СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОТСЛЕЖИВАНИЯ В ОБРАЗЦЕ ЧАСТИЦЫ, В ЧАСТНОСТИ ОДНОЙ МОЛЕКУЛЫ Российский патент 2017 года по МПК G01N15/14 G01N21/64 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу отслеживания движения в образце частицы, которая испускает фотоны при ее освещении, а также к способу, включающему в себя обнаружение фотонов, испускаемых частицей. Далее настоящее изобретение относится к устройству для выполнения такого способа, включающему в себя источник света, выполненный с возможностью обеспечивать свет, и детектор, выполненный с возможностью обнаруживать фотоны.

Частица, движение которой отслеживается в образце, может быть одной молекулой, группой движущихся вместе молекул, комплексом, квантовой точкой, отражающей частицей золота и т.п.

Процесс, лежащий в основе испускания фотонов освещаемой частицей, может быть флюоресценцией. Однако в качестве основания для испускания фотонов могут также использоваться много других процессов, например рассеяние света.

Соответствующий процесс, вызывающий испускание фотонов, может быть связан со свойствами самой частицы, которая будет отслеживаться, или с маркером, в частности с краской, отмечающей частицу, которая должна отслеживаться.

Уровень техники

В соответствии с известным способом отслеживания движения одной молекулы в образце молекула возбуждается светом для испускания фотонов, и фотоны, испускаемые молекулой, обнаруживаются с помощью двумерного детектора, формирующего изображение образца. Текущее положение молекулы затем определяется из пространственного распределения фотонов, обнаруженных детектором. При подходящей плотности пикселей детектора текущее положение молекулы может быть определено из пространственного распределения фотонов при пространственном разрешении выше, чем дифракционный предел. Однако существует дополнительное требование для отслеживания частицы при пространственном разрешении выше дифракционного предела, что большее количество фотонов может быть обнаружено для каждого положения молекулы, то есть прежде чем молекула изменит свое положение. Это требование основано на том факте, что большее количество фотонов только улучшает пространственное разрешение, достигаемое при определении положения молекулы, если это положение остается неизменным в течение всего периода времени, в котором молекула испускает большее количество фотонов.

Пространственное разрешение определяется радиусом Δr окружности вокруг положения молекулы, определенного по центру интенсивности дифракционного пятна фотонов от молекулы, попавших на детектор. Истинное положение молекулы расположено в пределах этой окружности. Радиус Δr определяется формулой

Δr=FWHM/N^1/2 (1)

и зависит от количества N обнаруженных фотонов и от полной ширины на половине максимума FWHM дифракционного пятна.

Поскольку известный способ отслеживания движения одной молекулы требует огромного количества N фотонов для каждого положения молекулы в образце, молекула подвергается серьезному напряжению, что приводит к увеличенному риску обесцвечивания молекулы. В процессе обесцвечивания молекула, находящаяся в возбужденном состоянии, химически изменяется таким образом, что после обесцвечивания фотоны молекулой больше не испускаются. Кроме фотохимического обесцвечивания возможно также, что молекула, которая была интенсивно и/или многократно возбуждена для испускания фотонов, перейдет в метастабильное темное состояние. Из метастабильного темного состояния молекула может возвратиться после некоторого времени. До этого, однако, молекула не может испускать фотоны, требуемые для того, чтобы непрерывно отслеживать молекулу.

Следовательно, существуют только некоторые молекулы, то есть только некоторые так называемые флуоресцентные краски или флуорофоры, которые подходят для использования в известном способе. Многие флуорофоры обесцвечиваются слишком быстро, и следовательно их движение или движение молекулы, отмеченной флуорофором, не может быть отслежено в течение длительного периода времени или большого расстояния, преодолеваемого в пределах образца.

Для вышеупомянутого способа положение молекулы определяется по распределению положений, в которых фотоны, испускаемые молекулой, обнаружены двумерным детектором. Этот подход называют локализацией. Другой подход, отличающийся от локализации, реализуется с помощью так называемой флюоресцентной световой микроскопии на основе подавления спонтанного испускания (STED) или RESOLFT (REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions). Здесь пространственная область, в которой молекулы в образце эффективно возбуждены для испускания фотонов, уменьшается до размера меньше, чем дифракционный предел. Таким образом, фотоны, испускаемые из образца, могут быть приписаны этой конкретной пространственной области уменьшенного размера независимо от положения, в котором фотоны обнаружены, и независимо от количества обнаруженных фотонов. На практике уменьшение пространственной области эффективного возбуждения молекул для испускания фотонов достигается путем применения сфокусированного возбуждающего светового луча, на который наложена интерференционная картина когерентных лучей света, замедляющих флюоресценцию. Эта интерференционная картина включает в себя нулевую точку в фокусе возбуждающего светового луча. Для высокой абсолютной интенсивности лучей замедляющего флюоресценцию света интенсивность замедляющего флюоресценцию света превышает интенсивность насыщения IS везде, кроме нулевой точки, так что испускание фотонов молекулами в образце замедляется по существу везде, кроме нулевой точки. Достигаемое пространственное разрешение определяется формулой

Δr=λ/(n sin α (1 + I/I_S)^1/2) (2),

где I представляет собой максимальную интенсивность интерференционной картины в образце.

