СПОСОБ КОНЕЧНОЙ ИНАКТИВАЦИИ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2017 года по МПК A61L2/04 A61L2/20 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу инактивации патогенных микроорганизмов и, в частности, к способу конечной инактивации патогенных микроорганизмов.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Биопродуктами являются продукты, получаемые с помощью традиционных методик или современных биотехнологий из микроорганизмов, клеток, тканей и биологических жидкостей животных или человека и т. д. в качестве исходных материалов для профилактики, терапии и диагностики заболеваний человека. Препараты крови, принадлежащие к биопродуктам, в основном относятся к биологически активным препаратам, полученным с помощью биологических способов или методик разделения и очистки из здоровой крови человека в качестве исходного материала, включающим сывороточный альбумин человека, альбумин, полученный из плаценты человека, иммуноглобулин человека для внутривенной инъекции, иммуноглобулин человека для внутримышечной инъекции, комплекс гистамина и иммуноглобулина человека, специфический иммуноглобулин против гепатита B и бешенства, иммуноглобулин против столбняка, фактор свертывания крови человека VIII, концентрат протромбинового комплекса человека, человеческий фибриноген, антилимфоцитарный иммуноглобулин и т. д. Препараты крови, для целей лечения и пассивной иммунизации, играют незаменимую роль при оказании неотложной медицинской помощи, спасении раненых на войне и предупреждении и лечении некоторых специфических заболеваний.

Поскольку препараты крови получают из плазмы человека, обычно путем смешивания множества порций плазмы с последующей обработкой с помощью определенной технологии разделения и очистки, заболевания, передаваемые через кровь, теоретически могут распространяться через препараты крови. В настоящее время распространенные вирусы, переносимые и распространяемые препаратами крови, в основном включают HBV, HCV, HIV и HTLV-1, CMV, EBV, HAV, парвовирусы и т. д.

Для того, чтобы улучшить безопасность препаратов крови в соответствии с требованиями соответствующих руководства и принципа, способ получения препаратов крови должен характеризоваться способностью к удалению/инактивации некоторых вирусов, и должны существовать конкретные подходы для удаления/инактивации вирусов, доступные в ходе получения. Подходы к инактивации вирусов для препаратов крови классифицируют на физическую инактивацию и химическую инактивацию. Физическая инактивация обычно включает пастеризацию, сухожаровую обработку, облучение γ-лучами и облучение коротковолновыми ультрафиолетовыми лучами. Химическая инактивация обычно включает обработку органическим растворителем/дезинфицирующим средством (S/D), инкубирование при низком pH, инактивацию каприлатом и фотохимическую обработку. Химическая инактивация оказывает хороший эффект только на вирусы с липидной оболочкой, но в то же время очень незначительный на вирусы без липидной оболочки; кроме того, при химической инактивации необходимо добавить один или несколько биохимических реагентов, что обуславливает сомнительную долгосрочную безопасность (Song Qingshuang, et al., Progress of Virus Inactivation and Removal Process for Blood Products, Letters in Biotechnology, 2012, No. 04). Большинство биопродуктов перерабатывают в конечные продукты путем сублимационной сушки в вакууме. Инактивация путем сухожаровой обработки представляет собой возможный способ конечной инактивации.

