Криосформированный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений Российский патент 2017 года по МПК C12N11/02 C12N9/16 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментным биокатализаторам в виде наноразмерных частиц, предназначенным для гидролиза фосфорорганических соединений (ФОС) и представляющим собой нековалентные полиэлектролитные комплексы, криосформированные полигистидин-содержащим полипептидом с активностью органофосфатгидролазы и блок-сополимером полиэтиленгликоля с полианионом, получающиеся в результате смешивания водных растворов указанных компонентов, замораживания и выдерживания их при температуре минус 10-80°С. Изобретение может быть использовано для гидролиза в различных водных средах, в том числе в крови человека или животных, ФОС, попадающих в эти среды в результате чрезвычайных ситуаций (утечек ФОС при их производстве, применении, транспортировке, хранении или утилизации, в результате катастроф или террористических актов).

ФОС представляют собой эфиры ортофосфорной и алкилфосфоновой кислот, а также их производных. К их числу относятся широко применяемые в сельском, приусадебном и домашнем хозяйстве пестициды, а также ингибиторы коррозии, применяемые в теплоэнергетике, нефте- и газодобывающей промышленности, пластификаторы и стабилизаторы, используемые в строительной промышленности, в составе моющих и чистящих средств промышленного назначения, а также высокотоксичные боевые отравляющие вещества нервно-паралитического действия зоман, зарин, Vx и продукты их разложения (метилфосфоновая кислота и ее эфиры) [Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2013 год. Министерство сельского хозяйства Российской Федерации (Минсельхоз России), http://www.mcx.ru/documents/document/v7_show/20198.285.htm; Балабин Ю.В., Костенко Г.И. Антинакипины - органофосфонаты в энергетике. История и современная практика // Энергоснабжение и водоподготовка, 2013, Т. 82 (№2), с. 2-8; Холстов В.И. Уничтожение запасов химического оружия в России на завершающем этапе // Теоретическая и прикладная экология, 2014, №4, с. 8-11].

Ежегодное производство, хранение и применение ФОС в объеме сотен тысяч тонн для нужд сельского хозяйства, а также низкие скорости разложения ФОС в условиях окружающей среды приводят к накоплению и обнаружению этих веществ первоначально в почве. Далее происходит попадание ФОС в грунтовые и речные воды, продукты питания, табачные и хлопчатобумажные изделия, домашнюю пыль [Obendorf, S.K., Lemley, А.Т., Hedge, A., Kline, А.А., Tan, К., Dokuchaeva, Т., Distribution of pesticide residues within homes in central New York state // Arch. Environ. Contam. Toxicol., 2006, V. 50(1), p. 31-44; Lemley, A., Hedge, A., Obendorf, S.K., Hong, S., Kim, J., Muss, T.M., Varner, C.J., Selected pesticide residues in house dust from farmers homes in central New York state // Bull. Environ. Contamin. Toxicol., 2002, V. 69(2), p. 155-163]. ФОС, проникновение которых в организм животных и, в том числе, человека может происходить перрорально, ингаляторно и трансдермально, обладают нейротоксичным воздействием, которое в зависимости от концентрации ФОС может быть острым или отдаленным. Также ФОС являются мутагенами, вызывающими хромосомную аберрацию, при этом негативный эффект от их воздействия, как правило, носит кумулятивный характер.

Для обеспечения защиты живых организмов от воздействия ФОС наиболее целесообразно использовать биологические средства, в частности ферментные катализаторы, осуществляющие с высокой специфичностью действия гидролитическое разложение ФОС в различных объектах - водных средах, в организме человека и др. [Ефременко Е.Н., Лягин И.В., Завьялов В.В., Варфоломеев С.Д., Завьялова Н.В., Холстов В.И. Ферменты в технологии уничтожения фосфорорганических отравляющих веществ // Рос. хим. ж., 2007, T.LI (2), с. 24-29; Ефременко Е.Н., Лягин И.В., Гудков Д.А., Сироткина М.С., Завьялова Н.В., Завьялов В.В., Варфоломеев С.Д., Холстов В.И. Иммобилизованные биокатализаторы на основе органофосфатгидролазы в процессах разложения ФОВ и продуктов их деструкции в различных объектах детоксификации // Теоретич. и прикладная экология, 2012, №4, с. 26-31; Патент РФ 2525658, МПК⁷ C12N 11/02, C12N 11/08, C122N 9/16. Наноразмерный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo].