В световой флюоресцентной микроскопии STED ингибирование флюоресценции достигается с помощью вынужденной эмиссии. В случае флюоресцентной микроскопии RESOLFT ингибирование флюоресценции достигается временным переходом молекул в состояние подтверждения, в котором молекулы не способны флуоресцировать. Поскольку в световой флюоресцентной микроскопии STED требуется высокая абсолютная интенсивность замедляющего флюоресценцию света, риск обесцвечивания используемого флуорофора относительно высок. Для световой флюоресцентной микроскопии RESOLFT достаточна уже относительно низкая интенсивность замедляющего флюоресценцию света. Однако этот подход может быть применен только со специальным флуорофором, который может быть переключен в такое конформационное состояние, в котором флуорофор не способен флуоресцировать.

В большинстве случаев такие подходы, как световая флюоресцентная микроскопия STED или RESOLFT, являются удовлетворительными для отслеживания движений частицы в образце, в котором частица отслеживается в области уменьшенного пространственного размера, где частица эффективно возбуждается для испускания флюоресцентного света. Обнаружение того, расположена ли частица все еще в области уменьшенного пространственного размера, где частица может быть эффективно возбуждена для испускания флюоресцентного света, и определение таким образом положения частицы, было бы возможно только при том, что скорость испускания фотонов отслеживаемой частицей будет непрерывно максимизироваться. Хотя бы для отслеживания согласно этому подходу требуется меньше фотонов, чем для непрерывной локализации частицы, число частиц и маркеров, которые подходят для отслеживания движения на более длинных расстояниях, не может быть значительно увеличено. Кроме того, в световой флюоресцентной микроскопии STED и RESOLFT для того, чтобы обеспечить свет возбуждения и свет для замедления флюоресценции, должны быть применены различные лучи света. Это требует дополнительных усилий, поскольку различные лучи света имеют различные длины волн и поскольку различные лучи света должны быть тщательно совмещены в пространстве.

Из патентного документа DE 2546952 A1 известна оптическая система, базирующаяся на так называемом ослабленном полном отражении, которая применяется для того, чтобы отслеживать движения частиц в образце. В соответствии с патентным документом DE 2546952 A1 образец облучается светом, побуждающим частицы испускать фотоны. Поскольку распределение интенсивности света, освещающего образец, является не однородным, а пространственно модулированным, движение частицы приводит к соответствующим флуктуациям количества испускаемых фотонов. Таким образом, рассматривая модуляцию распределения интенсивности, можно сделать выводы о движении частицы по обнаруженным флуктуациям испускаемых фотонов, то есть по модуляции сигнала детектора. Однако движение частицы, проходящей вдоль пути постоянной интенсивности света, не может быть отслежено. В частности, частица, которая никогда или лишь изредка освещается, не может быть отслежена. Вместо этого, чтобы отслеживать движения частиц в образце с помощью оптической системы, известной из патентного документа DE 2546952 A1, существенно, чтобы частицы освещались часто. Следовательно, риск обесцвечивания частиц или маркеров, отмечающих частицы, эффективно не уменьшается, но должен быть принят.

Таким образом, все еще существует потребность в способе и устройстве для того, чтобы отслеживать движение частицы в образце, в котором риск обесцвечивания частицы или маркера, отмечающего частицу, остается малым, даже если движение частицы отслеживается в течение длительного промежутка времени или на длинном расстоянии, преодолеваемом частицей в образце.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к способу отслеживания в образце движения частицы, которая испускает фотоны при ее освещении. Способ включает в себя формирование света для обеспечения распределения интенсивности света, включающего в себя пространственно ограниченный минимум. Распределение интенсивности света применяется к образцу таким образом, что частица располагается в пространственно ограниченном минимуме распределения интенсивности света. Фотоны, испускаемые частицей, обнаруживаются, и распределение интенсивности света перемещается относительно образца таким образом, чтобы количество фотонов, испускаемых частицей, оставалось минимальным. Таким образом, частица отслеживается по минимуму распределения интенсивности света.

Далее, настоящее изобретение относится к устройству для отслеживания движения частицы в образце. Устройство включает в себя источник света, выполненный с возможностью обеспечения света для того, чтобы он побудил частицу испускать фотоны, причем источник света включает в себя средство формирования луча, выполненное с возможностью освещения образца с распределением интенсивности, включающим в себя пространственно ограниченный минимум, детектор, выполненный с возможностью обнаруживать фотоны, испускаемые частицей и обеспечивать сигнал, указывающий на количество обнаруженных фотонов, а также средство отклонения луча, выполненное с возможностью перемещения распределения интенсивности относительно образца, управляемого на основе сигнала детектора таким образом, что количество фотонов, обнаруженных детектором, остается минимальным для того, чтобы отслеживать с помощью минимума распределения движущуюся частицу.