Существующий способ конечной инактивации путем сухожаровой обработки, где продукт сублимационной сушки в вакууме инактивируют путем сухожаровой обработки в условиях вакуума, характеризуется хорошим эффектом инактивации в отношении вирусов с липидной оболочкой, такие как HBV, но недостаточным эффектом инактивации в отношении высокотермостабильных вирусов с липидной оболочкой, в частности в отношении парвовирусов. Например, такие исследователи, как Roberts и соавт., показали, что различные вирусы без липидной оболочки обладают различной термостабильностью при одинаковых условиях обработки, только 2,2 log PPV могут быть инактивированы при сухожаровой обработке при 80°C даже в течение 72 ч. В докладе Kim и соавт. показано, что титр PPV (парвовирусов свиней) снижался всего лишь до 1,90 log посредством обработки концентратом FVIII на водяной бане при 100°C в течение 30 мин. В работе Xiang Qingqun et al., Effects of Final Dry-heating on Non-enveloped Viruses in Coagulation Factor Concentrate, Foreign Medical Sciences, Section of Bilogics for Prophylaxis, Diagnosis and Therapy, 1995, No. 06, отмечалось, что после добавления в SD-инактивированный FVIII высокой степени чистоты и последующей сублимационной сушки CPV (парвовирусы человека) подвергали сухожаровой обработке в вакууме при остаточной влажности менее 2%, и только 2,1 log CPV инактивировалось при обработке при 80°C в течение 72 ч или при 90°C в течение 10 ч.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для решения вышеизложенных проблем настоящее изобретение предусматривает новый способ конечной инактивации патогенных микроорганизмов.

Настоящее изобретение предусматривает способ конечной инактивации патогенных микроорганизмов, включающий следующие этапы:

a) сублимационную сушку в вакууме биопродукта, упакованного в контейнер, подачу газа и запечатывание с получением конечного продукта и

b) осуществление инактивации путем сухожаровой обработки.

Биопродуктами являются продукты, получаемые с помощью традиционных методик или современных биотехнологий из микроорганизмов, клеток, тканей и биологических жидкостей животных или человека и т. д. в качестве исходных материалов для профилактики, терапии и диагностики заболеваний человека, например, препараты крови.

Инактивация путем сухожаровой обработки представляет собой способ нагревания препаратов, подвергнутых сублимационной сушке, и инактивации патогенных микроорганизмов путем сухожаровой обработки.

Газ из этапа a) является инертным газом или неинертным газом.

Инертный газ представляет собой гелий, неон, аргон, криптон, ксенон или радон; а неинертный газ представляет собой азот, NO, NO₂, CO, CO₂, водяной пар, воздух, дезоксигенированный воздух, дегидрированный воздух, дезоксигенированный и дегидрированный воздух, кислород, водород, O₃, метан, ацетилен, этанол, метиловый эфир, пропан или бутан.

Азот представляет собой 99,999% азот.

На этапе a) величина давления подаваемого газа в контейнере составляет 0,4-1 атм. Предпочтительно, величина давления подаваемого газа в контейнере составляет 0,4-0,9 атм. Еще более предпочтительно, величина давления подаваемого газа в контейнере составляет 0,65-0,85 атм.

На этапе b) температура инактивации путем сухожаровой обработки составляет 0-130°C, а время обработки составляет 0-200 ч.

В тех случаях, когда температура составляет 60-110°C, время обработки составляет от 30 мин до 150 ч.

Предпочтительно, в тех случаях, когда температура составляет 80°C, время обработки составляет 18-140 ч; а в тех случаях, когда температура составляет 100°C, время обработки составляет 30-120 мин.

Еще более предпочтительно, в тех случаях, когда температура составляет 80°C, время обработки составляет 36-72 ч; а в тех случаях, когда температура составляет 100°C, время обработки составляет 60-90 мин.

Способ конечной инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением, может эффективно инактивировать вирусы без липидной оболочки с весьма исключительными эффектами инактивации, в частности, по отношению к парвовирусам, являясь в 10-1000 раз более эффективным по сравнению с существующим способом инактивации, и может в значительной степени улучшать безопасность биопродуктов; кроме того, для данного способа характерно короткое время обработки, уменьшение времени высокотемпературной инактивации вирусов на 10%-50% и значительное снижение производственных затрат, и поэтому он имеет хорошие перспективы промышленного применения.

Несомненно, в соответствии с вышеизложенным содержанием настоящего изобретения, модификации, замены или изменения во многих других формах могут быть осуществлены с помощью общих технических знаний и общеизвестных способов из уровня техники без отклонения от основных технических принципов настоящего изобретения, упомянутых выше.

