ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В биологии и в медицине для наблюдения различных мишеней в биологическом образце можно использовать различные способы. Например, анализ белков в гистологических срезах и других цитологических препаратах можно проводить, используя методы гистохимии, иммуногистохимии (ИГХ) или иммунофлуоресценции. Анализ белков в биологических образцах можно также проводить, используя твердофазные иммунологические анализы, например, используя методы Вестерн-блоттинга, или используя анализы на основе клеток, которые можно проводить, например, с применением проточной цитометрии.
Многие из современных методов могут обнаружить в одном образце лишь небольшое число мишеней одновременно (такие как ИГХ или флуоресцентные Вестерн-блоттинги, где число обнаружимых мишеней ограничено флуоресцентной системой обнаружения). Для дальнейшего анализа мишеней может потребоваться использование дополнительных биологических образцов из источника, что ограничивает способность к определению относительных характеристик мишеней, таких как присутствие, отсутствие, концентрация и/или пространственное распределение множественных биологических мишеней в биологическом образце. Кроме того, в некоторых случаях для анализа может быть доступно ограниченное количество образца или для отдельного образца может потребоваться дополнительный анализ.
Способы многократного анализа отдельного образца описаны в патенте США №7629125 и в патенте США №7741046. В частности, в патенте США №7741046 предложены способы обнаружения множественных мишеней в биологическом образце, в которые вовлечено использование окисления для инактивации генераторов сигнала (например, для обесцвечивания флуоресцентных красителей). Реакцию окисления осуществляют путем использования окисляющих реагентов, таких как пероксид водорода.
Кроме того, сигнал может быть инактивирован непрерывным воздействием излучения на генератор сигнала, т.е. фотообесцвечиванием. Подобно инактивации сигнала окислением, этот процесс может быть продолжительным и может не проходить до завершения, приводя в результате к сниженному отношению сигнал/шум. Кроме того, непрерывное воздействие излучения на образец может повредить биологический образец. Таким образом, все еще существует необходимость в более быстрых, более мягких и более чувствительных способах последовательного анализа биологических мишеней.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном изобретении раскрыты новые способы высокопроизводительного мультиплексного анализа образца. В способах используют, например, процесс цитирования сигнала, где в каждом цикле стадия фотореакции дает возможность повторно использовать одни и те же генераторы сигнала, например флуорофоры, в последующем цикле для обнаружения дополнительных маркеров, например белков. Эти способы можно применять, например, для последовательного анализа биологического образца, чтобы различать среди прочего присутствие, отсутствие, концентрацию и/или пространственное распределение множественных биологических мишеней в биологическом образце. Стадия фотореакции может включать нанесение агента переноса электрона, например боратной соли, и инициацию фотореакции, например, посредством облучения образца видимым светом, для инактивации генератора сигнала, например флуоресцентного красителя.
В некоторых воплощениях преимущества раскрытых способов могут включать быстрое разрушение сигнала в каждом цикле. Например, в некоторых случаях гашение наблюдают примерно за 20 секунд по сравнению с более чем 15 минутами при традиционных способах. В некоторых воплощениях раскрытые способы также могут характеризоваться отсутствием остаточной флуоресценции даже в мишенях с высокой экспрессией, приводящим в результате, например, к повышенному отношению сигнал/шум. Раскрытые способы также не повреждают биологический образец или его компоненты, например эпитопы, так что один и тот же образец можно использовать для множества циклов. Также в некоторых воплощениях, по сравнению с непосредственным фотообесцвечиванием флуоресцентных красителей, раскрытые способы обладают преимуществами, поскольку не требуют света высокой мощности, который может повредить компоненты биологического образца.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение представляет собой способ зондирования множественных мишеней в биологическом образце, включающий:
(а) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в биологическом образце, содержащем множественные мишени;
(б) наблюдение сигнала от по меньшей мере одного зонда, связанного на стадии (а);
(в) приведение образца, содержащего связанный зонд со стадии (а), в контакт с реагентом переноса электрона;
(г) облучение образца со стадии (в);
(д) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце со стадии (г); и
(е) наблюдение сигнала от зонда, связанного на стадии (д).
В некоторых воплощениях зонд на стадии (а) содержит генератор оптического сигнала, и сигнал, наблюдаемый на стадии (б), представляет собой оптический сигнал. В следующих воплощениях генератор оптического сигнала представляет собой генератор флуоресцентного сигнала, и оптический сигнал, наблюдаемый на стадии (б), представляет собой флуоресцентный сигнал.
В некоторых воплощениях стадия (а) включает связывание более чем одного зонда с двумя или более чем двумя мишенями.
В некоторых воплощениях облучение образца на стадии (г) осуществляют в присутствии буфера. В некоторых воплощениях облучение осуществляют при рН 5-9. В некоторых воплощениях облучение осуществляют при рН 6-8.
В некоторых воплощениях облучение образца на стадии (г) осуществляют при температуре 4-50°C. В предпочтительном воплощении облучение образца осуществляют при температуре 20-30°C.
В некоторых воплощениях облучение образца на стадии (г) осуществляют посредством воздействия на образец светом с длиной волны от 350 нм до 1,3 мкм. В некоторых воплощениях облучение образца осуществляют посредством воздействия светом с длиной волны 400-700 нм на образец.
В некоторых воплощениях реагент переноса электрона представляет собой боратную соль. В некоторых воплощениях боратная соль представлена следующей структурной формулой:
где:
каждый из R1, R2 и R3 независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, где алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил возможно замещен одним или более чем одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из (C1-C4)алкила, (C1-C4)алкокси, (С1-С4)алкиламино, амино, гидроксила, циано, галогена или нитро;
R4 представляет собой алкил, алкенил или алкинил, где алкил, алкенил или алкинил возможно замещен одним или более чем одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из (С1-С4)алкила, (С1-С4)алкокси, (С1-С4)алкиламино, амино, гидроксила, циано, галогена или нитро; и
M+ выбран из группы, состоящей из органических и неорганических катионов.
В некоторых воплощениях каждый из R1, R2 и R3 представляет собой арил. В некоторых воплощениях арил представляет собой фенил. В некоторых воплощениях фенил представляет собой незамещенный фенил.
В некоторых воплощениях R4 представляет собой возможно замещенный алкил. В некоторых воплощениях R4 представляет собой незамещенный бутил.
В некоторых воплощениях каждый из R1, R2 и R3 представляет собой возможно замещенный арил, и R4 представляет собой возможно замещенный алкил. В следующем воплощении каждый из R1, R2 и R3 представляет собой незамещенный фенил, R4 представляет собой незамещенный бутил, и боратная соль представляет собой трифенилбутилборатную соль.
В некоторых воплощениях M+ представляет собой неорганический катион. В некоторых воплощениях неорганический катион представляет собой Li+, Na+ или К+.
В некоторых воплощениях зонд содержит связывающий агент и генератор сигнала. В некоторых воплощениях генератор сигнала представляет собой генератор флуоресцентного сигнала. В некоторых воплощениях генератор флуоресцентного сигнала включает цианиновый краситель. В некоторых воплощениях цианиновый краситель представляет собой Cy3 или Cy5.
В некоторых воплощениях цианиновый краситель представляет собой Cy3; облучение образца на стадии (д) осуществляют путем использования оптических фильтров, и оно включает воздействие на образец светом с длиной волны 520-580 нм и приводит в результате к селективному фотовозбуждению Cy3.
В некоторых воплощениях цианиновый краситель представляет собой Cy5; облучение образца на стадии (д) осуществляют путем использования оптических фильтров, и оно включает воздействие на образец светом с длиной волны 620-680 нм и приводит в результате к селективному фотовозбуждению Cy5.
В некоторых воплощениях биологический образец на стадии (а) включает клеточные органеллы, целые клетки или тканевые срезы. В некоторых воплощениях образец включает белки, углеводы или нуклеиновые кислоты.
В некоторых воплощениях стадии (в)-(е) повторяют один или более чем один раз. В некоторых воплощениях стадии (в)-(е) повторяют по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, по меньшей мере 30, по меньшей мере 60, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 150 раз. В некоторых воплощениях стадии (в)-(е) повторяют 25-30 раз. В других воплощениях стадии (в)-(е) повторяют 2-10 раз.
В некоторых воплощениях стадии (в) и (г) проводят в течение от примерно 20 секунд до примерно 60 минут. В некоторых воплощениях стадии (в) и (г) проводят в течение от примерно 20 секунд до примерно 15 минут. В некоторых воплощениях стадии (в) и (г) проводят в течение от примерно 20 секунд до примерно 5 минут.
В некоторых воплощениях стадии (в) и (г) проводят при температуре 4-50°C. В предпочтительном воплощении стадии (в) и (г) проводят при температуре 20-30°C.
В некоторых воплощениях способ также включает измерение одного или более чем одного значения интенсивности сигнала, наблюдаемого на следующих стадиях наблюдения: на стадии (б), на стадии (е) или на стадиях (б) и (е). В некоторых воплощениях способ дополнительно включает коррелирование значения интенсивности с количеством мишени, присутствующей в образце.
В некоторых воплощениях и зонд на стадии (а) и зонд на стадии (д) содержат генератор сигнала. В некоторых воплощениях генератор сигнала на стадии (а) является таким же, как генератор сигнала на стадии (д). В других воплощениях генератор сигнала на стадии (а) отличается от генератора сигнала на стадии (д).
В некоторых воплощениях сигналы, наблюдаемые как на стадии (б), так и на стадии (е), могут быть обнаружены в одном канале обнаружения. В других воплощениях сигнал, наблюдаемый на стадии (б) или на стадии (е), может быть независимо обнаружен в разных каналах обнаружения.
В некоторых воплощениях компоненты биологического образца, отличные от зонда, значительно не модифицируются.
В некоторых воплощениях после стадии (г) не наблюдается обнаружимый сигнал.
В некоторых воплощениях генератор сигнала включает хромофор или Раман-активную метку.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение представляет собой способ зондирования множественных мишеней в биологическом образце, включающий:
(а) связывание множественных зондов с множественными мишенями, присутствующими в биологическом образце;
(б) наблюдение первого набора сигналов от первого набора зондов, связанных на стадии (а);
(в) приведение образца, содержащего связанные зонды со стадии (а), в контакт с реагентом переноса электрона;
(г) облучение образца со стадии (в);
(д) генерирование второго набора сигналов от второго набора зондов, связанных на стадии (а);
(е) наблюдение второго набора сигналов.
В некоторых воплощениях облучение образца на стадии (г) инициирует фотореакцию, по существу инактивирующую генератор сигнала путем фотоактивируемого химического обесцвечивания. В некоторых воплощениях фотореакция включает межмолекулярный перенос электрона. В других воплощениях фотореакция включает внутримолекулярный перенос электрона.
В некоторых воплощениях генератор сигнала модифицируется необратимо. В некоторых воплощениях генератор сигнала модифицируется необратимо посредством фотореакции, инактивирующей генератор сигнала посредством фотоактивируемого химического обесцвечивания.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение представляет собой способ высокопроизводительного мультиплексного анализа биологического образца, включающий:
процесс цитирования сигнала, где в каждом цикле за окрашиванием и визуализацией следует нанесение реагента переноса электрона и облучение биологического образца.
В некоторых воплощениях способ дает возможность быстрого цитирования сигнала без значительного модифицирования компонентов биологического образца, отличных от зонда.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение представляет собой набор для зондирования множественных мишеней в биологическом образце, содержащий:
множественные зонды, содержащие связывающий агент, соединенный с генератором сигнала;
реагент переноса электрона, который при контакте с генератором сигнала способен к обесцвечиванию генератора сигнала при облучении.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение представляет собой серию из по меньшей мере двух изображений, показывающих оптически меченные биологические мишени, где:
изображения получены в процессе зондирования множественных мишеней в биологическом образце, включающем:
(а) связывание по меньшей мере одного оптического зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в биологическом образце, содержащем множественные мишени;
(б) наблюдение сигнала от оптического зонда, связанного на стадии (а);
(в) приведение образца, содержащего связанный оптический зонд со стадии (а), в контакт с реагентом переноса электрона;
(г) облучение образца со стадии (в);
(д) связывание по меньшей мере одного оптического зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце со стадии (г); и
(е) наблюдение сигнала от оптического зонда, связанного на стадии (д).
В некоторых воплощениях настоящее изобретение представляет собой способ зондирования мишеней в биологическом образце, включающий:
(а) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в биологическом образце, содержащем множественные мишени;
(б) наблюдение сигнала от зонда, связанного на стадии (а);
(в) приведение образца, содержащего связанный зонд со стадии (а), в контакт с реагентом переноса электрона; и
(г) облучение образца со стадии (в).
В некоторых воплощениях настоящее изобретение представляет собой способ зондирования множественных мишеней в биологическом образце, включающий:
(а) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в биологическом образце, содержащем множественные мишени;
(б) связывание по меньшей мере одного контрольного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в биологическом образце;
(в) наблюдение сигнала от зонда, связанного на стадии (а), и контрольного сигнала от контрольного зонда, связанного на стадии (б);
(г) приведение образца со стадии (в) в контакт с реагентом переноса электрона, способным к селективному взаимодействию с зондом, но не с контрольным зондом;
(д) облучение образца со стадии (г);
(е) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце со стадии (д); и
(ж) наблюдение сигнала от зонда, связанного на стадии (е).
В некоторых воплощениях стадии (а) и (б) проводят одновременно. В некоторых воплощениях стадия (ж) также включает наблюдение сигнала от контрольного зонда, связанного на стадии (б).
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1 представляет собой полутоновое изображение графика, показывающего оптическую плотность красителя Cy3 при 550 нм после инкубации с солью трифенилбутилборат лития в различных концентрациях и облучения в течение 4 или 10 минут.
На Фиг. 2 показаны полутоновые изображения образцов, окрашенных Cy3-конъюгированным цитокератином, до и после фотоактивируемого химического обесцвечивания.
На Фиг. 3 показаны полутоновые изображения образцов, окрашенных Cy5-конъюгированным пан-кадгерином, до и после фотоактивируемого химического обесцвечивания.
На Фиг. 4 показано полутоновое изображение спектра флуоресценции красителя BODIPY до и после фотоактивируемого химического обесцвечивания.
На Фиг. 5 показано полутоновое изображение спектра флуоресценции красителя родамина до и после фотоактивируемого химического обесцвечивания.
На Фиг. 6 показано полутоновое изображение спектра флуоресценции красителя 1,3-дихлор-7-гидрокси-9,9-диметил-2(9Н)-акридинона (DDAO) до и после фотоактивируемого химического обесцвечивания.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
Формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст явным образом не диктует иное. Приблизительные формулировки, используемые в данном изобретении на протяжении всего описания и формулы изобретения, могут быть применены для модификации какого-либо количественного выражения, которое может допустимо варьировать, не приводя в результате к изменению основной функции, к которой оно относится. Соответственно, значение, модифицируемое таким термином, как "примерно", не ограничено указанным точным значением. Если не указано иное, все числа, которыми выражены количества ингредиентов, свойства, такие как молекулярная масса, условия реакций и т.д., используемые в описании и в формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином "примерно". Соответственно, если не указано противоположное, числовые параметры, указанные в последующем описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приближениями, которые могут варьировать в зависимости от желаемых свойств, которые подразумевают получить в настоящем изобретении. По крайней мере каждый числовой параметр следует по меньшей мере истолковывать в свете числа указанных значащих цифр и путем применения обычных методов округления.
Как используют в данном изобретении, термин "алкил" относится к насыщенным алифатическим группам, включающим прямоцепочечные алкильные группы (например метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, гептил, октил, нонил, децил и т.д.), разветвленные алкильные группы (изопропил, трет-бутил, изобутил и т.д.). В некоторых воплощениях прямоцепочечный или разветвленный алкил имеет 6 или менее атомов углерода (например C1-C6 для прямой цепи, С3-С6 для разветвленной цепи) в своем скелете или 4 атома углерода или менее в своем скелете (например C1-C4 для прямой цепи, С3-С4 для разветвленной цепи). Термин "(С1-C6)алкил" относится к алкильным группам, содержащим от 1 до 6 атомов углерода. Термин "(С1-С4)алкил" относится к алкильным группам, содержащим от 1 до 4 атомов углерода. Кроме того, термин алкил включает как "незамещенные алкилы", так и "замещенные алкилы", последние из которых относятся к алкильным группировкам, имеющим заместители, замещающие атом водорода на одном или более чем одном атоме углерода углеводородного скелета. Такие заместители могут включать, например, (C1-C4)алкил, (С1-С4)алкокси, амино (включая (C1-C4)алкиламино и (C1-C4)диалкиламино), гидроксил, циано, галоген или нитро. Циклоалкилы могут быть дополнительно замещены, например, описанными выше заместителями.
Как используют в данном изобретении, термин "алкенил" относится к ненасыщенным алифатическим группам, аналогичным по длине и возможному замещению описанным выше алкилам, но содержащим по меньшей мере одну двойную связь. Например, термин "алкенил" включает прямоцепочечные алкенильные группы (например этиленил, пропенил, бутенил, пентенил, гексенил, гептенил, октенил, ноненил, деценил и т.д.), разветвленные алкенильные группы. Кроме того, термин "алкенил" включает как "незамещенные алкенилы", так и "замещенные алкенилы", последние из которых относятся к алкенильным группировкам, имеющим заместители, замещающие атом водорода на одном или более чем одном атоме углерода углеводородного скелета. Такие заместители могут включать, например, (С1-С4)алкил, (C1-C4)алкокси, амино (включая (C1-C4)алкиламино и (С1-С4)диалкиламино), гидроксил, циано, галоген или нитро.
Как используют в данном изобретении, термин "алкинил" относится к ненасыщенным алифатическим группам, аналогичным по длине и возможному замещению описанным выше алкилам, но содержащим по меньшей мере одну тройную связь. Например, термин "алкинил" включает прямоцепочечные алкинильные группы (например этинил, пропинил, бутинил, пентинил, гексинил, гептинил, октинил, нонинил, децинил и т.д.) или разветвленные алкинильные группы. Кроме того, термин "алкинил" включает как "незамещенные алкинилы", так и "замещенные алкинилы", последние из которых относятся к алкинильным группировкам, имеющим заместители, замещающие атом водорода на одном или более чем одном атоме углерода углеводородного скелета. Такие заместители могут включать, например, (C1-C4)алкил, (C1-C4)алкокси, амино (включая (C1-C4)алкиламино и (С1-С4)диалкиламино), гидроксил, циано, галоген или нитро.
Как используют в данном изобретении, термин "алкокси" относится к замещенным и. незамещенным алкильным, алкенильным и алкинильным группам, ковалентно связанным с атомом кислорода. Примеры алкоксигрупп включают метокси, этокси, изопропилокси, пропокси, бутокси и пентокси, но не ограничены ими. В некоторых воплощениях прямоцепочечные или разветвленные алкоксигруппы имеют 4 атома углерода или менее (например C1-C4 для прямой цепи, С3-С4 для разветвленной цепи) в своем скелете. Термин "(С1-С4)алкил" относится к алкильным группам, содержащим от 1 до 4 атомов углерода.
Как используют в данном изобретении, термин "амин" или "амино" относится к соединениям или заместителям, где атом азота ковалентно связан по меньшей с одним атомом углерода или гетероатомом. Этот термин включает "алкиламино", включающий группы и соединения, где атом азота связан по меньшей мере с одной дополнительной алкильной группой. Термин "диалкиламино" включает группы, где атом азота связан по меньшей мере с двумя дополнительными алкильными группами. В некоторых воплощениях эти алкильные группы имеют 4 атома углерода или менее (например C1-C4 для прямой цепи, С3-С4 для разветвленной цепи) в своем скелете. Термин (С1-С4)алкиламино относится к группам и соединениям, где атом азота связан по меньшей мере с одной дополнительной (C1-C4)алкильной группой. Термин (C1-C4)диалкиламино относится к группам и соединениям, где атом азота связан по меньшей мере с двумя дополнительными (С1-С4)алкильными группами.
Как используют в данном изобретении, термин "арил" относится к группам, например 5- и 6-членным однокольцевым ароматическим группам, которые могут включать от нуля до четырех гетероатомов, например бензолу, фенилу, пирролу, фурану, тиофену, тиазолу, изотиазолу, имидазолу, триазолу, тетразолу, пиразолу, оксазолу, изоксазолу, пиридину, пиразину, пиридазину и пиримидину и тому подобному. Кроме того, термин "арил" включает полициклические арильные группы, например трициклические, бициклические, например нафталин, бензоксазол, бензодиоксазол, бензотиазол, бензоимидазол, бензотиофен, метилендиоксифенил, хинолин, изохинолин, нафтиридин, индол, бензофуран, пурин, бензофуран, деазапурин или индолизин. Арильные группы, имеющие гетероатомы в кольцевой структуре, могут также называться "арильными гетероциклами", "гетероарилами" или "гетероароматическими группами". Ароматическое кольцо может быть замещено в одном или более чем в одном кольцевом положении такими заместителями, как описано выше, как, например, (C1-C4)алкил, (C1-C4)алкокси, амино (включая (C1-C4)алкиламино и (C1-C4)диалкиламино), гидроксил, циано, галоген или нитро. Арильные группы могут быть также конденсированы или связаны через мостик с алициклическими или гетероциклическими кольцами, не являющимися ароматическими, таким образом, что образуют полицикл (например тетралин). Термин "гетероарил" включает ненасыщенные циклические соединения, такие как азирин, оксирен, дитиет, пирролин, пиррол, фуран, дигидрофуран, дигидротиофен, тиофен, пиразол, имидазол, оксазол, тиазол, изотиазол, 1,2,3-триазол, 1,2,4-триазол, дитиазол, тетразол, пиридин, пиран, пиримидин, пиран, тиапиран, диазин, тиазин, диоксин, триазин и тетразен.