Дальнейшие выгодные варианты осуществления настоящего изобретения следуют из формулы изобретения, описания и чертежей. Преимущества особенностей и комбинаций множества особенностей, упомянутых в этом описании, служат лишь примерами и могут использоваться альтернативно или кумулятивно без необходимости того, чтобы варианты осуществления в соответствии с настоящим достигали этих преимуществ. Без изменения охвата защиты, определенного включенной формулой изобретения, следующее применяется в отношении раскрытия оригинальной заявки и патента: дополнительные особенности могут быть взяты из чертежей, в частности из проиллюстрированных конструкций и размеров множества компонентов относительно друг друга, а также из их относительного расположения и их оперативного соединения. Комбинация особенностей различных вариантов осуществления настоящего изобретения или особенностей других пунктов формулы изобретения, независимых от выбранных пунктов формулы изобретения, также возможна, и это мотивировано при этом. Это также относится к особенностям, которые проиллюстрированы на отдельных чертежах, или которые упомянуты при их описании. Эти особенности могут также сочетаться с особенностями различных пунктов формулы изобретения. Кроме того, возможно, что дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения не имеют всех особенностей, упомянутых в пунктах формулы изобретения. Они могут даже не иметь всех особенностей, упомянутых в независимых пунктах формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

Далее настоящее изобретение объясняется и описывается со ссылкой на предпочтительные примерные варианты осуществления, проиллюстрированные на чертежах.

Фиг. 1 иллюстрирует примерный вариант осуществления устройства в соответствии с настоящим изобретением для выполнения варианта осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 2 показывает другой примерный вариант осуществления устройства в соответствии с настоящим изобретением для выполнения другого варианта осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 3 показывает частицу в области минимума распределения интенсивности для того, чтобы побудить частицу испускать фотоны.

Фиг. 4 показывает распределение интенсивности в соответствии с Фиг. 3 в зависимости от положения вдоль линии профиля; дополнительно показано количество получающихся фотонов, испускаемых частицей в соответствии с Фиг. 3.

Фиг. 5 показывает ситуацию после движения частицы из ее положения в соответствии с Фиг. 3; и

Фиг. 6 показывает ситуацию после того, как распределение интенсивности переместилось вслед за движением частицы.

Осуществление изобретения

В соответствии со способом по настоящему изобретению к образцу применяется распределение интенсивности света, включающее в себя пространственно ограниченный минимум. Как и в случае замедляющего флюоресценцию света, используемого во флюоресцентной микроскопии STED или RESOLFT, это распределение интенсивности предпочтительно формируется интерференционной картиной лучей когерентного света, в котором пространственно ограниченный минимум представляет собой нулевую точку интерференционной картины. Таким образом, минимум может быть обеспечен с малыми пространственными размерами. В частности, пространственные размеры минимума могут быть меньше, чем дифракционный предел. В отличие от флюоресцентной микроскопии STED и RESOLFT, свет, имеющий это конкретное распределение интенсивности, используется не для того, чтобы замедлять флюоресценцию, а для того, чтобы побудить частицу, которая отслеживается в образце, испускать фотоны в способе в соответствии с настоящим изобретением. Далее, образец не сканируется минимумом распределения интенсивности, но распределение интенсивности лишь непрерывно перемещается относительно образца таким образом, чтобы количество фотонов, испускаемых частицей и после этого обнаруживаемых, было минимальным. Минимальное количество фотонов соответствует тому, что частица все еще расположена в положении минимума распределения интенсивности света. При резком увеличении интенсивности света за пределами минимума и посредством быстрого отслеживания распределения интенсивности относительно текущего положения частицы в образце с использованием этого резкого увеличения движение частицы может быть отслежено с пространственным разрешением, которое значительно ниже дифракционного предела. В способе в соответствии с настоящим изобретением не требуется, чтобы частица испускала много фотонов. Следовательно, риск обесцвечивания частицы сильно уменьшается. Следовательно, даже частицы, которые являются склонными к обесцвечиванию, могут отслеживаться в течение более длительных промежутков времени или на более длинных расстояниях, преодолеваемых частицей в образце. Далее, в отличие от способов, основанных на флюоресцентной микроскопии STED или RESOLFT, в способе в соответствии с настоящим изобретением образец подвергается только распределению интенсивности, включающему в себя минимум. Таким образом, свет не должен быть выровнен ни пространственно, ни относительно его длины волны по отношению к другому лучу света. Из-за этого оптическая установка для применения способа в соответствии с настоящим изобретением является значительно менее сложной, чем оптическая установка флюоресцентного микроскопа STED или RESOLFT. По сравнению с флюоресцентной микроскопией STED и RESOLFT имеется также другое отличие: в соответствии со способом в соответствии с настоящим изобретением малой абсолютной интенсивности распределения интенсивности света с минимумом уже достаточно, при условии, что распределение интенсивности света вызывает испускание фотонов уже при низкой интенсивности вне его минимума. В особенности, не требуется, чтобы достигалось насыщение возбуждения для испускания вне нулевой точки для того, чтобы достичь пространственного разрешения ниже дифракционного предела. Вместо этого во многих случаях предпочтительно, чтобы возбуждение заметно увеличивалось с увеличением расстояния от нулевой точки. И наконец, последней, но не менее важной особенностью, отличающей настоящее изобретение, является то, что количество фотонов, испускаемых отслеженной частицей, минимизируется, и таким образом риск ее обесцвечивания также минимизируется.