Вышеизложенное содержание настоящего изобретения будет дополнительно подробно описано ниже с помощью конкретных путей реализации в виде вариантов осуществления. Однако нижеследующие отдельные случаи не должны считаться ограничениями объема вышеизложенного объекта настоящего изобретения. Все методики, осуществляемые с учетом вышеизложенного содержания настоящего изобретения, должны входить в объем настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1 показана кинетическая кривая, где PPV инактивируют при 80°C путем сухожаровой обработки (в сушильном шкафу); и

на фиг. 2 показана кинетическая кривая, где PPV инактивируют при 100°C путем сухожаровой обработки (на водяной бане).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Экспериментальные материалы

Материал 1: PPV: штамм AV30, предоставленный Китайским центром по хранению коллекций культур ветеринарных микроорганизмов и хранящийся с исходным титром 10,0 log TCID₅₀/мл при -70°C. Клетка для культивирования: клетка F81 (клеточный банк, Китайская академия наук). Титрование PPV: 0,50 TCID₅₀/0,1 мл определяли с помощью анализа CPE в 96-луночном планшете, и титр рассчитывали, исходя из его результатов по способу Карбера. Исходный титр ≥ 10⁶.

Материал 2: материалы в составах обычных реагентов или буферов: 0-25 ммоль/л цитрата натрия; 10-150 ммоль/л NaCl; 1-10% аминокислоты, которая является глицином, гистидином, лизином или их солями или аргинином или его солями; 1-5 ммоль/л растворимых солей кальция и 0,5%-5% альбумина (BSA).

Последующие биопродукты или материалы получали на основании способов, описанных или упомянутых в Liu Juanxiang. Blood Transfusion and Blood Products. People's Medical Publishing House, 1996.

Материал 3: фактор свертывания крови человека VIII в виде промежуточного продукта, полученный в соответствии с разделом "Улучшенный способ осаждения глицина" из доклада центра по разделению крови Армана Фрапье в Канаде, с альбумином и/или аминокислотой, действующими в качестве стабилизатора.

Материал 4: фактор свертывания крови человека VIII в виде промежуточного продукта, полученный согласно "Осаждению кислого гепарина", предложенному лабораторией по разделению белков плазмы крови и лабораторией препаратов крови в Элстри больницы Черчилль, Оксфорд, Великобритания, с альбумином и/или аминокислотой, действующими в качестве стабилизатора.

Материал 5: фактор свертывания крови человека VIII в виде промежуточного продукта, полученный согласно "Способам получения концентрата VIII высокой степени чистоты из DEAE-Fractogel TSK650M", предложенным в докладе Burnouf и соавт., из Франции, с альбумином и/или аминокислотой, действующими в качестве стабилизатора.

Материал 6: фактор свертывания крови человека VIII в виде промежуточного продукта, полученный путем растворения криопреципитатов в водном растворе, содержащем 3-10 МЕ/мл гепарина натрия, осаждения с помощью PEG, фильтрации в центрифуге, S/D-инактивации, абсорбции в колонке с DEAE-сефарозой Fast Flow или DEAE 650M, отмывки, элюирования, ультрафильтрации и концентрирования, с альбумином и/или аминокислотой, действующими в качестве стабилизатора.

Материал 7: человеческий фибриноген (Fg) в виде промежуточного продукта, полученный по способу Бломбека путем полного растворения криопреципитатов, абсорбции Al(OH)₃-гелем, фильтрации, инактивации вирусов с липидными оболочками с помощью S/D, осаждения с помощью PEG или глицина, ультрафильтрации и очистки с получением маточного раствора человеческого фибриногена (Fg), с альбумином и/или аминокислотой, действующими в качестве стабилизатора для получения человеческого фибриногена (Fg) (чистота ≥ 90%, и концентрация белка ≥ 40 мг/мл).