Детоксификация различных ФОС с помощью ферментных биокатализаторов имеет ряд преимуществ, а именно: она проходит в мягких условиях (при температурах и давлении окружающей среды, значениях pH, приближенных к нейтральным значениям), и продукты гидролиза, как правило, являются биологически деградируемыми соединениями с существенно сниженной токсичностью в сравнении с токсичностью исходных ФОС. На сегодняшний день ферментом, осуществляющим биодеструкцию самого широкого спектра ФОС, является органофосфатгидролаза (ОРН, КФ 3.1.8.1), катализирующая гидролиз эфирной связи в производных ортофосфорной и фосфоновой кислот [Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов // Успехи биол. химии, Т. 44, 2004, с. 307-340]. Однако введение в молекулу ОРН полигистидин-содержащей последовательности позволяет получить полипептид с активностью ОРН, который характеризуется существенно улучшенными (по отношению к исходному ферменту) каталитическими характеристиками, позволяющими использовать его для более эффективного и быстрого гидролиза различных ФОС в более широком диапазоне pH и температуры [Патент РФ 2255975, МПК⁷ C12N 1/21, C12N 15/52, C12N 15/70. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы; Патент РФ 2296164, МПК⁷ C12S 13/00, A62D 3/00. Способ ферментативного гидролиза боевых отравляющих веществ; Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н., Алиев Т.К., Варфоломеев С.Д. (2006) Свойства гексагистидин-содержащей органофосфатгидролазы // Биохимия, Т. 76 (2), с. 216-222; Гудков Д.А., Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н. (2006) Гидролиз параоксона, катализируемый органофосфатгидролазой, содержащей полигистидиновую последовательность на С-конце молекулы белка // Вестник МГУ, сер. Хим., Т. 47 (1), с. 15-20]. Наличие именно полигистидиновой последовательности в молекуле полипептида позволяет проводить быструю очистку и выделение такого фермента из клеток E.coli в одну стадию за счет образования множественных координационных связей между молекулой гибридного белка и металл-хелатирующими носителями [Efrernenko Е., Votchitseva Y., Plieva F., Galaev I., Mattiasson B. (2006) Purification of His₆-organophosphate hydrolase using monolithic supermacroporous polyacrylamide cryogels developed for immobilized metal affinity chromatography // Appl. Microb. Biotech.., V. 70(5), p. 558-563], и, следовательно, масштабирование процесса его наработки с целью использования при получении заявляемого ферментного биокатализатора легко реализуемо. Именно использование такого полипептида для разработки ферментных биокатализаторов, осуществляющих гидролитическую деструкцию ФОС, является наиболее рациональным. Для создания ферментного биокатализатора, пригодного для гидролитического разложения ФОС в различных водных средах, в том числе в крови человека или животных, наиболее целесообразно применение стабилизированных форм фермента, обеспечивающих длительное сохранение каталитической активности. При этом наиболее простой и эффективной формой стабилизации фермента, с точки зрения сохранения им максимальной каталитической активности и совершения для этого необходимого минимального числа технологических операций, является получение нековалентных полиэлектролитных комплексов фермента с полимером. При этом в результате смешивания растворов фермента и полимера между противоположно заряженными функциональными группами, находящимися на поверхности молекулы фермента и в составе выбранного полимера, формируются множественные межмолекулярные ионные связи, стабилизирующие и поддерживающие каталитически активную конформацию фермента. В качестве блок-сополимера для формирования нековалентного (без внесения каких-либо дополнительных сшивающих агентов) полиэлектролитного комплекса с ферментом эффективно используется блок-сополимер полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты, имеющей разную степень полимеризации [Патент США 2010/0291065 А1, 2010. Compositions for protein delivery and methods of use thereof.]. Он обеспечивает формирование устойчивого полиэлектролитного комплекса между положительно заряженными функциональными группами, локализованными на поверхности фермента, и полианионом. В случае полигистидин-содержащей органофосфатгидролазы такой полимер при формировании полиэлектролитного комплекса не затрагивает активный центр фермента, позволяя сохранять его высокую активность, но при этом существенно стабилизируя активную конформацию белка [Патент РФ 2525658, МПК⁷ C12N 11/02, C12N 11/08, C12N 9/16. Наноразмерный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo]. Этот физический метод стабилизации полипептида гарантирует максимальное сохранение исходных характеристик фермента.

