СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ ИНФЕКЦИОННОГО ГЕНЕЗА НА РАННИХ СРОКАХ ГЕСТАЦИИ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/53 

Настоящее изобретение относится к акушерству и касается прогнозирования угрозы невынашивания инфекционного генеза на ранних сроках гестации.

Беременность - это сложный уникальный процесс из множества иммунорегуляторных механизмов для обеспечения защиты полуаллогенного плода от иммунной системы матери, одновременно защищая организм матери от различных патогенов. Известно, что при физиологически протекающей беременности происходит супрессия адаптивного иммунитета, сопровождающаяся активацией врожденного иммунитета. (Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Ганковская О.А. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет, Москва, «ГЭОТАР-Медиа», 2007, с. 176).

Формирование баланса про- и противовоспалительных цитокинов является необходимым для нормального течения беременности. На данный момент основными причинами невынашивания считаются инфекции, передаваемые половым путем, и иммунные нарушения в организме женщины (Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. Москва. Триада-Х, 2000, с. 50). При наличии инфекции в организме беременной женщины цитокиновый баланс смещается в сторону провоспалительных цитокинов, увеличивается их продукция, что ведет к цитокин-опосредованной продукции простагландинов в высокой концентрации, вызывающих гипертонус миметрия матки.

Известен способ прогнозирования невынашивания беременности на ранних сроках инфекционного генеза (RU 2341799, С1, 20.12.2008), в котором у беременных женщин с выявленной урогенитальной инфекцией в 1 и 2 триместрах определяют уровень интерлейкина 12 (ИЛ-12) в слизи цервикального канала. При значении уровня ИЛ-12 выше 102,0 пг/мл прогнозируют высокий риск невынашивания беременности в 1 и 2 триместрах. Недостатком данного метода является взятие материала для исследования из цервикального канала.

Известен способ прогнозирования невынашивания беременности на ранних сроках инфекционного генеза (RU 2281504, С1, 10.08.2006), в котором у беременных женщин 1 триместра с верифицированной урогенитальной инфекцией проводят одновременное определение в сыворотке периферической крови и цервикальной слизи неоптерина, который является ранним маркером клеточной активации, является индикатором воспалительного процесса инфекционного генеза. При значении неоптерина в крови выше 3,2±0,7 нг/мл, в цервикальной слизи выше 10,1±6,4 нг/мл, прогнозируют высокий риск невынашивания беременности в 1 триместре. Недостатком данного метода является взятие материала для исследования из цервикального канала.

На данный момент известен способ прогнозирования невынашивания беременности в ранние сроки (RU 2501017, С1, 10.12.2013). У беременных женщин с выявленной урогенитальной инфекцией в 1 триместре проводят определение в слизи цервикального канала уровня хемокина макрофагов MIP-1α. При значении уровня MIP-1α в цервикальной слизи выше 36,9 пг/мл прогнозируют высокий риск невынашивания беременности в 1 триместре. Однако в данной работе отсутствуют референтные значения MIP-1α, кроме того, при одинаковых значениях авторы прогнозируют как угрозу выкидыша, так и нормальное течение. Недостатком данного метода является также взятие материала для исследования из цервикального канала.

Данный способ принят нами за прототип.

Из вышеизложенного очевидно, что на сегодняшний день основными недостатками способов прогнозирования невынашивания беременности является взятие материала для исследования из цервикального канала, что может спровоцировать прерывание беременности, а так же отсутствие референтных значений показателей цитокинов и хемокинов, что затрудняет прогноз угрозы прерывания беременности.

Указанные недостатки устраняются в заявленном способе.

Первая линия защиты против вирусной инфекции опосредована IFNs, которые продуцируются в кратчайшие сроки в ответ на инфекцию. В последнее время активно изучается группа IFN III типа (IFN-λ), включающая в себя IFN-λ1, IFN-λ2, и IFN-λ3 (IL-29, IL-28A, или IL-28B соответственно) (Gilles . IL-28 and IL-29: Newcomers to the interferon family // Biochimie V. 89, Issues 6-7, 2007, P. 729-734).

