ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 (DE3) BPSOMPA-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК PBPSOMPA, НЕСУЩЕЙ ПОЛНОРАЗМЕРНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ГЕНА ПОВЕРХНОСТНОГО ПРОТЕИНА OMPA/MOTB BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI Российский патент 2018 года по МПК C07K14/195 C12N1/21 C12N15/31 C12N15/70 C12P21/00 C12R1/19 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и касается конструирования рекомбинантных штаммов Escherichia coli, несущих клонированные последовательности генома возбудителя мелиоидоза Burkholderia pseudomallei. Полученный штамм Е. coli BL21 (DE3) BpsOmpA является продуцентом рекомбинантной плазмидной ДНК pBpsOmpA, несущей полноразмерную последовательность гена поверхностного протеина OmpA/MotB В. pseudomallei. Штамм предназначен для экспрессии клонированного гена мембранного белка OmpA/MotB В. pseudomallei, его накопления, выделения и очистки. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» под номером КМ 253.

В. pseudomallei относится к патогенным биологическим агентам II группы патогенности и является возбудителем особо опасной инфекции - мелиоидоза. Мелиоидоз распространен в регионах Юго-Восточной Азии, Северной Австралии, Западной Африки и Латинской Америки. Кроме того, ввиду значительной туристической и трудовой миграции в мире ежегодно регистрируются лабораторно подтвержденные случаи заболевания лиц, посещавших эндемичные по данной инфекции территории.

Лабораторная диагностика мелиоидоза основывается на изучении культурально-морфологических и биохимических свойств микроорганизмов, но применение классического бактериологического метода не позволяет достаточно быстро установить присутствие возбудителей в пробах. Помимо идентификации изолятов В. pseudomallei и В. mallei, являющихся генетически, биохимически и иммунологически очень схожими, важной задачей является их дифференциация между собой, а также от непатогенных сапрофитных представителей рода, широко распространенных в естественных биоценозах.

Тактика идентификации патогенных микроорганизмов предусматривает применение ряда иммунодиагностических тестов с использованием моноклональных антител (МКА). В практической работе для ускоренного выявления и последующей идентификации возбудителя мелиоидоза чаще всего используют метод флуоресцирующих антител, реакцию непрямой гемагглютинации, твердофазный иммуноферментный анализ, реакцию двойной иммунодиффузии, иммуноблоттинг. Используемые средства иммунодиагностики мелиоидоза на основе МКА к антигенным эпитопам экзополисахарида характеризуются различной степенью перекрестной реактивности в отношении филогенетически близких представителей рода Burkholderia. Поэтому важным направлением исследований является поиск высокоспецифичных антигенов, пригодных для применения в диагностических тест-системах нового поколения.

Современный подход к решению вышеуказанной проблемы основан на технологии направленного выбора потенциальных кандидатных биополимеров бактериальных клеток, клонирования кодирующих последовательностей целевых биомолекул-мишеней и получения рекомбинантных продуктов, удобных для быстрого и безопасного накопления.

На сегодняшний день имеется ряд сообщений о клонировании и анализе экспрессии генов В. pseudomallei, которые детерминируют синтез протеинов, обладающих высокой антигенной активностью. Например, в составе плазмиды pGEX4T-2 в Е. coli BL21 клонирован полноразмерный ген флагеллина В. pseudomallei, способного вызывать у мышей образование специфических антител против возбудителя мелиоидоза на ранних стадиях инфекции [Chen Y.S. Recombinant truncated flagellin of Burkholderia pseudomallei as a molecular probe for diagnosis of melioidosis / Y.S. Chen, D. Shiuan, S.C. Chen et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2003. - Vol. 10, №3. - P. 423-425]. По данным Garcia-Quintanilla, был получен рекомбинантный штамм Е. coli, содержащий в составе экспрессирующего плазмидного вектора pCC1FOS-BPF16β_E10 кластер генов, детерминирующих синтез О-полисахарида В. pseudomallei, который обуславливает выработку специфических IgG макроорганизма при мелиоидозе [Garcia-Quintanilla F. Production of a recombinant vaccine candidate against Burkholderia pseudomallei exploiting the bacterial N-glycosylation machinery / F. Garcia-Quintanilla, J.A. Iwashkiw, N.L. Price et al. // Front. Microbiol. - 2014. - 5: 381]. Тем не менее, проблема эффективной иммунодиагностики мелиоидоза не теряет актуальности. Перспективы ее дальнейшего совершенствования связывают с получением новых рекомбинантных белков, специфичных для В. pseudomallei, и использованием их в качестве основы разрабатываемых тест-систем.