Сегодня известен только один ферментный биокатализатор в виде в наноразмерных частиц нековалентного полиэлектролитного комплекса, получаемый на основе блок-сополимера полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты и полигистидин-содержащего полипептида с активностью ОРН и предназначенный для использования in vivo в качестве антидота против нейротоксичного действия ФОС [Патент РФ 2525658, МПК⁷ C12N 11/02, C12N 11/08, C12N 9/16. Наноразмерный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo]. Данный ферментный биокатализатор получают путем смешивания 1 г/л раствора полигистидин-содержащего полипептида с активностью ОРН (His₆-ОРН или His₁₂-OPH,) в буфере (pH 7,5-10,5) и 20 г/л водного раствора ПЭГ₁₁₉-ПГК₅₀ (M_W=13 кг/моль) или ПЭГ₁₁₉-ПГК₁₀ (M_W=6,5 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,09-0,90 г/л, а зарядовое соотношение фермента и блок-сополимера - 2:1÷1:5. Далее приготовленную смесь оставляют при температуре +8÷+30°C для экспонирования в течение 20÷40 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с размером наночастиц 27±4÷30±5 нм.

Каталитическая константа действия такого ферментного биокатализатора по фосфорорганическому пестициду Параоксону, Хлорпирифосу, Паратиону, Диазинону, Метилпаратиону, Кумафосу составляет соответственно 5010±60 с^-1, 482±25 с^-1, 1040±80 с^-1, 85,6±5,1 с^-1, 309±15 с^-1, 335±15 с^-1; константа Михаэлиса - 16,7±0,9 мкМ, 150±10 мкМ, 20,1±1,7 мкМ, 202±13 мкМ, 34,5±1,9 мкМ, 350±20 мкМ; константа эффективности действия - (3,0±0,2)×10⁸ М^-1с^-1, (3,2±0,4)×10⁶ М^-1с^-1, 5,2±0,8)×10⁷ М^-1с^-1, (4,2±0,5)×10⁵ М^-1с^-1, (9,0±0,9)×10⁶ М^-1с^-1, (9,6±1,0)×10⁵ М^-1с^-1. Снижение активности данного биокатализатора, выдержанного при 55°C в течение 15 мин, составляет 2-5%. Полученный ферментный биокатализатор функционирует в диапазоне pH 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Расчетный период полуинактивации биокатализатора при 37°C составляет как минимум 500 ч. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс у белых крыс (скорость выведения, CL) составляет 27,6-41,5 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.

Описанный ферментный биокатализатор обладает рядом недостатков, а именно:

- необходимость применения относительно высокой дозы, необходимой для достижения целевого эффекта in vivo, которая должна быть снижена для того, чтобы избежать появления иммунной реакции при неоднократном введении биокатализатора при сохранении его высокой стабильности и широкой субстратной специфичности;

- отсутствие среди свойств этого ферментного биокатализатора возможности его использования для детоксификации ФОС не только в крови, но и в других водных средах, в том числе содержащих органические растворители.

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по своему назначению и способу получения, а именно получению ферментного биокатализатора с органофосфатгидролазной активностью, представляющего собой нековалентный комплекс фермента с полимером, в качестве которого используется блок-сополимер полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты, формируемого в виде наноразмерных частиц и предназначенного для детоксификации ФОС, принято за прототип.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка ферментного биокатализатора, криоформируемого в виде наноразмерных частиц высокоактивных и стабильных нековалентных полиэлектролитных комплексов с широким субстратным спектром действия в реакциях гидролитической детоксификации ФОС в разных водных средах, в том числе и в крови животных, а также средах, содержащих органические растворители.

Поставленная задача решается тем, что ферментный биокатализатор в форме наноразмерных частиц для гидролитической детоксификации ФОС получают в виде нековалентных полиэлектролитных комплексов, криосформированных при pH 7,5-10,5 и температуре -80÷-10°C полигистидин-содержащим полипептидом со свойствами органофосфатгидролазы и блок-сополимером полиэтиленгликоля с полианионом в виде полиглутаминовой кислоты разной степени полимеризации, взятыми для смешивания в зарядовом соотношении «фермент:блок-сополимер» в диапазоне от 3:1 до 1:10.