Как используют в данном изобретении, термин "антитело" относится к иммуноглобулину, специфически связывающемуся с определенной пространственной и полярной организацией другой молекулы, и таким образом определен как комплементарный ей. Антитело может быть моноклональным или поликлональным и может быть получено методами, хорошо известными в данной области техники, такими как иммунизация хозяина и сбор сывороток (поликлональных), или путем получения стабильных гибридных клеточных линий и сбора секретируемого белка (моноклонального), или путем клонирования и экспрессии нуклеотидных последовательностей или их мутировавших вариантов, кодирующих по меньшей мере аминокислотные последовательности, необходимые для специфического связывания природных антител. Антитела могут включать полноразмерный иммуноглобулин или его фрагмент, где иммуноглобулины включают различные классы и изотипы, такие как IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3, IgM. Функциональные фрагменты антитела могут включать участки антитела, способные к сохранению связывания со сродством, подобным сродству полноразмерного антитела (например Fab, Fv и F(ab').sub.2 или Fab'). Кроме того, где это целесообразно, можно использовать агрегаты, полимеры и конъюгаты иммуноглобулинов или их фрагментов при условии, что их связывающее сродство к конкретной молекуле по существу сохранено.
Как используют в данном изобретении, термин "связывающий агент" относится к молекуле, которая связывается с одной или более чем одной мишенью в биологическом образце. Связывающий агент может специфически связываться с мишенью. Подходящие связывающие агенты могут включать один или более чем один из природных или модифицированных пептидов, белков (например антител, аффител или аптамеров), нуклеиновых кислот (например полинуклеотидов, ДНК, РНК или аптамеров), полисахаридов (например пектинов, сахаров), липидов, ферментов, субстратов ферментов или ингибиторов, лигандов, рецепторов, антигенов или гаптенов. Подходящий связывающий агент может быть выбран в зависимости от анализируемого образца и от мишеней, доступных для обнаружения. Например, мишень в образце может включать лиганд, а связывающий агент может включать рецептор, либо мишень может включать рецептор, а связывающий агент может включать лиганд. Подобным образом, мишень может включать антиген, а связывающий агент может включать антитело или фрагмент антитела, либо наоборот. В некоторых воплощениях мишень может включать нуклеиновую кислоту, а связывающий агент может включать комплементарную нуклеиновую кислоту. В некоторых воплощениях как мишень, так и связывающий агент могут включать белки, способные к связыванию друг с другом.
Как используют в данном изобретении, термин "биологический образец" относится к полученному от биологического субъекта образцу, включающему образец биологической ткани или жидкости, полученный in vivo или in vitro. Такие образцы могут представлять собой жидкость организма (например кровь, плазму крови, сыворотку или мочу), органы, ткани, фракции, клетки, выделенные из млекопитающих, включая людей, и клеточные органеллы, но не ограничены ими. Биологические образцы также могут включать срезы биологического образца, включающего ткани (например срезы органа или ткани). Биологические образцы могут также включать экстракты из биологического образца, например антиген или нуклеиновую кислоту из биологической жидкости (например крови или мочи). Биологические образцы могут содержать белки, углеводы или нуклеиновые кислоты.
Биологический образец может иметь прокариотическое происхождение, происхождение из простейших или эукариотическое происхождение (например из насекомых, простейших, птиц, рыб, рептилий). В некоторых воплощениях биологический образец представляет собой образец от млекопитающего (например от крысы, мыши, коровы, собаки, осла, морской свинки или кролика). В некоторых воплощениях биологический образец имеет происхождение из приматов (например от шимпанзе или человека).
Как используют в данном изобретении, термин "контрольный зонд" относится к агенту, имеющему в составе связывающий агент, соединенный с генератором сигнала, или к генератору сигнала, способному к прямому окрашиванию, так что генератор сигнала сохраняет по меньшей мере 80 процентов сигнала после контакта с реагентом переноса электрона и при последующем облучении. Подходящий генератор сигнала в контрольном зонде по существу не инактивируется, например по существу не обесцвечивается в результате фотоактивируемого химического обесцвечивания при контакте с реагентом переноса электрона и облучении. Подходящие примеры генераторов сигнала могут включать флуорофор, не претерпевающий обесцвечивание в используемых условиях (например DAPI).
Как используют в данном изобретении, термин "фермент" относится к молекуле белка, которая может катализировать химическую реакцию субстрата. В некоторых воплощениях подходящий фермент катализирует химическую реакцию субстрата с образованием продукта реакции, который может связываться с рецептором (например фенольные группы), присутствующим в образце. Рецептор может быть экзогенным (то есть рецептор снаружи прикреплен к образцу или к твердому носителю) или эндогенным (рецепторы, естественно присутствующие в образце или на твердом носителе). Примеры подходящих ферментов включают пероксидазы, оксидазы, фосфатазы, эстеразы и гликозидазы. Конкретные примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-D-галактозидазу, липазу и глюкозооксидазу.
Как используют в данном изобретении, термин "субстрат фермента" относится к химическому соединению, которое претерпевает химический катализ ферментом с образованием продукта реакции. В некоторых воплощениях продукт реакции способен к связыванию с рецептором, присутствующим в образце. В некоторых воплощениях субстраты ферментов, применяемые в способах по изобретению, могут включать нехромогенные или нехемилюминесцентные субстраты. Генератор сигнала может быть присоединен к субстрату фермента в виде метки.
Как используют в данном изобретении, термин "реагент переноса электрона" относится к реагенту, который может участвовать в фотореакции с молекулой, способной претерпевать фотовозбуждение. Этот термин также относится к композиции, содержащей реагент, который может участвовать в фотореакции с молекулой, способной претерпевать фотовозбуждение. В некоторых воплощениях молекула, способная претерпевать фотовозбуждение, может представлять собой генератор сигнала. В некоторых воплощениях реагент переноса электрона может передавать электрон генератору сигнала в ходе фотореакции. В альтернативных воплощениях реагент переноса электрона может принимать электрон от генератора сигнала в ходе фотореакции.
В некоторых воплощениях реагент переноса электрона, передающий электрон генератору сигнала в ходе фотореакции, может представлять собой боратную соль. В другом воплощении боратная соль представляет собой трифенилбутилборат.
В альтернативных воплощениях реагент переноса электрона, принимающий электрон от фотовозбужденной молекулы, может представлять собой ониевую соль [например гексафторфосфат дифенилиодония (DPI) или тетрафторборат диметилфенацилсульфония (DMPS)] или бутилтрифенилборат тетрабутиламмония (ТВАВ).
Как используют в данном изобретении, термин "флуорофор" или "генератор флуоресцентного сигнала" относится к химическому соединению, которое при возбуждении светом с определенной длиной волны испускает свет при другой длине волны. Флуорофоры могут быть описаны в отношении их профиля испускания или "цвета". Зеленые флуорофоры (например Cy3, флуоресцеинизотиоцианат (FITC) и Oregon Green) могут характеризоваться испусканием при длинах волн, находящихся как правило в диапазоне 515-540 нанометров. Красные флуорофоры (например Texas Red, Cy5 и тетраметилродамин) могут характеризоваться испусканием при длинах волн, находящихся как правило в диапазоне 590-690 нанометров. Примеры флуорофоров включают 4-ацетамидо-4'-изотиоцианатостильбен-2,2'-дисульфокислоту, акридин, производные акридина и изотиоцианата акридина, 5-(2'-аминоэтил)аминонафталин-1-сульфокислоту (EDANS), 4-амино-N-[3-винилсульфонил)фенил]нафталимид-3,5-дисульфонат (Lucifer Yellow VS), N-(4-анилино-1-нафтил)малеимид, антраниламид, бриллиантовый желтый, кумарин, производные кумарина, 7-амино-4-метилкумарин (АМС, Кумарин 120), 7-амино-трифторметилкумарин (Кумарин 151), цианозин, 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), 5',5ʺ-дибромпирогаллолсульфонфталеин (бромпирогаллоловый красный), 7-диэтиламино-3-(4'-изотиоцианатофенил)-4-метилкумарин, 4,4'-диизотиоцианатодигидростильбен-2,2'-дисуьфокислоту, 4,4'-диизотиоцианатостильбен-2,2'-дисульфокислоту, 5-[диметиламино]нафталин-1-сульфонилхлорид (DNS, дансилхлорид), флуоресцеин и производные, такие как 5-карбоксифлуоресцеин (РАМ), 5-(4,6-дихлортриазин-2-ил)аминофлуоресцеин (DTAF), 2'7'-диметокси-4'5'-дихлор-6-карбоксифлуоресцеин (JOE), флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), Q-FITC (XRITC); производное флуорескамина (флуоресценция при взаимодействии с аминами); IR144; IR1446; малахитовый зеленый изотиоцианат; 4-метилумбеллиферон; орто-крезолфталеин; нитротирозин; парарозанилин; феноловый красный, В-фикоэритрин; производное орто-фталдиальдегида (флуоресценция при взаимодействии с аминами); пирен и производные, такие как пирен, пиренбутират и сукцинимидил-1-пиренбутират; Reactive Red 4 (Cibacron. RTM. Бриллиантовый красный 3B-А), родамин и производные, такие как 6-карбокси-Х-родамин (ROX), 6-карбоксиродамин (R6G), лиссамин-родамин В сульфонилхлорид, родамин (Rhod), родамин В, родамин 123, родамин Х изотиоцианат, сульфородамин В, сульфородамин 101 и сульфонилхлоридное производное сульфородамина 101 (техасский красный); N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA); тетраметилродамин, тетраметилродамина изотиоцианат (TRITC); рибофлавин; хелатные производные розоловой кислоты и лантанида, цианины, пирилиевые красители, скварены, 1,3-дихлор-7-гидрокси-9,9-диметил-2(9Н)-акридинон (DDAO) и диметилакридинон (DAO), но не ограничены ими. В некоторых воплощениях флуорофор может представлять собой цианиновые, родаминовые, BODIPY или 1,3-дихлор-7-гидрокси-9,9-диметил-2(9Н)-акридиноновые (DDAO) красители. В предпочтительном воплощении флуорофор представляет собой цианиновый краситель. В другом воплощении цианиновый краситель представляет собой Cy3 или Cy5.
Как используют в данном изобретении, термин "in situ" в целом относится к событию, происходящему в исходной локализации, например в интактном органе или ткани или в репрезентативном сегменте органа или ткани. В некоторых воплощениях анализ мишеней in situ может быть проведен на клетках, имеющих происхождение из разнообразных источников, включающих организм, орган, образец ткани или клеточную культуру. Анализ in situ обеспечивает контекстную информацию, которая может быть утрачена, когда мишень извлечена из места ее происхождения. Соответственно, анализ мишеней in situ описывает анализ связанного с мишенью зонда, локализованного внутри целой клетки или образца ткани, при этом клеточная мембрана полностью интактна или частично интактна, причем связанный с мишенью зонд остается внутри клетки. Кроме того, способы, раскрытые в данном изобретении, можно применять для анализа мишеней in situ в фиксированных или нефиксированных образцах клеток или тканей.
Как используют в данном изобретении, термины "облучение" или "облучать" относятся к действию или процессу, заключающемуся в воздействии на образец или раствор неионизирующего излучения. В некоторых воплощениях неионизирующее излучение имеет длины волн от 350 нм до 1,3 мкм. В предпочтительных воплощениях неионизирующее излучение представляет собой видимый свет с длиной волны 400-700 нм. Облучение можно осуществлять путем воздействия на образец или раствор источника излучения, например лампы, способного к испусканию излучения с определенной длиной волны или определенным диапазоном длин волн. В некоторых воплощениях молекула, способная претерпевать фотовозбуждение, претерпевает фотовозбуждение в результате облучения. В некоторых воплощениях молекула, способная претерпевать фотовозбуждение, представляет собой генератор сигнала, например генератор флуоресцентного сигнала. В некоторых воплощениях облучение генератора флуоресцентного сигнала инициирует фотореакцию между генератором флуоресцентного сигнала и реагентом переноса электрона. В некоторых воплощениях облучение, инициирующее фотореакцию, по существу инактивирует генератор сигнала путем фотоактивируемого химического обесцвечивания.
Чтобы ограничить облучение образца или раствора конкретной длиной волны или диапазоном длин волн, можно использовать оптические фильтры. В некоторых воплощениях оптические фильтры можно использовать, чтобы ограничить облучение узким диапазоном длин волн для селективного фотовозбуждения одной или более чем одной молекулы, способной претерпевать фотовозбуждение. Термин "селективное фотовозбуждение" относится к действию или процессу, посредством которого одна или более чем одна молекула, способная претерпевать фотовозбуждение, претерпевает фотовозбуждение в присутствии одной или более чем одной другой молекулы, способной претерпевать фотовозбуждение, которая остается в основном электронном состоянии после облучения.
В некоторых воплощениях молекула, способная претерпевать фотовозбуждение, представляет собой флуоресцентный краситель, например цианиновый краситель. В еще одном воплощении облучение, ограниченное диапазоном длин волн 520-580 нм, используют для селективного фотовозбуждения красителя Cy3. В следующем воплощении облучение, ограниченное диапазоном длин волн 620-680 нм, используют для селективного фотовозбуждения красителя Cy5. В альтернативных воплощениях облучение образца при определенной длине волны можно также осуществлять путем использования лазера.
Как используют в данном изобретении, термин "пероксидаза" относится к классу ферментов, катализирующих реакцию окисления субстрата фермента донором электронов. Примеры ферментов, представляющих собой пероксидазы, включают пероксидазу хрена, цитохром-С-пероксидазу, глутатионпероксидазу, микропероксидазу, миелопероксидазу, лактопероксидазу или пероксидазу сои.
Как используют в данном изобретении, термин "субстрат пероксидазы" относится к химическому соединению, претерпевающему химический катализ пероксидазой с образованием продукта реакции. В некоторых воплощениях субстраты пероксидазы, используемые в способах по изобретению, могут включать нехромогенные или нехемилюминесцентные субстраты. Генератор флуоресцентного сигнала может быть присоединен к субстрату пероксидазы в виде метки.
Как используют в данном изобретении, термин "обесцвечивание", "фотоактивируемое химическое обесцвечивание" или "фотоиндуцируемое химическое обесцвечивание" относится к действию или процессу, посредством которого сигнал, генерируемый генератором сигнала, модифицируется в ходе фотореакции. В некоторых воплощениях генератор сигнала модифицируется необратимо.
В некоторых воплощениях сигнал ослабляется или исчезает в результате фотоактивируемого химического обесцвечивания. В некоторых воплощениях генератор сигнала полностью обесцвечивается, то есть интенсивность сигнала снижается примерно на 100%. В некоторых воплощениях сигнал представляет собой оптический сигнал, а генератор сигнала представляет собой генератор оптического сигнала. Термин "фотоактивируемое химическое обесцвечивание" подразумевают как исключающий фотообесцвечивание или потерю сигнала (например флуоресцентного сигнала), которые могут происходить в отсутствие реагента переноса электрона, например, после непрерывного облучения генератора сигнала, такого как флуорофор, или после непрерывного воздействия на него светом.
Как используют в данном изобретении, термин "фотовозбуждение" относится к действию или процессу, посредством которого молекула переходит от основного электронного состояния в возбужденное электронное состояние при поглощении энергии излучения, например при облучении. Фотовозбужденные молекулы могут участвовать в химических реакциях, например в реакциях переноса электронов. В некоторых воплощениях молекула, способная претерпевать фотовозбуждение, представляет собой генератор сигнала, например генератор флуоресцентного сигнала.
Как используют в данном изобретении, термин "фотореакция" или "фотоиндуцируемая реакция" относится к химической реакции, которая инициируется и/или протекает в результате фотовозбуждения по меньшей мере одного реагента. Реагентами при фотореакции могут быть реагент переноса электрона и молекула, способная претерпевать фотовозбуждение. В некоторых воплощениях фотореакция может включать перенос электрона от реагента переноса электрона на молекулу, которая претерпела фотовозбуждение, т.е. на фотовозбужденную молекулу. В альтернативных воплощениях фотореакция может также включать перенос электрона от молекулы, которая претерпела фотовозбуждение, на реагент переноса электрона. В некоторых воплощениях молекула, способная претерпевать фотовозбуждение, представляет собой генератор флуоресцентного сигнала, например флуорофор. В некоторых воплощениях фотореакция приводит в результате к необратимой модификации одного или более чем одного компонента фотореакции. В некоторых воплощениях фотореакция по существу инактивирует генератор сигнала за счет фотоактивируемого химического обесцвечивания.
В некоторых воплощениях фотореакция может включать межмолекулярный перенос электрона между реагентом переноса электрона и фотовозбужденной молекулой, например, перенос электрона происходит, когда связь между реагентом переноса электрона и фотовозбужденной молекулой является временной, образующейся непосредственно перед переносом электрона и разъединяющейся после переноса электрона.
В некоторых воплощениях фотореакция может включать внутримолекулярный перенос электрона между реагентом переноса электрона и фотовозбужденной молекулой, например, перенос электрона происходит, когда реагент переноса электрона и фотовозбужденная молекула связаны вместе, например, посредством ковалентных или электростатических взаимодействий, перед инициацией процесса переноса электрона. Фотореакция, включающая внутримолекулярный перенос электрона, может происходить, например, когда молекула, способная претерпевать фотовозбуждение, и реагент переноса электрона несут противоположные заряды и образуют комплекс, удерживаемый за счет электростатических взаимодействий. Например, катионный краситель, например катионный цианиновый краситель, и трифенилбутилборатный анион могут образовать комплекс, где внутримолекулярный перенос электрона может происходить между цианиновой и боратной группировками при облучении.
Как используют в данном изобретении, термин "зонд" относится к агенту, имеющему в составе связывающий агент и метку, такую как генератор сигнала или фермент. В некоторых воплощениях связывающий агент и метка (генератор сигнала или фермент) заключены в едином объекте. Связывающий агент и метка могут быть присоединены непосредственно (например посредством флуоресцентной молекулы, включенной в связывающий агент) или опосредованно (например через линкер) и нанесены на биологический образец в одну стадию. В альтернативных воплощениях связывающий агент и метка заключены в дискретных объектах (например, первичное антитело, способное связывать мишень, и вторичное антитело, меченное ферментом или генератором сигнала, способное связывать первичное антитело). Когда связывающий агент и метка (генератор сигнала или фермент) представляют собой отдельные объекты, тогда они могут быть нанесены на биологический образец в одну стадию или множество стадий. Как используют в данном изобретении, термин "флуоресцентный зонд" относится к агенту, имеющему в составе связывающий агент, соединенный с генератором флуоресцентного сигнала. В некоторых воплощениях зонд может содержать генератор оптического сигнала, так что наблюдаемый сигнал представляет собой оптический сигнал. В некоторых воплощениях зонд может содержать генератор флуоресцентного сигнала, так что наблюдаемый сигнал представляет собой флуоресцентный сигнал.
Как используют в данном изобретении, термин "генератор сигнала" относится к молекуле, способной давать обнаружимый сигнал при использовании одного или более чем одного метода обнаружения (например спектрометрии, калориметрии, спектроскопии или визуального осмотра). Подходящие примеры обнаружимого сигнала могут включать оптический сигнал и электрический сигнал. Примеры генераторов сигнала включают один или более чем один из хромофора, флуорофора или Раман-активной метки. Как указано выше в отношении зонда, в некоторых воплощениях генератор сигнала и связывающий агент могут находиться в едином объекте (например белок с флуоресцентной меткой, связывающий мишень). Альтернативно связывающий агент и генератор сигнала могут представлять собой дискретные объекты (например рецепторный белок и меченное антитело против данного конкретного рецепторного белка), которые ассоциируются друг с другом до введения в образец или при введении в образец.
В некоторых воплощениях генератор сигнала может представлять собой генератор оптического сигнала. В некоторых воплощениях генератор оптического сигнала может представлять собой генератор флуоресцентного сигнала, например флуорофор. В предпочтительных воплощениях генератор флуоресцентного сигнала может представлять собой цианиновый краситель, например Cy3, Cy5 или Cy7. В некоторых воплощениях генератор сигнала, например флуорофор, может быть заряженным. В одном воплощении генератор сигнала представляет собой катионный флуоресцентный краситель.
