НАБОР 5'-ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ПОЛНОЙ КОДИРУЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА ОМРА/МОТВ BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI Российский патент 2017 года по МПК C12N1/00 C12Q1/68 

Описание патента на изобретение RU2608505C1

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) гена ompA/motB, кодирующего поверхностный протеин OmpA/MotB возбудителя мелиоидоза. Изобретение может быть использовано в молекулярной биологии и биотехнологии для амплификации полной кодирующей нуклеотидной последовательности гена ompA/motB поверхностного антигена В. pseudomallei.

Возбудитель особо опасной инфекции - мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) - аэробная грамотрицательная неферментирующая бактерия, принадлежащая к роду Burkholderia подкласса протеобактерий семейства Burkholderiaceae. В настоящее время род Burkholderia включает более 50 видов микроорганизмов и представляет собой довольно гетерогенную таксономическую группу, объединяющую сапрофиты, фитопатогены и патогены теплокровных животных.

Мелиоидоз эндемичен для влажных тропических и субтропических регионов Юго-Восточной Азии, Северной Австралии, Западной Африки и Латинской Америки. В последнее время было отмечено довольно большое число спорадических случаев заболевания для ряда стран умеренного климатического пояса, связанных с заносом из эндемичных регионов.

В. pseudomallei относится к агентам II группы патогенности, все работы с которыми строго регламентированы СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

Важной диагностической задачей следует считать точную и быструю индикацию вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза и их дифференциацию от генетически и иммунологически близких непатогенных сапрофитных представителей рода, широко распространенных в естественных биоценозах.

Успешная реализация вышеуказанных задач зависит прежде всего от выбора и детальной технологической проработки стратегии поиска и выявления биополимеров В. pseudomallei, перспективных для использования в качестве специфичных диагностических мишеней при конструировании иммуно- и генодиагностических систем нового поколения.

На основании проведенного нами сравнительного in silico исследования последовательностей геномов В. pseudomallei был осуществлен выбор дифференцирующих групп кодирующих последовательностей поверхностных белков возбудителя мелиоидоза. В результате множественного выравнивания формально транслированных аминокислотных последовательностей были отобраны протеины, формировавшие наиболее гомогенные группы. Для каждого кластера белков исследованы потенциальные антигенные свойства и выделены линейные эпитопы. При этом наибольший интерес представляли протеины семейства OmpA, обладающие высокой потенциальной иммуногенностью. Использование приложения BLAST-protein показало, что белок MotB семейства OmpA видоспецифичен для В. pseudomallei. Следовательно, исследуемый протеин и кодирующий его регион могут являться перспективными диагностическими мишенями.

Современной тенденцией совершенствования лабораторной диагностики мелиоидоза считают сочетанное применение двух методов: ПЦР и иммуноферментного анализа (ИФА). ИФА на основе моноклональных антител может быть использован для аналитических исследований, связанных с идентификацией видовой принадлежности микроорганизмов и анализом топографии биологически активных и диагностически значимых компонентов бактериальной клетки.

ПЦР является прямым методом выявления ДНК и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Процесс амплификации нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий фрагментов ДНК, специфичных для конкретных определенных типов генетических последовательностей, например, генов мембранных протеинов микроорганизмов, в число которых входит и ген ompA/motB.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для исследуемой генетической мишени. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах детектируемого фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК проходит только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор ДНК-мишени и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации.

Близкими аналогами можно считать олигонуклеотидные затравки, использованные в нескольких работах для амплификации и последующего клонирования гена основного порина внешней мембраны BpsOmp38 (38 кДа) [Siritapetawee J., Prinz Н. et al. Expression and refolding of Omp38 from Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis, and its function as a diffusion porin // J. Biochem. - 2004. - P. 384] и гена цефалоспориназы (blaABPS) возбудителя мелиоидоза [Terence K.М. Cheung, P.L. Ho et al. Cloning and Expression of Class A β-Lactamase Gene blaABPS in Burkholderia pseudomallei // Antimicrob Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46. - P. 1132-1135]. В данных работах были использованы праймеры, фланкирующие полную кодирующую последовательность соответствующих генов, для их клонирования в гетерологичных системах и функциональной характеристики рекомбинантных биополимеров.

Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена ompA/motB В. pseudomallei.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена ompA/motB В. pseudomallei.

На основе геномных сиквенсов Burkholderia pseudomallei, представленных в общедоступных генетических базах данных (Genbank, EMBL, DDBJ), были подобраны 1 прямой и 2 варианта обратного (поскольку последовательность выбранной области отжига обратного праймера у проанализированных in silico геномов В. pseudomallei содержит SNP) праймеров, комплементарные фланкирующим последовательностям гена поверхностного протеина OmpA/MotB. Сконструированные олигонуклеотиды, структура которых указана в таблице 1, обладают активностью прямого (bps4255ricF) и обратных (bps4255ricR1, bps4255ricR2) праймеров в реакции амплификации. К специфической нуклеотидной последовательности прямого и обратных праймеров на 5'-конце добавлена фосфорилированная последовательность.