Для стабилизации ферментативной активности полигистидин-содержащего пептида, согласно заявляемому изобретению, осуществляют криоформирование нековалентного полиэлектролитного комплекса в виде наночастиц, для чего ферментный раствор смешивают в определенном соотношении с водным раствором (pH 7,5-10,5) блок-сополимера полиэтиленгликоля и полианиона в строгом зарядовом соотношении «фермент:блок-сополимер» и сразу же помещают смесь в условия криотемператур (-80÷-10°С), в которых выдерживают в течение 1-24 часов и размораживают. Получение нековалентного полиэлектролитного комплекса в таких условиях способствует криоформированию наноразмерных частиц, пригодных для детоксификации ФОС в различных системах, в том числе in vivo, с улучшенной каталитической активностью и повышенной стабильностью в сравнении с прототипом. Модификация поверхности молекулы фермента, возникающая в результате формирования полиэлектролитного комплекса, способствует снижению его доступности для гидролиза под действием различных гидролитических ферментов и также способствует увеличению срока его функциональной активности в различных системах, в том числе в средах с органическими растворителями, в более широком диапазоне pH 6,5-12,5 и температуры 10-65°С.

Смешивание растворов фермента и полимера с последующим криоформированием ферментного биокатализатора при температурах минус 10-80°C позволяет первоначально реализовать множественное межмолекулярное взаимодействие между противоположно заряженными молекулами фермента и полимера, модифицирующего белковую поверхность, а потом за счет быстрого и глубокого снижения температуры полученной биокаталитической системы дополнительно зафиксировать активную конформацию молекулы фермента без применения каких-либо сшивающих химических агентов, формирующих ковалентные связи между функциональными группами. В результате замораживания полученной смеси водных растворов фермента и полимера происходит увеличение концентрации полимера в микроокружении фермента за счет того, что растворитель (вода) превращается в лед (вымораживается). При этом между молекулами фермента и полимера, уже вступившими в противоионные взаимодействия, при их сближении в замороженном состоянии происходит формирование множественных водородных связей, которые оказывают дополнительное закрепление активной конформации фермента, а суммарно за счет множественности образовавшихся слабых химических (водородных и ионных) связей увеличивается стабильность сформированного полиэлектролитного комплекса, что выражается в расширении pH- и температурного диапазона действия заявляемого ферментного биокатализатора. Получаемый таким образом ферментный биокатализатор обладает повышенной стабильностью и активностью, в том числе и в средах, содержащих органические растворители. Диапазон температур, применяемых для криоформирования ферментного биокатализатора, определяется тем, что применение температуры ниже минус 80°C является просто нецелесообразным ввиду необходимости использования в этом случае специальной дорогостоящей техники, а температура выше минус 10°C приводит к уменьшению скорости замораживания и формированию более крупных кристаллов льда растворителем в микроокружении молекул фермента, мешающих возникновению множественных водородных связей с молекулой полимера, что приводит к заметному уменьшению эффекта от применения криоформирования биокатализатора, способствующего улучшению его активности и стабильности.

Диапазон варьирования зарядового соотношения фермента и блок-сополимера от 3:1 до 1:10, применяемый для получения заявляемого биокатализатора, выбран экспериментально и обеспечивает получение высокоактивного и высокотермостабильного ферментного биокатализатора в виде наноразмерных частиц, имеющих размер в диапазоне 35±4÷45±5 нм. Повышение зарядового соотношения фермента и блок-сополимера в сторону увеличения доли фермента (более 3:1) приводит к снижению стабильности его действия в диапазоне pH 6,5-12,5 и температуры 10-65°С, а увеличение доли полимера в соотношении «фермент:полимер» свыше 1:10 приводит к заметному снижению каталитической активности биокатализатора за счет увеличения доли полимера, окружающего фермент, что приводит к необходимости увеличения применяемой эффективной дозы биокатализатора для детоксификации ФОС.