Перемещение или отклонение распределения интенсивности относительно образца для непрерывной минимизации количества фотонов, обнаруженных детектором, может быть основано на подходе метода проб и ошибок. То есть распределение интенсивности перемещается в порядке проб малыми шагами. Если движение вызывает уменьшение количества обнаруженных фотонов, похожего на количество испускаемых фотонов, распределение интенсивности перемещается дальше в том же самом направлении. В противоположном случае, если движение вызывает увеличение количества обнаруженных фотонов, распределение интенсивности перемещается в другом направлении, например, в противоположном направлении. Различные подходящие алгоритмы и варианты осуществления, наподобие тех, которые обозначаются ключевыми словами "алгоритм отслеживания" и "нечеткая логика", доступны специалистам в данной области техники.

Из флюоресцентной микроскопии STED или RESOLFT известны различные методики для формирования распределения интенсивности замедляющего флюоресценцию света, включающего в себя минимум. Любая из этих методик также может использоваться в способе в соответствии с настоящим изобретением. В качестве лишь некоторых примеров, фазовые фильтры, пространственные модуляторы света, конфигурации 4п и т.п. могут использоваться для того, чтобы сформировать распределение интенсивности света, включающее в себя минимум.

Для перемещения или отклонения распределения интенсивности света с минимумом относительно образца может быть применен сканер, как известно из флюоресцентной микроскопии STED и RESOLFT. Например, такой сканер включает в себя оптоакустические или электрооптические отражатели, вращающиеся зеркала, пьезоэлектрические исполнительные механизмы, посредством которых положение образца изменяется относительно лучей света, или пьезоэлектрические исполнительные механизмы, которые приводят в действие линзу объектива, и с помощью которых лучи света перемещаются относительно образца.

Следует отметить, что перемещение распределения интенсивности света с минимумом относительно образца альтернативно или дополнительно к отклонению распределения интенсивности света также может быть достигнуто путем перемещения образца относительно распределения интенсивности света с минимумом. Перемещение распределения интенсивности света с минимумом относительно образца требует только относительного движения между распределением интенсивности света с минимумом и образцом. В частности, перемещение распределения интенсивности света с минимумом относительно образца в направлениях x и y может быть достигнуто путем отклонения распределения интенсивности света, а перемещение распределения интенсивности света с минимумом относительно образца в направлении z может быть достигнуто путем перемещения образца. Направление z может быть направлением, ортогональным к плоскости главной поверхности образца, через которую распределение интенсивности света применяется к образцу, а направления x и y могут проходить вдоль или параллельно к этой плоскости главной поверхности.

В соответствии со способом по настоящему изобретению минимум распределения интенсивности света может быть пространственно ограничен в одном, двух или трех измерениях, то есть минимум может быть плоским, линейным или точечным. Для отслеживания движения частицы распределение интенсивности затем перемещается или отклоняется относительно образца во всех направлениях этих измерений, в которых минимум ограничен. Движение в направлении, в котором минимум не ограничен, не будет вызывать уменьшения количества фотонов, испускаемых частицей, и таким образом не может использоваться эффективно. Это также означает, что движение частицы в этом направлении не может быть отслежено. Следовательно, это направление предпочтительно ориентировано таким образом, что движение частицы в этом направлении не ожидается. Во многих случаях движения частиц в образце так или иначе ограничены направлением вдоль специфической структуры. В случае двумерного образца движение частицы в направлении третьего измерения опускается в принципе.

Также возможно смодулировать фазовое отношение лучей света, обеспечивающее распределение интенсивности путем интерференции, для того, чтобы одномерно или двумерно ограничить минимум в различных направлениях. Например, фазовое отношение может изменяться между первым и вторым фазовыми отношениями таким образом, что минимум ограничен кольцом на плоскости x-y в случае первого фазового отношения, а также ограничен в z-направлении в случае второго фазового отношения. Альтернативно, различные последовательные фазовые отношения могут привести к линейному или плоскостному минимуму, который может быть ориентирован в различных направлениях. Такие минимумы могут быть описаны как вращающиеся полосы и включают в себя точку или линию как их пересечение в пространстве. Если быстро переключаться между такими фазовыми отношениями, и если минимум количества фотонов, испускаемых частицей, расположен либо индивидуально для каждого фазового отношения, либо по всей вариации фазовых отношений, движение частицы в образце может быть отслежено во всех трех измерениях.

В соответствии со способом по настоящему изобретению фотоны, испускаемые частицей, не должны обнаруживаться двумерным массивом детекторов. Вместо этого достаточно использовать точечный детектор для обнаружения фотонов, поскольку отслеживание главным образом зависит от количества этих фотонов. Текущее положение частицы в образце может быть определено из текущего положения распределения интенсивности с минимумом относительно образца. Это положение может быть получено из положений тех устройств, с помощью которых распределение интенсивности перемещается относительно образца, например, из текущего положения сканера, используемого для того, чтобы перемещать распределение интенсивности. Положение распределения интенсивности относительно образца также может быть определено напрямую, например, путем обнаружения фотонов, испускаемых частицей, с помощью камеры, формирующей изображение образца, и последующей оценки на камере изображения распределения интенсивности света, состоящего из этих фотонов. В соответствии с принципами локализации, это определение также позволяет достичь разрешения за дифракционным пределом.