Как используют в данном изобретении, термин "твердый носитель" относится к изделию, на котором мишени, находящиеся в биологическом образце, могут быть иммобилизованы и впоследствии обнаружены способами, раскрытыми в данном изобретении. Мишени могут быть иммобилизованы на твердом носителе путем физической адсорбции, путем образования ковалентной связи или с помощью комбинаций этих методов. Твердый носитель может включать полимерный, стеклянный или металлический материал. Примеры твердых носителей включают мембрану, микротитрационный планшет, гранулу, фильтр, тест-полоску, предметное стекло, покровное стекло и пробирку.
Как используют в данном изобретении, термин "специфическое связывание" относится к специфическому распознаванию одной из двух различных молекул другой молекулой по сравнению с существенно меньшим распознаванием других молекул. Молекулы могут иметь области на своих поверхностях или в полостях, вызывающие специфическое распознавание между двумя молекулами, возникающее в результате одного или более чем одного из электростатических взаимодействий, водородного связывания или гидрофобных взаимодействий. Примеры специфического связывания включают взаимодействия антитело-антиген, взаимодействия фермент-субстрат, полинуклеотидные взаимодействия и тому подобное, но не ограничены ими. В некоторых воплощениях связывающая молекула может иметь присущую ей равновесную константу ассоциации (KA) для мишени не ниже, чем примерно 105 М-1 в условиях окружающей среды, таких как рН от примерно 6 до примерно 8 и температура в диапазоне от примерно 0°C до примерно 37°C.
Как используют в данном изобретении, термин "мишень" относится к компоненту биологического образца, который может быть обнаружен при его присутствии в биологическом образце. Мишень может представлять собой любое вещество, для которого в природе существует специфический связывающий агент (например антитело) или для которого может быть получен специфический связывающий агент (например низкомолекулярный связывающий агент или аптамер). Как правило, связывающий агент может связываться с мишенью через одну или более чем одну дискретную химическую группировку мишени или трехмерный структурный компонент мишени (например трехмерные структуры, полученные в результате укладки белка). Мишень может включать одно или более чем одно из природных или модифицированных пептидов, белков (например антител, аффител или аптамеров), нуклеиновых кислот (например полинуклеотидов, ДНК, РНК или аптамеров), полисахаридов (например пектинов или сахаров), липидов, ферментов, субстратов ферментов, лигандов, рецепторов, антигенов или гаптенов. В некоторых воплощениях мишени могут включать белки или нуклеиновые кислоты.
Изобретение включает воплощения, в целом относящиеся к способам, применимым в аналитических, диагностических или прогностических областях применения, таких как определение аналита, флуоресцентно-активируемый клеточный сортинг (FACS), гистохимия, иммуногистохимия или иммунофлуоресценция. В некоторых воплощениях способы, раскрытые в данном изобретении, могут быть частично применимы в гистохимии, иммунологическом окрашивании, иммуногистохимии, иммунологических анализах или иммунофлуоресценции. В некоторых воплощениях способы, раскрытые в данном изобретении, могут быть частично применимы в методах иммуноблоттинга, например Вестерн-блоттингах или иммунологических анализах, таких как твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA).
Раскрытые способы в целом относятся к обнаружению множественных мишеней в одном биологическом образце. В некоторых воплощениях раскрыты способы обнаружения множественных мишеней в одном биологическом образце с использованием одного и того же канала обнаружения. Мишени могут находиться на поверхности клеток в суспензии, на поверхности цитологических мазков, на поверхности гистологических срезов, на поверхности микрочипов ДНК, на поверхности белковых микрочипов или на поверхности твердых носителей (таких как гели, блоты, предметные стекла, гранулы или планшеты ELISA).
Способы, раскрытые в данном изобретении, могут давать возможность обнаружения множества мишеней в одном и том же биологическом образце при небольшом воздействии или без воздействия на целостность биологического образца. Обнаружение мишеней в одном и том же биологическом образце может, кроме того, предоставить пространственную информацию о мишенях в биологическом образце. Способы, раскрытые в данном изобретении, могут быть также применимы в аналитических областях применения, где для анализа может быть доступно ограниченное количество биологического образца и один и тот же образец может быть необходимо обработать для множественных анализов. Способы, раскрытые в данном изобретении, могут также облегчить множественные анализы твердофазных образцов (например тканевых срезов) или образцов, прикрепленных к твердому носителю (например блотам), по существу без повреждения зондов и мишеней. Кроме того, один и тот же канал обнаружения можно использовать для обнаружения различных мишеней в образце, что обеспечивает меньшие химические требования к анализам множественных мишеней. Способы могут дополнительно облегчить анализы, основанные на способах обнаружения, которые могут быть ограничены числом одновременно обнаружимых мишеней в связи с ограничениями разделяемых сигналов. Например, при использовании обнаружения на основе флуоресценции число мишеней, которое можно обнаружить одновременно, может быть ограничено примерно до пяти, поскольку только примерно пять флуоресцентных сигналов могут быть разделяемыми на основании их свойств длины волны возбуждения и испускания. В некоторых воплощениях способы, раскрытые в изобретении, могут давать возможность обнаружения более чем пяти мишеней при использовании системы обнаружения на основе флуоресценции.
В некоторых воплощениях способ представляет собой высокопроизводительный мультиплексный анализ биологического образца, включающий процесс цитирования сигнала, где в каждом цикле за окрашиванием и визуализацией следует нанесение реагента переноса электрона и облучение биологического образца. Способ дает возможность быстрого цитирования сигнала без значительной модификации компонентов биологического образца, отличных от зонда.
В некоторых воплощениях способ обнаружения множественных мишеней в биологическом образце включает последовательное обнаружение мишеней в биологическом образце. Способ, как правило, включает стадии обнаружения первого набора мишеней в биологическом образце, обесцвечивания сигнала от первого набора мишеней путем фотоиндуцируемого химического обесцвечивания. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает обнаружение второго набора мишеней в биологическом образце. Способ может дополнительно включать повторение стадии фотоиндуцируемого химического обесцвечивания сигнала от второго набора мишеней с последующим обнаружением третьего набора мишеней в биологическом образе и т.д.
В некоторых воплощениях способ включает стадии приведения биологического образа в контакт с первым зондом и физического связывания первого зонда с первой мишенью. Способ дополнительно включает наблюдение первого сигнала от первого зонда. Реагент переноса электрона наносят на зонд, и образец, содержащий реагент переноса электрона и зонд облучают, посредством чего инициируется фотореакция, модифицирующая первый сигнал. Способ дополнительно включает приведение биологического образца в контакт со вторым зондом и физическое связывание второго зонда со второй мишенью в биологическом образце с последующим наблюдением второго сигнала от второго зонда.
В некоторых воплощениях способ также включает стадии приведения биологического образа в контакт с множеством множественных наборов зондов и физического связывания множества зондов с множеством мишеней. Способ дополнительно включает наблюдение первого набора сигналов от первого набора множества зондов. Реагент переноса электрона наносят на множество зондов, и образец облучают, посредством чего инициируется фотореакция, модифицирующая первый набор сигналов от первого набора множества зондов. Способ дополнительно включает генерирование второго набора сигналов от второго набора множества мишеней и наблюдение второго набора сигналов. Генерирование второго набора сигналов может включать ассоциирование второго набора зондов с отдельной группировкой, содержащей генератор сигнала. Например, второй набор зондов может содержать биотиновую метку, а группировка, содержащая генератор сигнала, может также включать стрептавидин, способный к связыванию биотиновой метки. Альтернативно генерирование второго набора сигналов может включать демаскировку группировки, генерирующей сигнал, например, путем модификации расстояния между парой флуорофор-гаситель. Еще в одном другом воплощении второй набор сигналов может быть вызван гибридизацией меченных нуклеиново-кислотных зондов с немеченными комплементарными последовательностями на втором наборе зондов.
В других воплощениях способ включает стадии получения образца, содержащего множественные мишени, и связывания по меньшей мере одного зонда, имеющего в составе соединенный с ферментом связывающий агент, с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце. Способ дополнительно включает взаимодействие связанного зонда с субстратом фермента, соединенным с генератором сигнала, и наблюдение сигнала от генератора сигнала. Реагент переноса электрона, по существу инактивирующий как генератор сигнала, так и фермент в ходе фотореакции, наносят на образец. Способ также включает возможную отдельную стадию инактивации фермента. Стадия инактивации фермента может включать, например, нанесение реагента инактивации фермента. Способ дополнительно включает связывание по меньшей мере одного последующего зонда, имеющего в составе соединенный с ферментом связывающий агент, с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце. Способ дополнительно включает взаимодействие связанного зонда с субстратом фермента, соединенным с генератором сигнала, и наблюдение сигнала от генератора сигнала.
В других воплощениях способ включает стадии получения биологического образца, содержащего множественные мишени, и связывания по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце. Способ дополнительно включает наблюдение сигнала от связанного зонда. Связанный зонд приводят в контакт с реагентом переноса электрона, и образец, содержащий связанный зонд и реагент переноса электрона, облучают, в результате чего зонд обесцвечивается. Способ дополнительно включает связывание по меньшей мере одного последующего зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце, с последующим наблюдением сигнала от последующего связанного зонда.
В других воплощениях способ включает стадии получения биологического образца, содержащего множественные мишени, и связывания по меньшей мере одного флуоресцентного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце. Способ дополнительно включает связывание по меньшей мере одного контрольного зонда с одной или более чем одной мишенью в образце. Связанный зонд приводят в контакт с реагентом переноса электрона, и образец, содержащий связанный зонд и реагент переноса электрона, облучают, посредством чего зонд обесцвечивается, а контрольный зонд не обесцвечивается. Способ дополнительно включает связывание по меньшей мере одного последующего зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце, с последующим наблюдением сигнала от последующего связанного зонда.
В других воплощениях описанные выше способы обеспечивают серию из по меньшей мере двух изображений, показывающих оптически меченные биологические мишени.
Биологические образцы
Биологический образец в соответствии с одним воплощением изобретения может быть твердым или жидким. Подходящие примеры биологических образцов могут включать культуры, кровь, плазму, сыворотку, слюну, спинномозговую жидкость, плевральную жидкость, молоко, лимфу, мокроту, семенную жидкость, мочу, кал, слезы, слюну, игольный аспират, наружные срезы кожи, дыхательных путей, кишечника и мочеполовых путей, опухолей, органов, клеточные культуры или компоненты клеточных культур, либо твердые тканевые срезы, но не ограничены ими. Клеточные культуры могут включать смешанную клеточную культуру, колонии или культуры стволовых клеток, имеющие происхождение из различных раковых или первичных клеточных линий. В некоторых воплощениях биологический образец можно анализировать как таковой, то есть без сбора и/или выделения мишени, представляющей интерес. В альтернативном воплощении перед анализом можно проводить сбор и выделение мишеней. В некоторых воплощениях способы, раскрытые в данном изобретении, могут особенно подходить для анализа биологических образцов in vitro.
Биологический образец может включать любой из упомянутых выше образцов независимо от их физического состояния, таких как замороженных, либо окрашенных, либо обработанных иным образом образцов, но не ограничиваясь ими. В некоторых воплощениях биологический образец может содержать соединения, которые не могут естественным образом смешиваться с образцом в его нативной форме, такие как консерванты, антикоагулянты, буферы, фиксаторы, питательные вещества, антибиотики или тому подобное.
В некоторых воплощениях биологический образец может включать образец или срез ткани, целую клетку, компонент клетки, например клеточную органеллу, цитоспиновый или клеточный мазок. В некоторых воплощениях биологический образец по существу включает образец ткани. Образец ткани может включать совокупность сходных клеток, полученных из ткани биологического субъекта, которые могут обладать сходной функцией. В некоторых воплощениях образец ткани может включать совокупность сходных клеток, полученных из ткани человека. Подходящие примеры тканей человека включают (1) эпителий; (2) соединительные ткани, включая кровеносные сосуды, кость и хрящ; (3) мышечную ткань и (4) нервную ткань, но не ограничены ими. Источник образца ткани может представлять собой твердую ткань, полученную из свежего, замороженного и/или консервированного образца, либо биоптата, либо аспирата органа или ткани; кровь или любые компоненты крови; жидкости организма, такие как спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость, перитонеальная жидкость или интерстициальная жидкость; либо клетки субъекта в любой срок беременности или развития. В некоторых воплощениях образец ткани может включать первичные или культивируемые клетки или клеточные литии.
В некоторых воплощениях биологический образец включает тканевые срезы из образцов здоровых или пораженных тканей (например тканевый срез из ободочной кишки, ткани молочной железы, предстательной железы). Тканевой срез может включать отдельный участок или часть образца ткани, например тонкий срез ткани или клеток, отсеченный от образца ткани. В некоторых воплощениях можно брать и подвергать анализу множественные срезы образцов ткани, при условии, что способы, раскрытые в данном изобретении, можно применять для анализа одного и того же среза образца ткани в отношении по меньшей мере двух различных мишеней (на морфологическом или молекулярном уровне). В некоторых воплощениях можно использовать тканевый микрочип. В некоторых воплощениях один и тот же срез образца ткани можно анализировать в отношении по меньшей мере пяти различных мишеней (на морфологическом или молекулярном уровне). В некоторых воплощениях один и тот же срез образца ткани можно анализировать в отношении более чем пяти различных мишеней (на морфологическом или молекулярном уровне). В некоторых воплощениях один и тот же срез образца ткани можно анализировать как на морфологическом, так и на молекулярном уровне.
Тканевой срез при использовании в качестве биологического образца может иметь толщину в диапазоне, составляющем менее чем примерно 100 микрометров, в диапазоне, составляющем менее чем примерно 50 микрометров, в диапазоне, составляющем менее чем примерно 25 микрометров, или в диапазоне, составляющем менее чем примерно 10 микрометров.
В некоторых воплощениях биологический образец может содержать один или более чем один из белков, углеводов или нуклеиновых кислот. В некоторых воплощениях биологический образец или мишени в биологическом образце могут быть прикреплены к твердому носителю. Твердый носитель может включать микрочипы (например ДНК- или РНК-микрочипы), гели, блоты, предметные стекла, гранулы или планшеты ELISA. В некоторых воплощениях биологический образец или мишени в биологическом образце могут быть прикреплены к мембране, выбранной из нейлоновой, нитроцеллюлозной и поливинилидендифторидной мембраны. В некоторых воплощениях твердый носитель может включать пластическую поверхность, выбранную из полистирола, поликарбоната и полипропилена.
Мишени
Мишень может присутствовать на поверхности биологического образца (например антиген на поверхности тканевого среза) или присутствовать в объеме образца (например антитело в буферном растворе). В некоторых воплощениях мишень изначально может не присутствовать на поверхности биологического образца, и биологический образец может быть необходимо обработать, чтобы сделать мишень доступной на поверхности (например, выделение антигена, ферментативное расщепление, демаскировка эпитопа или блокирование). В некоторых воплощениях мишень может присутствовать в жидкости организма, такой как кровь, плазма крови, сыворотка или моча. В некоторых других воплощениях мишень может быть фиксирована в ткани, либо на поверхности клетки, либо внутри клетки.
Пригодность мишеней для анализа может быть определена на основании типа и природы анализа, требующегося для биологического образца. В некоторых воплощениях мишень может предоставить информацию о наличии или отсутствии аналита в биологическом образце. В другом воплощении мишень может предоставить информацию по состоянию биологического образца. Например, если биологический образец включает образец ткани, способы, раскрытые в данном изобретении, можно применять для обнаружения мишеней, которые могут помочь при сравнении различных типов клеток или тканей, при сравнении различных стадий развития, при обнаружении наличия заболевания или аномалии или при определении типа заболевания или аномалии.
Мишени могут включать один или более чем один из пептидов, белков (например антител, аффител или аптамеров), нуклеиновых кислот (например полинуклеотидов, ДНК, РНК или аптамеров); полисахаридов (например пектинов или сахаров), липидов, ферментов, субстратов ферментов, лигандов, рецепторов, антигенов или гаптенов. В некоторых воплощениях мишени могут по существу включать белки или нуклеиновые кислоты. В других воплощениях в одном и том же биологическом образце можно обнаруживать и/или анализировать множественные типы мишеней, например нуклеиновые кислоты, полисахариды, липиды, ферменты, субстраты ферментов, лиганды, рецепторы, антигены или гаптены в одном цикле или во множественных циклах. Одна или более чем одна из упомянутых выше мишеней может быть характеристической для конкретных клеток, тогда как другие мишени могут быть ассоциированы с конкретным заболеванием или состоянием. В некоторых воплощениях мишени, которые можно обнаруживать и анализировать, используя способы, раскрытые в данном изобретении, могут включать прогностические мишени, мишени, представляющие собой гормоны или рецепторы гормонов, лимфоидные мишени, опухолевые мишени, мишени, ассоциированные с клеточным циклом, мишени нервной ткани и опухоли или мишени кластера дифференциации, но не ограничены ими.
Подходящие примеры прогностических мишеней могут включать ферментативные мишени, такие как галактозилтрансфераза II, нейрон-специфичная енолаза, протонная АТФаза-2 или кислая фосфатаза.
Подходящие примеры мишеней, представляющих собой гормоны или рецепторы гормонов, могут включать хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), адренокортикотропный гормон, карциноэмбриональный антиген (СЕА), простатоспецифический антиген (ПСА), рецептор эстрогена, рецептор прогестерона, рецептор андрогена, рецептор комплемента gC1q-R/p33, рецептор интерлейкина-2 (ИЛ-2), рецептор нейротропина р75, рецептор паратиреоидного гормона (ПТГ), рецептор тиреоидного гормона или рецептор инсулина.
Подходящие примеры лимфоидных мишеней могут включать альфа-1-антихимотрипсин, альфа-1-антитрипсин, В-клеточную мишень, bcl-2, bcl-6, антиген В-лимфоцитов 36 кД, ВМ1 (миелоидную мишень), ВМ2 (миелоидную мишень), галектин-3, гранзим В, HLA-антиген (антиген лимфоцитов человека) класса I, HLA-антиген класса II (DP), HLA-антиген класса II (DQ), HLA-антиген класса II (DR), дефенсины нейтрофилов человека, иммуноглобулин А, иммуноглобулин D, иммуноглобулин G, иммуноглобулин М, легкую цепь каппа, легкую цепь лямбда, лимфоцитарный/гистоцитарный антиген, макрофагальную мишень, мурамидазу (лизоцим), киназу р80 апластической лимфомы, мишень плазматических клеток, ингибитор секреторной лейкоцитарной протеазы, рецептор Т-клеточного антигена (JOVI 1), рецептор Т-клеточного антигена (JOVI 3), концевую дезоксинуклитидилтрансферазу или мишень некластерированных В-клеток.
Подходящие примеры опухолевых мишеней могут включать альфа-фетопротеин, аполипопротеин D, BAG-1 (белок RAP46), СА19-9 (антиген сиалил-Льюис), СА50 (муциноподобный карцинома-ассоциированный антиген), СА125 (антиген рака яичника), СА242 (муциноподобный опухолеассоциированный антиген), хромогранин А, кластерин (аполипопротеин J), эпителиальный мембранный антиген, антиген эпителиальных клеток, специфичный антиген эпителиальных клеток, жидкостный белок-15 макроскопического поликистозного заболевания, гепатоцит-специфичный антиген, герегулин, муцин желудка человека, жировые шарики женского молока, MAGE-1, матриксные металлопротеиназы, мелан А, мишень при меланоме (НМВ45), мезотелин, металлотионеин, микрофтальмия-ассоциированный транскрипционный фактор (MITF), Muc-1 первичный гликопротеин, гликопротеин Muc-1, гликопротеин Muc-2, гликопротеин Muc-5АС, гликопротеин Muc-6, миелопероксидазу, Myf-3 (мишень при рабдомиосаркоме), Myf-4 (мишень при рабдомиосаркоме), MyoD1 (мишень при рабдомиосаркоме), миоглобин, белок nm23, плацентарную щелочную фосфатазу, преальбумин, простатоспецифичный антиген, простатическую кислую фосфатазу, простатический пептид ингибин, PTEN, мишень при почечно-клеточной карциноме, муциноподобный антиген тонкого кишечника, тетранектин, тиреоидный транскрипционный фактор-1, тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы 1, тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы 2, тирозиназу, тирозиназа-связанный белок-1, виллин или фактор фон Виллебранда.
Подходящие примеры мишеней, ассоциированных с клеточным циклом, могут включать фактор-1 активации протеаз апоптоза, bcl-w, bcl-x, бромдезоксиуридин, САК (cdk-активирующая киназа), клеточный белок чувствительности к апоптозу (CAS), каспазу 2, каспазу 8, СРР32 (каспазу-3), СРР32 (каспазу-3), циклинзависимые киназы, циклин А, циклин В1, циклин D1, циклин D2, циклин D3, циклин Е, циклин G, фактор фрагментации ДНК (N-конец), Fas (CD95), Fas-ассоциированный белок, содержащий домен смерти, лиганд Fas, Fen-1, IPO-38, Mcl-1, белки поддержания мини-хромосом, белок репарации ошибочного спаривания (MSH2), поли(АДФ-рибоза)-полимеразу, ядерный антиген пролиферирующих клеток, белок р16, белок р27, p34cdc2, белок р57 (Kip2), белок р105, Stat 1 альфу, топоизомеразу I, топоизомеразу II альфа, топоизомеразу III альфа или топоизомеразу II бета.
