ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ КОМПОЗИТНЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ДЕГРАДАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ, МИКОТОКСИНОВ И МОЛЕКУЛ-РЕГУЛЯТОРОВ КВОРУМА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ Российский патент 2021 года по МПК C12N11/02 C12N9/00 A62D3/02 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к области ферментных препаратов, предназначенных для деградации разных фосфорорганическими пестицидами, микотоксинами и бактериальными патогенами, которыми одновременно контаминированы сельскохозяйственные объекты (сырье, корма для животных, продукты питания, почвогрунты). Изобретение представляет собой полифункциональный композитный ферментный препарат в виде многокомпонентной смеси ферментов, состоящей из варьируемых сочетаний протеазы, декарбоксилазы, целлобиогидролазы, карбоксипептидазы, гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы, лактоназы, гидролизующих различные фосфорорганические соединения, микотоксины, синтезируемые разными микроскопическими грибами, и молекулы грамотрицательных или грамположительных бактерий (соответственно N-ацилгомосеринлактоны и пептиды), ответственные за индукцию у патогенов резистентности к антибиотикам и формирование биопленок, при этом ферменты для формирования композита взяты в эквимолярном соотношении в виде нековалентных комплексов с биологически активными низкомолекулярными (антиоксидантами, гепатопротекторами, антимикробными агентами) и высокомолекулярными (полисахариды, полиаминокислоты) веществами, а сам композит стабилизирован за счет сорбции на природном носителе в виде диатомита в концентрации, которая предопределяется сорбционной емкостью носителя, и высушен до остаточной влажности 8-10%. Изобретение может быть использовано для универсальной детоксификационной обработки разных сельскохозяйственных объектов, значительно повышающей их химико-биологическую безопасность.

Фосфорорганические соединения (ФОС), в частности фосфорорганические пестициды (ФОП) широко применяются в сельскохозяйственном производстве для повышения урожая, однако низкие уровни их разложения в условиях окружающей среды приводят к тому, что они накапливаются в почвах, в сырье и продукции растениеводства и животноводства [Agriopoulou S., Stamatelopoulou Е., Varzakas Т. Advances in Occurrence, Importance, and Mycotoxin Control Strategies: Prevention and Detoxification in Foods. // Foods, 2020, V. 9, p. 137]. Поскольку ФОП оказывают на человека и животных нейротоксичное воздействие, которое усиливается в результате кумулятивного эффекта, то возникает необходимость в эффективной детоксификации разных объектов, содержащих ФОП.

Наиболее эффективным подходом к решению этой проблемы считается применение ферментов, гидролизующих максимально широкий перечень фосфорорганических соединений (ФОС) [Фосфорорганические нейротоксины : монография / Под ред. чл.-корр. РАН С.Д. Варфоломеева, проф. Е.Н. Ефременко. - Москва: РИОР, 2020. - 380 с. - ISBN 978-5-369-02026-5]. К числу наиболее каталитически активных ферментов с максимально широким спектром субстратного воздействия относится гексагистидинсодержащая органофосфатгидролаза (His₆-OPH, ЕС 3.1.8.1), способная катализировать гидролиз разных фосфорорганических нейротоксинов [Патент РФ №2525658, 2012; Патент РФ №2615176, 2015]. При этом фермент может быть использован как в нативном состоянии, так и стабилизированном за счет введения его в комплексы, получаемые в результате образования нековалентных комплексов с антибиотиками, антимикробными пептидами [Aslanli A., Lyagin I., Efremenko Е. Novel approach to Quorum Quenching: rational design of antibacterials in combination with hexahistidine-tagged organophosphorus hydrolase. // Biol. Chem., 2018, v. 399(8), p. 869-879], антиоксидантами [Патент РФ №2648169, 2017], полиаминокислотами [Lyagin I.V., Efremenko E.N. Biomolecular engineering of biocatalysts hydrolyzing neurotoxic organophosphates. // Biochimie, 2018, v. 144, p. 115-121].