Далее, формирование изображение образца с помощью камеры может использоваться для того, чтобы определить исходное положение частицы путем освещения образца светом, который побуждает частицы испускать фотоны, без пространственной структуризации света. В случае, если одна, две или больше частиц испускают фотоны и не могут быть отслежены отдельно друг от друга, возможно фотохимически обесцветить избыточные частицы путем целенаправленного применения высокой интенсивности света в максимумах распределения интенсивности света, смежных с его минимумом. Такое обесцвечивание мешающих частиц также может быть применено тогда, когда установлено, например, при помощи камеры, что переместилась не отслеживаемая частица, а другая частица подобного вида, которая проходила по пути отслеживаемой частицы. Это может быть установлено, например, по огромному количеству испускаемых фотонов вдали от минимума распределения интенсивности света.

Камера, формирующая изображение образца, может также использоваться для того, чтобы определить направление движения частицы из положений, где фотоны, испускаемые частицами, обнаруживаются камерой. Для этого определения также возможно, что выполняется локализация частиц на основе фотонов, которые испускает частица при покидании минимума распределения интенсивности света. Здесь не требуется, чтобы локализация выполнялась с высокой точностью. Таким образом, не требуется, чтобы частица испускала много фотонов, так как испускаемые фотоны используются лишь для того, чтобы определить направление, в котором должен быть перемещен минимум распределения интенсивности света, чтобы следовать за частицей. Однако испускаемые фотоны не нужны для того, чтобы достичь желаемого пространственного разрешения при отслеживании частицы. Вместо этого пространственное разрешение достигается последующей минимизацией количества фотонов, испускаемых частицей, и, таким образом, формой и/или расположением минимума распределения интенсивности света.

Поскольку способ в соответствии с настоящим изобретением нацелен на минимизацию количества фотонов, испускаемых частицей, становится важным фон, который обнаруживается в дополнение к фотонам. Фон может быть, например, образован светом, который применяется к образцу для того, чтобы побудить частицы испускать фотоны, или который образуется вследствие автофлюоресценции частиц. Для того, чтобы минимизировать влияние фона, свет, побуждающий частицы испускать фотоны, может применяться к образцу импульсно, и фотоны, испускаемые частицами, могут обнаруживаться в ограниченном временном интервале после каждого из импульсов света. Этот временной интервал или окно может быть настроен таким образом, чтобы достигалось максимальное отношение сигнал-шум.

Способ в соответствии с настоящим изобретением может также быть применен к отслеживанию переключаемой частицы, например переключаемой молекулы, где свет для вызывания испускания фотонов может вызвать активацию переключаемой молекулы из того состояния, в котором частицу нельзя побудить испускать фотоны, в состояние флюоресценции, в котором частицу можно побудить испускать фотоны. Один пример такой переключаемой молекулы называется PADRON, который является мутантом зеленого флуоресцентного протеина (GFP). Хотя это и не требуется, в этом варианте осуществления может быть предпочтительным, чтобы частица быстро возвращалась в нефлуоресцентное темное состояние, так как это поддерживает эффект минимизации количества испускаемых фотонов, достигаемый в минимуме распределения интенсивности света, вызывающего испускание фотонов. Возвращение частицы в темное состояние может произойти спонтанно или может быть вызвано любым физическим или химическим сигналом. Поскольку не требуется, чтобы этот стимулирующий сигнал был пространственно структурирован, он предпочтительно не структурируется пространственно. Например, свет с другой длины волны, отличной от длины волны света, вызывающего испускание фотонов, также может использоваться для подстройки малых концентраций активизированных частиц, которые можно побудить испускать фотоны в образце, как это требуется для любого отслеживания одиночных частиц. С этой целью может использоваться молекула под названием DRONPA. DRONPA является другим мутантом GFP и имеет характеристики активации на ее длине волны возбуждения, которые являются обратными по сравнению с характеристиками молекулы PADRON.

Также в соответствии со способом по настоящему изобретению возможно отслеживать движения двух или больше различных частиц. С этой целью может использоваться свет двух или больше различных длин волн, и могут быть обнаружены фотоны с длиной волны, являющейся характерной для соответствующих частиц. Кроме обычной линзы объектива, это отслеживание двух или больше различных частиц может быть выполнено с помощью отдельных устройств. Однако эти устройства могут также совместно использовать общие части, кроме соответствующих источников света. Все общие части могут тогда использоваться попеременно для обеих частиц, то есть путем переключения между прослеживанием одной частицы и прослеживанием другой частицы.

Устройство в соответствии с настоящим изобретением включает в себя источник света, обеспечивающий свет, который используется для того, чтобы побудить частицу испускать фотоны, и детектор для обнаружения фотонов, испускаемых частицей. Устройство далее включает в себя средства формирования луча в источнике света, чтобы применить к образцу свет с распределением интенсивности, включающим в себя пространственно ограниченный минимум. Кроме того, обеспечивается средство отклонения луча, которое управляется в зависимости от сигнала детектора. Эта зависимость формируется так, чтобы сохранять количество фотонов, обнаруживаемых детектором, минимальным путем перемещения или отклонения распределения интенсивности света относительно образца. Таким образом, движущаяся частица отслеживается с помощью минимума распределения интенсивности света.

