мкг молекулы нуклеиновой кислоты комбинируется с около 8 нмоль липосом, в другом варианте реализации от около 0.5 мкг до около 5 мкг молекулы нуклеиновой кислоты комбинируется с около 8 нмоль липосом, а в еще одном варианте реализации около 1.0 мкг молекулы нуклеиновой кислоты комбинируется с около 8 нмоль липосом. В одном варианте реализации соотношение нуклеиновых кислот к липидам (мкг нуклеиновой кислоты: нмоль липидов) в композиции составляет по меньшей мере около 1:1 нуклеиновая кислота:липид по весу (то есть 1 мкг нуклеиновой кислоты: 1 нмоль липида), а в другом варианте реализации по меньшей мере около 1:5, а в еще одном варианте реализации по меньшей мере около 1:10, а в дальнейшем варианте реализации по меньшей мере около 1:20. Соотношения, выраженные здесь, основываются на количестве катионного липида в композиции, а не на общем количестве липида в композиции. В другом варианте реализации соотношение нуклеиновых кислот к липидам у композиции согласно изобретению составляет от около 1:1 до около 1:80 нуклеиновая кислота:липид по весу; а в другом варианте реализации от около 1:2 до около 1:40 нуклеиновая кислота:липид по весу; а в дальнейшем варианте реализации от около 1:3 до около 1:30 нуклеиновая кислота:липид по весу; а в еще одном варианте реализации от около 1:6 до около 1:15 нуклеиновая кислота:липид по весу.

b. Биологический агент

В другом варианте реализации изобретения иммуномодулятор включает липосомное средство доставки, молекулу нуклеиновой кислоты и по меньшей мере один биологический агент.

Подходящие биологические агенты являются агентами, которые эффективны в предотвращении или лечении заболевания КРС. Такие биологические агенты включают иммуностимулирующие белки, иммуногены, вакцины, противомикробные средства или любую их комбинацию. Подходящие иммуностимулирующие белки являются известными белками, повышающими иммунитет. Лишь в качестве неограничивающего примера, цитокины, включающие семейство белков, являются известным семейством белков, повышающих иммунитет. Подходящие иммуногены являются белками, вызывающими гуморальный и/или клеточный иммунный отклик, так что введение иммуногена субъекту повышает иммуногенспецифический иммунный отклик против тех же или похожих белков, встречающихся внутри тканей субъекта. Иммуноген может включать патогенный антиген, экспрессирущийся бактерией, вирусом, паразитом или грибом. Предпочтительные антигены включают антигены, вызывающие инфекционное заболевание у субъекта. В соответствии с настоящим изобретением, иммуноген может быть любым фрагментом белка, природного или полученного синтетически, который вызывает гуморальный и/или клеточный иммунный отклик. Так, размер антигена или иммуногена может быть от 5-12 аминокислот до размера белка полной длины, включая промежуточные размеры. Антиген может быть мультимерным или составным белком. Антигены могут быть очищенными белковыми антигенами, полученными из природных или рекомбинантных клеток. Последовательности нуклеиновых кислот иммуностимулирующих белков и иммуногенов функционально связываются с последовательностью контроля трансляции, так что иммуноген экспрессируется в ткани субъекта, тем самым вызывая иммуногенспецифический иммунный отклик у субъекта, в дополнение к неспецифическому иммунному отклику.

В другом варианте реализации изобретения биологический агент является вакциной. Вакцина может включать живую, инфекционную, вирусную, бактериальную или паразитарную вакцину или убитую, инактивированную, вирусную, бактериальную или паразитарную вакцину. В одном варианте реализации одна или более вакцин, живых или убитых вирусных вакцин, может использоваться в сочетании с иммуномодулирующей композицией согласно настоящему изобретению. Подходящие вакцины включают те, которые известны из уровня техники для видов КРС. Примеры вакцин, без ограничения, включают те, что используются в уровне техники для защиты от инфекционного ринотрахеита КРС (IBR) (вирус герпеса КРС типа 1 (BHV1)), вируса парагриппа типа 3 (PI3), респираторно-синцитиального вируса КРС (BRSV), вируса диареи КРС (BVDV типа 1 и 2), Histophilus somni, Mycoplasma bovis и других заболеваний, известных из уровня техники. В примере реализации вакцина для защиты против Mannheimia haemolytica может использоваться в сочетании с иммуномодулирующей композицией согласно настоящему изобретению.

В еще одном варианте реализации изобретения биологический агент является противомикробным средством. Подходящие противомикробные средства включают: хинолоны, предпочтительно фторхинолоны, β-лактамы и макролид-стрептограмин-линкозамидные (MLS) антибиотики.

Подходящие хинолоны включают бенофлоксацин, бинфлоксацин, циноксацин, ципрофлоксацин, клинафлоксацин, данофлоксацин, дифлоксацин, эноксацин, энрофлоксацин, флероксацин, гемифлоксацин, ибафлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин, марбофлоксацин, моксифлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин, орбифлоксацин, пазуфлоксацин, прадофлоксацин, перфлоксацин, темафлоксацин, тосуфлоксацин, сарафлоксацин, гемифлоксацин и спарфлоксацин. Предпочтительные фторхинолоны включают ципрофлоксацин, энрофлоксацин, моксифлоксацин, данофлоксацин и прадофлоксацин. Подходящие нафтиридоны включают налидиксовую кислоту.

Подходящие β-лактамы включают пенициллины, такие как бензатинпенициллин, бензилпенициллин (пенициллин G), феноксиметил-пенициллин (пенициллин V), прокаинпенициллин, метициллин, оксациллин, нафциллин, клоксациллин, диклоксациллин, флуклоксациллин, темоциллин, амоксициллин, ампициллин, ко-амоксиклав (амоксициллин и клавулановая кислота), азлоциллин, карбенициллин, тикарциллин, мезлоциллин, пиперациллин; цефалоспорины, такие как цефалоний, цефалексин, цефазолин, цефапририн, цефквином, цефтиофур, цефалотин, цефаклор, цефуроксим, цефамандол, дефотетан, цефокситин, цефтриаксон, цефотаксим, цефподоксим, цефиксим, цефтазидим, цефепим, цефпиром; карбапенемы и пенемы, такие как имипенем, меропенем, ертапенем, фаропенем, дорипенем, монобактамы, такие как азтреонам (азактам), тигемонам, нокардицин A, табтоксинин-β-лактам; и ингибиторы β-лактамазы, такие как клавулановая кислота, тазобактам и сульбактам. Предпочтительные β-лактамы включают цефалоспорины, в частности цефазолин.

Подходящие антибиотики группы MLS включают любой макролид, линкомицин, клиндамицин, пирлимицин. Предпочтительным линкозамидом является пирлимицин.

Другие противомикробные средства включают 2-пиридоны, тетрациклины, сульфонамиды, аминогликозиды, триметоприм, диметридазолы, эритромицин, фрамицетин, фуразолидон, различные плевромутилины, такие как тиамулин, валнемулин, разные, стрептомицин, клопидол, салиномицин, моненсин, галофугинон, нарасин, робенидин и тому подобное.