Однако существенным недостатком таких ферментных препаратов (биокатализаторов) является удаление только ФОС из продукции сельского хозяйства, что не устраняет серьезных угроз для здоровья человека и животных, поскольку в составе сельскохозяйственного сырья помимо ФОС присутствует большое количество микотоксинов - естественных метаболитов, продуцируемых различными природными клетками микроскопических грибов, поражающими и загрязняющими практически все сельскохозяйственное сырье, продукты питания, корма для животных как в процессе выращивания сельскохозяйственных культур, так и при их хранении и переработке [Agriopoulou S., Stamatelopoulou Е., Varzakas Т. Advances in Occurrence, Importance, and Mycotoxin Control Strategies: Prevention and Detoxification in Foods. // Foods, 2020, V. 9, p. 137]. Поскольку микотоксины в низких концентрациях обладают высокой нейро-, гепато- и нефротоксичностью, то требуется снижение их концентрации в указанных объектах (сырье и продукции). Только для некоторых микотоксинов, содержащих лактонное кольцо в своей структуре (патулин, зеараленон, стеригматоцистин и дезоксиниваленол) это может быть достигнуто путем обработки объектов, содержащих эти микотоксины, только определенным ферментом - His₆-OPH [Патент РФ №2634914, 2016]. Для ряда других известных ферментов в отличие от His₆-OPH возможен гидролиз только отдельных одиночных вариантов микотоксинов [Lyagin I., Efremenko Е. Enzymes for detoxification of various mycotoxins: origins and mechanisms of catalytic action // Molecules. - 2019. - T. 24. - №. 13. - C. 2362] и с меньшими каталитическими скоростями.

Однако существенным недостатком ферментного препарата на основе только одного фермента His₆-OPH, применяемого для обезвреживания четырех микотоксинов, является фактическая ограниченность спектра микотоксинов, которые присутствуют в разных источниках сельскохозяйственного сырья и продуктов и должны подвергаться деградации. Узость спектра микотоксинов, гидролизуемых His₆-OPH предопределяется и ограничивается субстратной специфичностью действия данного фермента по отношению к определенным функциональным группам, присутствующим в четырех микотоксинах.

Сельскохозяйственное сырье и продукция из него часто подвержены бактериальной контаминации, а персонал, занятый в сельскохозяйственном производстве (хранении и переработке сырья), и животные, потребляющие зерновые и травяные корм, подвержены опасности контакта с бактериальными популяциями грамположительных и грамотрицательных клеток (Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и др.), которые исходно обитают в природных условиях и могут инфицировать с последующим развитием различных заболеваний. Для повышения безопасности сельскохозяйственной продукции ее подвергают обработке дезинфицирующими средствами, а также в саму продукцию (в продукты питания и корма) вводят антибиотики и консерванты. С повышением концентрации бактериальных клеток эффективность действия антибиотиков и консервантов снижается, поскольку с увеличением концентрации у клеток происходит формирование так называемого кворумного ответа, который выражается в том, что клетки бактерий активно синтезируют низкомолекулярные вещества, которые регулируют экспрессию в клетках генов, приводящую к накоплению ферментов и белков, не синтезируемых при низких концентрациях клеток в популяциях. Эти ферменты и белки в свою очередь каскадно регулируют синтез других белков и активацию многих процессов в клетках, которые приводят к тому, что клетки становятся более устойчивыми к действию антимикробных агентов. У грамположительных клеток роль молекул-регуляторов формирования кворумного ответа (ответа концентрированной популяции клеток = ответа большинства) выполняют разные пептиды, а у грамотрицательных клеток - N-ацилгмосеринлактоны (АГЛ) [Kagle, J. (2020). Small talk: chemical conversations with bacteria. ChemTexts, 6(1), 6.].