Материал 8: человеческий фибриноген (Fg) в виде промежуточного продукта, полученный согласно способам (способ низкотемпературного фракционирования этанолом по Коэну, для краткости), описываемым в Preparation and Properties of Serum and Plasma Protein, опубликованном E.J. Chon: путем полного растворения преципитатов FI, полученных согласно способу низкотемпературного осаждения этанолом по Кону, абсорбции Al(OH)₃-гелем, фильтрации, инактивации вирусов с липидной оболочкой с помощью S/D, повторного низкотемпературного осаждения этанолом, ультрафильтрации и очистки с получением маточного раствора человеческого фибриногена (Fg), с аминокислотой и/или альбумином, действующими в качестве стабилизатора для получения человеческого фибриногена в виде промежуточного продукта (чистота ≥ 90% и концентрация белка ≥ 40 мг/мл).

Материал 9: концентрат протромбинового комплекса человека (PCC) в виде промежуточного продукта, полученный путем абсорбции холодной надосадочной жидкости гелем DEAE-SephadexA50, отмывки, элюирования, фильтрации, инактивации вирусов с липидной оболочкой с помощью S/D, повторной абсорбции DEAE-сефарозой Fast Flow в виде геля для колонки (DEAE-сефароза Fast Flow), отмывки, элюирования, ультрафильтрации и очистки с получением маточного раствора концентрата протромбинового комплекса человека (PCC), с аминокислотой и/или альбумином, действующими в качестве стабилизатора для получения концентрата протромбинового комплекса человека в виде промежуточного продукта (специфическая активность ≥ 0,5 МЕ/мл и концентрация белка ≈ 30 мг/мл).

Материал 10: концентрат протромбинового комплекса человека (PCC) в виде промежуточного продукта, полученный путем абсорбции холодной надосадочной жидкости гелем DEAE-SephadexA50, отмывки, элюирования, фильтрации, инактивации вирусов с липидной оболочкой с помощью S/D, повторной абсорбции гелем DEAE-SephadexA50, отмывки, элюирования, ультрафильтрации и очистки с получением маточного раствора концентрата протромбинового комплекса человека (PCC), с аминокислотой и/или альбумином, действующими в качестве стабилизатора для получения концентрата протромбинового комплекса человека в виде промежуточного продукта (специфическая активность ≥ 0,5 МЕ/мл и концентрация белка ≈ 30 мг/мл).

Вышеизложенные биопродукты или материалы необходимо хранить при сверхнизкой температуре -70°C, если их не применяют немедленно.

Вариант осуществления 1. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Разлитый в бутылки материал 3 подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, прокалывали резиновую пробку, и подавали азот с высокой степенью чистоты (99,999%) для уравновешивания давления до 1 атм, и напоследок закупоривали с целью запечатывания, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Разлитый в бутылки материал 3 подвергали сухожаровой обработке (в сушильном шкафу) при 25°C в течение 200 ч.

Вариант осуществления 2. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Разлитый в бутылки материал 4 подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, прокалывали резиновую пробку, и подавали водяной пар для уравновешивания давления до 0,4 атм, и напоследок закупоривали с целью запечатывания, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Разлитый в бутылки материал 4 подвергали сухожаровой обработке (в сушильном шкафу) при 130°C в течение 1 мин.

Вариант осуществления 3. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Разлитый в бутылки материал 4 подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, прокалывали резиновую пробку, и подавали азот с высокой степенью чистоты (99,999%) для уравновешивания давления до 0,9 атм, и напоследок закупоривали с целью запечатывания, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Разлитый в бутылки материал 4 подвергали сухожаровой обработке (в сушильном шкафу) при 60°C в течение 150 ч.

Вариант осуществления 4. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Разлитый в бутылки материал 4 подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, прокалывали резиновую пробку, и подавали водород для уравновешивания давления до 0,65 атм, и напоследок закупоривали с целью запечатывания, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Разлитый в бутылки материал 4 подвергали сухожаровой обработке (в сушильном шкафу) при 110°C в течение 30 мин.

Вариант осуществления 5. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Разлитый в бутылки материал 4 подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, прокалывали резиновую пробку, и подавали CO₂ для уравновешивания давления до 0,851 атм, и напоследок закупоривали с целью запечатывания, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Разлитый в бутылки материал 4 подвергали сухожаровой обработке (в сушильном шкафу) при 60°C в течение 150 мин.