Характеристика генетических мишеней для данных пар праймеров и ожидаемые размеры амплифицируемых фрагментов ДНК приведены в таблице 2.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для амплификации полной нуклеотидной последовательности гена ompA/motB, кодирующего высокоиммуногенный поверхностный протеин OmpA/MotB возбудителя мелиоидоза, методом ПЦР.

На основе сравнительного анализа in silico последовательностей геномов микроорганизмов рода Burkholderia с использованием ресурса Pathema (http://pathema.jcvi.org/Pathema/) были выбраны дифференцирующие группы кодирующих последовательностей поверхностных белков возбудителя мелиоидоза. Использование приложения BLAST-protein (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) показало, что наиболее перспективной диагностической мишенью является видоспецифичный для В. pseudomallei белок MotB семейства OmpA.

Были выбраны специфические участки ДНК, являющиеся консервативными фрагментами нуклеотидных последовательностей гена ompA/motB, к которым с помощью сервиса PrimerBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast) были подобраны комплементарные олигонуклеотиды, формирующие 2 пары праймеров. К специфической нуклеотидной последовательности прямого и обратного праймеров на 5'-конце добавлена фосфорилированная последовательность, позволяющая повысить эффективность клонирования амплифицированного фрагмента. Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами, составила 1320 п.н. для пары bps4255ricF - bps4255ricR1 и 1310 п.н. для пары bps4255ricF - bps4255ricR2.

Праймеры были проанализированы с помощью компьютерной программы BLASTN (http://www.ncbi.nlm.mh.gov/BLAST/) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК возбудителя мелиоидоза с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров.

Для выделения ДНК использовался метод протеиназного лизиса [Higuchi R. Rapid, efficient DNA extraction for PCR from cells or blood // Amplifications: A Forum for PCR Users. Perkin-Elmer, Norwalk, CT. - 1989. - Issue 2] с модификациями: 200 мкл свежеприготовленной бактериальной взвеси в стерильной бидистиллированной воде плотностью 2×109 м.к./мл смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-HCl, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0.2 мг/мл желатина, 0.9% Nonidet Р-40, 0.9% Твин 20, 150 мкг/мл протеиназы К), инкубировали при 60°С 120 мин, прогревали при 99°С 30 мин для инактивации фермента.

Для постановки ПЦР использовался ДНК-амплификатор С1000 (Bio-Rad, США) с 96-луночным реакционным блоком. Программа амплификации для обеих пар праймеров состояла из этапов начального прогрева проб 95°С 4 мин, 35 реакционных циклов (денатурация 94°С 40 с, отжиг праймеров 66.2°С 30 с, удлинение цепи 72°С 1 мин 20 с) и финальной элонгации 72°С 10 мин.

Объем реакционной смеси на 1 пробу составлял 15 мкл. В состав реакционной смеси входили по 50 пМ прямого и обратного праймеров, 1.25 Ед. ДиаТак ДНК-полимеразы и 1×ПЦР-буфер с дНТФ и MgCl2 (ILS, Россия). Препараты геномной ДНК вносили в реакционную смесь в объеме 3 мкл.

Проводили электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 1,5% агарозном геле и визуализировали ампликоны окрашиванием бромистым этидием. Размер ампликона оценивали, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркерных фрагментов ДНК. Электрофоретический анализ реакции амплификации гена ompA/motB возбудителя мелиоидоза, результаты которого приводятся на рисунке 1, показал наличие расчетных ампликонов размером 1320 п.н. с праймерами bps4255ricF/bps4255ricR1 и 1310 п.н. с праймерами bps4255ricF/bps4255ricR2 (дорожки 1 и 2 на электрофореграмме соответственно).

Таким образом, сконструированные праймеры позволяют получить в высокой концентрации фрагмент ДНК, несущий полную последовательность гена ompA/motB, кодирующего высокоиммуногенный поверхностный протеин OmpA/MotB возбудителя мелиоидоза, что позволит в перспективе осуществить клонирование в составе экспрессирующего вектора с целью накопления рекомбинантного антигена.