Подходящие примеры мишеней в нервной ткани и опухолевых мишеней могут включать альфа-В-кристаллин, альфа-интернескин, альфа-синуклеин, белок-предшественник амилоида, бета-амилоид, кальбиндин, холинацетилтрансферазу, транспортер-1 возбуждающих аминокислот, GAP43, глиофибриллярный кислый белок, рецептор 2 глутамата, миелиновый основной белок, рецептор фактора роста нервов (др75), мишень при нейробластоме, нейрофиламент 68 кД, нейрофиламент 160 кД, нейрофиламент 200 кД, нейрон-специфическую енолазу, никотиновый ацетилхолиновый рецептор альфа-4, никотиновый ацетилхолиновый рецептор бета-2, периферии, белковый продукт гена 9, белок S-100, серотонин, SNAP-25, синапсин I, синаптофизин, tau, триптофангидроксилазу, тирозингидроксилазу или убиквитин.
Подходящие примеры мишеней кластера дифференциации могут включать CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3дельта, CD3эпсилон, CD3гамма, CD4, CD5, CD6, CD7, СОбальфа, С08бета, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16a, CD16b, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD44R, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD65s, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CDw92, CDw93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CDw108, CD109, CD114, CD115, CD116, CD117, CDw119, CD120a, CD120b, CD121a, CDw121b, CD122, CD123, CD124, CDw125, CD126, CD127, CDw128a, CDw128b, CD130, CDw131, CD132, CD134, CD135, CDw136, CDw137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CDw-149, CDw150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD157, CD158a, CD158b, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166 и TCR-дзета.
Другие подходящие прогностические мишени могут включать центромерный белок-F (CENP-F), гиантин, инволюкрин, ламин А&С (ХВ 10), LAP-70, муцин, белки комплекса ядерной поры, белок пластинчатых тел р180, ran, r, катепсин D, белок Ps2, Her2-neu, P53, S100, эпителиальный антиген-мишень (ЕМА), TdT, MB2, МВЗ, PCNA или Ki67.
Зонды
Как определено выше, зонд относится к агенту, имеющему в составе связывающий агент и метку, такую как генератор сигнала или фермент.
В некоторых воплощениях связывающий агент и метка (генератор сигнала или фермент) могут быть соединены друг с другом непосредственно (то есть без каких-либо линкеров). В других воплощениях связывающий агент и метка (генератор сигнала или фермент) могут быть соединены друг с другом через линкер. Как используют в данном изобретении, термин "соединены" в целом относится к двум объектам (например связывающему агенту и генератору сигнала), стабильно связанным друг с другом любыми физико-химическими способами. Природа этого соединения может быть такой, что по существу не нарушает эффективность ни одного из объектов. Связывающий агент и метка могут быть соединены друг с другом посредством ковалентных или нековалентных взаимодействий. Нековалентные взаимодействия могут включать гидрофобные взаимодействия, ионные взаимодействия, взаимодействия за счет водородных связей, высокоаффинные взаимодействия (такие как образование комплекса биотин-авидин или биотин-стрептавидин) или другие аффинные взаимодействия, но не ограничены ими.
В некоторых воплощениях связывающий агент и метка (генератор сигнала или фермент) могут быть химически связаны друг с другом посредством функциональных групп, способных к взаимодействию и образованию связи в подходящих условиях. Подходящие примеры комбинаций функциональных групп могут включать аминоэфир и амины или анилины; ацилазид и амины или анилины; ацилгалогениды и амины, анилины, спирты или фенолы; ацилнитрил и спирты или фенолы; альдегид и амины или анилины; алкилгалогенид и амины, анилины, спирты, фенолы или тиолы; алкилсульфонат и тиолы, спирты или фенолы; ангидрид и спирты, фенолы, амины или анилины; арилгалогенид и тиолы; азиридин и тиолы или тиоэфиры; карбоновую кислоту и амины, анилины, спирты или алкилгалогениды; диазоалкан и карбоновые кислоты; эпоксид и тиолы; галогенацетамид и тиолы; галогентриазин и амины, анилины или фенолы; гидразин и альдегиды или кетоны; гидроксиамин и альдегиды или кетоны; имидоэфир и амины или анилины; изоцианат и амины или анилины; и изотиоцианат и амины или анилины, но не ограничены ими. Функциональная группа в одной из упомянутых выше пар функциональных групп может присутствовать в связывающем агенте, а соответствующая функциональная группа может присутствовать в генераторе сигнала или ферменте. Например, связывающий агент может включать карбоновую кислоту, а генератор сигнала или фермент может включать амин, анилин, спирт или ацилгалогенид, или наоборот. Конъюгацию между связывающим агентом и генератором сигнала или ферментом в этом случае можно осуществлять посредством образования амидной или сложноэфирной связи.
В некоторых воплощениях связывающий агент может быть мечен изнутри генератором сигнала (например, если связывающий агент представляет собой белок, в процессе синтеза используют меченную с возможностью обнаружения аминокислоту) или ферментом (например, если связывающий агент представляет собой фермент). Связывающий агент, меченный изнутри, может не требовать отдельного генератора сигнала или фермента с целью его обнаружения. Вероятнее, внутренняя метка может быть достаточной, чтобы сделать зонд обнаружимым. В альтернативных воплощениях связывающий агент может быть мечен путем связывания с ним специфичного генератора сигнала или фермента (т.е. наружного мечения).
В некоторых воплощениях связывающий агент и метка (генератор сигнала или фермент) заключены в едином объекте. В альтернативных воплощениях связывающий агент и метка (генератор сигнала или фермент) заключены в дискретных объектах (например, первичное антитело, способное к связыванию мишени, и вторичное антитело, меченное ферментом или генератором сигнала, способное к связыванию первичного антитела, или первичное антитело, меченное гаптеном, способное к связыванию мишени, и антитело против гаптена, меченное ферментом или генератором сигнала, способное к связыванию первичного антитела, меченного гаптеном). Когда связывающий агент и генератор сигнала или фермент представляют собой отдельные объекты, их можно наносить на биологический образец в одну стадию или множество стадий. В некоторых воплощениях связывающий агент и метка (генератор сигнала или фермент) представляют собой отдельные объекты, которые предварительно присоединяют перед нанесением на биологический образец и наносят на биологический образец в одну стадию. В других воплощениях связывающий агент и метка (генератор сигнала или фермент) представляют собой отдельные объекты, которые наносят на биологический образец независимо и объединяют после нанесения.
Связывающие агенты
Способы, раскрытые в настоящем изобретении, включают применение связывающих агентов, физически связывающихся с мишенью специфическим путем. В некоторых воплощениях связывающий агент может связываться с мишенью с достаточной специфичностью, то есть связывающий агент может связываться с мишенью с более высоким сродством, чем с любой другой молекулой. В некоторых воплощениях связывающий агент может связываться с другими молекулами, но это связывание может быть таким, что неспецифическое связывание может находиться на фоновых уровнях или около них. В некоторых воплощениях сродство связывающего агента к мишени, представляющей интерес, может находиться в диапазоне, который выше по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз или более по сравнению с его сродством к другим молекулам. В некоторых воплощениях можно применять связывающие агенты, обладающие наибольшим дифференциальным сродством, хотя они могут не представлять собой молекулы, обладающие наибольшим сродством к мишени.
В некоторых воплощениях связывание между мишенью и связывающим агентом может осуществляться путем физического связывания. Физическое связывание может включать связывание, осуществляемое за счет нековалентных взаимодействий. Нековалентные взаимодействия могут включать гидрофобные взаимодействия, ионные взаимодействия, взаимодействия за счет водородных связей или аффинные взаимодействия (такие как образование комплекса биотин-авидин или биотин-стрептавидин), но не ограничены ими. В некоторых воплощениях мишень и связывающий агент могут иметь области на своих поверхностях или в полостях, вызывающие специфическое распознавание между ними, приводящее в результате к физическому связыванию. В некоторых воплощениях связывающий агент может связываться с биологической мишенью на основе реципрокного соответствия участков их молекулярных форм.
Связывающие агенты и их соответствующие мишени можно рассматривать как пары связывания, из которых неограничивающие примеры включают пары связывания иммунного типа, такие как антиген/антитело, антиген/фрагмент антитела или гаптен/антигаптен; пары связывания неиммунного типа. такие как биотин/авидин, биотин/стрептавидин, фолиевая кислота/фолат-связывающий белок, гормон/рецептор гормона, пектин/специфичный углевод, фермент/фермент, фермент/субстрат, фермент/аналог субстрата, фермент/псевдосубстрат (аналоги субстрата, которые не могут претерпевать катализ ферментативной активностью), фермент/кофактор, фермент/модулятор, фермент/ингибитор или витамин В12/внутренний фактор Касла. Другие подходящие примеры пар связывания могут включать комплементарные фрагменты нуклеиновой кислоты (включающие последовательности ДНК, последовательности РНК, последовательности LNA (закрытой нуклеиновой кислоты) и последовательности ПНК (пептидных нуклеиновых кислот) или другие модифицированные нуклеиновые кислоты, известные в литературе); белок А/антитело; белок G/антитело; нуклеиновая кислота/белок, связывающий нуклеиновую кислоту; или полинуклеотид/полинуклеотид-связывающий белок.
В некоторых воплощениях связывающий агент может представлять собой связывающий агент, специфичный к последовательности или к структуре, где последовательность или структура мишени, распознаваемой и связываемой связывающим агентом, может быть по существу уникальной для этой мишени.
В некоторых воплощениях связывающий агент может быть структурно-специфическим и может распознавать первичную, вторичную или третичную структуру мишени. Первичная структура мишени может включать описание ее атомного состава и химических связей, соединяющих эти атомы (включая стереохимию), например тип и природа линейного расположения аминокислот в белке. Вторичная структура мишени может относиться к общей трехмерной форме сегментов биомолекул, например, для белка вторичная структура может относиться к укладке цепи пептидного "остова" в различные конформации, которая может приводить в результате к тому, что отдаленные аминокислоты приводятся в близкое расположение друг к другу. Подходящие примеры вторичных структур могут включать альфа-спирали, бета-складчатые структуры или случайные клубки, но не ограничены ими. Третичная структура мишени может представлять собой ее общую трехмерную структуру. Четвертичная структура мишени может относиться к структуре, образованной ее нековалентным взаимодействием с одной или более чем одной другой мишенью или макромолекулой (таким как белковые взаимодействия). Примером четвертичной структуры может быть структура, образованная четырьмя глобиновыми субъединицами белка с образованием гемоглобина. Связывающий агент в соответствии с воплощениями изобретения может обладать специфичностью к любой из упомянутых выше структур.
Пример структурно-специфического связывающего агента может включать белок-специфическую молекулу, которая может связываться с белковой мишенью. Примеры подходящих белок-специфических молекул могут включать антитела и фрагменты антител, нуклеиновые кислоты (например аптамеры, распознающие белковые мишени) или белковые субстраты (некатализируемые).
В некоторых воплощениях мишень может включать антиген, а связывающий агент может включать антитело. Подходящее антитело может включать моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например биспецифические антитела) или фрагменты антител, при условии, что они специфически связываются с антигеном-мишенью.
В некоторых воплощениях биологический образец может включать образец клетки или ткани, и способы, раскрытые в данном изобретении, можно применять в иммуногистохимии (ИГХ). Иммуногистохимия может включать связывание антигена-мишени со связывающим агентом на основе антитела, предоставляющее информацию о тканях или клетках (например о пораженных клетках по сравнению с нормальными). Примеры антител (а также соответствующих заболеваний/пораженных клеток), подходящих в качестве связывающих агентов для способов, раскрытых в данном изобретении, включают антитело против рецептора эстрогена (рак молочной железы), антитело против рецептора прогестерона (рак молочной железы), антитело против р53 (множественные раки), антитело против Her-2/neu (множественные раки), антитело против EGFR (эпидермального фактора роста, множественные раки), антитело против катепсина D (рак молочной железы и другие типы рака), антитело против Вс1-2 (апоптические клетки), антитело против Е-кадгерина, антитело против СА125 (рак яичника и другие типы рака), антитело против СА15-3 (рак молочной железы), антитело против СА19-9 (рак ободочной кишки), антитело против c-erbB-2, антитело против Р-гликопротеина (MDR, множественная лекарственная устойчивость), антитело против СЕА (карциноэмбрионального антигена), антитело против белка ретинобластомы (Rb), антитело против онкобелка газ (р21), антитело против антигена Льюис Х (также называемого CD15), антитело против Ki-67 (клеточная пролиферация), антитело против PCNA (множественные раки), антитело против CD3 (Т-клетки), антитело против CD4 (Т-хелперные клетки), антитело против CD5 (Т-клетки), антитело против CD7 (тимоциты, незрелые Т-клетки, клетки-киллеры NK), антитело против CD8 (супрессорные Т-клетки), антитело против CD9/p24 (ОЛЛ (острый лимфобластный лейкоз)), антитело против CDIO (также называемого CALLA) (общий острый лимфобластный лейкоз), антитело против CD11c (моноциты, гранулоциты, ОМЛ (острый миелоидный лейкоз)), антитело против CD13 (миеломоноциты, ОМЛ), антитело против CD14 (зрелые моноциты, гранулоциты), антитело против CD15 (болезнь Ходжкина), антитело против CD19 (В-клетки), антитело против CD20 (В-клетки), антитело против CD22 (В-клетки), антитело против CD23 (активированные В-клетки, ХЛЛ (хронический лимфолейкоз)), антитело против CD30 (активированные Т- и В-клетки, болезнь Ходжкина), антитело против CD31 (маркер ангиогенеза), антитело против CD33 (миелоидные клетки, ОМЛ), антитело против CD34 (эндотелиальные стволовые клетки, стромальные опухоли), антитело против CD35 (дендритные клетки), антитело против CD38 (плазматические клетки, активированные Т-, В- и миелоидные клетки), антитело против CD41 (тромбоциты, мегакариоциты), антитело против LCA/CD45 (общий лейкоцитарный антиген), антитело против CD45RO (хелперные, индукторные Т-клетки), антитело против CD45RA (В-клетки), антитело против CD39, CD100, антитело против CD95/Fas (апоптоз), антитело против CD99 (маркер саркомы Юинга, генный продукт MIC2), антитело против CD106 (VCAM-1; активированные эндотелиальные клетки), антитело против убиквитина (болезнь Альцгеймера), антитело против CD71 (рецептор трансферрина), антитело против c-myc (онкобелок и гаптен), антитело против цитокератинов (рецептор трансферрина), антитело против виментинов (эндотелиальные клетки) (В- и Т-клетки), антитело против белков HPV (папилломавируса человека), антитело против легких цепей каппа (В-клетки), антитело против легких цепей лямбда (В-клетки), антитело против меланосом (НМВ45) (меланома), антитело против простатоспецифического антигена (ПСА) (рак предстательной железы), антитело против S-100 (меланома, слюнная железа, глиальные клетки), антитело против антигена tau (болезнь Альцгеймера), антитело против фибрина (эпителиальные клетки), антитело против кератинов, антитело против цитокератина (опухоль), антитело против альфа-катенина (клеточная мембрана) или антитело против антигена Tn (карцинома ободочной кишки, аденокарциномы и рак поджелудочной железы), но не ограничены ими.
Другие конкретные примеры подходящих антител могут включать антитело против ядерного антигена пролиферирующих клеток, клон рс10 (Sigma Aldrich, P8825); антитело против гладкомышечного альфа-актина (SmA), клон 1А4 (Sigma, A2547); антитело кролика против бета-катенина (Sigma, С 2206); антитело мыши против пан-цитокератина, клон РСК-26 (Sigma, C1801); антитело мыши против рецептора эстрогена альфа, клон 1D5 (DAKO, М 7047); антитело против бета-катенина, клон 15В8 (Sigma, С 7738); антитело козы против виментина (Sigma, V4630); антитело против циклического андрогенного рецептора, клон AR441 (DAKO, M3562); антитело против фактора фон Виллебранда 7, кератина 5, кератина 8/18, е-кадгерина, Her2/neu, эстрогенного рецептора, р53, рецептора прогестерона, бета-катенина; антимышиное антитело осла (Jackson Immunoresearch, 715-166-150) или антикроличье антитело осла (Jackson Immunoresearch, 711-166-152), но не ограничены ими.
В некоторых воплощениях связывающий агент может быть специфичным к последовательности. Связывающий агент, специфичный к последовательности, может включать нуклеиновую кислоту, и связывающий агент может обладать способностью к распознаванию конкретного линейного расположения нуклеотидов или их производных в мишени. В некоторых воплощениях линейное расположение может включать смежные нуклеотиды или их производные, каждый из которых может связываться с соответствующим комплементарным нуклеотидом в связывающем агенте. В альтернативном воплощении последовательность может не быть непрерывной, поскольку может быть один, два или более чем два нуклеотида, которые могут не иметь соответствующих комплементарных остатков на зонде. Подходящие примеры связывающих агентов на основе нуклеиновых кислот могут включать олигонуклеотиды или полинуклеотиды ДНК или РНК, но не ограничены ими. В некоторых воплощениях подходящие нуклеиновые кислоты могут включать аналоги нуклеиновых кислот, такие как дигоксигенин-dCTP, биотин-dcTP 7-азагуанозин, азидотимидин, инозин или уридин.
В некоторых воплощениях как связывающий агент, так и мишень могут включать нуклеиновые кислоты. В некоторых воплощениях связывающий агент на основе нуклеиновой кислоты может образовывать связь Уотсона-Крика с нуклеиново-кислотной мишенью. В другом воплощении нуклеиново-кислотный связывающий агент может образовать хугстиновскую связь с нуклеиново-кислотной мишенью, образуя посредством этого триплекс. Нуклеиново-кислотный связывающий агент, который связывается посредством хугстиновского связывания, может входить в большую бороздку нуклеиново-кислотной мишени и гибридизуется с расположенными там основаниями. Подходящие примеры описанных выше связывающих агентов могут включать молекулы, распознающие малые и большие бороздки нуклеиновых кислот и связывающиеся с ними (например некоторые формы антибиотиков). В некоторых воплощениях нуклеиново-кислотные связывающие агенты могут образовывать как связи Уотсона-Крика, так и хугстиновские связи с нуклеиново-кислотной мишенью (например, бис-ПНК зонды способны как к связыванию Уотсона-Крика, так и к хугстиновскому связыванию с нуклеиновой кислотой).
Длина нуклеиново-кислотного связывающего агента может также определять специфичность связывания. Энергетические затраты одного ошибочного спаривания между связывающим агентом и нуклеиново-кислотной мишенью могут быть относительно более высокими для более коротких последовательностей, чем для более длинных. В некоторых воплощениях гибридизация нуклеиново-кислотных связывающих агентов меньшего размера может быть более специфичной, чем гибридизация более длинных нуклеиново-кислотных зондов, поскольку более длинные зонды могут обладать большей склонностью к ошибочным спариваниям, и могут продолжать связываться с нуклеиновой кислотой в зависимости от условий. В некоторых воплощениях более короткие связывающие агенты могут проявлять более низкую стабильность связывания при заданной температуре и концентрации соли. В данном случае можно использовать связывающие агенты, которые могут проявлять более высокую стабильность связывания коротких последовательностей (например бис-ПНК). В некоторых воплощениях нуклеиново-кислотный связывающий агент может иметь длину в диапазоне от примерно 4 нуклеотидов до примерно 12 нуклеотидов, от примерно 12 нуклеотидов до примерно 25 нуклеотидов, от примерно 25 нуклеотидов до примерно 50 нуклеотидов, от примерно 50 нуклеотидов до примерно 100 нуклеотидов, от примерно 100 нуклеотидов до примерно 250 нуклеотидов, от примерно 250 нуклеотидов до примерно 500 нуклеотидов или от примерно 500 нуклеотидов до примерно 1000 нуклеотидов. В некоторых воплощениях нуклеиново-кислотный связывающий агент может иметь длину в диапазоне более чем примерно 1000 нуклеотидов. Независимо от длины нуклеиново-кислотного связывающего агента, все нуклеотидные остатки связывающего агента могут не гибридизоваться с комплементарными нуклеотидами в нуклеиново-кислотной мишени. Например, связывающий агент может включать 50 нуклеотидных остатков в длину, и только 25 из этих нуклеотидных остатков могут гибридизоваться с нуклеиново-кислотной мишенью. В некоторых воплощениях нуклеотидные остатки, которые могут гибридизоваться, могут быть смежными друг с другом. Нуклеиново-кислотные связывающие агенты могут быть однонитевыми, либо могут включать вторичную структуру. В некоторых воплощениях биологический образец может включать образец клетки или ткани, и биологический образец можно подвергать гибридизации in situ (ISH), используя нуклеиново-кислотный связывающий агент. В некоторых воплощениях образец ткани можно подвергать гибридизации in situ в дополнение к иммуногистохимии (ИГХ), чтобы получить желаемую информацию от образца.
Независимо от типа связывающего агента и мишени на специфичность связывания между связывающим агентом и мишенью можно также воздействовать в зависимости от условий связывания (например от условий гибридизации в случае комплементарных нуклеиновых кислот). Подходящие условия связывания могут быть выполнены путем модулирования одного или более чем одного из рН, температуры или концентрации соли.