IFN-λ, помимо противовирусной активности обладает иммуномодулирующими свойствами. IFN-λ, выступает в роли аутокринного сигнала для усиления противовирусного ответа дендритными клетками путем увеличения продукции IFN-α и IFN-λ, что обеспечивает выживаемость и функциональность плазмацитоидных ДК. Кроме того, IFN-λ, продуцируется ДК более пролонгировано для реализации длительной противовирусной защиты (Yin Z, Dai J, Deng J, Sheikh F. Type III IFNs are produced by and stimulate human plasmacytoid dendritic cells // 2012. J.Immunol. v. l89(6) p. 2735-45).

Нами была поставлена задача поиска статистически значимого маркера прогнозирования угрозы невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации, связанного с IFNλ3 (IL-28B) типа.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение точности прогнозирования угрозы невынашивания за счет использования в качестве количественного показателя увеличение концентрации цитокина IL-28В.

На первом этапе была обследована группа женщин с физиологически протекающей беременностью в I триместре и установлена норма концентрации IL-28B в сыворотке крови (Табл. 1).

При исследовании группы женщин с угрозой прерывания беременности инфекционного генеза ранних сроков гестации нами впервые было выявлено, что увеличение содержания цитокина IL-28B в сыворотке крови выше 261,4 пг/мл ассоциировано с выкидышем в первом триместре (Табл. 1). Повышенная концентрация IL-28B приводит к гиперпродукции IFN I типа, провоспалительных цитокинов и простагландинов. Это в свою очередь вызывает гипертонус матки и выкидыш.

Выявленные нами прогностические признаки оказались пригодными для клинических целей - прогнозирования невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации и, соответственно, своевременной коррекции ведения беременных.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для прогнозирования невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации в сыворотке крови беременных со сроком 6-11 недель гестации с помощью иммуноферментного анализа определяют уровень интерфероноподобного цитокина IL-28B. При концентрации IL-28B выше 261,4 пг/мл по сравнению с концентрацией, установленной для физиологически протекающей беременности, прогнозируют угрозу выкидыша в первом триместре гестации.

Способ осуществляется следующим образом.

Для изучения уровня IL-28B в сыворотке крови была использована следующая методика, которая включала в себя несколько последовательных этапов: забор венозной крови путем пункции локтевой вены, получение сыворотки крови, постановка иммуноферментного анализа.

Взятие венозной крови и получение сыворотки крови проводят общепринятым способом.

Для определения концентрации IL-28B в сыворотке крови применяли набор для иммуноферментного определения IL-28B человека ELISA Kit for Interleukin 28В (Cloud-Clone Corp., USA) «Сэндвич»-методом строго по протоколу фирмы-производителя.

Для этого готовили серию разведений стандартов IL-28B путем разведения стандарта, прилагаемого в наборе. Разведение стандартов соответствовало следующим концентрациям - от 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62.5 pg/mL, 31.25 pg/mL, 15.625 pg/mL и 7.813 pg/mL для построения калибровочной кривой. Далее вносили по 100 μL стандартов и образцов в соответствующие лунки, плашку закрывали адгезивной пленкой, инкубировали 2 часа при 37°C. Далее удаляли пленку, опустошали планшет и просушивали постукиванием по фильтровальной бумаге. Готовили рабочую концентрацию детектирующих реагентов, для чего прилагаемые в наборе Detection Reagent А и Detection Reagent В разводили Assay Diluent А и Assay Diluent В соответственно в соотношении 1:100. Далее добавляли в лунки по 100 μL Detection Reagent А, закрывали пленкой, инкубировали 1 час при 37°C. После инкубации удаляли пленку, в каждую лунку добавляли по 350 μL wash-буфера мультиканальной пипеткой. Отмывку повторяли 3 раза. Затем по 100 μL добавляли Detection Reagent В в рабочей концентрации, закрывали пленкой и инкубировали 30 минут при 37°C. Далее пленку удаляли, плашку опустошали и проводили отмывку wash-буфером 5 раз. После отмывки в каждую лунку добавляли 90 μL конъюгата стрептавидин-пероксидазы (ТМВ Substrate). Закрывали пленкой, инкубировали 25 мин при 37°C при темноте. Затем для остановки реакции в каждую лунку добавляли по 50 μL Stop-реагент. Измерение оптической плотности при 450 nm, построение калибровочной кривой и вычисление концентрации проводят с помощью микропланшетного ридера Anthos 2020 (БиоХимМак, РФ).