Мембранный белок MotB относится к семейству протеинов OmpA, характеризующихся высокой потенциальной иммуногенностью, и является видоспецифичным для В. pseudomallei. Следовательно, он может рассматриваться в качестве перспективной диагностической мишени.

Целью изобретения является конструирование штамма Е. coli, несущего стабильно реплицирующуюся рекомбинантную плазмиду с клонированной в составе экспрессирующего вектора полноразмерной последовательностью гена поверхностного протеина OmpA/MotB В. pseudomallei.

В качестве источника хромосомной ДНК был использован штамм В. pseudomallei 56770 SMR2. Хромосомную ДНК выделяли методом протеиназного лизиса [Тетерятникова Н.Н. Молекулярная детекция интегронов класса 1 у Burkholderia pseudomallei / Н.Н. Тетерятникова, И.Б. Захарова, М.В. Подшивалова и др. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - №2 (108). - С. 46-49] из 24-часовой культуры возбудителя мелиоидоза, выращенной на LB-агаре при 37°C.

В ПЦР с использованием высокоточной полимеразы и оригинальных праймеров bps4255 амплифицировали полную нуклеотидную последовательность гена ompA/motB размером 1310 п.н., кодирующего поверхностный протеин OmpA/MotB В. pseudomallei.

Клонирование полноразмерной последовательности гена поверхностного биополимера возбудителя мелиоидоза ompA/motB производили с использованием линейного экспрессионного вектора RIC-Ready - pPAL7, содержащего в своем составе специфическую аффинную метку Profinity eXact tag, которая позволяет накопить и очистить получаемый рекомбинантный белок в системе Profinia™ (Bio-Rad). Специфические ампликоны и вектор лигировали в соотношении 10:1. Для получения компетентных клеток Е. coli использовали метод с применением хлористого кальция [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование (Текст) / Пер. с англ. - М.: Мир, 1984. - 392 с.]. Полученной лигазной смесью трансформировали штамм Е. coli С-Мах5α для накопления рекомбинантной плазмидной ДНК. Выделение плазмидной ДНК из культуры бактерий Е. coli проводили с помощью набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) согласно инструкции, после чего ими трансформировали штамм Е. coli BL21 (DE3), предназначенный для экспрессии рекомбинантных протеинов с высокой интенсивностью. Для подтверждения присутствия клонированных последовательностей полученные трансформанты исследовали в ПЦР с последующей электрофоретической детекцией в 1.5% агарозном геле.

Рекомбинантный штамм Е. coli BL21(DE3) BpsOmpA, полученный путем трансформации клеток Е. coli BL21(DE3) полноразмерной последовательностью гена ompA/motB В. pseudomallei 56770 SMR2 в составе вектора pPAL7, несущего ген устойчивости к ампициллину (Amp^R), сохраняет основные культурально-морфологические и биохимические свойства Е. coli BL21(DE3).

Клетки агаровых культур имеют палочковидную форму, грамотрицательны, не образуют спор и капсул. Культуры штамма хорошо растут на простых питательных, средах, содержащих и не содержащих ампициллин, при 37°C, оптимум pH 6-7. На агаре Лурия-Бертани с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг/мл формируют гладкие, круглые, слабо выпуклые колонии с ровным краем, на бульоне Лурия-Бертани дают равномерное помутнение.

Биохимическая активность штамма исследована на микробиологическом анализаторе VITEK 2 (bioMerieux): глюкоза (+), мальтоза (+), маннит (+), манноза (+), арабиноза (-), ксилоза (-), сорбит (+), сахароза (-), цитрат (-), малонат (-), галактозидаза (+), уреаза (-), ацетилгалактозаминидаза (-), фосфатаза (-), орнитиндекарбоксилаза (-), лизиндекарбоксилаза (+), гистидин (-), кумарат (+), что подтверждает его видовую принадлежность с вероятностью идентификации 99%.

Штамм Е. coli BL21(DE3) BpsOmpA является продуцентом рекомбинантной плазмидной ДНК pBpsOmpA размером 7.2 т.п.н. Уровень выхода (синтеза) плазмидной ДНК pBpsOmpA в штамме составляет 0.25 мг/л при плотности культуры OD₆₀₀=0.5. Плазмида pBpsOmpA несет в своем составе ori репликации и маркер резистентности (Amp^R) вектора pPAL7, промотор Т7lас, расположенный непосредственно перед областью вставки, а также полноразмерную последовательность гена поверхностного протеина OmpA/MotB В. pseudomallei размером 1310 п.н. Продуктом экспрессии клонированного гена является протеин с молекулярной массой 36,9 kDa, который может быть накоплен и очищен.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. ПЦР-детекция клонированного фрагмента