Связывающий агент может быть мечен изнутри (генератор сигнала или фермент присоединяют в процессе синтеза связывающего агента) или мечен снаружи (генератор сигнала или фермент присоединяют во время более поздней стадии). Например, для связывающего агента на основе белка связывающий агент, меченный изнутри, может быть получен путем использования меченных аминокислот. Аналогично нуклеиновая кислота, меченная изнутри, может быть синтезирована, используя способы, при которых нуклеотиды, меченные генератором сигнала, или нуклеозидфосфорамидиты, меченные генератором сигнала, включаются непосредственно в растущую нуклеиновую кислоту в зависимости от способа, используемого для синтеза нуклеиновой кислоты. В некоторых воплощениях связывающий агент можно синтезировать таким способом, что генераторы сигнала или ферменты можно включать на более поздней стадии. Например, это более позднее мечение можно осуществлять химическими средствами путем введения активных аминогрупп или тиольных групп в аминокислотные или пептидные цепи. В некоторых воплощениях связывающий агент, такой как белок (например антитело) или нуклеиновая кислота (например ДНК), может быть мечен непосредственно химическим путем, используя подходящие химические процессы.
В некоторых воплощениях можно использовать комбинации связывающих агентов, которые могут обеспечить более высокую специфичность или в некоторых воплощениях амплификацию сигнала. Так, в некоторых воплощениях можно использовать "сэндвич" связывающих агентов, где первый связывающий агент может связываться с мишенью и служить для обеспечения вторичного связывания, где вторичный связывающий агент может включать или не включать метку, которое может далее обеспечивать третичное связывание (при необходимости), где участник третичного связывания может включать метку.
Подходящие примеры комбинаций связывающих агентов могут включать первичное антитело-вторичное антитело, комплементарные нуклеиновые кислоты или другие пары лиганд-рецептор (такие как биотин-стрептавидин). Некоторые конкретные примеры подходящих пар связывания могут включать антитело мыши против туе для рекомбинантно экспрессируемых белков с эпитопом c-myc; антитело мыши против HisG для рекомбинантного белка с эпитопом His-Tag, антитело Anti-express™ мыши для рекомбинантного белка с эпитопной меткой, антикозье антитело кролика для первичных молекул IgG козы, комплементарная нуклеиново-кислотная последовательность для нуклеиновой кислоты; анти-тио антитело мыши для белков, слитых с тиоредоксином; антитело кролика против GFP (зеленого флуоресцентного белка) для слитого белка, джакалин для альфа-D-галактозы и мелибиоза для углевод-связывающих белков, сахара, никель-связывающей матрицы или гепарина.
В некоторых воплощениях в качестве связывающего агента можно использовать комбинацию первичного антитела и вторичного антитела. Первичное антитело может обладать способностью к связыванию со специфичной областью мишени, а вторичное антитело может обладать способностью к связыванию с первичным антителом. Вторичное антитело может быть присоединено к генератору сигнала или ферменту перед связыванием с первичным антителом, либо может обладать способностью к связыванию с генератором сигнала или ферментом на более поздней стадии. В альтернативном воплощении можно использовать первичное антитело и пары специфического связывания лиганд-рецептор (такие как биотин-стрептавидин). Первичное антитело может быть присоединено к одному члену пары (например биотину), а другой член пары (например стрептавидин) может быть мечен генератором сигнала или ферментом. Каждый из вторичного антитела, авидина, стрептавидина или биотина может быть независимо мечен генератором сигнала или ферментом.
В некоторых воплощениях способы, раскрытые в данном изобретении, можно применять в методе иммунологического окрашивания, и первичное антитело можно использовать для специфического связывания белка-мишени. Вторичное антитело можно использовать для специфичного связывания с первичным антителом, образуя посредством этого мостиковую связь между первичным антителом и последующим реагентом (например генератором сигнала или ферментом), если он есть. Например, первичное антитело может представлять собой IgG мыши (антитело, созданное в организме мыши), а соответствующее вторичное антитело может представлять собой антимышиное антитело козы (антитело, созданное в организме козы), имеющее области, способные к связыванию с областью в IgG мыши.
В некоторых воплощениях амплификация сигнала может быть получена, когда несколько вторичных антител могут связываться с эпитопами на первичном антителе. При методе иммунологического окрашивания первичное антитело может представлять собой первое антитело, используемое в методе, а вторичное антитело может представлять собой второе антитело, используемое в методе. В других воплощениях для дополнительного усиления сигнала можно использовать третье антитело. Например, антитело, созданное в организме мыши, можно использовать для связывания мишени. Вторичное антимышиное антитело козы можно использовать для связывания первичного антитела, а меченное антикозье антитело осла можно использовать в качестве третичного антитела для связывания со вторичными антителами, уже связанными с первичным антителом, которое связано с мишенью. В некоторых воплощениях первичное антитело может представлять собой единственное антитело, используемое в методе иммунологического окрашивания.
Генераторы сигнала
Тип генератора сигнала, подходящий для способов, раскрытых в данном изобретении, может зависеть от ряда факторов, включающих природу проводимого анализа, тип используемого источника энергии и детектора, тип используемого реагента переноса электрона, тип связывающего агента, тип мишени.
Подходящий генератор сигнала может включать молекулу или соединение способное обеспечивать обнаружимый сигнал. Генератор сигнала может обеспечивать характеристический сигнал после взаимодействия с источником энергии или током. Источник энергии может включать источник электромагнитного излучения и источник возбуждения флуоресценции. Источник электромагнитного излучения может быть способен к обеспечению электромагнитной энергии любой длины волны, включая видимый, инфракрасный и ультрафиолетовый свет. Электромагнитное излучение может находиться в форме прямого источника света или может испускаться соединением, излучающим свет, таким как донорный флуорофор. Источник возбуждения флуоресценции может обладать способностью к созданию флуоресценции источника или может вызывать испускания фотонов (то есть электромагнитное излучение, направленное электрическое поле, температура, физический контакт или механическое разрушение). Подходящие генераторы сигнала могут обеспечить сигнал, способный к обнаружению различными способами, включающими оптические измерения (например флуоресценцию), измерения электрической проводимости или радиоактивности. Подходящие генераторы сигнала могут быть, например, излучающими свет, принимающими энергию, флуоресцирующими, радиоактивными или гасящими.
Подходящий генератор сигнала может обладать стерической и химической совместимостью с компонентами, с которыми он связан, например со связывающим агентом. Дополнительно подходящий генератор сигнала может ни препятствовать связыванию связывающего агента с мишенью, ни оказывать значимое влияние на связывающую специфичность связывающего агента. Подходящий генератор сигнала может быть органическим или неорганическим по природе. В некоторых воплощениях генератор сигнала может иметь химическую, пептидную или нуклеиново-кислотную природу.
Подходящий генератор сигнала может быть обнаружимым непосредственно. Непосредственно обнаружимая группировка может представлять собой группировку, которая может быть обнаружена непосредственно по ее способности к испусканию сигнала, такую как, например, флуоресцентная метка, испускающая свет с определенной длиной волны после возбуждения светом с другой более низкой характеристической длиной волны, и/или к поглощению света с определенной длиной волны.
Генератор сигнала, подходящий в соответствии со способами, раскрытыми в данном изобретении, может быть пригодным для манипуляций при применении реагента переноса электрона. В некоторых воплощениях генератор сигнала может обладать способностью к обесцвечиванию, например, сигнал, который он генерирует, может быть ослаблен или разрушен в результате модифицирования генератора сигнала в ходе фотореакции. Химическое модифицирование может включать полное расщепление генератора сигнала или модифицирование компонента генератора сигнала, генерирующего сигнал. В некоторых воплощениях генератор сигнала является заряженным.
Модифицирование компонента, генерирующего сигнал, может включать любую химическую модификацию (такую как присоединение, замещение или удаление), которая может привести в результате к модифицированию свойств генерирования сигнала. Например, разъединение конъюгированного генератора сигнала может привести в результате к разрушению хромогенных свойств генератора сигнала. Подобным образом, замещение функциональной группы, ингибирующей флуоресценцию, на генераторе флуоресцентного сигнала может привести в результате к модифицированию его флуоресцентных свойств. В некоторых воплощениях в качестве контрольного зонда в предложенных способах можно использовать один или более чем один генератор сигнала, по существу устойчивый к инактивации специфичным химическим агентом.
В некоторых воплощениях генератор сигнала может быть выбран из светоизлучающей молекулы, радиоактивного изотопа (например Р32 или Н3, 14С, 125I и 131I), маркера оптической или электронной плотности, Раман-активной метки, электронно-спиново-резонансной молекулы (такой как, например, нитроксильные радикалы), молекулы, переносящей электрический заряд (т.е. молекулы, преобразующей электрический заряд), полупроводникового нанокристалла, полупроводниковой наночастицы, нанокристалла коллоидного золота, микрогранулы, магнитной гранулы, парамагнитной частицы.
В некоторых воплощениях генератор сигнала может представлять собой генератор оптического сигнала, например, может включать светоизлучающую молекулу. Светоизлучающая молекула может испускать свет в ответ на облучение светом с определенной длиной волны. Светоизлучающие молекулы могут обладать способностью к поглощению и испусканию света посредством люминесценции (нетеплового испускания электромагнитного излучения веществом при возбуждении), фосфоресценции (замедленной люминесценции в результате поглощения излучения), хемилюминесценции (люминесценции вследствие химической реакции), флуоресценции или поляризованной флуоресценции. Неограничивающие примеры генераторов оптического сигнала включают генератор флуоресцентного сигнала, например флуорофор, Раман-активную метку или хромофор.
В некоторых воплощениях генератор сигнала может по существу включать флуорофор. В некоторых воплощениях генератор сигнала может по существу включать флуорофор, присоединенный к антителу, например, в иммуногистохимическом анализе. Подходящие флуорофоры, которые можно конъюгировать с первичным антителом, включают флуоресцеин, родамин, Texas Red, VECTOR Red, ELF (фермент-меченная флуоресценция), Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7, Fluor X, кальцеин, кальцеин-АМ, CRYPTOFLUOR, Orange (42 кДа), Tangerine (35 кДа), Gold (31 кДа), Red (42 кДа), Crimson (40 кДа), ВНМР, BHDMAP, Br-Oregon, Lucifer Yellow, семейство красителей Alexa, N-[6-(7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил)амино]капроил] (NBD), BODIPY, дифторид бор-дипиррометен, 1,3-дихлор-7-гидрокси-9,9-диметил-2(9Н)-акридинон (DDAO), диметилакридинон (DAO), Oregon Green, MITOTRACKER Red, фикоэритрин, фикобилипротеины ВРЕ (240 кДа), RPE (240 кДа), СРС (264 кДа), АРС (104 кДа), Spectrum Blue, Spectrum Aqua, Spectrum Green, Spectrum Gold, Spectrum Orange, Spectrum Red, инфракрасные (ИК) красители, циклический ГДФ (гуанозиндифосфат)-рибоза (цГДФР), Calcofluor White, лиссамин, умбеллиферон, тирозин или триптофан, но не ограничены ими. В некоторых воплощениях флуорофор может представлять собой цианиновые, родаминовые, кумариновые или пирилиевые красители. В некоторых воплощениях генератор сигнала может по существу включать цианиновый краситель. В других воплощениях генератор сигнала может по существу включать один или более чем один из красителя Cy2, красителя Cy3, красителя Cy5 или красителя Cy7. В альтернативных воплощениях генератор сигнала может представлять собой BODIPY, родамин, 1,3-дихлор-7-гидрокси-9,9-диметил-2(9Н)-акридинон (DDAO) или 7-гидрокси-9,9-диметил-2(9Н)-акридинон (DAO).
В некоторых воплощениях генератор сигнала может представлять собой часть пары FRET (резонансного переноса энергии флюоресценции). Пара FRET включает два флуорофора, способных претерпевать FRET с образованием или устранением обнаружимого сигнала при расположении близко друг к другу. Некоторые примеры доноров могут включать Alexa 488, Alexa 546, BODIPY 493, Oyster 556, Fluor (FAM), Cy3 или TTR (Tamra). Некоторые примеры акцепторов могут включать Cy5, Alexa 594, Alexa 647 или Oyster 656.
Как раскрыто в данном изобретении выше, одну или более чем одну из упомянутых выше молекул можно применять в качестве генератора сигнала. В некоторых воплощениях один или более чем один генератор сигнала может быть пригоден для разрушения сигнала, и генератор сигнала может по существу включать молекулу, способную к обесцвечиванию путем фотоактивируемого химического обесцвечивания. В некоторых воплощениях генератор сигнала может включать флуорофор, способный к химическому модифицированию при фотореакции, в которую также вовлечены реагент переноса электрона и излучение. В некоторых воплощениях генератор сигнала может по существу включать цианин, BODIPY, родамин или акридинон (например DDAO и DAO), которые могут быть модифицированы при фотореакции, в которую также вовлечены присоединение реагента переноса электрона и излучение. В некоторых воплощениях генератор сигнала может включать один или более чем один краситель Cy2, краситель Cy3, краситель Cy5 или краситель Cy7, которые могут обесцвечиваться путем фотоактивируемого химического обесцвечивания.
Ферменты и субстраты ферментов
В некоторых воплощениях зонд может включать связывающий агент, соединенный с ферментом. В некоторых воплощениях подходящий фермент катализирует химическую реакцию субстрата с образованием продукта реакции, который может связываться с рецептором (например фенольные группы), присутствующим в образце. Рецептор может быть экзогенным (то есть рецептор снаружи прикреплен к образцу или к твердому носителю) или эндогенным (рецепторы, естественно присутствующие в образце или на твердом носителе). Можно осуществить амплификацию сигнала, поскольку один фермент может катализировать химическую реакцию субстрата с ковалентным связыванием множественных генераторов сигнала вблизи мишени.
В некоторых воплощениях подходящий фермент может также обладать способностью инактивироваться в ходе фотореакции. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазы, оксидазы, фосфатазы, эстеразы и гликозидазы. Конкретные примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-D-галактозидазу, липазу и глюкозооксидазу. В некоторых воплощениях фермент представляет собой пероксидазу, выбранную из пероксидазы хрена, цитохром-С-пероксидазы, глутатионпероксидазы, микропероксидазы, миелопероксидазы, лактопероксидазы и пероксидазы сои.
В некоторых воплощениях фермент не инактивируется в ходе фотореакции, но инактивируется на отдельной стадии инактивации, проводимой до или после завершения фотореакции. Стадия инактивации может включать нанесение реагента инактивации фермента к образцу, содержащему фермент.
В некоторых воплощениях связывающий агент и фермент могут быть заключены в едином объекте, например молекуле белка, способной к связыванию с мишенью, а также катализирующей химическую реакцию субстрата. В других воплощениях связывающий агент и фермент могут быть заключены в отдельных объектах и могут быть соединены путем образования ковалентной связи или путем использования пар конъюгатов лиганд-рецептор (например биотин-стрептавидин).
Субстрат фермента может быть выбран в зависимости от используемого фермента и от мишени, доступной для связывания в образце. Например, в воплощениях, включающих HRP (пероксидазу хрена) в качестве фермента, субстрат может включать замещенный фенол (например тирамин). Взаимодействие HRP с тирамином может образовать активированный фенольный субстрат, который может связываться с эндогенными рецепторами, такими как богатые электронами группировки (такие как тирозин или триптофан) или фенольные группы, присутствующие в поверхностных белках биологического образца. В альтернативных воплощениях, где вместе с ферментом HRP в качестве субстрата можно использовать гидрохлорид 3-метил-2-бензотиазолинона (МВТН), экзогенные рецепторы, такие как пара-диметиламинобензальдегид (DMAB), могут быть прикреплены к твердому носителю или к биологическому образцу перед взаимодействием с субстратом.
В некоторых воплощениях субстрат фермента может быть дефосфорилирован после взаимодействия с ферментом. Дефосфорилированный продукт реакции может обладать способностью к связыванию с эндогенными или экзогенными рецепторами (например с антителами) в образце или на твердом носителе. Например, фермент может включать щелочную фосфатазу (АР), а субстрат может включать НАДФ (никотинамиддинуклеотидфосфат), замещенные фосфаты (например нитрофенилфосфат) или фосфорилированный биотин. Рецепторы могут включать НАД-связывающие белки, антитела к дефосфорилированному продукту реакции (например антитела к нитрофенолу), авидин или стрептавидин, соответственно. В некоторых воплощениях субстрат может образовывать нерастворимый продукт под действием фермента, который может осаждаться вблизи того места, где они образуются. Неограничивающие примеры таких субстратов могут включать диаминобензидин (DAB) для HRP и ELF для АР.
В некоторых воплощениях фермент может включать β-галактозидазу, а субстрат может включать β-галактопиранозилгликозид флуоресцеина или кумарина. Рецепторы могут включать антитела к дегликозилированным группировкам (например против флуоресцеина или против кумарина). В некоторых воплощениях в качестве фермента можно использовать комбинации множественных ферментов, такие как HRP/AP. Субстрат может включать фосфорилированный замещенный фенол, например тирозинфосфат, который может быть дефосфорилирован АР перед взаимодействием с HRP с образованием продукта реакции, способного к связыванию с рецепторами на основе фенольных групп или богатых электронами группировок.
Продукт реакции субстрата фермента может обладать дополнительной способностью к обеспечению обнаружимого сигнала. В некоторых воплощениях субстраты ферментов, применяемые в способах, раскрытых в данном изобретении, могут включать нехромогенные или нехемилюминесцентные субстраты, то есть само по себе взаимодействие фермента и субстрата фермента может не обеспечивать обнаружимый сигнал. Субстраты ферментов, применяемые в способах, раскрытых в данном изобретении, могут включать внешний генератор сигнала (например флуорофор) в качестве метки. Генератор сигнала и субстрат фермента могут быть присоединены непосредственно (например субстрат фермента с флуоресцентной меткой) или опосредованно (например посредством пары конъюгата лиганд-рецептор). В некоторых воплощениях субстрат может включать защищенные функциональные группы (например сульфгидрильные группы). После связывания активированного субстрата с рецепторами защита функциональной группы может быть удалена, и конъюгация с генератором сигнала осуществлена с использованием генератора сигнала, имеющего тиольную реакционную группу (например малеимида или йодацетила).
В некоторых воплощениях зонд может включать пероксидазу хрена, а субстрат выбран из замещенных фенолов (например тирамина). В некоторых воплощениях пероксидаза хрена вызывает ковалентное связывание активированного фенольного субстрата с фенольными группами, присутствующими в образце. В некоторых воплощениях зонд может включать связывающий агент, соединенный с HRP, а субстрат может включать тирамин, соединенный с флуорофором.
Реагенты переноса электрона и фотореакция
Реагент переноса электрона может включать одно или более чем одно химическое вещество, которое может участвовать в фотореакции с молекулой, способной претерпевать фотовозбуждение. Молекула, способная претерпевать фотовозбуждение, может представлять собой генератор сигнала. Реагент переноса электрона можно приводить в контакт с образцом в виде твердого вещества, раствора, геля или суспензии.
В некоторых воплощениях реагент переноса электрона может включать боратную соль. В некоторых воплощениях боратная соль представлена следующей структурной формулой:
где:
каждый из R1, R2 и R3 независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, где алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил возможно замещен одним или более чем одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из (С1-С4)алкила, (С1-С4)алкокси, (C1-C4)алкиламино, амино, гидроксила, циано, галогена или нитро;
R4 представляет собой алкил, алкенил или алкинил, где алкил, алкенил или алкинил возможно замещен одним или более чем одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из (C1-C4)алкила, (C1-C4)алкокси, (C1-C4)алкиламино, амино, гидроксила, циано, галогена или нитро; и
М+ выбран из группы, состоящей из неорганических катионов и органических катионов.
В некоторых воплощениях M+ выбран из группы неорганических катионов, например Li+, Na+ или К+. В других воплощениях М+ выбран из группы органических катионов. Неограничивающие примеры органических катионов могут включать 
В некоторых воплощениях каждый из R1, R2 и R3 представляет собой арил. В некоторых воплощениях арил представляет собой фенил. В некоторых воплощениях фенил представляет собой незамещенный фенил.
В некоторых воплощениях R4 представляет собой возможно замещенный алкил. В некоторых воплощениях R4 представляет собой незамещенный бутил.
В некоторых воплощениях каждый из R1, R2 и R3 представляет собой возможно замещенный арил, а R4 представляет собой возможно замещенный алкил. В следующем воплощении каждый из R1, R2 и R3 представляет собой незамещенный фенил, и R4 представляет собой незамещенный бутил, а боратная соль представляет собой трифенилбутилборатную соль.
В некоторых воплощениях M+ представляет собой неорганический катион. В некоторых воплощениях неорганический катион представляет собой Li+, Na+ или К+. В одном воплощении М+ представляет собой Li+.
Другие подходящие реагенты переноса электрона могут включать сульфинаты, еноляты, карбоксилаты (например аскорбиновую кислоту), металлорганические соединения и амины (например триэтаноламин и N-фенилглицин). Эти и другие реагенты переноса электрона описаны ранее (см., например, Macromolecules 1974, 7, 179-187; Photogr. Sci. Eng. 1979, 23, 150-154; Topics in Current Chemistry, Mattay, J., Ed.; Springer-Verlag: Berlin, 1990, Vol. 156, pp 199-225; и Pure Appl. Chem. 1984, 56, 1191-1202).