Вариант осуществления 6. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Материал 4 (фактор свертывания крови человека VIII в виде промежуточного продукта) подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, подавали in situ водород для уравновешивания давления до 1 атм и напоследок закупоривали с целью запечатывания, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Материал 4 подвергали сухожаровой обработке (в сушильном шкафу) при 110°C в течение 120 мин.

Вариант осуществления 7. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Разлитый в бутылки материал 5 подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, прокалывали резиновую пробку, и подавали аргон для уравновешивания давления до 0,4 атм, и напоследок закупоривали с целью запечатывания, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Разлитый в бутылки материал 5 подвергали сухожаровой обработке (в сушильном шкафу) при 80°C в течение 36 ч.

Вариант осуществления 8. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Разлитый в бутылки материал 6 подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, непосредственно подавали in situ азот с высокой степенью чистоты (99,999%) через стерильную трубку для уравновешивания давления до 0,65 атм и напоследок закупоривали с целью запечатывания, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Разлитый в бутылки материал 6 подвергали сухожаровой обработке (в сушильном шкафу) при 80°C в течение 48 ч.

Вариант осуществления 9. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Разлитый в бутылки материал 4 подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, непосредственно подавали in situ азот с высокой степенью чистоты (99,999%) через стерильную трубку для уравновешивания давления до 0,9 атм и напоследок закупоривали с целью запечатывания, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Разлитый в бутылки материал 4 подвергали сухожаровой обработке (в сушильном шкафу) при 80°C в течение 72 ч.

Вариант осуществления 10. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Разлитый в бутылки материал 7 подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, прокалывали резиновую пробку и подавали азот с высокой степенью чистоты для уравновешивания давления до 0,85 атм, закупоривали с целью запечатывания и закрывали колпачком, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Разлитый в бутылки материал 7 подвергали сухожаровой обработке (на водяной бане) при 100°C в течение 120 мин.

Вариант осуществления 11. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Разлитый в бутылки материал 8 подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, непосредственно подавали in situ ацетилен через стерильную трубку для уравновешивания давления до 1 атм, закупоривали с целью запечатывания и закрывали колпачком, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Разлитый в бутылки материал 8 подвергали сухожаровой обработке (на водяной бане) при 100°C в течение 120 мин.

Вариант осуществления 12. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Разлитый в бутылки материал 8 подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, непосредственно подавали in situ сжатый воздух через стерильную трубку для уравновешивания давления до 0,85 атм, закупоривали с целью запечатывания и закрывали колпачком, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Разлитый в бутылки материал 8 подвергали сухожаровой обработке (на водяной бане) при 100°C в течение 120 мин.

Вариант осуществления 13. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Разлитый в бутылки материал 9 подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, непосредственно подавали in situ сжатый воздух через стерильную трубку для уравновешивания давления до 0,65 атм, закупоривали с целью запечатывания и закрывали колпачком, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Разлитый в бутылки материал 8 подвергали сухожаровой обработке (на водяной бане) при 100°C в течение 120 мин.

Вариант осуществления 14. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Разлитый в бутылки материал 4 подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, прокалывали резиновую пробку и подавали NO₂ для уравновешивания давления до 0,9 атм, закупоривали с целью запечатывания и закрывали колпачком, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Разлитый в бутылки материал 4 подвергали сухожаровой обработке (в сушильном шкафу) при 100°C в течение 60 мин.

Вариант осуществления 15. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Разлитый в бутылки материал 4 подвергали сублимационной сушке в вакууме под действием вакуума 0,05 мбар, прокалывали резиновую пробку, и подавали азот с высокой степенью чистоты (99,999%) для уравновешивания давления до 1 атм, и напоследок закупоривали с целью запечатывания, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Разлитый в бутылки материал 4 подвергали сухожаровой обработке (на водяной бане) при 100°C в течение 90 мин.

Положительные эффекты настоящего изобретения будут описаны, как представлено ниже, посредством вариантов осуществления.