Источник света устройства в соответствии с настоящим изобретением может накладывать лучи когерентного света, которые интерферируют с образованием интерференционной картины, имеющего нулевую точку в положении минимума. Для модулирования фазового отношения лучей света источник света может включать в себя динамически управляемый пространственный световой модулятор.

Для формирования изображения образца может быть предусмотрена камера. Камера может использоваться, например, для того, чтобы определять, где в образце расположена частица, которая будет отслежена. Для этого определения образец может быть освещен светом без пространственной структуры. Камера может также использоваться для того, чтобы определить положение распределения интенсивности света, когда частица отслеживается в образце. Кроме того, камера может использоваться для того, чтобы определить направление, в котором должно быть перемещено распределение интенсивности для того, чтобы отслеживать частицу.

Для того, чтобы отслеживать две разные частицы, могут быть предусмотрены два источника света, обеспечивающие свет с различными длинами волн. Для одновременного отслеживания для каждого из источников света могут быть предусмотрены отдельные средства формирования луча и средства отклонения луча. Однако возможно также, что для обоих источников света предусматриваются общие средства, которые используются попеременно. Также возможно, чтобы было предусмотрено больше чем два источника света для одновременного или быстрого попеременного отслеживания более чем двух частиц.

В частности, источник света может быть импульсным источником света, таким как импульсный лазер, таким образом, что свет применяется к образцу импульсами. Детектор тогда может быть синхронизирован с импульсным источником света таким образом, что фотоны, испускаемые частицей, обнаруживаются после каждого светового импульса в ограниченном интервале времени при максимальном соотношении сигнал-шум.

Поскольку устройство в соответствии с настоящим изобретением требует обеспечения света лишь для того, чтобы побудить частицу испускать фотоны, его настройка может быть весьма простой. Однако устройство в соответствии с настоящим изобретением также может быть реализовано на основе (уже существующего) флюоресцентного микроскопа STED или RESOLFT. Здесь средство формирования луча, используемое для лучей света, замедляющих флюоресценцию, может использоваться для света, с помощью которого частицу побуждают испускать фотоны в соответствии с настоящим изобретением. Далее, средство отклонения луча, используемое для сканирования образца, может быть адаптировано к использованию для отслеживания частицы путем минимизации количества обнаруженных фотонов.

Обращаясь теперь более подробно к чертежам, Фиг. 1 показывает устройство 1 для отслеживания движения частицы 2 в образце 3. Частица 2 может, например, быть флуоресцентным маркером, либо частица 2 может быть отмечена таким флуоресцентным маркером. Свет 4 от источника 5 света побуждает флуоресцентный маркер испускать фотоны. Это по существу происходит только за пределами минимума распределения интенсивности света 4 в образце 3. Это распределение интенсивности более подробно описано со ссылками на Фиг. 3-6. Источник 5 света включает в себя лазер 6, средство 7 формирования луча для подстройки желаемого распределения интенсивности света в фокальном объеме линзы 8 объектива, и средства 9, 10 и 11 отклонения луча для подстройки положения минимума распределения интенсивности света 4 в образце 3. Средства 9 и 10 отклонения луча непосредственно работают со светом 4 и перемещают или отклоняют минимум в направлении x и/или y, то есть в боковом направлении по отношению к пути света. Средство 11 отклонения луча, однако, непосредственно работает с образцом 3 и перемещает или отклоняет минимум распределения интенсивности света 4 относительно образца 3 в направлении z. Позади дихроичного расщепителя 13 луча предусмотрен точечный детектор 12 для селективного обнаружения фотонов, испускаемых частицей 2. Расщепитель 13 луча расположен на оптическом пути между лазером 6 и образцом 3, и в частности между лазером 6 и средствами 9 и 10 отклонения луча. Другой расщепитель 14 луча расположен между средствами 9 и 10 отклонения луча и линзой 8 объектива. Посредством расщепителя 14 луча камера 15, включающая в себя двумерный детектор, следит за образцом 3. Для первоначального определения местонахождения частицы 2 свет 4 применяется к образцу 3 на большой площади, и местонахождение частицы 2 обнаруживается на основе фотонов, испускаемых частицей 2 и воспринимаемых камерой 15. Затем распределение интенсивности света 4 подстраивается относительно частицы 2 таким образом, чтобы частица 2 располагалась в положении минимума распределения интенсивности света 4. То, что частица 2 на самом деле находится в положении минимума, проверяется путем перемещения распределения интенсивности света 4 относительно образца 3 на основе проб. При этих перемещениях должно увеличиваться количество фотонов, испускаемых частицей 2, которые обнаруживаются точечным детектором 12. Однако уменьшение количества фотонов указывает на то, что распределение интенсивности света 4 должно быть изменено так, чтобы отслеживать частицу 2 посредством минимума, поскольку частица 2 переместилась. Увеличение количества фотонов без перемещения распределения интенсивности света 4 также означает, что частица 2 переместилась в образце 3. Тогда распределение интенсивности света 4 должно быть перемещено для того, чтобы отследить частицу 2 посредством минимума, пока количество фотонов снова не достигнет своего минимума. Для этого отслеживания средства 9-11 отклонения луча управляются контроллером 16 в зависимости от сигнала детектора 12. Положение и/или перемещение минимума распределения интенсивности света 4, которое определяется во время отслеживания, соответствует перемещению частицы 2 в образце 3. Направление перемещения частицы 2 может быть определено из тех положений, где фотоны, испускаемые частицей 2, обнаруживаются камерой 15, то есть где частица выходит из минимума, чтобы поддержать отслеживание частицы посредством минимума.