В Таблице 1 представлен уровень цитокина IL-28B в сыворотке крови при физиологическом течении беременности и при невынашивании инфекционного генеза на ранних сроках гестации.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример 1

Беременная Р., 34 лет. Наблюдается в женской консультации с диагнозом физиологически протекающая беременность, 12 недель. Данная беременность первая. Menarche в 14 лет, установились сразу, по 5 дней, ч/з 29 дней, регулярные, умеренные, безболезненные. Гинекологические заболевания - эктопия шейки матки. Из анамнеза: в детстве - ветряная оспа, краснуха. Результаты клинико-лабораторного обследования - в пределах нормы. АД - в пределах нормы. Соматические заболевания отрицает. Амбулаторно обследована на урогенитальную инфекцию методом ПЦР-диагностики - отрицательно.

У данной беременной уровень цитокина IL-28B в сыворотке крови составил 162,19 [пг/мл]. Таким образом, у этой беременной женщины с физиологическим течением гестации прогностический показатель находится в пределах нормы. Невынашивания беременности не прогнозируется. Осложнений беременности в дальнейшем не выявлено.

Пример 2

Беременная, И. 27 лет поступила в гинекологическое отделение с диагнозом: Беременность 10-11 недель. Начавшийся самопроизвольный выкидыш. Предъявляла жалобы на тянущие боли внизу живота, кровяные выделения из половых путей. Из анамнеза: данная беременность первая. Menarche (первая менструация) в 14 лет, установились через 1 год, по 4 дня, ч/з 30 дней, регулярные, умеренные, болезненные. Обследована на УГИ: обнаружен HPV 16/18/32, Herpes simplex virus 2. Из анамнеза: в детстве - краснуха, ветряная оспа; гастрит. Гинекологический анамнез: эрозия шейки матки, кондиломы. По УЗИ - беременность 10-11 недель. Гипертонус миометрия.

Несмотря на терапию, направленную на пролонгирование беременности, через три дня пациентка отмечала усиление схваткообразных болей внизу живота и кровяных выделений, со сгустками. Диагностирован аборт в ходу, произведено удаление остатков плодного яйца.

Уровень IL-28B составил 343,7 [пг/мл]. Увеличение концентрации цитокина IL-28B в 2,2 раза.

Вывод: по сравнению с группой здоровых беременных женщин у пациентки И. выявлено достоверное повышение уровня противовирусного цитокина в сыворотке крови при наличии урогенитальной инфекции вирусного генеза. Было прогнозировано развитие выкидыша, который состоялся на 11 неделе гестации. Прогноз был подтвержден.

Пример 3

Беременная, З. 35 лет, поступила в гинекологическое отделение 1ГКБ с жалобами на головокружение, обильные кровяные выделения из половых путей, схваткообразные боли внизу живота. Выставлен диагноз: Аборт в ходу при беременности 9-10 недель. Привычное невынашивание. Произведено удаление остатков плодного яйца. Из анамнеза: беременность третья, протекала с угрозой прерывания, проводилась терапия, направленная на пролонгирование беременности (дюфастон, магнеВ6, валериана). В сроке 5-6 недель перенесла ОРВИ с повышением температуры до 37.2, лечилась народными средствами. Первая беременность в 2006 г закончилась самопроизвольным выкидышем на сроке 8-9 недель. Вторая в 2007 г. - неразвивающаяся беременность на сроке 6-7 недель. Menarche в 13 лет, установились сразу, по 5 дней, ч/з 28 дней, регулярные, умеренные, безболезненные. Обследована на УГИ: обнаружена Ureaplasma urealiticum, лечение не проводилось. Из анамнеза: в детстве - краснуха, ветряная оспа; хронический тонзиллит.