Похожие патенты RU2608505C1

название год авторы номер документа
НАБОР 5'-ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ПОЛНОЙ КОДИРУЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА МЕМБРАННОГО ПРОТЕИНА TTSS HRCV BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI 2016
  • Викторов Дмитрий Викторович
  • Захарова Ирина Борисовна
  • Кузютина Юлия Александровна
  • Лопастейская Яна Анатольевна
RU2608506C1
ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ И ТИПИРОВАНИЯ ГЕНОВ β-ЛАКТАМАЗ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ 2011
  • Викторов Дмитрий Викторович
  • Романова Александр Владимирович
  • Захарова Ирина Борисовна
RU2474614C1
ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ЗОНДЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА B. pseudomallei И B. mallei 2010
  • Ткаченко Галина Александровна
  • Савченко Сергей Сергеевич
  • Зинченко Ольга Владимировна
  • Антонов Валерий Алексеевич
  • Алексеева Виктория Владимировна
RU2435861C1
НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Burkholderia pseudomallei 2014
  • Лемасова Людмила Викторовна
  • Савченко Сергей Сергеевич
  • Ткаченко Галина Александровна
  • Антонов Валерий Алексеевич
RU2556810C1
ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА B.pseudomallei И B.mallei 2010
  • Ткаченко Галина Александровна
  • Савченко Сергей Сергеевич
  • Зинченко Ольга Владимировна
  • Антонов Валерий Алексеевич
  • Алексеева Виктория Владимировна
RU2435860C1
НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Burkholderia mallei И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ Burkholderia pseudomallei 2014
  • Лемасова Людмила Викторовна
  • Савченко Сергей Сергеевич
  • Ткаченко Галина Александровна
  • Антонов Валерий Алексеевич
RU2551208C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 (DE3) BPSOMPA-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК PBPSOMPA, НЕСУЩЕЙ ПОЛНОРАЗМЕРНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ГЕНА ПОВЕРХНОСТНОГО ПРОТЕИНА OMPA/MOTB BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI 2016
  • Кузютина Юлия Александровна
  • Захарова Ирина Борисовна
  • Викторов Дмитрий Викторович
RU2662958C2
ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА B. pseudomallei И B. mallei 2010
  • Ткаченко Галина Александровна
  • Савченко Сергей Сергеевич
  • Зинченко Ольга Владимировна
  • Антонов Валерий Алексеевич
  • Алексеева Виктория Владимировна
RU2439159C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 (DE3) BPSOMP39 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК PBPSOMP39, НЕСУЩЕЙ ПОЛНОРАЗМЕРНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ГЕНА ПОВЕРХНОСТНОГО ПРОТЕИНА OMP39 BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI 2016
  • Кузютина Юлия Александровна
  • Захарова Ирина Борисовна
  • Викторов Дмитрий Викторович
RU2662957C2
ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ BURK1526S/BURK1526AS ДЛЯ ОЦЕНКИ АДАПТАЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ГЕНОМА ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ 2013
  • Савченко Сергей Сергеевич
  • Ткаченко Галина Александровна
  • Бондарева Ольга Сергеевна
  • Шпак Иван Михайлович
  • Леденева Маргарита Леонтьевна
  • Антонов Валерий Алексеевич
RU2545710C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 608 505 C1

Реферат патента 2017 года НАБОР 5'-ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ПОЛНОЙ КОДИРУЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА ОМРА/МОТВ BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии. Изобретение представляет собой набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции гена ompA/motB, кодирующего поверхностный протеин OmpA/MotB возбудителя мелиоидоза. Изобретение позволяет получить в высокой концентрации фрагмент ДНК, несущий полную последовательность гена ompA/motB, кодирующего высокоиммуногенный поверхностный протеин OmpA/MotB возбудителя мелиоидоза, что позволит в перспективе осуществить его клонирование в составе экспрессирующего вектора с целью накопления рекомбинантного антигена. 1 ил., 2 табл., 2 пр.

Формула изобретения RU 2 608 505 C1

Набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена ompA/motB Burkholderia pseudomallei, обладающих активностью прямого (bps4255ricF) и обратных (bps4255ricR1, bps4255ricR2) праймеров в реакции амплификации и имеющих следующую структуру:

bps4255ricF 5'-(P)AAGCTTTGTTGGGGAGTGCGTCACAAATG-3' bps4255ricR1 5'-(P)AATTCTTATTACAGCGTGACTGCGATTTC-3' bps4255ricR2 5'-(P)AATTCTTATTACAGCGTGACCGCGATTTC-3'

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2017 года RU2608505C1

CN 102146478 A, 10.08.2011
НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Burkholderia mallei И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ Burkholderia pseudomallei 2014
  • Лемасова Людмила Викторовна
  • Савченко Сергей Сергеевич
  • Ткаченко Галина Александровна
  • Антонов Валерий Алексеевич
RU2551208C1
WO 2009009484 A2, 15.01.2009
US 20150361435 A1, 17.12.2015.

RU 2 608 505 C1

Авторы

Викторов Дмитрий Викторович

Захарова Ирина Борисовна

Кузютина Юлия Александровна

Лопастейская Яна Анатольевна

Даты

2017-01-18Публикация

2016-02-02Подача