Для предотвращения формирования антибиотикорезистентности у грамотрицательных клеток бактерий возможно применение ферментных препаратов, осуществляющих гидролиз молекул-регуляторов кворума у них - АГЛ [Kusada Н., Tamaki Н., Kamagata Y., Hanada S., Kimura N. A Novel Quorum-Quenching N-Acylhomoserine Lactone Acylase from Acidovorax sp. Strain MR-S7 Mediates Antibiotic Resistance. // Appl. Environ. Microbiol., 2017, v. 83(13), e00080-17, doi: 10.1128/АЕМ.00080-17]. Для этих целей возможно использование нековалетных комплексов His₆-OPH с антибиотиками и антимикробными пептидами. Однако эти ферментные препараты на основе His₆-OPH гидролитически действуют на ограниченное число АГЛ, характеризующихся определенной длиной ацильного радикала. Поскольку каждый тип бактерий синтезирует АГЛ с определенным химическим строением, то препараты на основе His₆-OPH могут предотвращать синтез АГЛ и развитие кворума и антибиотикорезистентности только у определенных грамотрицательных бактерий. А в отношении молекул-регуляторов грамположительных бактерий этот фермент в целом не действует, так как не способен гидролизовать пептиды.

Для нейтрализации негативного действия фосфорорганических пестицидов и микотоксинов в корма животным добавляют различные природные сорбенты [ Е., MacDonald S., Elliott С.Т. A review of the efficacy of mycotoxin detoxifying agents used in feed in light of changing global environment and legislation //World Mycotoxin Journal. - 2016. - T. 9. - №. 3. - C. 419-433.]. Преимуществом среди ряда минеральных природных сорбентов отдается бентониту. Однако бентониты обладают рядом существенных недостатков, которые заключаются в том, что они могут как сорбировать, так и десорбировать токсины, при этом не происходит никакой деградации самих токсинов. Природная глина, коей являются бентониты, может содержать различные ионы металлов, в том числе тяжелых, что при введении в организм животных и человека может наносить вред. При этом сорбция разных токсинов на глине (бентоните) относительно невысокая, так как это предопределяется химическими свойствами самих фосфорорганических пестицидов и микотоксинов, а также алюмосиликатным каркасом самого бентонита.

Для улучшения эффективности применения бентонита была предложена его модификация как органоминеральная кормовая добавка Mycofix®, предназначенная для сорбции и ферментативной детоксификации таких микотоксинов как трихотецены (диоксинивалинол (далее ДОН) и Т-2 токсин), а также фумонизина В1, зеараленона, охратоксина и афлатоксинов, которая представляет собой по сути сорбированный на диатомите ферментный препарат FUMzyme® в виде фермента фумонизинэстеразы, продуцируемого с использованием генетически модифицированных клеток Komagataella pastoris, гидролизующих молекулы фумонизина путем отщепления двух боковых цепей - трикарбаллиловых кислот:

Эта разработка принадлежит компании Biomin (Австрия), направлена на реализацию комплексного действия, обеспечивающего при употреблении в качестве пищевой добавки не только связывание, но и разложение микотоксинов (FUMzyme®, Biomin® BBSH 797, Mycofix® Plus, Mycofix® Select 3.0, Mycofix® 5.0 Absolute Protection) [[Верена С. Последние достижения в управлении рисками микотоксидозов в птицеводстве. - 2019. - №.4 (152) - С. 48-50.].

Наличие в этом же биопрепарате добавки Biomin®BBSH 797 в виде клеток бактерий Eubacterium sp. DSM 11798, изначально выделенных из бычьего рубца и способных синтезировать деэпоксидазу, разрушающие эпоксидные группы [ P. Mycotoxins, an overlooked threat in shrimp farming! // All about feed. net (diet formulation, aquaculture). - 2008.], обеспечивает разложение представителей трихотеценовых микотоксинов, среди которых наиболее распространенными являются дезоксиниваленол (ДОН) и Т-2 токсин:

Однако характеристики такого ферментного препарата полностью отсутствуют, так как рассматривается в целом эта разработка как кормовая добавка, которая позволяет сохранить при ее введении в корм продуктивность животных на постоянном уровне при наличии в кормах микотоксинов. Таким образом, действие добавки к корму оценивается в единицах продуктивности животных. При этом отдельно сравнительное действие бентонита и бентонита с ферментной добавкой не продемонстрировано. Наличие реальной ферментной активности в отношении всех заявленных в этой известной разработке микотоксинов каталитически (химически) никак не мотивировано. Также минеральные адсорбенты (бентонит с возможными алюмосиликатными добавками), входящие в состав комбинированного препарата, избирательно сорбируют микотоксины, например, такие как афлатоксины, охратоксин А и алкалоиды спорыньи, а остальные - не сорбируются.