Для детекции клонированного фрагмента геномную ДНК рекомбинантного штамма выделяли методом протеиназного лизиса [Тетерятникова Н.Н. Молекулярная детекция интегронов класса 1 у Burkholderia pseudomallei / Н.Н. Тетерятникова, И.Б. Захарова, М.В. Подшивалова и др. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - №2 (108). - С. 46-49]. Из 18-часовой культуры рекомбинантного штамма Е. coli BL21(DE3) BpsOmpA делали взвесь в 150 мкл деионизированной воды, которую смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-HCl, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl₂, 0.2 мг/мл желатина, 0.9% Nonidet Р-40, 0.9% Твин 20, 200 мкг/мл протеиназы К), инкубировали при 60°C 180 мин, прогревали при 97°C 30 мин для инактивации фермента, центрифугировали (10.000 об/мин в течение 1 мин) и хранили до использования при - 20°C.

Амплификацию полной кодирующей последовательности гена ompA/motB с использованием оригинальных праймеров bps4255 проводили в монолокусном формате на амплификаторе С1000 (Bio-Rad) при параметрах: плавление 95°C, 4 мин, 35 реакционных циклов (денатурация 94°C 40 с, отжиг праймеров 66,2°C, 30 с, удлинение цепи 72°C 120 с), финальная элонгация 72°C в течение 10 мин.

Объем реакционной смеси на одну пробу составлял 15 мкл, концентрация праймеров - 0.100 μМ. Препарат геномной ДНК вносили в реакционную смесь в объеме 1 мкл. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1.5% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и визуализировали в системе гель-документирования. Результат электрофореза подтвердил наличие специфического ампликона гена ompA/motB размером 1310 п.н. в исследованной ДНК рекомбинантного штамма (рис. 1).

Пример 2. Анализ экспрессии целевого белка OmpA/MotB

Для экспрессии поверхностного протеина OmpA/MotB В. pseudomallei в клетках Е. coli BL21(DE3) BpsOmpA ночную культуру штамма-продуцента засевали в LB бульон, содержащий ампициллин (100 мкг/мл) и 0,5% глюкозы и выращивали при 37°C и интенсивной аэрации в течение 18-20 ч до достижения оптической плотности раствора OD₆₀₀=0.5-0.7. Затем для индукции синтеза целевого белка в бульон с культурой вносили изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 2 μМ и продолжали культивировать при 37°C в течение 4 ч.

Клетки осаждали центрифугированием и разрушали при помощи ультразвука. Анализ ультразвукового дезинтеграта клеточных суспензий рекомбинантного штамма в SDS-PAGE подтвердил наличие клонированного белка OmpA/MotB с известной молекулярной массой (36,9 kDa), причем концентрация целевого белка в индуцированном варианте значительно превышала таковую без индукции. На рис. 2 представлена электрофореграмма тотальных лизатов Е. coli BL21(DE3) BpsOmpA, где 1 - белковый маркер молекулярного веса, кДа, 2 - лизат клеток, культивируемых в условиях индукции синтеза целевого белка, 3 - лизат неиндуцированных клеток.

Таким образом, сконструированный штамм бактерий Е. coli BL21 (DE3) BpsOmpA является продуцентом рекомбинантной плазмидной ДНК pBpsOmpA, несущей полноразмерную последовательность гена поверхностного протеина OmpA/MotB В. pseudomallei, и может быть использован для экспрессии клонированного гена мембранного белка OmpA/MotB В. pseudomallei, его накопления, выделения и очистки.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к штамму бактерии Escherichia coli BL21(DE3) BpsOmpA - продуценту поверхностного протеина OmpA/MotB с молекулярной массой 36,9 кДа. Указанный штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» под номером КМ 253. Настоящий штамм является носителем рекомбинантной плазмидной ДНК pBpsOmpA с клонированной полноразмерной последовательностью гена поверхностного протеина OmpA/MotB Burkholderia pseudomallei 56770 SMR2. Настоящее изобретение позволяет получать поверхностный протеин OmpA/MotB с молекулярной массой 36,9 кДа. 2 ил., 2 пр.

Штамм бактерии Escherichia coli BL21(DE3) BpsOmpA, Государственная коллекция патогенных бактерий ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» КМ 253, - носитель рекомбинантной плазмидной ДНК pBpsOmpA с клонированной полноразмерной последовательностью гена поверхностного протеина OmpA/MotB Burkholderia pseudomallei 56770 SMR2, продуцент поверхностного протеина OmpA/MotB с молекулярной массой 36,9 кДа.