Вариант осуществления 1. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Парвовирусы свиней (PPV) в качестве вирусной модели равномерно смешивали с материалом 9, т.е. PCC в виде промежуточного продукта, путем инокуляции в количестве 10% (вес/вес) и затем подвергали сублимационной сушке в вакууме; а подвергнутые сублимационной сушке образцы разделяли на группы A и B, при этом группа A находилась в вакууме, а группу B обрабатывали согласно способу, предусматриваемому настоящим изобретением.

Группа A: образец закупоривали с целью запечатывания в камере под действием вакуума 0,05 мбар и закрывали колпачком, при этом измеренное содержание влаги в образце составляло ≤ 2%.

Группа B: под действием вакуума 0,05 мбар к разлитому в бутылки материалу обеспечивали доступ путем прокалывания резиновой пробки и подавали азот с высокой степенью чистоты до тех пор, пока давление в бутылке, определяемое миниатюрным электронным измерителем давления, не достигало 1 атм, закупоривали с целью запечатывания и закрывали колпачком, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Отбор образцов в процессе сухожаровой обработки при 100°C осуществляли в моменты времени 10 мин, 30 мин, 60 мин и 90 мин, соответственно; образцы охлаждали и хранили при -70°C для измерения титра PPV; и путем вычисления определяли сниженное значение титра вирусов как разность титра перед нагреванием и титра после нагревания в единицах log TCID₅₀/0,1 мл.

2. Результаты обработки

В таблице 1 показаны результаты определения титра PPV в обработанном PPC.

Таблица 1. Сниженные значения титра PPV

Тестовые группы Сниженные значения титра PPV при сухожаровой обработке (на водяной бане) при 100°C в различные моменты времени (TCID₅₀/0,1 мл) 0 мин 30 мин 60 мин 90 мин A 0 2,5 3,58 5,42 B 0 3,42 4,34 6,50 Log^-1（B－A） 0 10 10 10

Log TCID₅₀/0,1 мл, минимальный предел обнаружения вирусов в данном эксперименте: ≤ 0,50 log TCID₅₀/0,1 мл.

Как показано в таблице 1, в различные моменты времени при обработке сниженное значение титра парвовирусов в образце, обработанном согласно способу, предусматриваемому настоящим изобретением (группа B), было более чем в 10 раз меньшим по сравнению с таким значением согласно существующему способу (группа A); сниженное значение титра вирусов через 30 мин обработки согласно способу, предусматриваемому настоящим изобретением (группа B), было равным такому значению, полученному через 60 мин обработки согласно существующему способу (группа A). Таким образом, было показано, что время, необходимое для достижения таких же эффектов инактивации в способе, предусматриваемом настоящим изобретением, является намного меньшим, чем время, необходимое в существующем способе.

Результаты тестов показали, что способ, предусматриваемый настоящим изобретением, может инактивировать парвовирусы более эффективно и характеризуется коротким временем инактивации.

Вариант осуществления 2. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Парвовирусы свиней (PPV) в качестве вирусной модели равномерно смешивали с материалом 4, т. е. фактором свертывания крови человека VIII в виде промежуточного продукта, путем инокуляции в количестве 10% (вес/вес) и затем подвергали сублимационной сушке в вакууме; а подвергнутые сублимационной сушке образцы разделяли на группы A и B, при этом группа A находилась в вакууме, а группу B обрабатывали согласно способу, предусматриваемому настоящим изобретением.

Группа A: образец закупоривали с целью запечатывания в камере под действием вакуума 0,05 мбар и закрывали колпачком, при этом измеренное содержание влаги в образце составляло ≤ 2%.

Группа B: под действием вакуума 0,05 мбар к разлитому в бутылки материалу обеспечивали доступ путем прокалывания резиновой пробки и подавали азот с высокой степенью чистоты до тех пор, пока давление в бутылке, определяемое миниатюрным электронным измерителем давления, не достигало 0,85 атм, закупоривали с целью запечатывания и закрывали колпачком, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Отбор образцов в процессе сухожаровой обработки (в сушильном шкафу) при 80°C осуществляли в моменты времени 0 ч, 18 ч, 36 ч и 72 ч, соответственно; образцы охлаждали и хранили при -70°C для измерения титра PPV; и путем вычисления определяли сниженное значение титра вирусов как разность титра перед нагреванием и титра после нагревания в единицах log TCID₅₀/0,1 мл.