2. Методы

a. Методы иммунной стимуляции

В одном варианте реализации изобретения иммунный отклик вызывается у особи вида крупного рогатого скота посредством введения эффективного количества иммуномодулирующей композиции до особи вида крупного рогатого скота. Эффективное количество достаточно для вызова иммунного отклика у особи вида крупного рогатого скота. Иммуномодулятор включает липосомное средство доставки и молекулу нуклеиновой кислоты.

В одном варианте реализации эффективное количество иммуномодулятора составляет от около 1 микрограмма до около 1000 микрограмм на животное. В другом варианте реализации эффективное количество иммуномодулятора составляет от около 5 микрограмм до около 500 микрограмм на животное. У еще одном варианте реализации эффективное количество иммуномодулятора составляет от около 10 микрограмм до около 100 микрограмм на животное. У дальнейшем варианте реализации эффективное количество иммуномодулятора составляет от около 10 микрограмм до около 50 микрограмм на животное.

В другом варианте реализации изобретения иммунный отклик вызывается у особи вида крупного рогатого скота введением эффективного количества иммуномодулятора, включающего липосомное средство доставки, изолированную молекулу нуклеиновой кислоты и биологический агент. Предполагается, что биологический агент может быть смешан или введен вместе с иммуномодулятором, или независимо от него. Независимое введение может быть до или после введения иммуномодулятора. Также предполагается, что более чем одно введение иммуномодулятора или биологического агента может использоваться для расширения повышенного иммунитета. Более того, более чем один биологический агент может вводиться вместе с иммуномодулятором, вводиться перед иммуномодулятором, вводиться после введения иммуномодулятора или параллельно.

b. Заболевания

Методы согласно изобретению вызывают иммунный отклик у субъекта, так что субъект защищен от заболевания, ответственного за вызов иммунного отклика. В данном контексте фраза "защищенный от заболевания" означает ослабление симптомов заболевания; снижение частоты заболевания и уменьшение клинической или патологической тяжести заболевания, или снижение выделения патогена, вызывающего заболевание. Защита субъекта может означать способность терапевтической композиции согласно настоящему изобретению, при введении субъекту, предотвращать возникновение заболевания, лечить и/или облегчать или уменьшать симптомы, клинические признаки, патологию или причины. Примеры клинических признаков РЗ КРС включают поражения легких, повышение температуры, депрессию (напр., анорексию, пониженную реакцию на внешние стимулы, повисшие уши), выделения из носа и характер дыхания (напр., частота дыхания, дыхательное усилие). Так, защита особи вида КРС от заболевания включает как предотвращение возникновения заболевания (профилактическое лечение), так и лечение особи вида КРС, имеющей заболевание (терапевтическое лечение). В частности, защита субъекта от заболевания достигается вызовом иммунного отклика у особи вида КРС посредством запуска благотворного или защитного иммунного отклика, который может, в некоторых случаях, дополнительно угнетать, понижать, ингибировать или блокировать слишком активный или вредные иммунный отклик. Термин "заболевание" означает любое отклонение от здорового состояния особи вида КРС и включает состояние, в котором есть симптомы заболевания, а также состояния, в которых отклонение (напр., инфекция, мутация гена, генетический дефект и т.д.) присутствует, но симптомы еще не проявились.

Методы согласно изобретению могут использоваться для предотвращения заболевания, стимуляции иммунитета эффекторных клеток против заболевания, уничтожения заболевания, облегчения заболевания и предотвращения вторичного заболевания в результате возникновения первичного заболевания.

Настоящее изобретение также может улучшать приобретенный иммунный отклик у животных при введении вместе с вакциной сравнительно с введением самой вакцины. В общем случае вакцина, будучи однажды введена, не защищает животное сразу, так как требуется время для стимуляции приобретенного иммунитета. Термин "улучшение" означает, в контексте данного изобретения, вызов врожденного иммунного отклика у животных до того, как вакцина начинает защищать животное, и/или продление периода защиты через приобретенный иммунитет, обеспеченный вакциной.

Методы согласно изобретению включают введение композиции для защиты от инфицирования широким спектром патогенов. Композиция, которая вводится, может включать или не включать специфический антиген для вызова специфического отклика. Предполагается, что методы согласно изобретению будут защищать субъекта-реципиента от заболевания, вызывающегося конфекционными микробными агентами, включающими, без ограничения, вирусы, бактерии, грибы и паразиты. Примеры вирусных инфекционных заболеваний, без ограничения, включают те, что возникают от заражения инфекционным ринотрахеитом КРС (IBR) (вирус герпеса КРС типа 1 (BHV1)), вирусом парагриппа типа 3 (PI3), респираторно-синцитиальним вирусом КРС (BRSV), вирусом диареи КРС (BVDV типа 1 и 2), аденовирусом КРС, коронавирусом КРС (BCV), калицивирусом КРС, парвовирусом КРС, BHV4, реовирусом КРС, энтеровирусом КРС, риновирусом КРС, вирусом злокачественной катаральной лихорадки КРС, вирусом лейкоза КРС, вирусом бешенства, вирусом везикулярного стоматита (VSV), орбивирусом катаральной лихорадки ("синий язык"), их рекомбинантами и другими вирусами, известными из уровня техники. Примеры бактериальних инфекций, без ограничения, включают возникающие от заражения грамположительными и грамотрицательными бактериями и микобактериями, такими как Escherichia coli, Pasteurella multocida, Clostridium perfringens, Clostridium colinum, Campylobacter jejuni, Clostridium botulinum, Clostridium novyi, Clostridium chauveoi, Clostridium septicum, Clostridium hemolyticum, Clostridium tetani, Mannheimia haemolytica, Ureaplasma diversum, Mycoplasma dispar, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovirhinis, Histophilus somni, Campylobacter fetus, Leptospira spp., Arcanobacterium pyogenes, Bacillus anthrax, Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium spp., Treponema spp., Corynebacterium, Brucella abortus, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium spp., Histophilus spp., Moraxella spp., Muellerius spp., Mycoplasma spp., Salmonella spp., Bacillus anthracis и другими бактериями, известными из уровня техники. Примеры грибных или грибковых инфекций, без ограничения, включают возникающие от заражения Actinobacterium spp., Aspergillus spp., Histomonas spp. и другими инфекционными грибами или грибками, известными из уровня техники. Примеры паразитов включают, без ограничения, Neospora spp., Trichostrongylus, Cooperia, Anaplasma spp., Babesia spp., Chorioptes spp., Cysticercus spp., Dermatophilus spp., Damalinia bovis, Dictylocaulus spp., Eimeria spp., Eperythrozoon spp., Haemonchus spp., Melophagus spp., Muellerius spp., Nematodirus spp., Oestrus spp., Ostertagia spp., Psoroptes spp., Sarcoptes spp., Serpens spp., Strongyloides spp., Toxoplasma spp., Trichuris spp., Trichophyton spp., Tritrichomas spp., Fascioloides spp., Anaplasma marginale и других паразитов, известных из уровня техники.

