ВАКЦИНА ПРОТИВ ЯЩУРА И СПОСОБ ЕЁ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2017 года по МПК A61K39/135 C12N7/00 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении вакцины против ящура.

Известен способ изготовления вакцины против ящура типа О, включающий культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в течение 10-15 часов при 36-37°C, причем культивирование прекращают при достижении количества мертвых клееток 90-95%, после чего вирус ящура подвергают инактивации, очищают от балластных примесей, концентрируют полученный антиген и соединяют концентрат антигена с адъювантом. Вакцина, полученная данным способом, содержит авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов (146S+75S) вируса ящура типа О, гель гидроокиси алюминия, сапонин и поддерживающую среду (патент РФ №2212895, МПК A61K 39/135, C12N 7/00, 27.09.2003).

Недостатком известного способа изготовления вакцины является негарантированный уровень полученного антигенного материала в связи с оценкой его количества методом определения (146S+75S)-компонентов, т.к. капсид вируса 75S, как неполная структура антигена, склонна к разрушению до капсомеров 12S при температурных колебаниях и других физико-химических факторах.

Известны также вакцина и способ изготовления вакцины против ящура, включающий культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36-37°C, очистку вирусной суспензии от балластных примесей, инактивацию, концентрирование полученного антигена вируса ящура и соединение концентрата антигена с адъювантом, причем, начиная с 6-8 часов культивирования вирусного антигена, через каждые 2 часа определяют процент мертвых клеток, и при достижении его уровня 95% и выше осуществляют дальнейшее культивирование в течение 2-8 часов в зависимости от типа вируса (патент РФ №2332233, МПК A61K 39/135, Бюл. №24, 27.08.2008).

Недостатком известного технического решения является не только недостаточная иммуногенность целевого продукта, но и то, что при изготовлении вакцины не учитывается показатель специфического местного иммунитета.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности предложения за счет повышения его иммуногенности и снижения заболеваемости сельскохозяйственных животных.

Поставленная задача решается в вакцине против ящура, включающей вирусный антиген ящура, гидроокись алюминия и адъювант - сапонин тем, что в качестве адъюванта дополнительно используют натриевую соль сукцината хитозана при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Также поставленная задача решается в вакцине против ящура, включающей вирусный антиген ящура, гидроокись алюминия и адъювант - сапонин тем, что в качестве вируса ящура используют вирус ящура типа А штамм А₂₂ №550.

Также поставленная задача решается в вакцине против ящура, включающей вирусный антиген ящура, гидроокись алюминия и адъювант - сапонин тем, что в качестве вируса ящура используют вирус ящура типа О штамм O₁ Manisa или штамм O₁ №1618.

Также поставленная задача решается в вакцине против ящура, включающей вирусный антиген ящура, гидроокись алюминия и адъювант - сапонин тем, что в качестве вируса ящура используют вирус ящура типа Азия-1 штамм Шамир.

Также поставленная задача решается в способе получения вакцины против ящура, включающем культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток, очистку вирусной суспензии от балластных примесей, инактивацию, концентрирование полученного антигена вируса ящура гидроокисью алюминия и соединение концентрата антигена с адъювантом - сапонином, отличающемся тем, что культивирование вирусного антигена проводят в суспензионной культуре клеток ВНК-21-13-13, а в качестве адъюванта используют смесь натриевой соли сукцината хитозана и сапонина.

Также поставленная задача решается в способе применения вакцины против ящура, включающем вакцинацию в вакцинальной дозе антигенного материала, тем, что вакцинирование проводят смесью вакцин, одна из которых содержит антиген, изготовленный на основе вируса ящура, распространенного в регионе применения вакцины, а другая - антиген, изготовленный на основе вируса ящура, распространенного в пограничном районе региона применения ее, взятых в соотношении 1:0,1-0,2 соответственно, в суммарной дозе антигенов - 7-10 мкг, а при ревакцинации через 7-8 суток используют половину вакцинальной дозы.

Культура клеток ВНК-21-13-13 известна (патент №2553552, «ВНК-21/13-13-перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства», МПК C12N 5/071, опубликовано 20.06.2015 Бюл. №17).

Штаммы вируса ящура типа А (штамм А₂₂ №550), типа О (штамм O₁ Manisa или штамм O₁ №1618) и типа Азия-1 (штамм Шамир) известны (патент РФ №2332233, МПК A61K 39/135, опубликовано 27.08.2008, Бюл. №24).