Такое сочетание всех основных компонентов наноразмерного ферментного биокатализатора, которое указано в заявляемом техническом решении, при заявляемых соотношениях фермента и блок-сополимера, эффективное взаимодействие между которыми осуществляется при pH 7,5-10,5 и температуре минус 10-80°C в результате смешивания их водных растворов, замораживания с последующим экспонированием полученной смеси в течение 1-24 часов в данных условиях и оттаивания, ранее известно не было и позволяет характеризовать предлагаемое техническое решение как новое.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения, которое в сравнении с прототипом характеризуется достижением следующего эффекта:

- применяемые температурные условия криоформирования ферментного биокатализатора позволяют совместить процесс его получения с его длительным хранением и существенным образом продлить срок сохранения им своих характеристик;

- применяемое криоформирование ферментного биокатализатора позволяет получить более активный и стабильный, в том числе термостабильный, наноструктурированный ферментный биокатализатор, что, в свою очередь, позволяет снизить эффективную дозу, применяемую для детоксификации ФОС, и способствовать уменьшению возможности формирования иммунного ответа на повторное и многократное применение уменьшенного количества такого ферментного биокатализатора для детоксификации ФОС in vivo;

- более высокая активность и стабильность заявляемого ферментного биокатализатора позволяет не только снизить вводимую дозу на 25%, но и способствует улучшению экономической привлекательности применения такого ферментного биокатализатора,

- заявляемый ферментный биокатализатор обладает наряду с широким субстратным спектром действия в отношении ФОС более расширенным диапазоном температурного и pH-оптимума действия, а также проявляет высокую активность в реакциях гидролиза разных пестицидов и отравляющих веществ (на примере вещества Vx) не только in vivo, но и in vitro, в том числе в средах с органическими растворителями, и может быть использован для введения вместо растворимого фермента в различные биокаталитические системы для разложения ФОС.

Пример 1. Ферментный биокатализатор, криосформированный в виде наноразмерных частиц на основе His₆-OPH и ПЭГ-ПГК₅₀, взятых в зарядовом соотношении 3:1.

К раствору очищенного фермента His₆-OPH в 100 мМ карбонатном буфере (pH 10,5), приготовленному в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ₁₁₉-ПГК₅₀ (M_W=13 г/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,0675 г/л. Приготовленную смесь переносят в морозильную камеру при минус 10°C и оставляют на 5 ч для криоформирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением «фермент:блок-сополимер»=3:1. После размораживания полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 45±5 нм и проявляет активность в диапазоне pH 6,5-12,5 и температур 10-65°С.

Если ферментный биокатализатор не размораживается через 5 ч, а хранится при заданной температуре в течение 120 суток, то его остаточная активность составляет 95% от того уровня, которым обладает биокатализатор, размороженный сразу после криоформирования (без продолжительного хранения).

В реакции гидролиза фосфорорганических пестицидов Параоксона и Хлорпирифоса полученный ферментный биокатализатор имеет следующие каталитические характеристики соответственно: каталитическую константу - 5515±50 с^-1 и554±28 с^-1; константу Михаэлиса - 17,0±1,0 мкМ и 165±15 мкМ, константу эффективности действия - (3,3±0,2)×10⁸ М^-1с^-1 и (3,4±0,4)×10⁶ М^-1с^-1. Снижение каталитической активности у данного ферментного биокатализатора при его экспонировании при 55°C составляет менее 4% в течение 30 мин, а не в течение 15 мин, как в прототипе. Расчетный период полуинактивации биокатализатора при 37°C составляет как минимум 600 ч, что на 100 ч больше, чем в прототипе.

При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 0,75 мг/кг клиренс у белых крыс (скорость выведения, CL) составляет 30,5 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных не обнаруживаются. Остаточная активность данного ферментного биокатализатора при использовании его с целью полного гидролиза 2 мМ раствора Параоксона в среде 100 мМ карбонатного буфера (pH 10,5), содержащего 10% этанола, составляет 85%.

Пример 2. Ферментный биокатализатор, криосформированный в виде наноразмерных частиц на основе His₆-OPH и ПЭГ-ПГК₁₀, взятых в зарядовом соотношении 1:2.

К раствору очищенного фермента His₆-OPH в 50 мМ фосфатно-солевом буфере (pH 7,5), приготовленному в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ₁₁₉-ПГК₁₀ (M_W=6,5 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,675 г/л. Приготовленную смесь переносят в морозильную камеру при минус 80°C и оставляют на 1 ч для криоформирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением «фермент:блок-сополимер»=1:2. После размораживания полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 35±4 нм и проявляет активность в диапазоне pH 6,5-12,5 и температур 10-65°С.