c. Субъекты

Методы согласно изобретению могут применяться к любому субъекту или особи вида бычьих, домашнему или дикому. В частности, они могут применяться к субъектам, находящимся на промышленном содержании для разведения, мясного и молочного производства. Подходящие субъекты видов бычьих, без ограничения, включают антилоп, буйволов, яков, КРС и бизонов. В одном варианте реализации особь вида бычьих является КРС. Виды КРС включают, без ограничения, коров, быков, телят, телок, волов, мясной скот или молочный скот. Специалист в данной области техники признает, что способы согласно изобретению будут в значительной мере благоприятны для скота, находящегося на промышленном содержании для разведения, мясного и молочного производства, поскольку он особенно уязвим для влияния инфекционных агентов из окружающей среды.

d. Введение

Существует много путей введения. Конкретный выбранный режим будет зависеть, обычно, от конкретных выбранных биологических агентов, возраста и общего состояния здоровья субъекта, конкретного состояния, которое лечится, и дозировки, нужной для терапевтической эффективности. Методы согласно изобретению могут осуществляться с использованием любого режима введения, вырабатывающего эффективные уровни иммунного отклика, не вызывая клинически неприемлемых побочных эффектов. Композиции могут быть удобно представлены в виде единичной дозированной формы и могут быть приготовлены любым из способов, хорошо известных из уровня техники.

Прививка видов КРС может осуществляться в любом возрасте. Вакцина может вводиться внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, внутрибрюшинно, подкожно, распыливанием/аэрозолем, перорально, внутриглазно, внутритрахейно, внутриносово или другими способами, известными из уровня техники. Далее, предполагается, что методы согласно изобретению могут использоваться на основе типовых графиков прививок. Иммуномодулятор также может вводиться внутривенно, внутримышечно, подкожно, аэрозолем, перорально, внутриглазно, внутритрахейно, через нос или другими способами, известными из уровня техники. В одном варианте реализации иммуномодулятор вводится подкожно. В другом варианте реализации иммуномодулятор вводится внутримышечно. В еще одном варианте реализации иммуномодулятор вводится как аэрозоль. В дальнейшем варианте реализации иммуномодулятор вводится перорально.

В одном варианте реализации иммуномодулятор вводится один животным перед заражением (или инфицированием). В другом варианте реализации иммуномодулятор вводиться один животным после заражения (или инфицирования). В еще одном варианте реализации иммуномодулятор вводится один животным одновременно с заражением (или инфицированием). В дальнейшем варианте реализации иммуномодулирующая композиция вводится одновременно вместе с вакцинацией перед заражением. В еще одном дальнейшем варианте реализации иммуномодулирующая композиция вводится одновременно вместе с вакцинацией одновременно с заражением (или инфицированием). Совместное введение может включать введение вакцины и иммуномодулятора в одном месте на животном в двух разных точках, близких друг к другу (напр., инъекции близко друг к другу на шее животного), с разных сторон животного в одном месте (напр., по одной с каждой стороны шеи) или в разных местах на одном животном. В другом варианте реализации иммуномодулирующая композиция вводится перед вакцинацией и заражением. В дальнейшем варианте реализации иммуномодулирующая композиция вводится после вакцинации, не до заражения. В дальнейшем варианте реализации иммуномодулятор вводится после заражения животного, которое было вакцинировано перед заражением (или инфицированием).

В одном варианте реализации иммуномодулятор вводится от около 1 до около 14 дней перед заражением или от около 1 до около 14 дней после заражение. В одном варианте реализации иммуномодулятор вводиться от около 1 до около 7 дней перед заражением или от около 1 до около 7 дней после заражения. В еще одном варианте реализации иммуномодулятор вводиться на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 день до заражения или на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 день после заражения.

Другие системы доставки могут включать системы высвобождения со временем, отложенного высвобождения или замедленного высвобождения. Такие системы позволяют избежать многократного введения композиций, тем самым повышая удобство. Существует много типов систем доставки, известных специалистам в данной области техники. Они включают системы на полимерной основе, такие как полилактид-гликолид, кополиоксалаты, поликапролактоны, полиэфирамиды, полиортоэфиры, полиоксимасляную кислоту и полиангидриды. Микрокапсулы из вышеприведенных полимеров, содержащие лекарственные средства, описаны, например, в патенте США №5075109. Системы доставки включают также неполимерные системы, такие как липиды, включая стерины, такие как холестерин, эфиры холестерина и жирных кислот, и нейтральные жиры, такие как моно-, ди- и триглицериды; гидрогелевые системы высвобождения; силиконовые системы; системы на пептидной основе; восковые покрытия; прессованные таблетки с использованием обычных связующих и эксципиентов; частично оплавленные имплантанты и тому подобное. Отдельные примеры включают, но не ограничиваются, эрозионные системы, в которых агент согласно изобретению содержится в форме внутри матрицы, такие как описанные в патентах США №4452775, 4675189 и 5736152, и диффузионные системы, в которых активный компонент проникает с контролируемой скоростью из полимера, такие как описанные в патентах США №3854480, 5133974 и 5407686. Кроме того, могут использоваться аппаратные системы доставки на основе насоса, некоторые из которых адаптированы для имплантации.

Так как различные изменения могут быть внесены в вышеприведенные композиции, препараты и методы без отхода от объема изобретения, следует понимать, что все, что содержится в вышеприведенном описании и в примерах, которые предоставляются ниже, следует рассматривать как иллюстративное, а не в смысле ограничения.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин "эффективное количество" означает количество, необходимое или достаточное для реализации желаемого биологического эффекта. Например, эффективное количество иммуномодулятора для лечения или предотвращения инфекционного заболевания является таким количеством, которое необходимо для того, чтобы вызвать развитие иммунного отклика при контакте с микроорганизмом, тем самым вызывая снижение количества микроорганизма внутри субъекта и предпочтительно искоренение микроорганизма. Эффективное количество для каждого конкретного применения может изменяться в зависимости от таких факторов, как заболевание или состояние, которое лечится, размер субъекта или тяжесть заболевания или состояния. Специалист в данной области техники может эмпирически определить эффективное количество иммуномодулятора без необходимости ненужных экспериментов.

Термин "цитокин" означает семейство белков, повышающих иммунитет. Семейство цитокинов включает гематопоэтический фактор роста, интерлейкины, интерфероны, молекулы надсемейства иммуноглобулинов, молекулы семейства факторов некроза опухолей и хемокины (то есть белки, регулирующие миграцию и активацию клеток, в частности фагоцитарных клеток). Примеры цитокинов включают, без ограничения, интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-12 (IL12), интерлейкин-15 (IL-15), интерлейкин-18 (IL-18), интерферон-α (IFNα), и интерферон-γ (IFNγ).

Термин "вызывать" может использоваться взаимозаменяемо с терминами активировать, стимулировать, генерировать или повышать.