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие признаки, аналогичные заявляемым предложениям, т.е. предложенные технические решения соответствует критерию «новизна» и «изобретательский уровень».

Все режимы способа осуществимы в лабораторных и промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

Пример 1. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура А₂₂ №550, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21-13-13 при температуре 36°C. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 2 часов.

После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. К полученному антигену вируса ящура А₂₂ №550 добавляют 12% гидроокись алюминия в гликолевом буфере с pH 7,4 до конечной концентрации 15%. Полученную вирусную суспензию с гидроокисью алюминия отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30°C. Далее к реакционной среде добавляют сапонин натриевую соль сукцината хитозана в качестве адъюванта, получая вакцину 1 при следующем соотношении компонентов, мас. %:

Полученную вакцину 1 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.

Пример 2. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура А₂₂ №550, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21-13-13 при температуре 37°C. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 98% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 1,5 часов.

После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. К полученному антигену вируса ящура А₂₂ №550 добавляют 15% гидроокись алюминия в гликолевом буфере с pH 8,6 до конечной концентрации 25%. Полученную вирусную суспензию с гидроокисью алюминия отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30°C. Далее к реакционной среде добавляют сапонин натриевую соль сукцината хитозана в качестве адъюванта, получая вакцину 1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Полученную вакцину 2 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.

Пример 3. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура O₁ Manisa, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21-13-13 при температуре 36°C. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 2 часов.

После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. К полученному антигену вируса ящура O₁ Manisa добавляют 12% гидроокись алюминия в гликолевом буфере с pH 7,4 до конечной концентрации 15%. Полученную вирусную суспензию с гидроокисью алюминия отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30°C. Далее к реакционной среде добавляют сапонин натриевую соль сукцината хитозана в качестве адъюванта, получая вакцину 1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Полученную вакцину 3 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.

Пример 4. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура O₁ Manisa, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21-13-13 при температуре 37°C. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 98% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 1,5 часов.

После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. К полученному антигену вируса ящура O₁ Manisa добавляют 15% гидроокись алюминия в гликолевом буфере с pH 8,6 до конечной концентрации 25%. Полученную вирусную суспензию с гидроокисью алюминия отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30°C. Далее к реакционной среде добавляют сапонин натриевую соль сукцината хитозана в качестве адъюванта, получая вакцину 1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Полученную вакцину 4 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.

Пример 5. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура O₁ №1618, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21-13-13 при температуре 36°C. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 2 часов.

После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. К полученному антигену вируса ящура O₁ №1618 добавляют 12% гидроокись алюминия в гликолевом буфере с pH 7,4 до конечной концентрации 15%. Полученную вирусную суспензию с гидроокисью алюминия отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30°C. Далее к реакционной среде добавляют сапонин натриевую соль сукцината хитозана в качестве адъюванта, получая вакцину 1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Полученную вакцину 5 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.

Пример 6. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура O₁ №1618, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21-13-13 при температуре 37°C. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 98% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 1,5 часов.

После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. К полученному антигену вируса ящура O₁ №1618 добавляют 15% гидроокись алюминия в гликолевом буфере с pH 8,6 до конечной концентрации 25%. Полученную вирусную суспензию с гидроокисью алюминия отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30°C. Далее к реакционной среде добавляют сапонин натриевую соль сукцината хитозана в качестве адъюванта, получая вакцину 1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Полученную вакцину 6 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.

Пример 7. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура Шамир, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21-13-13 при температуре 36°C. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 2 часов.

После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. К полученному антигену вируса ящура Шамир добавляют 12% гидроокись алюминия в гликолевом буфере с pH 7,4 до конечной концентрации 15%. Полученную вирусную суспензию с гидроокисью алюминия отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30°C. Далее к реакционной среде добавляют сапонин натриевую соль сукцината хитозана в качестве адъюванта, получая вакцину 1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Полученную вакцину 7 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.

Пример 8. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура Шамир, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21-13-13 при температуре 37°C. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 98% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 1,5 часов.

После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. К полученному антигену вируса ящура Шамир добавляют 15% гидроокись алюминия в гликолевом буфере с pH 8,6 до конечной концентрации 25%. Полученную вирусную суспензию с гидроокисью алюминия отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30°C. Далее к реакционной среде добавляют сапонин натриевую соль сукцината хитозана в качестве адъюванта, получая вакцину 1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Полученную вакцину 8 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.