На Фиг. 1 обозначено, что контроллер 16 также управляет средством 7 формирования луча. На практике средство 7 формирования луча может быть пространственным модулятором света, с помощью которого различные распределения интенсивности света 4 могут быть подходящим образом подстроены в образце 3. Минимумы этих распределений интенсивности света ограничены каждый в одном или в двух измерениях и включают в себя только общую точку пересечения, с помощью которой частица 2 может быть отслежена в образце 3. Этот вариант осуществления позволяет отслеживать частицу 2, принимая во внимание ее перемещение в образце 3 с максимальным пространственным разрешением во всех трех измерениях.

Вариант осуществления устройства 1, проиллюстрированный на Фиг. 2, не включает в себя точечный детектор 12, изображенный на Фиг. 1. Здесь предусматривается только камера 15 для обнаружения фотонов, испускаемых частицей 2 в образце 3. Далее, образец 3 по существу является двумерным образцом. Распределение интенсивности света 4 включает в себя центральный минимум, окруженный кольцеобразным максимумом, с помощью которого отслеживается частица 2. Это бубликообразное распределение интенсивности света 4 образуется с помощью статического средства 7 формирования луча. В плоскость двумерного образца 3 минимум распределения интенсивности света 4 помещается средствами отклонения луча 9 и 10, которые непосредственно работают со светом 4. Камера 15 расположена позади дополнительной линзы 17 объектива, которая расположена на стороне образца 3, противоположной линзе 8 объектива. Здесь камера 15 дополнительно используется для определения положения распределения интенсивности света 4 в образце 3. Это с одной стороны позволяет определять текущее положение средств 9 и 10 отклонения луча. С другой стороны, это может использоваться для того, чтобы определять положение минимума распределения интенсивности света 4 в образце. В частности, положение минимума в образце таким образом также может быть определено с пространственным разрешением, которое значительно ниже дифракционного предела.

Фиг. 3 схематично показывает распределение интенсивности света 4 в образце 3, причем частица 2 располагается в центральном минимуме 19 распределения 18 интенсивности света. Фиг. 4 представляет собой график, показывающий интенсивность I распределения 18 интенсивности света (сплошная линия) вдоль линии профиля через образец 3 в соответствии с Фиг. 3 (в увеличенном масштабе). В области минимума 19 распределение 18 интенсивности света имеет существенно синусоидальную кривизну, которая симметрична относительно минимума 19. В дополнение к распределению 18 интенсивности света Фиг. 3 показывает получающееся количество R фотонов, испускаемых частицей 2 (пунктирная линия), в предположении, что частица 2 подвергается освещению светом 4 соответствующей интенсивности I. В положении минимума 19 количество R также принимает свое минимальное значение Rmin. Как только частица 2 выходит из этого минимума 19, количество R быстро увеличивается. В частности, даже при небольшом расстоянии до минимума 19 количество R уже достигает значения, близкого к или равного его максимальному значению Rmax. Это поведение с выгодой используется для отслеживания частицы 2 в образце 3 посредством минимума 19 распределения 18 интенсивности света с высоким пространственным разрешением.

Когда частица 2 изменяет свое положение относительно распределения 18 интенсивности и покидает минимум 19, как проиллюстрировано на Фиг. 5, обнаруживается увеличенное количество R фотонов, испускаемых частицей 2. Путем перемещения распределения 18 интенсивности в образце 3 на основе проб, количество фотонов снова уменьшается и поддерживается минимальным. Таким образом определяется, в каком направлении и на какое расстояние переместилась частица 2, так как минимум количества фотонов не будет достигнут прежде, чем распределение 18 интенсивности света с минимумом 19 не будет перемещено в том же самом направлении и на то же самое расстояние относительно образца 3, как проиллюстрировано на Фиг. 6. Направление, в котором распределение интенсивности 18 с минимумом 19 должно быть перемещено для того, чтобы отслеживать частицу 2, также может быть определено из положений, в которых фотоны, испускаемые частицей 2, обнаруживаются камерой.

СПИСОК ССЫЛОЧНЫХ ПОЗИЦИЙ

1 устройство

2 частица

3 образец

4 свет

5 источник света

6 лазер

7 средство формирования луча

8 линза объектива

9 средство отклонения луча

10 средство отклонения луча

11 средство отклонения луча

12 точечный детектор

13 расщепитель луча

14 расщепитель луча

15 камера

16 контроллер

17 линза объектива

18 распределение интенсивности

19 минимум

I интенсивность

R количество фотонов.