Если ферментный биокатализатор не размораживается через 1 ч, а хранится при заданной температуре в течение 360 суток, то его остаточная активность составляет 87% от того уровня, которым обладает биокатализатор, размороженный сразу после криоформирования (без продолжительного хранения).

В реакции гидролиза фосфорорганических пестицидов Паратиону и Диазинону полученный ферментный биокатализатор имеет следующие каталитические характеристики соответственно: каталитическую константу - 1200±60 с^-1 и 99,0±5,0 с^-1; константу Михаэлиса - 22,4±1,6 мкМ и 220±10 мкМ, константу эффективности действия - (5,4±0,6)×10⁷ М^-1с^-1 и (4,5±0,5)×10⁵ М^-1с^-1. Снижение каталитической активности у данного ферментного биокатализатора при его экспонировании при 55°C в течение 30 мин составляет менее 5%. Расчетный период полуинактивации биокатализатора при 37°C составляет как минимум 624 ч. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 0,75 мг/кг клиренс у белых крыс (скорость выведения, CL) составляет 35,0 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных не обнаруживаются. Остаточная активность данного ферментного биокатализатора при использовании его с целью полного гидролиза 1 мМ раствора Паратиона в среде 50 мМ карбонатного буфера (pH 9,5), содержащего 10% диметилсульфоксида, составляет 75%.

Пример 3. Ферментный биокатализатор, криосформированный в виде наноразмерных частиц на основе His₁₂-OPH и ПЭГ-ПГК₅₀ в зарядовом соотношении 1:10.

К раствору очищенного фермента His₁₂-OPH [Efremenko Е., Lyagin I., Votchitseva Y., Sirotkina M., Varfolomeyev S. Polyhistidine-containing organophosphorus hydrolase with outstanding properties // Biocat. Biotransform., 2007, V. 25 (1), p. 103-108] в 100 мМ карбонатном буфере (pH 9,5), приготовленному в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ₁₁₉-ПГК₅₀ (M_W=13 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 1,80 г/л. Приготовленную смесь переносят в морозильную камеру при минус 70°C и оставляют на 3 ч для криоформирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением «фермент:блок-сополимер»=1:10. После размораживания полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 42±3 нм и проявляет активность в диапазоне pH 6,5-12,5 и температур 10-65°С.

Если ферментный биокатализатор не размораживается через 3 ч, а хранится при заданной температуре в течение 240 суток, то его остаточная активность составляет 90% от того уровня, которым обладает биокатализатор, размороженный сразу после криоформирования (без продолжительного хранения).

В реакции гидролиза фосфорорганического пестицида Метилпаратиона полученный ферментный биокатализатор имеет следующие каталитические характеристики соответственно: каталитическую константу - 355±30 с^-1; константу Михаэлиса - 38±4 мкМ, константу эффективности действия - (9,4±0,7)×10⁶ М^-1с^-1. Снижение каталитической активности у данного ферментного биокатализатора при его экспонировании при 55°C в течение 60 мин составляет менее 5%. Расчетный период полуинактивации биокатализатора при 37°C составляет как минимум 672 ч. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 0,75 мг/кг клиренс у белых крыс (скорость выведения, CL) составляет 43,0 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных не обнаруживаются. Остаточная активность данного ферментного биокатализатора при использовании его с целью полного гидролиза 1 мМ раствора Метилпаратиона в среде 100 мМ карбонатного буфера (pH 9,5), содержащего 10% метанола, составляет 80%.

Пример 4. Ферментный биокатализатор, криосформированный в виде наноразмерных частиц на основе His₆-OPH и ПЭГ-ПГК₅₀, взятых в зарядовом соотношении 1:4.

К раствору очищенного фермента His₆-OPH в 50 мМ карбонатном буфере (pH 10,5), приготовленному в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ₁₁₉-ПГК₅₀ (M_W=13 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,75 г/л. Приготовленную смесь переносят в морозильную камеру при минус 20°C и оставляют на 24 ч для криоформирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением «фермент:блок-сополимер»=1:4. После размораживания полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 44±5 нм.