Термин "вызов иммунного отклика" у субъекта означает специфический контроль или влияние на активность иммунного отклика и может включать активацию иммунного отклика, повышение иммунного отклика, усиление иммунного отклику и/или изменение иммунного отклика (такая как вызов типа иммунного отклика, который, в свою очередь, меняет преобладающий тип иммунного отклика у субъекта от являющегося вредным или неэффективным, к являющемуся благотворным или защитным).

Термин "функционально связанный" означает соединение молекулы нуклеиновой кислоты с последовательностью контроля транскрипции таким способом, что молекула способна экспрессироваться при трансфекции (то есть трансформации, трансдукции или трансфекции) в клетку-хозяин. Последовательности контроля транскрипции являются последовательностями, контролирующими инициацию, элонгацию и терминацию транскрипции. Частично важные последовательности контроля транскрипции являются контролирующими инициацию транскрипции, такие как последовательности промотора, энхансера, оператора и репрессора. Многие такие последовательности контроля транскрипции известны специалистам в данной области техники. Предпочтительные последовательности контроля транскрипции включают те, что функционируют в клетках птиц, рыб, млекопитающих, бактерий, растений и насекомых. В то время как в изобретении могут использоваться любые последовательности контроля транскрипции, последовательности могут включать природные последовательности контроля транскрипции, связанные в природе с последовательностью, кодирующей иммуноген или иммуностимулирующий белок.

Термины "молекула нуклеиновой кислоты" и "последовательность нуклеиновой кислоты" могут использоваться взаимозаменяемо и включают ДНК, РНК или производные, как ДНК, так и РНК. Термины включают также олигонуклеотиды и большие последовательности, включая как молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих белок или его фрагмент, так и молекулы нуклеиновых кислот, содержащие регулирующие области, интроны, или другие некодирующие ДНК и РНК. Типично олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность от около 1 до около 500 нуклеотидов, и более типично имеет по меньшей мере около 5 нуклеотидов в длину. Молекула нуклеиновой кислоты может быть получена из любого источника, включая млекопитающих, рыб, насекомых, бактериальные, вирусные, растительные или синтетические источники. Молекула нуклеиновой кислоты может быть получена обычными способами, известными из уровня техники, такими как технология рекомбинантной ДНК (напр., полимеразная цепная реакция (ПЦР), амплификация, клонирование) или химический синтез. Молекулы нуклеиновых кислот включают молекулы природных нуклеиновых кислот и их гомологи, включая, но не ограничиваясь, природные аллельные варианты и модифицированные молекулы нуклеиновых кислот, в которых нуклеотиды были вставлены, удалены, замещены или инвертованы так, что такие модификации преимущественно не мешают способности молекулы нуклеиновой кислоты кодировать иммуноген или иммуностимулирующий белок, полезный в методах согласно настоящему изобретению. Гомолог нуклеиновой кислоты можно получить при помощи многих способов, известных специалистам в данной области техники (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989), которая включается сюда по ссылке. Методики скрининга на иммуногенность, такую как иммуногенность патогенного антигена или активность цитокинов, известны специалистам из уровня техники и включают множество методов анализа in vitro и in vivo.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры иллюстрируют различные варианты реализации изобретения.

Пример 1. Оценка скота, получающего ДНК-иммуномодулятор, перед или после развития естественного респираторного заболевания КРС.

Целью этого исследования было определение эффективности ДНК-иммуномодулятора, введенного телятам перед и после развития естественных случаев РЗ КРС.

Иммуномодулятор

Иммуномодулятор, использовавшийся в этом исследовании, являлся композицией, содержащей катионный липид и некодирующую ДНК. Липидные компоненты синтетического иммуномодулятора [1-[2-[9-(Z)-октадеценоилокси]]-2-[8](Z)-гептадеценил]-3-[гидроксиэтил]имидазолийхлорид (DOTIM) и синтетический нейтральный липид холестерин были комбинированы для получения липосом диаметром приблизительно 200 нм (см. патент США 6693086). ДНК-компонент являлся некодирующей ДНК-плазмидой с 4242 парами оснований, произведенной в Е.coli, которая, будучи заряжена отрицательно, ассоциируется с положительно заряженными (катионными) липосомами (см. патент США 6693086).

Исследуемые животные

84 кастрированных телят-бычков голштинской породы в возрасте отъема отобрали из стада без текущей истории респираторного заболевания. Каждого отдельного теленка сначала осмотрели и признали здоровым. 84 телят были разделены на семь опытных групп по 12 телят каждая. Только животные, не привитые от Mannheimia haemolytica, были включены в исследование. Ни одно из животных не получало противомикробных средств в продолжение 30 дней до введения ДНК-иммуномодулятора. Опытным группам вводили различные дозы вышеописанного ДНК-иммуномодулятора в день эксперимента, как отмечено в Таблице 1.1 ниже. Схема разбавления ДНК-иммуномодулятора предоставлена в Таблице 1.2. ДНК-иммуномодулятор вводился внутримышечно, краниально к левому плечу, вентрально к выйной связке и каудодорсально к яремному желобу телят.

Как отмечено ниже, день эксперимента - 1 означает день начала исследования после начального отбора, в который телят оценивали и определяли их пригодность для исследования. День эксперимента 0 является днем, следующим за днем - 1 и так далее.

Таблица 1.1 График введения иммуномодулятора Номер опыта ДНК-иммуномодулятор, доза (мкг) День введения иммуномодулятора Животных на опытную группу 1 500 -1 12 2 200 -1 12 3 50 -1 12 4 500 0 12 5 200 0 12 6 50 0 12 7 0 (контроль) н/п 12

У значительной части телят наблюдались проявления разной степени РЗ КРС утром дня 0. На 5 день было отмечено, что все телята, что остались в исследуемой популяции, соответствуют признакам заболевания РЗ КРС. Скот исключали из исследуемой популяции, только если была показана эвтаназия из-за тяжелого РЗ КРС. Не наблюдалось никаких других инфекционных/неинфекционных заболеваний, которые требовали бы исключения из этого исследования.

Оценка

На 1-5 дни эксперимента телята оценивались по различным показателям здоровья. Например, ректальная температура и среднесуточный вес определялись для каждого из телят каждый день в продолжение исследования. Животных оценивали приблизительно в то же время каждый день (+/-3 часа) от 1 дня до 5 дня. На Фиг.1.1 и 1.2 представлены средние значения ректальной температуры и среднесуточный привес соответственно дозе иммуномодулятора, который вводился.

На 5 день всех телят подвергли эвтаназии и вскрытию. Показатели поражения легких определялись (на основе степени отвердевания легких, оцененного посредством визуального осмотра и ручной пальпации) для каждого отдельного теленка во время вскрытия.