Кроме того, данный ферментный препарат в композите с бентонитом никак не решает задачи, связанные с деструкцией фосфорорганических пестицидов и гидролизом молекул-стимуляторов формирования бактериального кворума и антибиотикорезистентности, присутствующих в сельскохозяйственном сырье или сельскохозяйственной продукции, тем более в почвогрунте. Вместе с этим данная разработка по сущности (использование ферментов в композите с природным сорбентом при иммобилизации ферментов на этом сорбенте) и достигаемому результату (в плане защиты от нескольких разных микотоксинов путем их гидролиза) является самой близкой к заявляемому техническому решению и была принята за прототип.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка полифункционального композитного ферментного препарата для деградации фосфорорганических соединений, микотоксинов и молекул-регуляторов кворума бактериальных патогенов. Предлагаемое техническое решение предназначено для проведения универсальной глубокой детоксификации сельскохозяйственного сырья, продукции и почвогрунтов за счет деградации сразу нескольких видов разных по своей химической природе токсинов - разных фосфорорганических пестицидов, синтезируемых человеком, и разных микотоксинов (диоксиниваленола (ДОН), T-2-токсина, афлатоксинов, зеараленона, фумонизина В1, охратоксина А, патулина, эрготамина, стеригматоцистина), синтезируемых разными клетками микроскопических грибов, природно контаминирующих различное сельскохозяйственное сырье и продукцию, - а также провести обработку направленную на деструкцию разных молекул-регуляторов кворума (АГЛ и пептидов), синтезируемых грамположительными (Г+) и грамотрицательными (Г-) клетками бактерий, которые индуцируют развитие кворумного ответа у клеток и формирование популяций патогенов, устойчивых к воздействию антимикробных агентов. Ферментативный гидролиз указанных бактериальных молекул приводит к значительному увеличению эффективности действия применяемых антибиотиков и антимикробных пептидов, снижению резистентности бактерий к ним и повышению уровню биобезопасности сельскохозяйственного сырья и продукции.

Поставленная задача решается тем, что полифункциональный композитный ферментный препарат для деградации фосфорорганических соединений, микотоксинов и молекул-регуляций кворума бактериальных патогенов получают в виде смеси ферментов, выбранных из ряда протеаза, декарбоксилаза, целлобиогидролаза, карбоксипептидаза, гексагистидинсодержащая органофосфатгидролаза, лактоназа, стабилизированных в нековалентных комплексах с биологически активными низкомолекулярными (антимикробные агенты, гепатопротекторы, антиоксиданты) или высокомолекулярными (полиаминокислоты, полисахариды) веществами, взятыми в разном сочетании для получения смеси, но при эквимолярных соотношениях для сорбционной иммобилизации на диатомите в концентрации, соответствующей его сорбционной емкости, с последующим их высушиванием до остаточной влажности 8-10%.

Нековалентно стабилизированные комплексы отобранных ферментов получают путем смешивания водных растворов соответствующих ферментов и низко- или высокомолекулярных веществ при рН, соответствующем известному оптимальному значению рН для каталитического действия конкретного фермента при комнатной температуре, при этом мольное соотношение фермента и вещества, используемого для нековалентного взаимодействия с ферментом, должно быть 1:1.