Несмотря на терапию, направленную на пролонгирование беременности, в дальнейшем пациентка отмечала усиление боли внизу живота и кровяных выделений. Диагностирован аборт в ходу, произведено удаление остатков плодного яйца.

Уровень IL-28B составил 471,54 [пг/мл]. Увеличение концентрации цитокина IL-28B в 3 раза.

Вывод: по сравнению с группой здоровых беременных женщин у пациентки 3. выявлено достоверное увеличение содержания цитокина IL-28B при наличии урогенитальной инфекции. Было прогнозировано развитие выкидыша, который состоялся на 12 неделе гестации.

Пример 4

Беременная, Б. 28 лет поступила в отделение гинекологии 1РД с диагнозом: Беременность 8-9 недель. Токсикоз средней ст. тяжести. Жалобы на слабость, тошноту, рвоту до 8 раз в сутки, снижение веса на 4 кг. Из анамнеза: беременность вторая. Первая в 2013 г - закончилась самопроизвольным выкидышем на сроке 7/8 нед. Menarche в 12 лет, установились сразу, по 6-7 дней, ч/з 28-30 дней, умеренные, безболезненные. Эктопия шейки матки с 2010 г. Обследована на УГИ: обнаружен HPV 16/18/32, Herpes simplex virus 2. Лечение не проводилось. Из анамнеза: в детстве - ветряная оспа; хронический гастрит. По УЗИ - Беременность 8-9 недель, гипертонус миометрия. Проводилась противорвотная, инфузионная, седативная терапия.

Уровень IL-28B составил 324,43 [пг/мл]. Увеличение концентрации цитокина IL-28B в 2,1 раза.

Вывод: по сравнению с группой здоровых беременных женщин у пациентки Б. выявлено достоверное увеличение содержания цитокина IL-28B при наличии урогенитальной инфекции вирусного генеза. Было прогнозировано развитие выкидыша. Несмотря на терапию, выкидыш состоялся на 10 неделе гестации. Прогноз был подтвержден.

В результате проведенных исследований по оценке показателей врожденного иммунитета в группе 18 беременных с угрозой прерывания беременности, мы прогнозируем развитие выкидыша с вероятностью 66,6%. Кроме того, среди исследуемых женщин 80% всех выкидышей произошло на сроке 6-7 и 10-11 недель беременности.

Таким образом, данный способ малоинвазивен, удобен и прост в применении, достаточно информативен и имеет высокую достоверность прогноза невынашивания беременности инфекционного генеза ранних сроков гестации. Заявленное изобретение позволяет решать важную практическую задачу раннего прогнозирования угрозы невынашивания беременности в I триместре, что важно в практическом отношении, и основано на конкретных показателях. Использование данного способа будет способствовать более быстрой и безопасной диагностике угрозы прерывания беременности инфекционного генеза в I триместре.

Настоящее изобретение относится к акушерству и касается прогнозирования угрозы невынашивания инфекционного генеза на ранних сроках гестации. Сущность способа: в сыворотке крови беременных со сроком 6-11 недель гестации с помощью иммуноферментного анализа определяют уровень интерфероноподобного цитокина IL-28B. При концентрации IL-28B выше 261,4 пг/мл по сравнению с концентрацией, установленной для физиологически протекающей беременности, прогнозируют угрозу выкидыша в первом триместре гестации. Изобретение обеспечивает повышение точности прогнозирования угрозы невынашивания за счет использования в качестве количественного показателя увеличение концентрации цитокина IL-28B. Способ малоинвазивен, удобен и прост в применении, достаточно информативен и имеет высокую достоверность прогноза. Использование данного способа будет способствовать более быстрой и безопасной диагностике угрозы прерывания беременности инфекционного генеза в I триместре. 1 табл., 4 пр.

Способ прогнозирования невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации, отличающийся тем, что в сыворотке крови беременных со сроком 6-11 недель гестации с помощью иммуноферментного анализа определяют уровень интерфероноподобного цитокина IL-28B и при его концентрации выше 261 пг/мл прогнозируют угрозу выкидыша в первом триместре гестации.