Если ферментный биокатализатор не размораживается через 24 ч, а хранится при заданной температуре в течение 180 суток, то его остаточная активность составляет 92% от того уровня, которым обладает биокатализатор, размороженный сразу после криоформирования (без продолжительного хранения).

Полученный ферментный биокатализатор вводят внутривенно белым крысам в дозе 0,75 мг/кг. Через 1 ч крысам внутривенно вводят вещество Vx в дозе 2LD₅₀, фиксируют гибель 25% животных и наблюдают уменьшение количества погибших животных в 4 раза по сравнению с контрольной группой (без введения ферментного биокатализатора).

Пример 5. Свойства криосформированного ферментного биокатализатора, применяемого при детоксификации ФОС в водных средах вместо растворимого очищенного His₆-OPH

Ферментный биокатализатор, полученный, как описано в Примере 1, и размороженный после его хранения в условиях криоформирования в течение 120 суток, используют для гидролиза Vx вместо полигистидин-содержащего пептида со свойствами ОРН, очищенного до 98%-ной гомогенности по белку и вводимого в реакцию в виде раствора 1,0 мг белка/мл в 10 мМ фосфатно-карбонатном буфере (pH 8,0), как описано в Примере 3 в Патенте РФ 2296164 (МПК⁷ C12S 13/00, A62D 3/00. Способ ферментативного гидролиза фосфорорганических боевых отравляющих веществ). Для этого при температуре 20°C в герметичную емкость, содержащую 1 л 10 мМ раствора чистого вещества Vx в буфере (10 мМ фосфатно-карбонатном буфере, pH 8,0), вносят ферментный биокатализатор в дозе 0,75 мг/л, то есть на 25% меньше, чем в прототипе. Через 28 мин устанавливают 100% гидролиз вещества Vx, тогда как в прототипе полный гидролиз вещества Vx показан через 30 мин.

Таким образом, данное техническое решение позволяет в сравнении с прототипом увеличить каталитическую активность и стабильность ферментного биокатализатора, имеющего наноразмерные характеристики, в том числе термостабильность, и приобрести стабильность в средах с органическими растворителями, расширить диапазоны pH- и температурного действия, снизить эффективную дозу, применяемую для детоксификации ФОС in vivo, а также использовать заявляемый ферментный биокатализатор в виде полиэлектролитного комплекса для замены очищенного растворимого фермента в водных средах, предназначенных для гидролитического разложения ФОС, в том числе после длительного хранения биокатализатора в условиях его криоформирования.

Изобретение относится к биохимии. Предложен ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений. Биокатализатор представляет собой нековалентные полиэлектролитные комплексы в виде наноразмерных частиц, сформированных полигистидинсодержащим полипептидом со свойствами органофосфатгидролазы и блок-сополимером полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты. Полиэлектролитные комплексы получены путём смешивания ферментного раствора с водным раствором блок-сополимера полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты, замораживания и экспонирования полученной смеси. Изобретение обеспечивает увеличение каталитической активности и стабильности ферментного биокатализатора, приобретение стабильности в средах с органическими растворителями, расширение диапазона рН- и температурного действия, снижение эффективной дозы, применяемой для детоксификации ФОС in vivo, а также использование ферментного биокатализатора в виде полиэлектролитного комплекса для замены очищенного растворимого фермента в водных средах, предназначенных для гидролитического разложения ФОС. 1 з.п. ф-лы., 5 пр.

1. Ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений, представляющий собой нековалентные полиэлектролитные комплексы в виде наноразмерных частиц, сформированных полигистидинсодержащим полипептидом со свойствами органофосфатгидролазы и блок-сополимером полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты, отличающийся тем, что полиэлектролитные комплексы получены методом криоформирования, заключающегося в смешивании ферментного раствора с водным раствором, имеющим рН=7,5-10,5, блок-сополимера полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты в зарядовом соотношении фермент:блок-сополимер в диапазоне от 3:1 до 1:10, замораживании и экспонировании полученной смеси при температуре минус 10-80°С в течение 1-24 ч.

2. Ферментный биокатализатор по п. 1, отличающийся тем, что полиэлектролитные комплексы представляют собой наночастицы, имеющие размер в диапазоне 35±4÷45±5 нм.