Выбор ферментов, которые вводятся в заявляемый полифункциональный композитный препарат в определенных сочетаниях и соотношениях, основан на экспериментальных данных, полученных авторами предлагаемого технического решения. В составе заявляемого ферментного препарата минимально может быть введено два разных фермента, и максимально - все перечисленные ферменты из ряда: протеаза, декарбоксилаза, целлобиогидролаза, карбоксипептидаза, гексагистидинсодержащая органофосфатгидролаза (His₆-OPH), лактоназа. Целесообразность применения того или иного сочетания ферментов в составе заявляемого полифункционального композитного ферментного препарата предопределяется сложностью химического состава контаминантов, присутствующих в обрабатываемом образце.

Комплексное использование строго подобранных ферментов позволяет проводить более глубокую деструкцию микотоксинов, относящихся к разным классам, в силу разной субстратной специфичности ферментов, а также с помощью тех же самых ферментов проводить деструкцию фосфорорганических соединений и гидролиз молекул-регуляторов кворума бактерий. При этом применяемая протеаза катализирует гидролиз пептидов, являющихся кворумными молекулами Г(+)-бактерий, а также молекулы трихотеценовых микотоксинов (ДОН и Т-2 токсина) и эргот-алколоидные микотоксины (микотоксины спорыньи). Декарбоксилаза обеспечивает гидролиз афлотоксинов и фумонизина В1. Гидролиз такого микотоксина как зеараленон обеспечивают целлобиогидролаза и His₆-OPH. Кроме того, His₆-ОРН и лактоназа обеспечивает гидролиз АГЛ, а также патулина, ДОНа, стеригматоцистина и афлотоксинов. Карбоксипептидаза катализирует гидролиз охратоксина. Его также гидролизует и целлобиогидролаза [Lyagin I., Efremenko Е. Enzymes for detoxification of various mycotoxins: origins and mechanisms of catalytic action // Molecules. - 2019. - T. 24. - №. 13. - C. 2362].

Стабилизация ферментов в составе комплексов, получаемых в результате нековалентного взаимодействия ферментов с биологически активными низко- или высокомолекулярными веществами позволяет:

1 - придать дополнительные функциональные характеристики предлагаемому препарату в виде антиоксидантных, гепатопротекторных и антимикробных свойств,

2 - значительно стабилизировать ферменты за счет множественных химически слабых взаимодействий (полиаминокислоты, полисахариды), возникающих между разными функциональными группами, находящимися на поверхности молекул ферментов и разными применяемыми биологически активными веществами, не требующими применения сшивающих агентов, химически активных и опасных реагентов.

При этом выбор гепатопротекторов (урсодезоксихолевой кислоты, ацетилцистеин), антиоксидантов (апигенина, катехина), антибиотиков (меропенем, полимиксин) и антимикробных пептидов (индолицидина и темпорина) для получения нековалентных комплексов ферментов был основан на компьютерном анализе методом молекулярного докинга низко- и высокомолекулярных веществ (полиглутаминовой кислоты, бета-глюкана) к поверхности ферментов, оценке степени экранирования активных центров ферментов и последующей экспериментальной проверки полученных данных по каталитическому гидролизу соответствующих микотоксинов, АГЛ, пептидов, и фосфорорганических пестицидов [Lyagin I.V., Efremenko E.N. Biomolecular engineering of biocatalysts hydrolyzing neurotoxic organophosphates. // Biochimie, 2018, v. 144, p. 115-121; Maslova O., Aslanli A., Stepanov N., Lyagin I., Efremenko E. Catalytic Characteristics of New Antibacterials Based on Hexahistidine-Containing Organophosphorus Hydrolase. // Catalysts, 2017, v. 7(9), e271; doi:10.3390/catal7090271; Aslanli A., Lyagin I., Efremenko E. Novel approach to Quorum Quenching: rational design of antibacterials in combination with hexahistidine-tagged organophosphorus hydrolase. // Biol. Chem., 2018, v. 399(8), p. 869-879; Aslanli A., Lyagin I., Efremenko E. Charges' interaction in polyelectrolyte (nano)complexing of His₆-OPH with peptides: unpredictable results due to imperfect or useless concept? // Int. J. Biol. Macromol., 2019, v. 140, p. 368-376].