2. Результаты обработки

В таблице 1 и на фиг. 1 показаны сниженные значения титра PPV.

Таблица 2. Сниженные значения титра PPV при сухожаровой обработке (в сушильном шкафу) при 80°C в различные моменты времени

Тестовые группы Сниженные значения титра PPV при сухожаровой обработке (в сушильном шкафу) при 80°C в различные моменты времени (TCID₅₀/0,1 мл) 0 ч 18 ч 36 ч 72 ч A 0 0 1,34 2,58 B 0 2,50 4,34 5,58 Log^-1（B－A） / 316,23 1000,00 1000,00

Log TCID₅₀/0,1 мл, минимальный предел обнаружения вирусов в данном эксперименте: ≤ 0,50 Log TCID₅₀/0,1 мл.

Как показано в таблице 2 и на фиг. 1, в различные моменты времени при обработке сниженное значение титра парвовирусов в образце, обработанном согласно способу, предусматриваемому настоящим изобретением (группа B), было в 316-1000 раз меньшим по сравнению с таким значением согласно существующему способу (группа A); сниженное значение титра вирусов через 18 ч обработки согласно способу, предусматриваемому настоящим изобретением (группа B), было равным такому значению, полученному через 72 ч обработки согласно существующему способу (группа A). Таким образом, было показано, что время, необходимое для достижения таких же эффектов инактивации в способе, предусматриваемом настоящим изобретением, составляет 1/4 времени, необходимого в существующем способе.

Результаты тестов показали, что способ, предусматриваемый настоящим изобретением, может инактивировать парвовирусы более эффективно и характеризуется коротким временем инактивации.

Вариант осуществления 3. Способ инактивации патогенных микроорганизмов, предусматриваемый настоящим изобретением

1. Способ обработки

(1) Парвовирусы свиней (PPV) в качестве вирусной модели равномерно смешивали с материалом 4, т.е. фактором свертывания крови человека VIII в виде промежуточного продукта, путем инокуляции в количестве 10% (вес/вес) и затем подвергали сублимационной сушке в вакууме; а подвергнутые сублимационной сушке образцы разделяли на группы A и B, при этом группа A находилась в вакууме, а группу B обрабатывали согласно способу, предусматриваемому настоящим изобретением.

Группа A: образец закупоривали с целью запечатывания в камере под действием вакуума 0,05 мбар и закрывали колпачком, при этом измеренное содержание влаги в образце составляло ≤ 2%.

Группа B: под действием вакуума 0,05 мбар к разлитому в бутылки материалу обеспечивали доступ путем прокалывания резиновой пробки и подавали азот с высокой степенью чистоты до тех пор, пока давление в бутылке, определяемое миниатюрным электронным измерителем давления, не достигало 0,4 атм, закупоривали с целью запечатывания и закрывали колпачком, при этом измеренное содержание влаги составляло ≤ 2%.

(2) Отбор образцов в процессе сухожаровой обработки (на водяной бане) при 100°C осуществляли в моменты времени 10 мин, 30 мин, 60 мин и 90 мин, соответственно; образцы охлаждали и хранили при -70°C для измерения титра PPV; и путем вычисления определяли сниженное значение титра вирусов как разность титра перед нагреванием и титра после нагревания в единицах log TCID₅₀/0,1 мл.

2. Результаты обработки

В таблице 3 и на фиг. 2 показаны сниженные значения титра PPV.

Таблица 3. Сниженные значения титра PPV при сухожаровой обработке (на водяной бане) при 80°C в различные моменты времени

Тестовые группы Сниженные значения титра PPV при сухожаровой обработке (на водяной бане) при 80°C в различные моменты времени (TCID₅₀/0,1 мл) 0 мин 30 мин 60 мин 90 мин A 0 0,38 2,17 4,08 B 0 3,73 4,51 6,59 Log^-1（B－A） 0 2238,72 218,78 323,59

Log TCID₅₀/0,1 мл, минимальный предел обнаружения вирусов в данном эксперименте: ≤ 0,50 log TCID₅₀/0,1 мл.