На Фиг.1.3 представлены показатели поражения легких относительно дозы иммуномодулятора, который вводился. Общие показатели поражения легких для каждого дня введения составляли приблизительно 11% и 14% для дня - 1 и дня 0 соответственно. Показатели поражения легких 11.2%, 9.0%, 10.8% и 19.9% проявлялись для групп 500, 200, 50 и негативного контроля соответственно. Наибольшее отличие между контрольной группой и опытной группой (200 мкг) составляло приблизительно 11% уменьшение.

Оценки с поправкой на модель согласно Фиг.1.3 отражают сырые средние значения, скорректированные для всех переменных статистической модели (то есть доза, день и доза * день), а также для загона, в котором телят содержали в течение исследования. Таким образом, оценки с поправкой на модель могут обнаруживать отличия, сравнимые с сырыми средними значениями.

Проводились также следующие бактериологические (легочные культуры) и вирусологические (носовые мазки) исследования. Из телят, которые оставались (69), которые были подвергнуты эвтаназии на 5 день, у 11.6% было обнаружено выделение вируса герпеса КРС типа 1 (BHV-1) в носовом отделяемом. Относительно легочных культур из всех исследуемых животных, 41% были положительны по Mh, 31.3% культур были положительны по Pasteurella multocida (Pm), 10.8% культур были положительны как по Mh, так и по Pm, и ни один Histophilus somni не был выделен по исследуемой популяции. Культивирование Mycoplasma bovis не производилось в этом исследовании.

Результаты

В этом исследовании доза ДНК-иммуномодулятора (то есть 500 мкг, 200 мкг и 50 мкг) добилась значительного снижения показателей поражения легких в сравнении с отрицательным контролем (P=0.1284; см. Фиг.1.3). Однако день введения ДНК-иммуномодулятора (то есть день - 1 или 0) не был значимо связан с показателями поражения легких. Не наблюдалось статистических отличий в показателях поражения легких среди групп, получавших дозу ДНК-иммуномодулятора. Ректальная температура имела тенденцию к значимой связи с дозой ДНК-иммуномодулятора (P=0.1190), но не была связана с днем введения. Не наблюдалось заметных отличий между дозой ДНК-иммуномодулятора и отрицательным контролем по среднесуточному привесу.

Была сильна тенденция ДНК-иммуномодулятора к снижению поражения легких в сравнении с отрицательным контролем, что тем самым представляет доказательство того, что этот препарат имеет потенциал для защиты ткани легких во время вспышки РЗ КРС. В этом исследовании день введения препарата не был связан с поражением легких, что означает, что не имеет значения, получает ли скот ДНК-иммуномодулятор накануне или в тот же день, что и появление клинических признаков, связанных с РЗ КРС. Этот результат важен, так как время контакта с патогенами РЗ КРС обычно неизвестно в типичных производственных системах, и к тому же осложнено влиянием различных стрессовых факторов, которым скот подвергается в течение производственного цикла. Таким образом, обеспечение производителей препаратом, предоставляющим гибкость во времени введения, по отношению к вспышке РЗ КРС, крайне важно для мясной и молочной промышленности.

Пример 2. Оценка скота, получающего ДНК-иммуномодулятор одновременно или на следующий день после экспериментального заражения Mannheimia haemolytica.

Целью этого исследования было определение эффективности ДНК-иммуномодулятора, введенного телятам одновременно или на следующий день после экспериментального заражения Mannheimia haemolytica.

Иммуномодулятор

Иммуномодулятор, использовавшийся в этом исследовании, был композицией, описанной выше в Примере 1.

Исследуемые животные

84 кастрированных телят-бычков голштинской породы в возрасте отъема весом в среднем около 300 фунтов (136 кг) отобрали из стада без текущей истории респираторного заболевания. Каждого отдельного теленка вначале осмотрели и признали здоровым. 84 телят были разделены на семь опытных групп по 12 телят каждая. Только животные, не привитые от Mannheimia haemolytica, были включены в исследование. Ни одно из животных не получало противомикробных средств в продолжение 30 дней до введения ДНК-иммуномодулятора. Исследуемым группам вводили различные дозы ДНК-иммуномодулятора в день эксперимента, как отмечено в Таблице 2.1 ниже. Схема разбавления ДНК-иммуномодулятора предоставлена в Таблице 2.2. ДНК-иммуномодулятор вводился внутримышечно, краниально к левому плечу, вентрально к выйной связке и каудодорсально к яремному желобу телят.

Как отмечено ниже, день эксперимента 0 означает день начала исследования после начального отбора, в который телят оценивали и определяли их пребывание в здоровом состоянии. День эксперимента 1 является днем, следующим за днем 0 и так далее.

Таблица 2.1 График введения иммуномодулятора и заражения Mh Номер опыта ДНК-иммуномодулятор, доза (мкг) День введения иммуномодулятора День заражения Mh Животных на опытную группу 1 500 0 0 12 2 200 0 0 12 3 50 0 0 12 4 500 1 0 12 5 200 1 0 12 6 50 1 0 12 7 0 (контроль) н/п 0 12

Экспериментальное заражение

В день 0 телята были заражены общим количеством 3.12×10⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ) Mannheimia haemolytica. Инокулят вводился через дыхательные пути. На 3 день было отмечено, что все телята в исследуемой популяции соответствуют признакам заболевания РЗ КРС. Средний срок появления признаков составлял один день.

Оценка

Как и в предыдущем примере, на 1-5 дни эксперимента телята оценивались по различным показателям здоровья. Ректальная температура и среднесуточный вес определялись для каждого из телят каждый день в течение исследования. Животных оценивали приблизительно в то же время каждый день. На Фиг.2.1 и 2.2 представлены средние значения ректальной температуры и среднесуточный привес соответственно дозе иммуномодулятора, который вводился.

На 5 день всех телят подвергли эвтаназии и вскрытию. Показатели поражения легких определялись для каждого отдельного теленка во время вскрытия согласно формуле, описанной в Примере 1.

На Фиг.2.3 представлены показатели поражения легких с поправкой на модель относительно дозы иммуномодулятора, который вводился.

Результаты

В этом исследовании доза ДНК-иммуномодулятора (то есть 500 мкг, 200 мкг и 50 мкг) значительно снизила показатели поражения легких в сравнении с отрицательным контролем. Однако низшие дозы (200 мкг и 50 мкг) превзошли дозу 500 мкг в снижении поражения легких. День введения ДНК-иммуномодулятора (то есть день 0 или 1) не был значимо связан с показателями поражения легких. Не наблюдалось статистических отличий в показателях поражения легких среди групп, получавших дозу ДНК-иммуномодулятора. Ректальная температура была значительно снижена у телят, которым вводили ДНК-иммуномодулятор, в сравнении с отрицательным контролем, но не была связана с дозой. Не наблюдалось заметных отличий между дозой ДНК-иммуномодулятора и отрицательным контролем по среднесуточному привесу.