Изобретение относится к способам и устройствам для осуществления наблюдений за перемещениями люминесцирующей частицы в образце. Способ наблюдения за перемещениями люминесцирующей частицы в образце включает формирование светового луча, распределение интенсивности в котором имеет минимум, направление указанного луча на образец таким образом, чтобы частица располагалась в области минимума интенсивности, детектирование фотонов, испускаемых исследуемой частицей, и перемещение луча по образцу таким образом, чтобы число испускаемых частицей фотонов оставалось минимальным. Устройство для наблюдения за перемещением частицы в образце состоит из источника света, формирующего луч с необходимым распределением интенсивности, детектора, регистрирующего испускаемые исследуемой частицей фотоны и формирующего сигнал, содержащий информацию о количестве зарегистрированных фотонов и средств отклонения луча . 2 н. 18 и з.п. ф-лы, 6 ил.

1. Способ отслеживания перемещения частицы (2) в образце (3), причем частица (2) побуждается к испусканию фотонов при ее освещении светом (4), причем способ содержит этапы, на которых:

- формируют свет для обеспечения распределения (18) интенсивности света, содержащего пространственно ограниченный минимум (19),

- применяют распределение (18) интенсивности света к образцу (3) таким образом, что частица (2) располагается в пространственно ограниченном минимуме (19) распределения (18) интенсивности света,

- обнаруживают фотоны, испускаемые частицей (2), и

- перемещают распределение (18) интенсивности света относительно образца (3) таким образом, чтобы количество фотонов, испускаемых частицей (2), оставалось минимальным, причем частица (2) отслеживается минимумом (19) распределения (18) интенсивности света.

2. Способ по п. 1, в котором минимум (19) распределения (18) интенсивности света пространственно ограничен по меньшей мере в одном пространственном измерении и в котором распределение (18) интенсивности света перемещается относительно образца (3) в направлениях всех измерений, в которых минимум (19) пространственно ограничен.

3. Способ по п. 1, в котором свет формируется для обеспечения распределения (18) интенсивности света с помощью интерференционной картины лучей когерентного света и в котором минимум (19) является нулевой точкой интерференционной картины.

4. Способ по п. 3, в котором фазовое отношение лучей когерентного света модулируется так, чтобы пространственно ограничить минимум (19) в различных направлениях.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором фотоны обнаруживаются точечным детектором (12) или камерой (15).

6. Способ по любому из пп. 1-4, в котором фотоны обнаруживаются точечным детектором (12), и при этом камера (15) дополнительно формирует изображение образца (3).

7. Способ по п. 6, в котором стартовое положение частицы (2) определяется камерой (15), когда образец (3) равномерно освещается.

8. Способ по п. 6, в котором положение распределения (18) интенсивности света относительно образца (3) отслеживается камерой (15).

9. Способ по п. 6, в котором направление перемещения частицы (2) определяется положениями, в которых фотоны, испускаемые частицей (2), обнаруживаются камерой (15).

10. Способ по любому из пп. 1-4, в котором свет (4) применяется к образцу импульсами и в котором фотоны, испускаемые частицей (2), обнаруживаются в ограниченном временном интервале после каждого из импульсов.

11. Способ по любому из пп. 1-4, в котором частица активизируется светом (4) из первого состояния, в котором частицу невозможно побудить испускать фотоны, во второе состояние, в котором частицу можно побудить испускать фотоны.

12. Способ по любому из пп. 1-4, в котором перемещения двух различных частиц (2) отслеживаются одновременно или поочередно с помощью света (4) с двумя различными длинами волн.

13. Устройство (1) для отслеживания движения частицы (2) в образце (3), причем устройство (1) содержит:

- источник (5) света, выполненный с возможностью обеспечения света для того, чтобы побудить частицу (2) испускать фотоны, причем источник (5) света включает в себя средство (7) формирования луча, выполненное с возможностью применения света (4) к образцу (3) с распределением (18) интенсивности, содержащим пространственно ограниченный минимум (19),

- детектор, выполненный с возможностью обнаружения фотонов, испускаемых частицей (2), и обеспечения сигнала, указывающего на количество обнаруженных фотонов, и

- средство (9-11) отклонения луча, выполненное с возможностью перемещения распределения (18) интенсивности относительно образца (3) и управляемое на основании сигнала детектора таким образом, что количество фотонов, обнаруженных детектором, остается минимальным для отслеживания движущейся частицы (2) минимумом (19).

14. Устройство (1) по п. 13, в котором источник (5) света осуществляет наложение множества лучей когерентного света для образования интерференционной картины, включающей в себя нулевую точку в положении минимума (19).

15. Устройство (1) по п. 14, в котором источник (5) света включает в себя управляемый пространственный модулятор света для модулирования фазового отношения множества лучей света.

16. Устройство (1) по любому из пп. 13-15, в котором детектор является точечным детектором (12).

17. Устройство (1) по любому из пп. 13-15, в котором детектор является камерой (15).

18. Устройство (1) по любому из пп. 13-15, дополнительно содержащее камеру (15), выполненную с возможностью формирования изображения образца (3).

19. Устройство (1) по любому из пп. 13-15, в котором источник (5) света является импульсным источником света, который применяет свет (4) к образцу импульсами, и в котором детектор (12) содержит затвор, синхронизированный с импульсным источником света, выполненный с возможностью обнаружения фотонов, испускаемых частицей, в ограниченном временном интервале после каждого из импульсов.

20. Устройство (1) по любому из пп. 13-15, в котором предусмотрены два источника света для света различных длин волн для одновременного или поочередного отслеживания движений двух различных частиц.