Как показано в таблице 3 и на фиг. 2, в различные моменты времени при обработке сниженное значение титра парвовирусов в образце, обработанном согласно способу, предусматриваемому настоящим изобретением (группа B), было в 218-2238 раз меньшим по сравнению с таким значением согласно существующему способу (группа A); сниженное значение титра вирусов через 60 мин обработки согласно настоящему способу, предусматриваемому настоящим изобретением (группа B), было большим, чем такое значение через 90 мин обработки согласно существующему способу (группа A). Таким образом, было показано, что время, необходимое для достижения таких же эффектов инактивации в способе, предусматриваемом настоящим изобретением, является значительно меньшим, чем время, необходимое в существующем способе.

Результаты тестов показали, что способ, предусматриваемый настоящим изобретением, может инактивировать парвовирусы более эффективно и характеризуется коротким временем инактивации.

В заключение, конечная инактивация патогенных микроорганизмов, предусматриваемая настоящим изобретением, может эффективно инактивировать вирусы без липидной оболочки, такие как парвовирусы, и улучшать безопасность биопродуктов; кроме того, она характеризуется коротким временем инактивации, низкими производственными затратами и хорошими перспективами промышленного применения.

Изобретение относится к области медицины, а именно к дезинфекции и стерилизации, и предназначено для конечной инактивации патогенных микроорганизмов. Для осуществления способа выполняют: a) сублимационную сушку в вакууме препарата крови, упакованного в контейнер, подачу газа в контейнер и запечатывание с получением конечного продукта и b) инактивацию путем сухожаровой обработки при температуре 100°С. При этом время обработки составляет 60-90 мин, а сублимационную сушку и сухожаровую обработку осуществляют в одном и том же контейнере. Использование изобретения позволяет эффективно инактивировать патогенные микроорганизмы с исключительными эффектами инактивации и коротким временем инактивации. 10 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 ил., 3 пр.

1. Способ конечной инактивации патогенных микроорганизмов, включающий следующие этапы:

а) сублимационную сушку в вакууме препарата крови, упакованного в контейнер, подачу газа в контейнер и запечатывание с получением конечного продукта и

б) осуществление инактивации путем сухожаровой обработки, отличающийся тем, что инактивацию путем сухожаровой обработки осуществляют при температуре 100°С, при этом время обработки составляет 60-90 мин, а сублимационную сушку и сухожаровую обработку осуществляют в одном и том же контейнере.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что газ из этапа а) является инертным газом или неинертным газом.

3. Способ по п. 2 отличающийся тем, что инертный газ представляет собой гелий, неон, аргон, криптон, ксенон или радон; а неинертный газ представляет собой азот, NO, NO₂, СО, СО₂, водяной пар, воздух, дезоксигенированный воздух, дегидрированный воздух, дезоксигенированный и дегидрированный воздух, кислород, водород, О₃, метан, ацетилен, этанол, метиловый эфир, пропан или бутан.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что азот представляет собой 99,999% азот.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на этапе а) величина давления подаваемого газа в контейнере составляет 0,4-1 атм.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что величина давления подаваемого газа в контейнере составляет 0,4-1 атм.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что величина давления подаваемого газа в контейнере составляет 0,65-0,85 атм.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на этапе б) температура инактивации путем сухожаровой обработки составляет 0-130°С, а время обработки составляет 0-200 ч.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что в тех случаях, когда температура составляет 60-110°С, время обработки составляет от 30 мин до 150 ч.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что в тех случаях, когда температура составляет 80°С, время обработки составляет 18-140 ч; а в тех случаях, когда температура составляет 100°С, время обработки составляет 30-120 мин.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что в тех случаях, когда температура составляет 80°С, время обработки составляет 36-72 ч.