Была сильна тенденция ДНК-иммуномодулятора к снижению поражения легких в сравнении с отрицательным контролем, что тем самым представляет доказательство того, что этот препарат имеет потенциал для защиты ткани легких во время вспышки РЗ КРС. В этом исследовании день введения препарата не был связан с поражением легких, что означает, что не имело значения, получал ли скот ДНК-иммуномодулятор накануне или в тот же день, что и появление клинических признаков, связанных с РЗ КРС. Этот результат важен, так как время контакта с патогенами РЗ КРС обычно неизвестно в типичных производственных системах, и к тому же осложнено влиянием различных стрессовых факторов, которым скот подвергается в течение производственного цикла. Таким образом, обеспечение производителей препаратом, предоставляющим гибкость во времени введения, по отношению к вспышке РЗ КРС, крайне важно для мясной и молочной промышленности.

Пример 3. Оценка скота, получающего ДНК-иммуномодулятор за два дня до или одновременно с экспериментальным заражением Mannheimia haemolytica.

Целью этого исследования было определение эффективности ДНК-иммуномодулятора, введенного телятам за два дня до или одновременно с экспериментальным заражением Mannheimia haemolytica.

Иммуномодулятор

Иммуномодулятор, использовавшийся в этом исследовании, был композицией, описанной выше в Примере 1.

Исследуемые животные

96 кастрированных телят-бычков голштинской породы весом в среднем около 800-1000 фунтов (363-454 кг) отобрали из стада без текущей истории респираторного заболевания. Каждого отдельного теленка вначале осмотрели и признали здоровым. 96 телят были разделены на восемь опытных групп по 12 телят каждая. Только животные, не привитые от Mannheimia haemolytica, были включены в исследование. Ни одно из животных не получало противомикробных средств в продолжение 30 дней до введения ДНК-иммуномодулятора. Исследуемым группам вводили различные дозы ДНК-иммуномодулятора в день эксперимента, как отмечено в Таблице 3.1 ниже. Схема разбавления ДНК-иммуномодулятора предоставлена в Таблице 3.2. ДНК-иммуномодулятор вводился внутримышечно, краниально к левому плечу, вентрально к выйной связке и каудодорсально к яремному желобу телят.

Как отмечено ниже, день эксперимента - 2 означает день начала исследования, когда опытным группам 1-3 вводили иммуномодулятор. День эксперимента 0 был через два дня после дня - 2 и так далее.

Таблица 3.1 График введения иммуномодулятора и заражения Mh Номер опыта ДНК-иммуномодулятор, доза (мкг) День введения иммуномодулятора День заражения Mh Животных на опытную группу 1 200 -2 0 12 2 50 -2 0 12 3 25 -2 0 12 4 200 0 0 12 5 50 0 0 12 6 25 0 0 12 7 0 (контроль) -2 0 12 8 0 (контроль) 0 0 12

Экспериментальное заражение

В день 0 телята были заражены общим количеством 1.9*10¹⁰ КОЕ. Инокулят вводился через дыхательные пути.

Оценка

Как и в предыдущих примерах, на 1-5 дни эксперимента телята оценивались по различным показателям здоровья. На 5 день всех телят подвергли эвтаназии и вскрытию. Показатели поражения легких определялись для каждого отдельного теленка во время вскрытия.

На Фиг.3.1 представлены показатели поражения легких с поправкой на модель относительно дозы иммуномодулятора, который вводился. На Фиг.3.2 представлены показатели поражения легких с поправкой на модель относительно дня введения иммуномодулятора.

Результаты

В этом исследовании доза ДНК-иммуномодулятора (то есть 500 мкг, 200 мкг и 50 мкг) значительно снизила показатели поражения легких в сравнении с отрицательным контролем. Однако не наблюдалось статистических отличий в показателях поражения легких среди групп, получавших дозу ДНК-иммуномодулятора. День введения ДНК-иммуномодулятора (то есть день - 2 или 0) был значимо связан с показателями поражения легких. Значительное снижение поражения легких наблюдалось, когда иммуномодулятор вводился в день 0 в сравнении с днем - 2.

Пример 4. Совместное введение иммуномодулятора и убитой вакцины Mh после заражения Mh.

Целью этого исследования было определение эффективности ДНК-иммуномодулятора, введенного вместе с убитой вакциной против Mh телятам, которых подвергли экспериментальному заражению Mannheimia haemolytica.

Иммуномодулятор

Иммуномодулятор, использовавшийся в этом исследовании, был композицией, описанной выше в Примере 1.

Исследуемые животные

81 телят-бычков голштинской породы в возрасте 12 недель отобрали из стада без текущей истории респираторного заболевания. Каждого отдельного теленка осмотрели и признали здоровым. Только животные, не привитые от Mannheimia haemolytica, были включены в исследование. Ни одно из животных не получало противомикробных средств в продолжение 30 дней до введения инокулята.

Экспериментальное инфицирование и заражение

Заражение, или экспериментальное инфицирование, включает контакт с инокулятом Mannheimia haemolytica. Использовались микроорганизмы в концентрации 1.7*10⁸ на животное для первой инокуляции и 2.4*10¹⁰ на животное для второй инокуляции. Также животных заражали аэрозолем через другой дыхательный путь. Концентрация микроорганизмов в аэрозольном инокуляте составляла 1.9*10¹⁰ на животное.

Эффективность иммуномодулятора, как описано выше, введенного телятам, с последующим контактом с Mannheimia haemolytica, определялась при помощи двенадцати опытных групп, как подробно приведено в Таблице 3.

Таблица 4.3 Исследуемые группы Группа Целевая доза Дни лечения Количество животных День Контакт Т1 Убитая вакцина МН (масло) п/к 0 + 7 Т2 Убитая вакцина МН (масло) + иммуномодулятор 500 мкг п/к 0 + 7 Т3 Убитая вакцина МН (масло) п/к 7 + 6 Т4 Убитая вакцина МН (масло) + иммуномодулятор 500 мкг п/к 7 + 7 Т5 Иммуномодулятор 500 мкг п/к 7 + 7 Т6 Иммуномодулятор 500 мкг п/к 13 + 7 Т7 Иммуномодулятор 500 мкг в/м 13 + 7 Т8 Иммуномодулятор 500 мкг п/к 15* + 7 Т9 Контроль н/м н/п н/п 7 Т10 Контроль ЗК н/п + 5 Т11 Контроль ЗН н/п + 7 Т12 Убитая вакцина МН (вода) + иммуномодулятор 500 мкг п/к 0 + 7

МН (масло) = вакцина против Mannheimia haemolytica (Pulmo-Guard® РНМ)

МН (вода) = вакцина против Mannheimia haemolytica (One Shot®)

НС = He смешаны и не заражены аэрозольно (для фоновой макропатологии)

ЗК = Заражены контактно и аэрозольно

ЗН = Использованы как зараженные носители (заражены внутритрахейно)

Все животные, кроме ЗН и НС, были заражены аэрозольно

п/к = Подкожный путь введения

в/м = Внутримышечный путь введения

н/п = Не применимо

*Животных в группе Т8 будут лечить после внутриносового заражения

В день 0 исследования всем животным в группах Т1, Т2 и Т12 вводили иммуномодулятор подкожно. Иммуномодулятор вводили подкожно в день 7 группам Т3, Т4 и Т5. Иммуномодулятор вводили подкожно в день 13 группе Т6 и внутримышечно группе Т7. Иммуномодулятор вводили подкожно в день 15 группе Т8.