Результаты исследования иммуногенной активности моновалентных вакцин при исследовании на крупном рогатом скоте представлена в данных таблицы 1.

Пример 9. В 30% хозяйствах региона применения вакцины вакцинируют молодняк крупного рогатого скота прививают с 4-х месяцев, молодняк овец и коз - с 3-х месяцев всех клинически здоровых животных, вакцинирование проводят смесью вакцин, одна из которых содержит антиген, изготовленный на основе вируса ящура типа А, в частности штамм А₂₂ №550, распространенного в регионе применения вакцины, а другая - антиген, изготовленный на основе вируса ящура типа Азия-1, в частности штамм Шамир, распространенного в пограничном районе региона применения ее, в частности, взятых в соотношении 1:0,1, соответственно, в суммарной дозе антигенов - 7 мкг, а при ревакцинации через 7 суток используют половину вакцинальной дозы.

Также в 30% хозяйствах региона применения вакцины вакцинируют молодняк крупного рогатого скота прививают с 4-х месяцев, молодняк овец и коз - с 3-х месяцев всех клинически здоровых животных, вакцинирование проводят смесью вакцин, одна из которых содержит антиген, изготовленный на основе вируса ящура типа А, в частности штамм А₂₂ №550, распространенного в регионе применения вакцины, а другая - антиген, изготовленный на основе вируса ящура типа Азия-1, в частности штамм Шамир, распространенного в пограничном районе региона применения ее, в частности, взятых в соотношении 1:0,2, соответственно, в суммарной дозе антигенов - 10 мкг, а при ревакцинации через 8 суток используют половину вакцинальной дозы.

В остальных 40% хозяйствах Дагестана вакцинируют молодняк крупного рогатого скота прививают с 4-х месяцев, молодняк овец и коз - с 3-х месяцев всех клинически здоровых животных. Вакцинирование и ревакцинирование проводят известной вакциной, согласно известной инструкции по применению.

Место инъекции обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом или другим дезинфицирующим раствором. Для каждого животного используют отдельную иглу или шприц однократного применения. Каждый флакон перед применением и в процессе вакцинации и ревакцинации необходимо тщательно взбалтывать.

В результате ни в одном из 60% хозяйств, применяющих вакцинирование, согласно заявляемому способу, заболеваний ящура не установлено. В то же время в хозяйствах, использующих известную вакцину, заболевание ящуром установлено.

Таким образом, заявленное предложение позволяет в 1,5-2,3 раз повысить иммуногенность целевого продукта и полностью провести защиту сельскохозяйственных животных от ящура при выявлении в пограничных районах региона применения вакцинирования заболеваний ящуром, вызванных иным штаммом вируса ящура, чем распространенного в регионе применения вакцины.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к биотехнологии и иммунологии, и может быть использована для получения вакцины против ящура. Вакцина включает вирусный антиген ящура, гидроокись алюминия, сапонин и в качестве адъюванта дополнительно используют натриевую соль сукцината хитозана при следующем соотношении компонентов, мас.%: сапонин 0,25-0,75, натриевая соль сукцината хитозана 05,-1,5, гидроокись алюминия в гликолевом буфере с рН 7,-8,6 15,0-25,0 и вирусный антиген ящура – остальное. Группа изобретений относится также к способу получения вакцины против ящура. Использование данной группы изобретений позволяет повысить иммуногенность целевого продукта при вакцинации животных от ящура. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 9 пр., 1 табл.

1. Вакцина против ящура, включающая вирусный антиген ящура, гидроокись алюминия, адъювант – сапонин, отличающаяся тем, что в качестве адъюванта дополнительно используют натриевую соль сукцината хитозана при следующем соотношении компонентов, мас.%:

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве вируса ящура используют вирус ящура типа А штамм А₂₂ №550.

3. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве вируса ящура используют вирус ящура типа О штамм O₁ Manisa или штамм O₁ №1618.

4. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве вируса ящура используют вирус ящура типа Азия-1 штамм Шамир.

5. Способ получения вакцины против ящура по п. 1, включающий культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток, очистку вирусной суспензии от балластных примесей, инактивацию, концентрирование полученного антигена вируса ящура гидроокисью алюминия и соединение концентрата антигена с адъювантом - сапонином, отличающийся тем, что культивирование вирусного антигена проводят в суспензионной культуре клеток ВНК-21-13-13, а в качестве адъюванта используют смесь натриевой соли сукцината хитозана и сапонина.