Реагент переноса электрона, применяемый для фотоактивируемого химического обесцвечивания, выбран таким образом, что фотореакция между реагентом переноса электрона и генератором сигнала энергетически выгодна. В некоторых воплощениях реагент переноса электрона и фото возбужденны и генератор сигнала образуют пару донор электрона/акцептор электрона, где перенос электрона от реагента переноса электрона на генератор сигнала энергетически выгоден. Перенос электрона может дополнительно привести к химическому модифицированию генератора сигнала, результатом которого является обесцвечивание генератора сигнала. Примеры реагентов переноса электрона и генераторов сигнала, которые могут образовать пары донор/акцептор электрона, включают триарилалкилбораты, такие как трифенилбутилборат, в качестве реагента переноса электрона и цианиновые красители (например Cy3 и Cy5), BODIPY, родаминовые или акридиновые красители в качестве генераторов сигнала.
Один или более чем один из упомянутых выше реагентов переноса электрона можно применять в способах, раскрытых в данном изобретении, в зависимости от восприимчивости генератора сигнала, фермента, связывающего агента, мишени или биологического образца к фотовозбуждению и/или последующей фотореакции с реагентом переноса электрона. В некоторых воплощениях фотовозбуждение генератора сигнала облучением и последующая фотореакция между реагентом переноса электрона и фотовозбужденным генератором сигнала по существу не влияет на целостность связывающего агента, мишени и биологического образца. В некоторых воплощениях фотовозбуждение генератора сигнала облучением и последующая фотореакция не влияет на специфичность связывания между связывающим агентом и мишенью.
В некоторых воплощениях, где два или более чем два (вплоть до 5) генератора сигнала можно использовать одновременно, фотореакция может обладать способностью к селективному модифицированию одного или более чем одного генератора сигнала. Эта селективность может быть результатом селективного фотовозбуждения генератора сигнала облучением при определенной длине волны. Длина волны излучения выбрана таким образом, что один или более чем один генератор сигнала может претерпевать фотовозбуждение, тогда как остальные из одного или более чем одного генератора сигнала, которые могут присутствовать в образце, могут оставаться незатронутыми. В некоторых воплощениях излучение, ограниченное диапазоном длин волн 520-580 нм, можно использовать для селективного фотовозбуждения красителя Cy3. В других воплощениях излучение, ограниченное диапазоном длин волн 620-680 нм, можно использовать для селективного фотовозбуждения красителя Cy5. В альтернативных воплощениях селективное фотовозбуждение можно осуществить путем использования лазера.
Склонность фотовозбужденных генераторов сигнала к дальнейшему прохождению фотореакции может зависеть от выбора реагента переноса электрона, как обсуждалось выше, а также от условий реакции, таких как температура, растворитель и рН.
В некоторых воплощениях фотоактивируемое химическое обесцвечивание осуществляют при температуре 4-50°C, более предпочтительно при температуре 20-30°C.
В некоторых воплощениях фотоактивируемое химическое обесцвечивание осуществляют в растворе. В некоторых воплощениях раствор представляет собой буферный раствор. В следующем воплощении буферный раствор представляет собой раствор, забуференный фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). В некоторых воплощениях раствор забуферен при рН 5-9. В предпочтительном воплощении рН раствора составляет 6-8.
Последовательный анализ биологического образца, приведение в контакт и связывание зонда
Биологический образец можно приводить в контакт с зондом для связывания зонда с мишенью в биологическом образце. В некоторых воплощениях мишень может не являться легко доступной для связывания с зондом, и биологический образец можно дополнительно обрабатывать, чтобы облегчить связывание между мишенью и связывающим агентом в зонде, например, посредством выделения антигена, ферментативного расщепления, демаскировки эпитопа или блокирования.
В некоторых воплощениях зонд можно приводить в контакт с биологическим образцом в виде раствора. В некоторых воплощениях зонд может включать связывающий агент, соединенный с меткой (генератором сигнала или ферментом). Связывающий агент и метка (генератор сигнала или фермент) могут быть заключены в единой молекуле, и раствор зонда можно наносить в одну стадию. Альтернативно связывающий агент и метка (генератор сигнала или фермент) могут представлять собой отдельные объекты, и раствор зонда можно наносить в одну стадию или множество стадий. Во всех воплощениях контрольный зонд можно дополнительно связывать с одной или более чем одной мишенью в образце.
В зависимости от природы связывающего агента, мишени и связывания между ними может быть предоставлено достаточное время контакта. В некоторых воплощениях, чтобы обеспечить связывание всех мишеней в биологическом образце, можно использовать избыток молекул зонда (и, соответственно, молекул связывающего агента). После предоставления достаточного времени для осуществления связывания образец может быть приведен в контакт с промывочным раствором (например подходящим буферным раствором) для промывки любых несвязанных зондов. В зависимости от концентрации и типа используемых зондов биологический образец можно подвергать ряду стадий промывки одним и тем же или различными промывочными растворами, используемыми на каждой стадии.
В некоторых воплощениях биологический образец можно приводить в контакт с более чем одним зондом на первой стадии связывания. Множество зондов может обладать способностью к связыванию различных мишеней в биологическом образце. Например, биологический образец может содержать две мишени: мишень 1 и мишень 2, и в данном случае можно использовать два набора зондов: зонд 1 (имеющий в составе связывающий агент 1, способный к связыванию с мишенью 1) и зонд 2 (имеющий в составе связывающий агент 2, способный к связыванию с мишенью 2). Множество зондов может также содержать множество множественных наборов зондов, связывающих мишень. Множество зондов можно приводить в контакт с биологическим образцом одновременно (например, в виде единой смеси) или последовательно (например, зонд 1 можно приводить в контакт с биологическим образцом с последующей стадией промывки для удаления любого несвязанного зонда 1, с последующим приведением зонда 2 в контакт с биологическим образцом и т.д.).
Число зондов, которые могут одновременно связываться с мишенью, может зависеть от типа используемого обнаружения, то есть от достижимого спектрального разделения. Например, в случае генераторов сигнала на основе флуоресценции в соответствии с раскрытыми способами можно использовать вплоть до пяти различных зондов (обеспечивающих вплоть до пяти спектрально разделимых флуоресцентных сигналов). "Спектрально разделимый" в отношении множества генераторов флуоресцентного сигнала указывает на то, что полосы испускания флуоресценции генераторов сигнала являются достаточно отчетливыми, т.е. по существу не перекрывающимися, так что связывающие агенты, к которым присоединены соответствующие генераторы сигнала, можно различить на основании флуоресцентного сигнала, генерируемого соответствующими генераторами сигнала, используя стандартные системы фотообнаружения. В некоторых воплощениях все зонды можно связывать одновременно, но обнаруживать последовательно в наборах из 1-5 зондов на цикл.
В некоторых воплощениях биологический образец можно приводить в контакт по существу с пятью или менее зондами на первой стадии связывания. В воплощениях с применением зондов на основе ферментов число зондов, которые могут одновременно связываться с мишенью, может также зависеть от числа различных ферментов и их соответствующих доступных субстратов.
В некоторых воплощениях биологический образец может включать целую клетку, образец ткани, либо биологический образец может быть прикреплен к микрочипу, гелю или мембране. В некоторых воплощениях биологический образец может включать образец ткани. Образец ткани может быть получен с помощью ряда методов, включающих хирургическое удаление, аспирацию или биопсию, но не ограниченных ими. Ткань может быть свежей или замороженной. В некоторых воплощениях образец ткани можно фиксировать или заключать в парафин. Образец ткани можно фиксировать или консервировать иначе с помощью традиционной методологии; выбор фиксатора может определяться целью, для которой ткань подвергают гистохимическому окрашиванию или анализируют иным путем. Длительность фиксации может зависеть от размера образца ткани и от используемого фиксатора. Например, для фиксации или консервации образца ткани можно использовать нейтральный забуференный формалин, жидкость Буэна или параформальдегид.
В некоторых воплощениях образец ткани можно сначала фиксировать, а затем дегидратировать посредством серии спиртов возрастающей концентрации, пропитывать и заключать в парафин или другую среду для приготовления срезов таким образом, чтобы можно было получить срезы образца ткани. В альтернативном воплощении можно получить срезы образца ткани и впоследствии фиксировать. В некоторых воплощениях образец ткани можно заключать в парафин и обрабатывать в нем. Примеры парафина, который можно использовать, включают Paraplast, Broloid и Tissuemay, но не ограничены ими. Как только образец ткани заключен, этот образец можно нарезать при помощи микротома с получением срезов, которые могут иметь толщину в диапазоне от примерно трех микрон до примерно пяти микрон. Как только срезы получены, их можно прикреплять к предметным стеклам, используя адгезив. Примеры адгезивов для предметных стекол включают силан, желатин, поли-L-лизин, но не ограничены ими. В воплощениях, если парафин используют в качестве заливочного материала, срезы ткани можно депарафинизировать и регидратировать в воде. Срезы ткани можно депарафинизировать, например, путем использования органических агентов (таких как ксилолы или серии спиртов постепенно понижающейся концентрации).
В некоторых воплощениях, кроме обсуждаемых выше методов получения образца, срез ткани можно подвергать дополнительной обработке до, во время или после иммуногистохимии. Например, в некоторых воплощениях срез ткани можно подвергать способам демаскировки эпитопов, таким как нагревание образца ткани в цитратном буфере или в Трис-буфере, либо последовательно в обоих. В некоторых воплощениях срез ткани можно, возможно, подвергать стадии блокирования, чтобы минимизировать любое неспецифическое связывание.
В некоторых воплощениях биологический образец, либо часть биологического образца, либо мишени, присутствующие в биологическом образце, можно прикреплять к поверхности, например ДНК-микрочипам, либо белковым микрочипам, либо к поверхности твердых носителей (таких как гели, блоты, предметные стекла, гранулы или планшеты для ELISA). В некоторых воплощениях мишени, присутствующие в биологическом образце, можно прикреплять к поверхности твердых носителей. Мишени в биологическом образце можно прикреплять к твердому носителю путем образования физической связи, путем образования ковалентной связи или обоими путями.
В некоторых воплощениях мишени в биологическом образце можно прикреплять к мембранам и исследовать, последовательно используя способы, раскрытые в данном изобретении. В некоторых воплощениях мишени в биологическом образце можно обрабатывать перед приведением образца в контакт с мембраной. Например, воплощения, включающие способы зондирования белковых мишеней в образце ткани, могут включать стадию экстрагирования белков-мишеней из биологического образца гомогената или экстракта ткани. Твердые ткани или целые клетки можно сначала разрушать механически, используя смеситель (для образцов большего объема), используя гомогенизатор (для меньших объемов), или путем обработки ультразвуком. Различные клеточные компартменты и органеллы можно разделять, используя методы фильтрования и центрифугирования. Можно также использовать детергенты, соли и буферы, чтобы способствовать лизису клеток и солюбилизации белков. Подобным образом, воплощения, включающие способы зондирования нуклеиновых кислот, могут включать стадию получения фрагментов ДНК или РНК, например, используя эндонуклеазы рестрикции (для ДНК).
В некоторых воплощениях мишени, экстрагированные из биологического образца, можно дополнительно разделять с помощью гель-электрофореза. Разделение мишеней можно осуществлять на основании изоэлектрической точки (р1), молекулярной массы, электрического заряда или комбинации этих факторов. Природа разделения может зависеть от обработки образца и от природы геля. Подходящий гель может быть выбран из полиакриламидного геля, додецилсульфат натрия (ДСН)-полиакриламидного геля или агарозного геля.
Подходящая мембрана может быть выбрана таким образом, чтобы эта мембрана обладала свойствами неспецифического связывания мишени. В некоторых воплощениях подходящая мембрана может быть выбрана из поливинилиденфторидной мембраны, нитроцеллюлозной мембраны или нейлоновой мембраны. В некотором воплощении подходящая мембрана может быть выбрана таким образом, чтобы эта мембрана была по существу устойчивой к многократному зондированию. В воплощениях, включающих зондирование мишеней с использованием белковых зондов, мембраны можно блокировать, используя блокирующий раствор, чтобы предотвратить неспецифическое связывание белковых зондов с мембранами. В воплощениях, включающих зондирование фрагментов ДНК, гель с ДНК можно обрабатывать разбавленным раствором HCl или щелочным раствором, чтобы способствовать более эффективному переносу ДНК из геля на мембрану.
В некоторых воплощениях мембрану можно подвергать воздействию температур в диапазоне от примерно 60°C до примерно 100°C для ковалентного связывания мишеней с мембраной, например ДНК-мишеней с нитроцеллюлозной мембраной. В некоторых воплощениях мембрану можно подвергать воздействию ультрафиолетового излучения для ковалентного связывания мишеней с мембраной, например ДНК-мишеней с нейлоновой мембраной. В некоторых воплощениях мишени в биологическом образце можно не разделять электрофорезом перед блоттингом на мембране, и их можно зондировать непосредственно на мембране, например, методами дот-блоттинга.
После приготовления образца ткани или мембраны раствор зонда (например раствор меченного антитела) можно приводить в контакт со срезом ткани или мембраной в течение достаточного периода времени и в условиях, подходящих для связывания связывающего агента с мишенью (например антигеном). Как раскрыто ранее, можно использовать два способа обнаружения: непосредственный или опосредованный. При непосредственном обнаружении первичное антитело, меченное генератором сигнала (например первичное антитело, меченное флуорофором, или первичное антитело, меченное ферментом), можно инкубировать с антигеном в образце ткани или на мембране, который можно визуализировать без взаимодействия с дополнительным антителом. При опосредованном обнаружении неконъюгированное первичное антитело можно инкубировать с антигеном, а затем меченное вторичное антитело можно связывать с первичным антителом. Может происходить амплификация сигнала, поскольку несколько вторичных антител может взаимодействовать с различными эпитопами на первичном антителе. В некоторых воплощениях два или более чем два (самое большее пять) первичных антитела (от различных видов, меченных или немеченных) можно приводить в контакт с образцом ткани. Затем немеченные антитела можно приводить в контакт с соответствующими меченными вторичными антителами. В альтернативных воплощениях можно использовать первичное антитело и специфические связывающие пары лиганд-рецептор (такие как биотин-стрептавидин). Первичное антитело может быть присоединено к одному члену пары (например биотину), а другой член (например стрептавидин) может быть мечен генератором сигнала или ферментом. Каждый из вторичного антитела, авидина, стрептавидина или биотина может быть независимо мечен генератором сигнала или ферментом.
В воплощениях, где первичное антитело или вторичное антитело может быть конъюгировано с ферментной меткой, субстрат, соединенный с генератором флуоресцентного сигнала, можно добавлять для обеспечения визуализации антигена. В некоторых воплощениях субстрат и генератор флуоресцентного сигнала могут быть заключены в единой молекуле и могут быть нанесены в одну стадию. В других воплощениях субстрат и генератор флуоресцентного сигнала могут представлять собой отдельные объекты и могут быть нанесены в одну стадию или множество стадий.
Фермент, соединенный со связывающим агентом, можно подвергать взаимодействию с субстратом, чтобы катализировать химическую реакцию субстрата для ковалентного связывания субстрата, соединенного с генератором флуоресцентного сигнала, с биологическим образцом. В некоторых воплощениях фермент может включать пероксидазу хрена, а субстрат может включать тирамин. Взаимодействие пероксидазы хрена (HRP) с тираминовым субстратом может вызвать ковалентное связывание тираминового субстрата с фенольными группами, присутствующими в образце. В воплощениях, в которых применяют конъюгаты фермент-субстрат, может быть достигнута амплификация сигнала, поскольку один фермент может катализировать множественные молекулы субстрата. В некоторых воплощениях способы, раскрытые в настоящем изобретении, можно применять для обнаружения малораспространенных мишеней, используя опосредованные способы обнаружения (например, используя первичные-вторичные антитела), используя способы амплификации сигнала HRP-тирамин, или комбинации обоих способов (например опосредованные способы амплификации сигнала HRP-тирамин). Включение методов амплификации сигнала в способы, раскрытые в данном изобретении, и соответственно тип включенных методов амплификации сигнала могут зависеть от чувствительности, необходимой для конкретной мишени, и от числа стадий, включенных в протокол.
Наблюдение сигнала от зонда или от первого набора из множества зондов
Сигнал от генератора сигнала может быть обнаружен, используя систему обнаружения. Природа используемой системы обнаружения может зависеть от природы используемых генераторов сигнала. Система обнаружения может включать систему обнаружения на основе прибора с зарядовой связью (CCD), флуоресцентную систему обнаружения, электрическую систему обнаружения, систему обнаружения на основе фотопленки, хемилюминесцентную систему обнаружения, ферментативную систему обнаружения, оптическую систему обнаружения, систему обнаружения в ближнем поле или систему обнаружения на основе полного внутреннего отражения (TIR).
Один или более чем один из упомянутых выше методов можно использовать для наблюдения одной или более чем одной характеристики сигнала от генератора сигнала (соединенного со связывающим агентом или соединенного с субстратом фермента). В некоторых воплощениях интенсивность сигнала, длину волны сигнала, положение сигнала, частоту сигнала или сдвиг сигнала можно определить, используя один или более чем один из упомянутых выше методов. В некоторых воплощениях одну или более чем одну из упомянутых выше характеристик сигнала можно наблюдать, измерять и регистрировать.
В некоторых воплощениях наблюдаемый сигнал представляет собой флуоресцентный сигнал, и зонд, связанный с мишенью в биологическом образце, может содержать генератор сигнала, представляющий собой флуорофор. В некоторых воплощениях флуоресцентный сигнал можно измерить путем определения длины волны флуоресценции или интенсивности флуоресценции, используя систему обнаружения флуоресценции. В некоторых воплощениях сигнал можно наблюдать in situ, то есть сигнал можно наблюдать непосредственно от генератора сигнала, ассоциированного посредством связывающего агента с мишенью в биологическом образце. В некоторых воплощениях сигнал от генератора сигнала можно анализировать внутри биологического образца, что устраняет необходимость в отдельных системах обнаружения на основе матриц.
В некоторых воплощениях наблюдение сигнала может включать снятие изображения биологического образца. В некоторых воплощениях в качестве системы обнаружения можно использовать микроскоп, соединенный с устройством визуализации в соответствии со способами, раскрытыми в данном изобретении. В некоторых воплощениях генератор сигнала (такой как флуорофор) может быть возбужден, и полученный сигнал (такой как флуоресцентный сигнал) можно наблюдать и регистрировать в форме цифрового сигнала (например оцифрованного изображения). Тот же метод можно повторять для различных генераторов сигнала (если они присутствуют), связанных в образце, используя подходящие фильтры флуоресценции.
В некоторых воплощениях в одном и том же образце можно наблюдать множественные различные типы сигналов. Например, одна мишень может быть обнаружена флуоресцентным зондом, а вторая мишень в том же образце может быть обнаружена хромогенным зондом.
Нанесение реагента переноса электрона и облучение для инициации фотореакции с целью модификации сигнала
Чтобы модифицировать сигнал, реагент переноса электрона можно наносить на образец, и впоследствии образец можно облучать для инициации фотореакции. В некоторых воплощениях модификация сигнала может включать изменение в одной или более чем одной характеристике сигнала, например снижение интенсивности сигнала, сдвиг пика сигнала или изменение резонансной частоты. В некоторых воплощениях фотореакция может модифицировать сигнал путем существенной инактивации, т.е. обесцвечивания генератора флуоресцентного сигнала и фермента (при его использовании).
В некоторых воплощениях реагент переноса электрона может находиться в форме раствора. В одном воплощении реагент переноса электрона находится в форме буферного водного раствора. В некоторых воплощениях реагент переноса электрона может представлять собой боратную соль. В следующих воплощениях реагент переноса электрона может представлять собой соль трифенилбутилборат лития, присутствующую в концентрации от 0,001 мМ до 1000 мМ. В предпочтительном воплощении концентрация трифенилбутилбората составляет от 20 мМ до 100 мМ. В некоторых воплощениях концентрация реагента переноса электрона, например боратной соли, может составлять 1-60 эквивалентов концентрации генератора сигнала, например флуоресцентного красителя.
Облучение образца, приведенного в контакт с реагентом переноса электрона, можно проводить в течение предварительно установленного количества времени. Продолжительность облучения может зависеть от желаемой продолжительности фотореакции между реагентом переноса электрона и фотовозбужденным генератором сигнала. В некоторых воплощениях стадию облучения можно проводить в течение периода времени от примерно 20 секунд до примерно 60 минут, предпочтительно от примерно 20 секунд до примерно 15 минут и еще более предпочтительно от примерно 20 секунд до примерно 5 минут. В некоторых воплощениях стадию облучения можно проводить до тех пор, пока никакого остаточного сигнала от генератора сигнала не будет наблюдаться. В некоторых воплощениях стадию облучения можно проводить при комнатной температуре.
В некоторых воплощениях фотореакцию проводят при температуре 4-50°C, более предпочтительно при температуре 20-30°C.