Все животные, получавшие вакцину, были привиты согласно инструкциям на этикетке. Иммуномодулятор и вакцину вводили как можно ближе друг к другу возле лимфоузла (шея) - две инъекции (одна для вакцины, а другая для иммуномодулятора). Все животные, получавшие подкожные инъекции, были уколоты возле лимфоузла в подлопаточной области.

В день эксперимента 10 всех телят Т11 вывозили за территорию в трейлере для скота в течение приблизительно 24 часов, чтобы подвергнуть телят стрессу. В день эксперимента 11, 20 мл инокулята, содержащего Mannheimia haemolytica, ввели внутритрахейно всем животным группы Т11, а через 4 часа повторили с 25 мл инокулята. В день эксперимента 14 всех телят, кроме Т9, перемешали и вывозили за территорию в трейлере для скота в течение приблизительно 24 часов, чтобы подвергнуть телят стрессу. Всех животных, кроме группы НС, перемешали в большом загоне на 12-16 часов в день эксперимента 14, а потом вернули их в отдельные загоны (у каждого животного был отдельный загон). В день эксперимента 15, 20 мл Mannheimia haemolytica ввели через другой дыхательный путь всем группам, кроме Т9 и Т11. В продолжение исследования всех животных каждый день проверяли на клинические отклонения и падеж. Все животные имели нулевые или низкие титры при проверке перед приобретением животных. Животные имели высокие титры перед лечением, что означает, что животные стали серологически положительными по Mannheimia haemolytica перед получением лечения.

Результаты

Животные группы Т8 имели значительно низшие поражения легких.

Исследование наводит на мысль, что существует начало ранней защиты (день 7), с вакциной или без (группы Т4 и Т5 в сравнении с ТЗ). См. Фиг.4.1 и 4.2.

Пример 5. Оценка приобретенного иммунитета у КРС, привитого продажной живой вакциной при совместном введении с ДНК-иммуномодулятором.

Целью этого исследования было определение, повышает ли совместное введение ДНК-иммуномодулятора приобретенный иммунитет, обеспеченный ослабленными живыми вирусными вакцинами (ОЖВ).

Иммуномодулятор

Иммуномодулятор, использовавшийся в этом исследовании, был композицией, описанной выше в Примере 1.

Исследуемые животные

72 кастрированных телят-бычков голштинской породы в возрасте отъема отобрали из стада без текущей истории респираторного заболевания. 72 телят были разделены на шесть опытных групп по 12 телят каждая. Каждого отдельного теленка осмотрели и признали здоровым. У всех телят отсутствовали сывороточные антитела к BHV-1, BVDV типов 1 и 2, и BRSV. Кроме того, обнаружили, что у всех телят нет сывороточных антител к PI-3. Впоследствии определили, что телята отрицательны по персистентной инфекции вирусной диареи КРС иммуногистохимическими методами.

Исследуемым группам вводили вакцину и различные дозы ДНК-иммуномодулятора внутримышечно в день эксперимента, как отмечено в Таблице 5.1 ниже. Схема разбавления ДНК-иммуномодулятора предоставлена в Таблице 5.2. В день 0 исследования всем животным в группах Т1-Т4 вводили иммуномодулятор. Все животные, получавшие вакцину, были привиты согласно инструкциям на этикетке. Иммуномодулятор и вакцину вводили как можно ближе друг к другу краниально к передней части плеча - две инъекции (одна для вакцины, а другая для иммуномодулятора).

Таблица 5.1 График введения иммуномодулятора и вакцины Группа Целевая доза День введения вакцины и/или иммуномодулятора Количество животных Т1 ОЖВ + иммуномодулятор (500 мкг) в/м 0 12 Т2 ОЖВ + иммуномодулятор (200 мкг) в/м 0 12 Т3 ОЖВ + иммуномодулятор (100 мкг) в/м 0 12 Т4 ОЖВ + иммуномодулятор (50 мкг) в/м 0 12 Т5 ОЖВ 0 12 Т6 Без лечение н/п 12

ОЖВ = вакцина против Mannheimia haemolytica (Bovi-shield®) - ослабленная живая вирусная 4-компонентная респираторная вакцина

в/м = Внутримышечный путь введения

Оценка

Иммунологическое тестирование проводилось на образцах соответствующих гематологических проб, отобранных у телят на 0, 13, 28, 27, 34 и 41 дни. Измерения клеточно-опосредованного иммунитета (КОИ) проводились для каждой пробы. Целевыми патогенами для этого исследования 15 являлись BHV-1, BVDV 1 и 2, и BRSV. Лаборатории использовали стандартизованные процедуры и методы, в зависимости от предварительно выбранных целевых патогенов.

Результаты

Были определены данные с поправкой на модель для результатов КОИ на каждый день отбора образцов среди всех опытных групп. Среди всех опытных групп, типов клеток и антигенов не были обнаружены статистические отличия (P>0.10) при сравнении групп, которые лечились комбинациями ДНК-иммуномодулятор - вакцина ОЖВ со скотом, получавшим лишь вакцину ОЖВ (см. Фиг.5.1-5.12). В частности, на Фиг.5.1-5.4 представлены измерения индекса экспрессии CD 25 EI (ось y) по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x). На Фиг.5.5-5.8 представлены измерения индекса экспрессии IFNγ (ось y) по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x). На Фиг.5.9-5.12 представлены измерения индекса экспрессии IL-4 (ось y) по всем пяти типам клеток для каждой из 6 опытных групп (ось x). Были проведены оценки для каждого из 4 вирусных патогенов РЗ КРС, представленных на соответствующих графиках. Для этих статистических оценок все сравнения производились с опытной группой "только ОЖВ".

Статистически значимые (P<0.10) корреляции лечение * день были обнаружены для BVDV 1 (дни 28 и 35) и BVDV 2 (день 42). Не были обнаружены значимые результаты (P>0.10) для BHV-1 в любой из перечисленных моментов времени. Графическое представление этих результатов изображено на Фиг.5.13-5.15. Данные по BRSV были исключены из анализа из-за наблюдения сероконверсии в опытной группе негативного контроля. Следует отметить, что для всех статистических оценок все сравнения производились с опытной группой "только ОЖВ".

Вес отдельных животных также определялся в течение исследования. Графическое представление результатов среднесуточного привеса с поправкой на модель изображено на Фиг.5.16. Не были обнаружены значимые результаты (P>0.10) по опытным группам в сравнении с группой "только ОЖВ".