Применение диатомита с известными характеристиками для сорбции смесей стабилизированных ферментов с целью получения полифункционального композитного ферментного препарата позволяет существенно улучшить сорбционные характеристики применяемого носителя для ферментов, в сравнении с прототипом, поскольку в отличие от глины, данный сорбент обладает среди природных минеральных добавок максимальной сорбционной емкостью, и также разрешен к применению в составе сельскохозяйственных кормов как добавка.

Для иммобилизации методом сорбции смеси стабилизированных форм ферментов на диатомите их смешивают в эквимолярном соотношении и наносят в виде водных растворов на образец диатомита ровно в той концентрации, которая предопределяется известной сорбционной емкостью используемого типа диатомита. Полная сорбция смеси стабилизированных ферментов происходит одновременно с ее нанесением на образец диатомита при комнатной температуре.

Для придания препарату возможности продолжительного хранения и дополнительной стабилизации композитного ферментного препарата проводится высушивание сорбционно иммобилизованных нековалентно стабилизированных форм ферментов на диатомите до остаточной влажности образцов 8-10%.

Полученный таким образом полифункциональный композитный ферментный препарат обладает способностью к универсальной деградации различных фосфорорганических соединений, микотоксинов и молекул-регуляторов кворума бактериальных патогенов, сохраняет гепатопротекторные, антиоксидантные, противомикробные характеристики, которые ему придают биологически активные вещества, используемые для стабилизации отдельных ферментов-компонентов препарата, тогда как диатомит выполняет функции носителя и стабилизатора для ферментов, а также сорбента для целевых веществ, предназначенных для деградации, обеспечивая таким образом их присутствие в микроокружении ферментов, как субстратов, необходимых для катализа.

Такое сочетание всех основных компонентов полифункционального композитного ферментного препарата, которое указано в заявляемом техническом решении, с использованием заявляемых соотношений ферментов и биологически активных веществ, используемых для их нековалентной активации с приданием новых свойств препарату, и с применяемой последовательностью осуществляемых операций, ранее известно не было и позволяет характеризовать предлагаемое техническое решение как новое.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Полифункциональный композитный ферментный препарат для деградации фосфорорганических соединений, микотоксинов и молекул-регуляторов кворума бактериальных патогенов

К растворам очищенных ферментов протеазы, декарбоксилазы, целлобиогидролазы, карбоксипептидазы, гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы и лактоназы, приготовленных на основе 100 мМ водных буферных растворов с рН, соответствующих известным рН-оптимумам действия каждого из указанных ферментов, по отдельности соответственно добавляют водный раствор антибиотика меропенема так, чтобы в каждом случае мольное соотношение фермента и меропенема было 1:1. Полученные смеси ферментов с раствором добавленного вещества оставляют при комнатной температуре на 30 мин для формирования нековалентных комплексов ферментов и их стабилизации.

Далее полученные растворы ферментных комплексов смешивают при комнатной температуре так, чтобы в конечной смеси они все были в эквимолярном соотношении. Затем аликвота полученной смеси наносится на сухой образец коммерческого диатомита NDP-D-280 с учетом его известной сорбционной емкости 208,8%. Полная сорбция и распределение по объему сорбента всего образца смеси ферментов происходит по мере его нанесения. Полученный влажный носитель с сорбционно иммобилизованными на нем ферментами в составе нековалентных комплексов высушивают под вакуумом при комнатной температуре до остаточной влажности 8-10% и используют для деградации смеси контаминантов (ФОП, микотоксинов и АГЛ) в образце рисового зерна. Для этого рисовое зерно (1000 г), контаминированное зеаралиноном (30 мкг/кг), стеригматоцистином (30 мкг/кг), ДОНом (20 мкг/кг), Т-2 токсином (20 мкг/кг), афлотоксином В1 (30 мкг/кг), охратоксином А (30 мкг/кг), фумонизином В1 (20 мкг/кг), эрготамином (20 мкг/кг) и патулином (30 мкг/кг), а также 50 мкг/кг хлорпирифоса, 50 мкг/кг паратиона, 10 мкг/кг С₁₂-ацилгомосеринлактона и 10 мкг/кг кворумного пептида Bacillus subtilis посыпают 20 г диатомита с сорбированными ферментами, перемешивают, заливают раствором 0,9% хлорида натрия и экспонируют в течение 5 часов при 30°С. Далее стандартными хроматографическими методами определяют остаточную концентрацию всех контаминантов в зерне и рассчитывают степень деградации всех контаминантов. При указанных условиях все исходные контаминанты гидролизуются на 97-100%.