В некоторых воплощениях фотореакцию проводят в растворе. В некоторых воплощениях раствор представляет собой буферный раствор. В следующем воплощении буферный раствор представляет собой раствор, забуференный фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). В некоторых воплощениях раствор забуферен при рН 5-9. В предпочтительном воплощении рН раствора составляет 6-8.
В некоторых воплощениях условия фотореакции (например длина волны излучения) могут быть выбраны таким образом, чтобы фотореакция могла не оказывать влияния на связывающий агент, мишень, биологический образец и связывание между связывающим агентом и мишенью. В некоторых воплощениях фотореакция может влиять только на генератор сигнала и фермент (при его использовании) и на реагент переноса электрона и может не влиять на связывание мишень/связывающий агент или целостность связывающего агента. Так, в качестве примера, связывающий агент может включать первичное антитело или комбинацию первичное/вторичное антитело. Фотореакция согласно способам, раскрытым в данном изобретении, может влиять только на генератор сигнала, а первичное антитело или комбинация первичное антитело/вторичное антитело могут по существу оставаться незатронутыми. В некоторых воплощениях связывающий агент (такой как первичное антитело или комбинация первичное антитело/вторичное антитело) может оставаться связанным с мишенью в биологическом образце после приведения образца в контакт с реагентом переноса электрона и последующего облучения для инициации фотореакции.
В некоторых воплощениях характеристику сигнала можно наблюдать после фотореакции, чтобы определить эффективность модификации сигнала. Например, окрашивание можно наблюдать до фотореакции, и окрашивание может отсутствовать после фотореакции. В другом примере интенсивность флуоресценции от генератора флуоресцентного сигнала можно наблюдать до фотореакции и после фотореакции. В некоторых воплощениях снижение интенсивности сигнала на предварительно заданное значение может относиться к модификации сигнала, либо к фотоактивируемому химическому обесцвечиванию, либо к обесцвечиванию. В некоторых воплощениях модификация сигнала или фотоактивируемое химическое обесцвечивание может относиться к снижению интенсивности сигнала на значение, находящееся в диапазоне более чем примерно 50 процентов. В некоторых воплощениях модификация сигнала или фотоактивируемое химическое обесцвечивание может относиться к снижению интенсивности сигнала на значение, находящееся в диапазоне более чем примерно 60 процентов. В некоторых воплощениях модификация сигнала или фотоактивируемое химическое обесцвечивание может относиться к снижению интенсивности сигнала на значение, находящееся в диапазоне более чем примерно 80 процентов. В некоторых воплощениях модификация сигнала или фотоактивируемое химическое обесцвечивание может относиться к снижению интенсивности сигнала на значение, находящееся в диапазоне более чем примерно 90 процентов. В некоторых воплощениях модификация сигнала или фотоактивируемое химическое обесцвечивание может относиться к снижению интенсивности сигнала на значение, находящееся в диапазоне более чем примерно 95 процентов. В некоторых воплощениях модификация сигнала или фотоактивируемое химическое обесцвечивание может относиться к снижению интенсивности сигнала на значение, находящееся в диапазоне примерно 100 процентов, или к полному обесцвечиванию.
Приведение образца в контакт с последующим зондом и связывание с последующей мишенью
Биологический образец или образец можно приводить в контакт с последующим зондом, используя один или более чем один метод, раскрытый выше в данном изобретении для первого зонда. Последующий зонд может быть способен к связыванию с мишенью, отличной от мишени, связанной на предшествующих стадиях. В воплощениях, где множество зондов можно приводить в контакт с биологическим образцом на предшествующих стадиях контакта с зондом, последующий зонд может быть способен связываться с мишенью, отличной от мишеней, связанных предшествующим набором зондов. В некоторых воплощениях биологический образец можно приводить в контакт с множеством зондов на стадии контакта с последующим зондом. В некоторых воплощениях, где на биологический образец наносили множество множественных наборов зондов на первой стадии, можно генерировать последующий набор сигналов от последующего набора зондов. Генерирование второго набора сигналов может включать ассоциирование второго набора зондов с отдельной группировкой, содержащей генератор сигнала. Например, второй набор зондов может содержать биотиновую метку, а группировка, содержащая генератор сигнала, может также содержать стрептавидин, способный к связыванию биотиновой метки. Альтернативно генерирование второго набора сигналов может включать демаскировку группировки, генерирующей сигнал, например, путем модифицирования расстояния между парой флуорофор-гаситель. В некоторых воплощениях генерирование второго набора сигналов может осуществляться путем гибридизации меченных зондов, комплементарных последовательностям, присоединенным ко второму набору зондов.
В воплощениях, где связывающие агенты, соединенные с ферментами, можно использовать в качестве зондов, стадии связывания могут дополнительно включать стадии взаимодействия, включающие взаимодействие фермента с субстратом фермента, соединенным с генератором флуоресцентного сигнала.
В некоторых воплощениях генератор сигнала (например генератор флуоресцентного сигнала), используемый на различных стадиях связывания, может быть одним и тем же, то есть обнаружимым в одном и том же канале обнаружения. Способы, в которых используют один и тот же генератор сигнала на различных стадиях связывания, могут дать возможность обнаружения множественных мишеней, когда доступно ограниченное число каналов обнаружения. В некоторых воплощениях, где на первой стадии связывания можно использовать набор зондов (от 2 до 5 зондов), последующие зонды могут содержать те же генераторы сигнала, что и на предшествующих стадиях связывания. Например, первая стадия связывания может включать различные Cy3, Cy5 и Cy7-конъюгированные связывающие агенты. В некоторых воплощениях последующие стадии связывания могут также включать тот же набор красителей, то есть Cy3, Cy5 и Cy7.
В некоторых воплощениях генератор сигнала (например генератор флуоресцентного сигнала), используемый на различных стадиях связывания, может отличаться, то есть независимо обнаруживаться в различных каналах обнаружения. Например, в некоторых воплощениях первый зонд может включать краситель Cy3, имеющий длину волны испускания флуоресценции в зеленой области, а последующий зонд может включать краситель Cy7, имеющий длину волны испускания флуоресценции в ближней инфракрасной области.
В воплощениях, в которых в качестве зондов используют ферменты, соединенные со связывающим агентом, ферменты и субстраты, используемые на различных стадиях связывания и взаимодействия, могут быть одними и теми же. Предшествующий фермент может быть инактивирован в ходе фотореакции или на отдельной стадии инактивации перед связыванием образца с последующим ферментом, чтобы предотвратить перекрестную реакцию предшествующего фермента с последующим субстратом. Например, первая стадия связывания и взаимодействия может включать связывающий агент, соединенный с HRP, и тирамин, соединенный с первым флуорофором. Стадия фотоиндуцируемого химического обесцвечивания может включать стадии инактивации по существу флуорофора и инактивации по существу HRP. В некоторых воплощениях стадии фотоиндуцируемого химического обесцвечивания и инактивации можно осуществлять одновременно. В некоторых воплощениях стадии фотоиндуцируемого химического обесцвечивания и инактивации можно осуществлять последовательно. После стадий фотоиндуцируемого химического обесцвечивания и инактивации образец можно приводить в контакт с последующим связывающим агентом, соединенным с HRP, который можно дополнительно подвергать взаимодействию с тирамином, соединенным со вторым флуорофором. Аналогично последующие стадии связывания и взаимодействия можно осуществлять, используя множественные повторения HRP-тирамина в качестве конъюгатов фермент-субстрат, где за каждой стадией связывания и взаимодействия следует стадия фотоиндуцируемого химического обесцвечивания и инактивации. Первый флуорофор и последующие флуорофоры могут быть одинаковыми или разными в зависимости от числа каналов обнаружения, доступных для обнаружения.
В некоторых воплощениях первая стадия связывания может включать набор зондов (например от 2 до 5 зондов), где каждый зонд содержит связывающий агент, способный к связыванию с отличной мишенью, и каждый фермент способен катализировать химическую реакцию отличного субстрата. Например, в одном воплощении первый набор зондов может содержать связывающий агент 1, соединенный с HRP, и связывающий агент 2, соединенный с АР. Стадия взаимодействия может включать приведение образца в контакт с тирамином, соединенным с Cy3, и НАДФ, соединенным с Cy7. После взаимодействия ферментов с их соответствующими субстратами и наблюдения сигналов цианиновые красители могут быть инактивированы путем фотоиндуцируемого химического обесцвечивания, а ферменты инактивированы в ходе фотореакции или путем присоединения подходящего инактивирующего агента. Последующие стадии зондирования могут включать тот же набор пар связывающий агент-фермент и субстрат-флуорофор или отличный набор пар связывающий агент-фермент и субстрат-флуорофор. Множество зондов и субстрат-генератор сигнала можно приводить в контакт с биологическим образцом одновременно (например, в виде единой смеси) или последовательно (например, зонд 1 можно приводить в контакт с биологическим образцом с последующей стадией промывки для удаления любого несвязанного зонда 1, с последующим приведением зонда 2 в контакт с биологическим образом и т.д.).
Наблюдение последующего сигнала от последующего зонда
Один или более чем один способ обнаружения, раскрытый выше в данном изобретении, можно применять для наблюдения одной или более чем одной характеристики последующего (например, второго, третьего и т.д.) сигнала от последующего генератора сигнала (присутствующего в последующем зонде). В некоторых воплощениях интенсивность сигнала, длину волны сигнала, положение сигнала, частоту сигнала или сдвиг сигнала можно определить, используя один или более чем один из упомянутых выше методов. Подобно первому сигналу, полученный последующий сигнал (например флуоресцентный сигнал) можно регистрировать в форме цифрового сигнала (например оцифрованного изображения). В некоторых воплощениях наблюдение последующего сигнала может также включать снятие оптического изображения биологического образца.
Многократное повторение стадий приведения в контакт, связывания и наблюдения
В некоторых воплощениях после приведения образца в контакт с последующим (например вторым, третьим и т.д.) зондом обесцвечивание генератора сигнала в фотореакции и введение последующего зонда/генерирование сигнала от уже связанных зондов можно повторять множество раз. В некоторых воплощениях после наблюдения второго сигнала от второго зонда биологический образец можно приводить в контакт с реагентом переноса электрона и облучать, чтобы модифицировать сигнал от второго зонда. Кроме того, третий зонд можно приводить в контакт с биологическим образцом, где третий зонд может обладать способностью к связыванию мишени, отличной от мишени первого и второго зондов. Аналогично можно наблюдать сигнал от третьего зонда с последующим нанесением реагента переноса электрона и облучением для модификации сигнала. Стадии связывания, наблюдения и обесцвечивания можно многократно повторять множество раз, используя n-ный зонд, способный к связыванию с дополнительными мишенями, чтобы обеспечить пользователя информацией о ряде мишеней, используя ряд зондов и/или генераторов сигнала. В воплощениях, где в качестве зондов можно использовать связывающие агенты, соединенные с ферментами, стадии связывания могут дополнительно включать стадии взаимодействия, включающие взаимодействие фермента с субстратом фермента, соединенным с генератором флуоресцентного сигнала.
В некоторых воплощениях стадии обесцвечивания, связывания, взаимодействия (если применимо) и наблюдения можно повторять один или более чем один раз. В некоторых воплощениях стадии обесцвечивания, связывания, взаимодействия (если применимо) и наблюдения можно повторять по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, по меньшей мере 30, по меньшей мере 60 раз, по меньшей мере 100 раз или по меньшей мере 150 раз. В некоторых воплощениях серию стадий можно повторять 25-30 раз. В других воплощениях серию стадий можно повторять 2-10 раз.
В некоторых воплощениях серию зондов можно приводить в контакт с биологическим образцом последовательно с получением мультиплексного анализа биологического образца. В некоторых воплощениях серию наборов зондов (содержащих самое большее 5 зондов в одном наборе) можно приводить в контакт с биологическим образом последовательно с получением мультиплексного анализа биологического образца. Мультиплексный анализ в целом относится к анализу множественных мишеней в биологическом образце, используя один и тот же механизм обнаружения.
В некоторых воплощениях, где биологический образец приводят в контакт с множеством множественных наборов зондов на первой стадии, серию стадий, включающую обесцвечивание, генерирование сигналов от последующего набора зондов и наблюдение сигнала, можно повторять по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, по меньшей мере 30, по меньшей мере 60 раз, по меньшей мере 100 раз или по меньшей мере 150 раз. В некоторых воплощениях серию стадий можно повторять 25-30 раз. В других воплощениях серию стадий можно повторять 2-10 раз.
В некоторых воплощениях компоненты биологического образца значительно не модифицируются после повторных циклов стадий обесцвечивания, связывания, взаимодействия (если применимо) и наблюдения. В некоторых воплощениях компоненты биологического образца значительно не модифицируются во время стадии обесцвечивания. В некоторых воплощениях компоненты биологического образца, которые значительно не модифицирующиеся во время стадии обесцвечивания, представляют собой мишени. В некоторых воплощениях более чем 80% мишеней значительно не модифицируется в ходе стадии обесцвечивания. В некоторых воплощениях более чем 95% мишеней значительно не модифицируется в ходе стадии обесцвечивания.
Приведение образца в контакт с одним или более чем одним морфологическим красителем
В некоторых воплощениях биологический образец может включать клетку или ткань, и этот образец можно приводить в контакт с морфологическим красителем до, во время или после стадии приведения в контакт с первым зондом или последующим зондом. Морфологический краситель может включать краситель, который может окрашивать различные клеточные компоненты с целью облегчения идентификации типа клетки или статуса заболевания. В некоторых воплощениях морфологический краситель может быть легко отличимым от генераторов сигнала в зондах, то есть краситель может не испускать сигнал, который может перекрываться с сигналом от зонда. Например, для флуоресцентного морфологического красителя сигнал от морфологического красителя может не автофлуоресцировать при той же длине волны, что и флуорофоры, используемые в зондах.
Морфологический краситель можно приводить в контакт с биологическим образцом до, во время или после любой из упомянутых выше стадий. В некоторых воплощениях морфологический краситель можно приводить в контакт с биологическим образцом вместе со стадией приведения в контакт с первым зондом. В некоторых воплощениях морфологический краситель можно приводить в контакт с биологическим образцом до приведения образца в контакт с реагентом переноса электрона и облучать после связывания первого зонда с мишенью. В некоторых воплощениях морфологический краситель можно приводить в контакт с биологическим образцом после приведения образца в контакт с реагентом переноса электрона и облучения для модификации сигнала. В некоторых воплощениях морфологический краситель можно приводить в контакт с биологическим образцом вместе со стадией приведения в контакт со вторым зондом. В некоторых воплощениях биологический образец можно приводить в контакт с морфологическим красителем после связывания второго зонда с мишенью. В некоторых воплощениях, где морфологические красители могут приводить в результате к фоновому шуму для флуоресцентного сигнала от генератора сигнала, морфологические красители можно приводить в контакт с биологическим образцом после стадий зондирования, обесцвечивания и повторного зондирования. Например, морфологические красители, такие как Н&Е (гематоксилин-эозин), можно последовательно визуализировать и регистрировать после способов, раскрытых в данном изобретении.
В некоторых воплощениях хромофоры, флуорофоры или ферменты/субстраты ферментов можно использовать в качестве морфологических красителей. Походящие примеры хромофоров, которые можно применять в качестве морфологических красителей (и их мишеней, представляющих собой клетки, субклеточные компартменты или клеточные компоненты), могут включать гематоксилин (нуклеиновые кислоты), Orange G (эритроциты, клетки поджелудочной железы и надпочечников), Light Green SF (коллаген), краситель Романовского-Гимзы (общая морфология клетки), краситель Май-Грюнвальда (клетки крови), Blue Counterstain (Trevigen), этиловый зеленый (CAS) (амилоид), Фельген - нафтоловый желтый S (ДНК), Гимза (дифференциально окрашивает различные клеточные компартменты), метиловый зеленый (амилоид), пиронин (нуклеиновые кислоты), нафтоловый желтый (эритроциты), Neutral Red (ядра), краситель Папаниколау (смесь гематоксилина, Orange G и Bismarck Brown (общая морфология клетки)), Red Counterstain В (Trevigen), Red Counterstain С (Trevigen), Sirius Red (амилоид), реагент Фельгена (парарозанилин) (ДНК), галлоцианин хром-алюминий (ДНК), галлоцианин хром-алюминий и нафтоловый желтый S (ДНК), метиловый зеленый-пиронин Y (ДНК), тионин-реагент Фельгена (ДНК), акридиновый оранжевый (ДНК), метиленовый синий (РНК и ДНК), толуидиновый синий (РНК и ДНК), альциановый синий (углеводы), рутениевый красный (углеводы), судам черный (липиды), судан IV (липиды), масляный красный-O (липиды), краситель трихром Ван-Гизона (смесь кислого фуксина и пикриновой кислоты) (мышечные клетки), краситель трихром Массона (смесь гематоксилина, кислого фуксина и Light Green) (дифференциально окрашивает коллаген, цитоплазму, ядрышки), альдегид фуксина (эластиновые волокна) или краситель Вейгерта (дифференциально окрашивает ретикулярные и коллагеновые волокна), но не ограничены ими.
Примеры подходящих флуоресцентных морфологических красителей (и их мишеней, представляющих собой клетки, субклеточные компартменты или клеточные компоненты, если они применимы) могут включать, но не ограничены ими: 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (нуклеиновые кислоты), Hoechst 33258 и Hoechst 33342 (два бисбензимида) (нуклеиновые кислоты), пропидиумиодид (нуклеиновые кислоты), Spectrum Orange (нуклеиновые кислоты), Spectrum Green (нуклеиновые кислоты), хинакрин (нуклеиновые кислоты), флуоресцеин-фаллоидин (актиновые волокна), хромомицин A3 (нуклеиновые кислоты), акрифлавин-реагент Фельгена (нуклеиновые кислоты), аурамин O-реагент Фельгена (нуклеиновые кислоты), этидиумбромид (нуклеиновые кислоты), красители Ниссля (нейроны), флуорофоры с высоким сродством к ДНК, такие как POPO, BOBO, YOYO и ТОТО и другие, и зеленый флуоресцентный белок, слитый с ДНК-связывающим белком, таким как гистоны, АСМА, хинакрин и акридиновый оранжевый.
Примеры подходящих ферментов (и их первичных клеточных локализаций или активностей) могут включать АТФазы (мышечные волокна), сукцинатдегидрогеназы (митохондрии), цитохром-с-оксидазы (митохондрии), фосфорилазы (митохондрии), фосфофруктокиназы (митохондрии), ацетилхолинэстеразы (нервные клетки), лактазы (тонкий кишечник), кислые фосфатазы (лизосомы), лейцинаминопептидазы (клетки печени), дегидрогеназы (митохондрии), миоденилатдеаминазы (мышечные клетки), НАДФ-диафоразы (эритроциты) и сукразы (тонкий кишечник), но не ограничены ими.
В некоторых воплощениях морфологический краситель может быть устойчивым к фотоактивируемому химическому обесцвечиванию, то есть фотореакция, включающая приведение морфологического красителя в контакт с реагентом переноса электрона и последующее облучение, может не оказывать существенного влияния на свойства генерирования сигнала морфологического красителя. В некоторых воплощениях, где биологический образец может быть окрашен зондом и морфологическим красителем в одно и то же время, обесцвечивание сигнала от зонда может не модифицировать сигнал от морфологического красителя. В некоторых воплощениях морфологический краситель можно использовать в качестве контроля для совместной регистрации молекулярной информации (полученной в результате повторяющихся стадий зондирования) и морфологической информации (полученной посредством морфологического окрашивания). В некоторых воплощениях морфологический краситель не модифицируется реагентом переноса электрона при облучении образца.
Приведение образца в контакт с одним или более чем одним контрольным зондом
В некоторых воплощениях контрольный зонд может быть связан с одной или более чем одной мишенью в биологическом образце. В некоторых воплощениях контрольный зонд может быть связан с мишенями вместе со стадией приведения в контакт с первым зондом. В некоторых воплощениях контрольный зонд может быть нанесен на биологический образец одновременно с первым зондом. В некоторых воплощениях контрольный зонд может быть нанесен на биологический образец последовательно, то есть до или после нанесения первого зонда, но до нанесения реагента переноса электрона и последующего облучения.
Контрольный зонд может содержать генератор сигнала, устойчивый к фотоактивируемому химическому обесцвечиванию, или свойства генерирования сигнала генератора сигнала по существу не подвергаются влиянию при контакте с реагентом переноса электрона и последующем облучении. Генератор сигнала может включать радиоактивный изотоп, устойчивый при воздействии реагента переноса электрона и облучения, или флуорофор, не модифицируемый химически при воздействии реагента переноса электрона и облучения. Подходящий радиоактивный изотоп может включать Р32, 3H, 14С, 125I или 131I. Подходящий флуорофор может включать DAPI.