В итоге ДНК-иммуномодулятор не повышал КОИ при совместном введении с ОЖВ-вакциной в сравнении с введением самой ОЖВ-вакцины. Однако 500 мкг ДНК-иммуномодулятора могут повышать гуморальный иммунитет при совместном введении с ОЖВ-вакциной (особенно для BVDV). Тем не менее, следует отметить, что, несмотря на нехватку достоверного улучшения приобретенного иммунитета, совместное введение ДНК-иммуномодулятора в дозах 500 мкг, 200 мкг, 100 мкг и 50 мкг не ухудшает иммунологические эффекты, вызванные ОЖВ-вакциной. К тому же, введение ДНК-иммуномодулятора не оказывает отрицательного влияния на производительность (напр., среднесуточный привес).

Пример 6. Оценка приобретенного иммунитета у КРС, привитого продажной вакциной при совместном введении с ДНК-иммуномодулятором.

Целью этого исследования было определение, повышает ли совместное введение ДНК-иммуномодулятора приобретенный иммунитет, обеспеченный вакцинами, содержащими инактивированные антигены.

Иммуномодулятор

Иммуномодулятор, использовавшийся в этом исследовании, был композицией, описанной выше в Примере 1.

Исследуемые животные

48 телок голштинской породы в возрасте 3-5 месяцев отобрали из стада без текущей истории респираторного заболевания. 48 телок были разделены на шесть опытных групп по 8 животных каждая. Каждое отдельное животное осмотрели и признали здоровым. У всех животных отсутствовали сывороточные антитела к BHV-1, BVDV типов 1 и 2. Также определили, что животные отрицательны по персистентной инфекции вирусной диареи КРС при помощи ПЦР. Животных не отбирали по титрам РСН против вирусов BRSV и PI3.

Исследуемым группам вводили вакцину и различные дозы ДНК-иммуномодулятора внутримышечно в день эксперимента, как отмечено в Таблице 5.1 ниже. Вакцина содержала BHV1 и BVDV типа 1 и 2 в виде инактивированных антигенов и ослабленные живые вирусы PI3 и BRSV. Иммуномодулятор и вакцину вводили или отдельно с одной стороны животного краниально к передней части плеча, или отдельно с разных сторон животного в одинаковой области, или смешивали в одном шприце. Схема разбавления ДНК-иммуномодулятора предоставлена в Таблице 5.2.

Таблица 6.1 График введения иммуномодулятора и вакцины Группа Целевая доза День введения вакцины и/или иммуномодулятора Количество животных Т1 Плацебо (декстроза 5%) 0 8 Т2 Вакцина + декстроза в/м, отдельно 0 8 Т3 Вакцина + иммуномодулятор (20 мкг) в/м, смешанно 0 8 Т4 Вакцина + иммуномодулятор (200 мкг) в/м, смешанно 0 8 Т5 Вакцина + иммуномодулятор (200 мкг) в/м, отдельно с одной стороны 0 8 Т6 Вакцина + иммуномодулятор (200 мкг) в/м, отдельно с разных сторон 0 8

Вакцина = комбинированная (инактивированная и ослабленная живая) 4-компонентная вирусная респираторная вакцина (Rispoval®)

в/м = Внутримышечный путь введения

Оценка

Иммунологическое тестирование проводилось на образцах соответствующих гематологических проб, отобранных у скота на 0, 3, 5, 7, 9, 11, 14, 17, 20, 23 и 27 дни. Целевыми патогенами для этого исследования являлись BHV-1, BVDV 1 и 2. Только для информационных целей, определялись также титры антител против вирусов BRSV и PI3. Лаборатории использовали стандартизованные реакции сывороточной нейтрализации (РСН) в качестве процедур для предварительно выбранных целевых патогенов.

Результаты

Статистически значимые (P<0.010) корреляции лечение * день были обнаружены для BHV1 (день 27). Не были обнаружены значимые результаты (P>0.10) для всех других моментов времени для BHV1 и для BVDV типа 1 и 2 в любой из перечисленных моментов времени. Результаты по титрам BRSV и PI3 далее не оценивались из-за того, что животные не были серологически отрицательны в начале исследования. Потому лечебный эффект нельзя было подтвердить. Графическое представление этих результатов изображено на Фиг.6.1. Следует отметить, что для всех статистических оценок все сравнения производились с опытной группой "вакцина + декстроза 5%".

Изобретение относится к области фармацевтики и касается композиции иммуномодулятора для лечения респираторного заболевания у крупного рогатого скота, которое вызвано Mannheimia haemolytica, которая включает катионное липосомное средство и молекулу нуклеиновой кислоты, где молекула нуклеиновой кислоты является выделенным, происходящим из бактерии E.coli некодирующим ДНК плазмидным вектором, содержащим 4242 пар оснований, без встроенного гена. Изобретение обеспечивает вызов системного, неспецифического и антигенспецифического иммунных откликов у животных для защиты против инфекционного респираторного заболевания. 10 з.п. ф-лы, 6 пр., 6 табл., 27 ил.

1. Композиция иммуномодулятора, причем композиция иммуномодулятора включает:

a) катионное липосомное средство доставки и

b) молекулу нуклеиновой кислоты, где молекула нуклеиновой кислоты является выделенным, происходящим из бактерии E. coli некодирующим ДНК плазмидным вектором, содержащим 4242 пар оснований, без встроенного гена,

для применения для лечения респираторного заболевания у крупного рогатого скота (КРС), которое вызвано Mannheimia haemolytica.

2. Композиция по п. 1, в которой липосомное средство доставки включает липиды, выбранные из многослойных везикулярных липидов и экструзионных липидов.

3. Композиция по п. 2, в которой липосомное средство доставки включает пары липидов, выбранные из группы, включающей DTMA и холестерин; DOTAP и холестерин; DOTIM и холестерин и DDAB и холестерин.

4. Композиция по пп. 1-3, где клинические симптомы поражения легких и/или повышение температуры снижены.

5. Композиция по п. 4, для способа введения, выбранного из группы, включающей внутривенный, внутримышечный, внутрикожный, внутрибрюшинный, подкожный, распылительный/аэрозольный, пероральный, внутриглазной, внутритрахейный и внутриносовой.

6. Композиция по п. 5, дополнительно включающая биологический агент, где этот биологический агент выбран из группы, включающей иммуностимулирующие белки, иммуногены, вакцины, противомикробные средства или любую их комбинацию.

7. Композиция по п. 1, в которой респираторное заболевание КРС вызвано вирусной инфекцией и/или бактериальной инфекцией.

8. Композиция по п. 1, где лечение респираторного заболевания у крупного рогатого скота, которое вызвано Mannheimia haemolytica, происходит с уменьшением клинических симптомов.

9. Композиция по п. 8, дополнительно включающая биологический агент, где этот биологический агент выбран из группы, включающей иммуностимулирующие белки, иммуногены, вакцины, противомикробные средства или любую их комбинацию.

10. Композиция по п. 1, где лечение респираторного заболевания у крупного рогатого скота, которое вызвано Mannheimia haemolytica, приводит к улучшению приобретенного иммунного ответа у животного.

11. Композиция по п. 10, где композиция иммуномодулятора вводится совместно с вакциной или вводится до, после или в смеси с вакциной.