Остальные примеры, реализуемые по аналогии с Примером №1, иллюстрирующие заявляемое техническое решение, сведены в таблицу.

Таким образом, заявляемое изобретение в сравнении с прототипом характеризуется существенным расширением перечня веществ, которые могут быть подвержены ферментативной деградации в ряду самих микотоксинов (дополнительно в сравнении с прототипом возможна деструкция патулина и стеригматоцистина), а также тот же самый ферментный препарат может быть использован для деградации фосфорорганических соединений и молекул-регуляторов кворума (АГЛ и пептидов), синтезируемых грамположительными (Г+) и грамотрицательными (Г-) клетками бактерий, воздействие на которые в прототипе не предусмотрено.

В отличие от прототипа, в предлагаемом изобретении не используются клетки бактерий, синтезирующие ферменты, а только сами ферменты, что позволяет увеличить каталитическую эффективность их действия, избежать необходимости сохранения и поддержания жизнеспособности клеток, осуществляющих деструкцию микотоксинов. Применение низко- и высокомолекулярных веществ как нековалентных стабилизаторов ферментов позволяет дополнительно придать новые свойства композитному ферментному препарату и расширить его функциональные характеристики, а примененный в качестве сорбента диатомит обладает известной лучшей в сравнении с глиной (бентонитом) проникающей способностью для водных сред и эффективностью сорбции. Применение такого полифункционального композитного ферментного препарата не ограничивается как в случае с прототипом только применением в качестве кормовой добавки, а он может быть использован для детоксификации разных типов сред, содержащих вещества, подлежащие деструкции, в том числе сельскохозяйственное сырье и продукция из него, почвогрунты и др.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен полифункциональный композитный ферментный препарат для деградации фосфорорганических соединений, микотоксинов и молекул-регуляторов кворума бактериальных патогенов, включающий смесь ферментов протеазы, декарбоксилазы, целлобиогидролазы, карбоксипептидазы, гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы, лактоназы, стабилизированных в нековалентных комплексах с биологически активными низкомолекулярными (антимикробные агенты, гепатопротекторы, антиоксиданты) или высокомолекулярными (полиаминокислоты, полисахариды) веществами, взятыми в разном сочетании при эквимолярных соотношениях для сорбционной иммобилизации на диатомите, затем их высушивают до остаточной влажности 8-10%. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств для деградации разных по химической природе токсинов сельскохозяйственного сырья, продукции и почвогрунтов. 1 табл., 10 пр.

Полифункциональный композитный ферментный препарат для деградации фосфорорганических соединений, микотоксинов и молекул-регуляторов кворума бактериальных патогенов, отличающийся тем, что представляет собой смесь ферментов, выбранных из ряда: протеаза, декарбоксилаза, целлобиогидролаза, карбоксипептидаза, гексагистидинсодержащая органофосфатгидролаза, лактоназа, стабилизированных в нековалентных комплексах с биологически активными низкомолекулярными (антимикробные агенты, гепатопротекторы, антиоксиданты) или высокомолекулярными (полиаминокислоты, полисахариды) веществами, взятыми в разном сочетании, но при эквимолярных соотношениях для сорбционной иммобилизации на диатомите в концентрации, соответствующей его сорбционной емкости, с последующим их высушиванием до остаточной влажности 8-10%.