В некоторых воплощениях подходящий генератор сигнала может быть соединен со связывающим агентом с образованием контрольного зонда. Например, радиоактивная метка может быть соединена с антителом с образованием контрольного зонда, а антитело может связываться с одним или более чем одним антигеном-мишенью, присутствующим в биологическом образце. В других воплощениях подходящий генератор сигнала может обладать способностью к связыванию с одной или более чем одной мишенью в образце, а также образовывать обнаружимый сигнал, устойчивый в присутствии реагента переноса электрона и во время облучения. Например, подходящий контрольный зонд может представлять собой DAPI, способный к связыванию с нуклеиновыми кислотами в образце, а также способный обеспечивать флуоресцентный сигнал, который по существу устойчив к фотоактивируемому химическому обесцвечиванию, то есть который по существу не модифицируется после добавления реагента переноса электрона и последующего облучения.
В некоторых воплощениях контрольный зонд можно использовать в способах, раскрытых в данном изобретении, для обеспечения показателя устойчивости мишеней к повторяющимся стадиям окрашивания. Например, контрольный зонд может быть связан с известной мишенью в образце, и сигнал от контроля наблюдают и определяют количественно. Затем можно следить за контрольным сигналом во время повторяющихся стадий окрашивания для обеспечения показателя устойчивости мишеней или связывающих агентов к реагенту переноса электрона и последующему облучению. В некоторых воплощениях за количественной мерой (например интенсивностью сигнала) можно следить, чтобы определить количество мишеней, присутствующих в образце, после повторяющихся стадий зондирования.
В некоторых воплощениях контрольный зонд можно использовать для получения количественной информации интересующего образца, например концентрации мишеней в образце или молекулярной массы мишеней в образце. Например, контрольная мишень (имеющая известную концентрацию или известную молекулярную массу) можно загружать вместе с интересующим образцом в методе блоттинга. Контрольный зонд можно связывать с контрольной мишенью и наблюдать контрольный сигнал. Затем контрольный сигнал можно коррелировать с сигналами, наблюдаемыми от интересующего образца, используя способы, раскрытые в данном изобретении ниже.
В некоторых воплощениях контрольный зонд можно использовать в способах, раскрытых в данном изобретении, для обеспечения совместной регистрации множественной молекулярной информации (полученной посредством повторяющихся стадий зондирования) и морфологической информации (полученной, например, с использованием DAPI). В некоторых воплощениях способы, раскрытые в данном изобретении, могут включать совместную регистрацию множественных флуоресцентных изображений со светлопольными морфологическими изображениями полученными, например, используя Н&Е. В некоторых воплощениях зонды, используемые на повторяющихся стадиях зондирования, могут не обладать какой-либо общей компартментальной информацией, которую можно использовать для регистрации изображений Н&Е. Контрольный зонд, подобный ядерному красителю DAPI, можно использовать для совместной регистрации ядер, окрашенных гематоксилином, в светлопольных изображениях с флуоресцентными изображениями. Флуоресцентные изображения и светлопольные изображения можно совместно регистрировать, используя алгоритмы регистрации изображений, которые можно сгруппировать в две категории: методы на основе интенсивности и на основе топологии.
Коррелированно первого сигнала и последующих сигналов
В некоторых воплощениях первый сигнал, последующий сигнал или первый сигнал и последующие сигналы можно анализировать для получения информации, касающейся биологического образца. Например, в некоторых воплощениях наличие или отсутствие первого сигнала может указывать на наличие или отсутствие первой мишени (способной связываться с первым связывающим агентом) в биологическом образце. Подобным образом, наличие или отсутствие второго сигнала может указывать на наличие или отсутствие второй мишени (способной связываться со вторым связывающим агентом). В воплощениях, где можно анализировать множественные мишени, используя множество зондов, наличие или отсутствие конкретного сигнала может указывать на наличие или отсутствие соответствующей мишени в биологическом образце.
В некоторых воплощениях стадии наблюдения могут включать количественное измерение по меньшей мере одной мишени в образце. В некоторых воплощениях значение интенсивности сигнала (например интенсивности флуоресценции) можно измерять и коррелировать с количеством мишени в биологическом образце. Корреляцию между количеством мишени и интенсивностью сигнала можно определить, используя калибровочные стандарты. В некоторых воплощениях значения интенсивности первого и второго сигналов можно измерять и коррелировать с соответствующими количествами мишени. В некоторых воплощениях путем сравнения интенсивностей двух сигналов можно установить относительные количества первой мишени и второй мишени (по отношению друг к другу или по отношению к контролю). Подобным образом, где можно анализировать множественные мишени, используя множественные зонды, относительные количества различных мишеней в биологическом образце можно определить путем измерения интенсивностей различных сигналов. В некоторых воплощениях можно использовать один или более чем один контрольный образец, как раскрыто в данном изобретении выше. Путем наблюдения наличия или отсутствия сигнала в образцах (интересующий биологический образец по сравнению с контролем) может быть получена информация, касающаяся биологического образца. Например, путем сравнения образца пораженной ткани по отношению к образцу нормальной ткани может быть получена информация, касающаяся мишеней, присутствующих в образце пораженной ткани. Подобным образом, путем сравнения интенсивностей сигнала между образцами (т.е. интересующим образцом и одним или более чем одним контролем) может быть получена информация, касающаяся экспрессии мишеней в образце.
В некоторых воплощениях стадии наблюдения включают совместную локализацию по меньшей мере двух мишеней в образце. Способы совместной локализации мишеней в образце раскрыты в заявке на патент США №11/686649, озаглавленной "System and Methods for Analyzing Images of Tissue Samples", поданной 15 марта 2007; в заявке на патент США №11/500028, озаглавленной "System and Method for Co-Registering Multi-Channel Images of a Tissue Micro Array", поданной 7 августа 2006; в заявке на патент США №11/606582, озаглавленной "System and Methods for Scoring Images of a Tissue Micro Array", поданной 30 ноября 2006, и в заявке на патент США №11/680063, озаглавленной "Automated Segmentation of Image Structures", поданной 28 февраля 2007, в настоящее время патенте США №8036462, опубликованном 11 октября 2011, каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки.
В некоторых воплощениях можно наблюдать локализацию сигнала в биологическом образце. В некоторых воплощениях можно наблюдать локализацию сигнала в биологическом образце, используя морфологические красители. В некоторых воплощениях можно наблюдать относительные локализации двух или более чем двух сигналов. Локализацию сигнала можно коррелировать с локализацией мишени в биологическом образце с получением информации, касающейся локализации различных мишеней в биологическом образце. В некоторых воплощениях можно коррелировать значение интенсивности сигнала и локализацию сигнала с получением информации, касающейся локализации различных мишеней в биологическом образце. Например, определенные мишени могут в большей степени экспрессироваться в цитоплазме по сравнению с ядром или наоборот. В некоторых воплощениях информация, касающаяся относительной локализации мишеней, может быть получена путем сравнения локализации и значений интенсивности двух или более чем двух сигналов.
В воплощениях, в которых используют методы блоттинга, стадии наблюдения могут включать наблюдение локализации сигнала на блоте. Затем локализацию сигнала на блоте можно коррелировать с калибровочными стандартами, загруженными в гель вместе с образцом, с получением информации, касающейся молекулярной массы мишеней в различных полосах. В некоторых воплощениях локализацию сигнала на блоте можно коррелировать с молекулярной массой мишени и изоэлектрической точкой мишени, например, в 2D-PAGE (двухмерном электрофорезе в полиакриламидном геле). В некоторых воплощениях структурные белки, такие как актин или тубулин, можно зондировать с использованием контрольных зондов в Вестерн-блоттингах, чтобы определить количество мишеней в образце.
В некоторых воплощениях одну или более чем одну стадию наблюдения или коррелирования можно выполнять, используя компьютерные средства. В воплощениях, где сигнал(ы) от генератора сигнала могут храниться в виде цифрового изображения(ий), можно проводить компьютерный анализ изображения(ий). В некоторых воплощениях изображения (например сигналы от зонда(ов) и морфологических красителей) можно налагать друг на друга, используя компьютерную программу совмещения, чтобы получить полную информацию о биологическом образце, например топологическую и корреляционную информацию.
В некоторых воплощениях один или более чем один из упомянутых выше способов может быть автоматизирован, и его можно выполнять, используя автоматизированные системы. В некоторых воплощениях все стадии можно выполнять, используя автоматизированные системы.
Способы, раскрытые в данном изобретении, могут находить применение в аналитических, диагностических и терапевтических областях применения в биологии и медицине. В некоторых воплощениях способы, раскрытые в данном изобретении, могут находить применение в гистохимии, в частности в иммуногистохимии. Анализ образцов клеток или тканей от пациента согласно способам, раскрытым в данном изобретении, можно применять диагностически (например, для идентификации пациентов, имеющих определенное заболевание, подвергнутых воздействию определенного токсина или хорошо реагирующих на определенное терапевтическое средство или трансплантат органа) и прогностически (например, для идентификации пациентов, для которых вероятно развитие определенного заболевания, вероятна хорошая реакция на определенное терапевтическое средство или прием определенного трансплантата органа). Способы, раскрытые в данном изобретении, могут способствовать точному и надежному анализу множества (например потенциально бесконечного числа) мишеней (например маркеров заболевания) от одного и того же биологического образца.
ПРИМЕРЫ
Приведенные ниже примеры предназначены только для иллюстрации способов и воплощений в соответствии с изобретением и как таковые не должны быть истолкованы как налагающие ограничения на формулу изобретения.
Пример 1. Фотоактивируемое химическое обесцвечивание цианиновых красителей: доза-ответ
К раствору Cy3 в PBS добавляли 2-60 эквивалентов соли трифенилбутилборат лития, и раствор облучали в течение 4 минут или в течение 10 минут. Для мониторинга фотоактивируемого химического обесцвечивания измеряли оптическую плотность при 550 нм и результаты наносили на график, как показано на Фиг. 1. Сплошной линией с квадратами изображена оптическая плотность A550 после облучения красителя Cy3 в течение 4 минут в присутствии различных концентраций трифенилбутилбората. Сплошной линией с ромбами изображена оптическая плотность Аб5о после облучения красителя Cy3 в течение 10 минут в присутствии различных концентраций трифенилбутилбората. Результаты демонстрируют, что степень обесцвечивания Cy3 возрастает при возрастании концентраций боратной соли.
Пример 2. Сравнение обесцвечивания Cy3 посредством Фотореакции и термического окисления
Сравнивали три способа обесцвечивания Cy3. Для реакции фотоактивируемого химического обесцвечивания Cy3 смешивали с солью трифенилбутилборат лития и облучали в течение 20 секунд. Для реакции термического окисления Cy3 смешивали с основным пероксидом водорода и облучали в течение 20 секунд. Для контрольной реакции Cy3 инкубировали с водой в течение 20 секунд. Цвет раствора Cy3 во всех трех реакциях сравнивали до и после каждой инкубации и/или реакции. Контрольная реакционная смесь не изменяет свой темно-розовый цвет. Цвет реакционной смеси при термическом окислении меняется с темно-розового на светло-розовый после 20 секунд термического окисления. Реакционная смесь при фотоактивируемом химическом обесцвечивании меняет цвет с темно-розового до бесцветного после 20 секунд облучения.
Пример 3. Фотоактивируемое химическое обесцвечивание Cy3 и Cv5 в тканях
Тканевые микрочипы (ТМА, Pantomics, № по каталогу MTU541C) окрашивали Cy3-конъюгированным цитокератином и Cy5-конъюгированным пан-кадгерином. Фотоактивируемое химическое обесцвечивание Cy3 и Cy5 осуществляли путем инкубации окрашенных ТМА с солью трифенилбутилборат лития и облучения в течение 2 минут. Изображения снимали на микроскопе Olympus до и после обесцвечивания. Изображения образцов, окрашенных Cy3-конъюгированным цитокератином, до и после обесцвечивания показаны на Фиг. 2. Изображения образцов, окрашенных Cy5-конъюгированным пан-кадгерином, до и после обесцвечивания показаны на Фиг. 3. Эти данные демонстрируют, что фотоактивируемое химическое обесцвечивание эффективно разрушает сигналы Cy3 и Cy5 в окрашенных тканях.
Пример 4. Фотоактивируемое химическое обесцвечивание BODIPY
Реакцию фотоактивируемого химического обесцвечивания BODIPY проводили в метаноле/воде со 100 мМ раствором соли трифенилбутилбората лития или без этого раствора. Облучение обоих образцов проводили в течение 2 минут, используя галогеновую лампу мощностью 100 Вт. Ярко-желтый цвет реакционного сосуда, содержащего BODIPY и трифенилбутилборатную соль, после облучения становится светло-желтоватым. На Фиг. 4 показан спектр флуоресценции реакционной смеси до облучения (неравномерно пунктирная линия) и после облучения (сплошная линия). Спектр флуоресценции демонстрирует полное гашение флуоресценции BODIPY в результате фотоактивируемого химического обесцвечивания. Ярко-желтый цвет реакционного сосуда, содержащего BODIPY без трифенилбутилборатной соли, сохраняет свой ярко-желтый цвет после облучения.
Пример 5. Фотоактивируемое химическое обесцвечивание родамина
Реакцию фотоактивируемого химического обесцвечивания родамина проводили в метаноле/воде со 100 мМ раствором соли трифенилбутилборат лития или без этого раствора. Облучение обоих образцов проводили в течение 2 минут, используя галогеновую лампу мощностью 100 Вт. Ярко-красный цвет реакционного сосуда, содержащего родамин и соль трифенилбутилборат лития, теряется после облучения. На Фиг. 5 показан спектр флуоресценции реакционной смеси до облучения (неравномерно пунктирная линия) и после облучения (сплошная линия). Спектр флуоресценции демонстрирует полное гашение флуоресценции родамина в результате фотоактивируемого химического обесцвечивания. Ярко-красный цвет реакционного сосуда, содержащего родамин без трифенилбутилборатной соли, сохраняет свой ярко-красный цвет после облучения.
Пример 6. Фотоактивируемое химическое обесцвечивание 1,3-дихлор-7-гидрокси-9,9-диметил-2(9Н)-акридинона (DDAO)
Реакцию фотоактивируемого химического обесцвечивания акридона проводили в метаноле/воде со 100 мМ раствором соли трифенилбутилборат лития или без этого раствора. Облучение обоих образцов проводили в течение 2 минут, используя галогеновую лампу мощностью 100 Вт. Коричневый цвет реакционной смеси становится желтым после облучения. На Фиг. 6 показан спектр флуоресценции реакционной смеси до облучения (неравномерно пунктирная линия), после 1 мин облучения (сплошная линия) и после 2 минут облучения (равномерно пунктирная линия). Спектр флуоресценции также демонстрирует неполное гашение флуоресценции DDAO при ограниченном периоде времени, используемом для облучения. Коричневый цвет реакционного сосуда, содержащего DDAO без трифенилбутилборатной соли, сохраняет свой коричневый цвет после облучения.
Хотя показано и описано конкретное воплощение настоящего изобретения, специалистам в данной области техники очевидно, что могут быть произведены изменения и модификации без отклонения от идей изобретения. Материал, изложенный в приведенном выше описании и сопроводительных графических материалах, предложен только в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения. Действительный объем изобретения определен в следующей формуле изобретения при рассмотрении ее в правильном ракурсе на основании предшествующего уровня техники.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ И АППАРАТ ДЛЯ ПРОЦЕССА ВОССТАНОВЛЕНИЯ АНТИГЕНА | 2010 |
|
RU2538022C2 |
| СПОСОБЫ КЛАССИФИКАЦИИ ПАЦИЕНТОВ С СОЛИДНЫМ РАКОМ | 2017 |
|
RU2745730C2 |
| БЫСТРЫЙ БИОСЕНСОР СО СЛОЕМ РЕАГЕНТА | 2007 |
|
RU2482495C2 |
| РЕПРЕЗЕНТАТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА | 2016 |
|
RU2743169C2 |
| ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОДИНОЧНЫХ МИШЕНЕЙ | 2010 |
|
RU2566714C2 |
| Высокопроизводительный скрининг соединений, модулирующих экспрессию клеточных макромолекул | 2012 |
|
RU2612017C2 |
| ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ | 2011 |
|
RU2550925C2 |
| СИСТЕМА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ НАЛИЧИЯ АНАЛИТА В ЖИДКОМ ОБРАЗЦЕ | 2011 |
|
RU2653451C2 |
| МУЛЬТИПЛЕКСНЫЕ АНАЛИЗЫ НА ОСНОВЕ АПТАМЕРОВ | 2013 |
|
RU2666989C2 |
| СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕОПЛАЗМ-II | 2008 |
|
RU2565540C2 |
Изобретение относится к области медицины. Предложены способы зондирования множественных мишеней в биологическом образце, включающие использование фотоактивируемого химического обесцвечивания для обнаружения множественных мишеней в биологическом образце. Способы включают: связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце, содержащей множественные мишени; обнаружение сигнала от по меньшей мере,одного связанного зонда; приведение образца, содержащего связанный зонд, в контакт с реагентом переноса электрона; облучение образца, связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце; обнаружение сигнала от зонда. Также предложен способ получения серии по меньшей мере двух изображений, показывающих оптически меченные биологические мишени. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 пр.
1. Способ зондирования множественных мишеней в биологическом образце, включающий:
(а) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в биологическом образце, содержащем множественные мишени;
(б) обнаружение сигнала от по меньшей мере одного зонда, связанного на стадии (а);
(в) приведение образца, содержащего связанный зонд со стадии (а), в контакт с реагентом переноса электрона, где реагент переноса электрона представляет собой боратную соль, представленную следующей структурной формулой:
,
где:
каждый из R1, R2 и R3 представляет собой фенил;
R4 представляет собой C1-С6алкил; и
М+ представляет собой неорганический катион, выбранный из группы, состоящей из Li+, Na+ или K+;
(г) облучение образца со стадии (в);
(д) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце со стадии (г); и
(е) обнаружение сигнала от зонда, связанного на стадии (д).
2. Способ по п. 1, где зонд на стадии (а) содержит генератор оптического сигнала, и сигнал, наблюдаемый на стадии (б), представляет собой оптический сигнал.
3. Способ по п. 2, где зонд на стадии (а) содержит генератор флуоресцентного сигнала, и сигнал, наблюдаемый на стадии (б), представляет собой флуоресцентный сигнал.
4. Способ по п. 1, где облучение образца на стадии (г) осуществляют в присутствии буфера при рН 5-9.
5. Способ по п. 1, где облучение образца на стадии (г) осуществляют посредством воздействия на образец светом с длиной волны от 350 нм до 1,3 мкм.
6. Способ по п. 5, где облучение образца на стадии (г) осуществляют посредством воздействия на образец светом с длиной волны 400-700 нм.
7. Способ по п. 1, где каждый из R1, R2 и R3 представляет собой фенил, R4 представляет собой бутил, и боратная соль представляет собой трифенилбутилборатную соль.
8. Способ по п. 1, где стадии (в)-(е) повторяют один или более чем один раз.
9. Способ по п. 1, где и зонд на стадии (а) и зонд на стадии (д) содержат генератор сигнала, где генератор сигнала на стадии (а) отличается от генератора сигнала на стадии (д).
10. Способ зондирования множественных мишеней в биологическом образце, включающий:
(а) связывание множественных зондов с множественными мишенями, присутствующими в биологическом образце, где множественные зонды включают первый набор зондов и второй набор зондов;
(б) обнаружение первого набора сигналов от первого набора зондов, связанных на стадии (а);
(в) приведение образца, содержащего связанный зонд со стадии (а), в контакт с реагентом переноса электрона, где реагент переноса электрона представляет собой боратную соль, представленную следующей структурной формулой:
,
где:
каждый из R1, R2 и R3 представляет собой фенил;
R4 представляет собой C1-С6алкил; и
М+ представляет собой неорганический катион, выбранный из группы, состоящей из Li+, Na+ или K+;
(г) облучение образца со стадии (в);
(д) генерирование второго набора сигналов от второго набора зондов, связанных на стадии (а);
(е) обнаружение второго набора сигналов.
11. Способ по п. 1, где облучение образца на стадии (г) инициирует фотореакцию, по существу инактивирующую генератор сигнала путем фотоактивируемого химического обесцвечивания.
12. Способ по п. 1, где после стадии (г) не наблюдается обнаружимый сигнал.
13. Способ получения серии из по меньшей мере двух изображений, показывающих оптически меченные биологические мишени, где:
изображения получают в процессе зондирования множественных мишеней в биологическом образце, включающем:
(а) связывание по меньшей мере одного оптического зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в биологическом образце, содержащем множественные мишени;
(б) наблюдение сигнала от оптического зонда, связанного на стадии (а);
(в) приведение образца, содержащего связанный оптический зонд со стадии (а), в контакт с реагентом переноса электрона, где реагент переноса электрона представляет собой боратную соль, представленную следующей структурной формулой:
,
где:
каждый из R1, R2 и R3 представляет собой фенил;
R4 представляет собой С1-С6алкил; и
М+ представляет собой неорганический катион, выбранный из группы, состоящей из Li+, Na+ или K+;
(г) облучение образца со стадии (в);
(д) связывание по меньшей мере одного оптического зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце со стадии (г); и
(е) наблюдение сигнала от оптического зонда, связанного на стадии (д).
| US 2006083688 A1, 20.04.2006 | |||
| US 2008118944 A1, 22.05.2008 | |||
| US 2009263612 A1, 22.10.2009. |
