СПОСОБ КОНТАКТНОЙ СУШКИ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1994 года по МПК F26B5/16 

Изобретение относится к технологии производства препаратов, а именно к производству сухих микробных препаратов.

Высушивание является наиболее популярным методом консервации микроорганизмов при приготовлении препаратов широкого применения, пpедназначенных для хранения в обычном бытовом холодильнике (0. . . 4^оС) или при комнатной температуре. Изредка в практике музейного хранения культур микроорганизмов используется также метод консервации под слоем масла, которое обеспечивает защиту от воздействия кислорода. Однако препараты, полученные таким способом, хранятся хуже сухих и менее удобны в работе.

Ряд известных способов приготовления сухих препаратов включает стадию диспергирования высушиваемого объекта в гидрофобной жидкости с целью увеличения поверхности испарения и повышения эффективности теплоотвода, а в случае сублимационной сушки - увеличения скорости замораживания при диспергировании в холодной жидкости. Тепловые методы сушки, в том числе с использованием микроволнового нагрева, мало пригодны для получения микробных биопрепаратов, так как приводят к сильной инактивации микроорганизмов. Основной недостаток сублимационной сушки - высокая сложность аппаратурного оформления; кроме того, полученный препарат обычно обладает очень высокой гигроскопичностью. Наконец, все методы этой группы связаны с определенными потерями высушиваемого вещества и гидрофобной жидкости в ходе сушки, а также существенными энергетическими затратами.

В производстве сухих микробных препаратов широко используется метод контактной сушки, суть которого состоит в смешивании высушиваемого объекта (например, суспензии микроорганизмов) с сорбентом влаги.

В пищевой промышленности для приготовления контактно-высушенных препаратов в качестве сорбентов применяются сухие крахмал, мука. В практике музейного хранения штаммов микроорганизмов наиболее популярным сорбентом является силикагель. Упомянутые препараты характеризуются низким уровнем биологической концентрации. В первом случае это обусловлено тем, что для высушивания требуется большое количество крахмала или муки на единицу высушиваемой суспензии, и препарат получается сильно разбавленным. В случае высушивания на силикагеле существенный вклад в падение концентрации вносит инактивация микроорганизмов в ходе сушки.

Для получения высококонцентрированных биопрепаратов используются высоковлагоемкие сорбенты (ионообменные смолы, цеолит, окись алюминия), обеспечивающие достижение оптимального для хранения уровня остаточной влажности биокомпонента при минимальном содержании сорбента в биопрепарате. Однако использование таких сорбентов для высушивания микроорганизмов обычно приводит к значительной инактивации последних из-за резкого обезвоживания, разогрева смеси в ходе сушки.

Известен способ консервации микроорганизмов путем смешивания с сухим силикагелем. Пробирки (13х100 мм) наполовину заполняют силикагелем, затыкают хлопковыми пробками, подвергают сухой стерилизации при 180^оС в течение 1,5 ч и помещают в контейнеры для остывания. По 0,5 мл суспензии микроорганизмов вносят в каждую пробирку, равномерно распределяя по объему. После выдерживания в течение недели при комнатной температуре отбирают небольшое количество содержимого каждой пробирки для тестирования, хлопковую пробку заменяют на пленку "Парафильм" и хранят пробирки при 5^оС.

Положительным результатом считается наличие в пробирке живых микроорганизмов. Их выживаемость в ходе сушки не определяется.

Данный способ имеет следующие недостатки:
выживаемость микроорганизмов в ходе сушки очень низка, поэтому данный способ не может широко использоваться для приготовления биопрепаратов;
микроорганизмы прилипают к поверхности частиц, полученная таким способом форма биопрепарата неудобна для применения в большинстве практических случаев.

Цель изобретения - повышение выживаемости микроорганизмов при контактной сушке.

Это достигается путем предварительного смешивания суспензии микроорганизмов и/или сорбента влаги с гидрофобной жидкостью, содержащей или не содержащей стабилизатор суспензии (эмульсии). При этом гидрофобная жидкость обеспечивает эффективный теплоотвод из зоны контакта высушиваемого объекта с осушителем, облегчает перемешивание, замедляет влагоперенос и предохраняет суспензию микроорганизмов от воздействия кислорода и других повреждающих факторов. В целом это приводит к повышению выживаемости микроорганизмов в ходе контактной сушки по сравнению с известным способом. Полученный препарат имеет жидкий или пастообразный вид, удобен в применении и хорошо хранится. При использовании съедобных компонентов способ пригоден для производства препаратов, предназначенных для приема внутрь животными или людьми.

Для повышения биологической концентрации препарата после сушки гидрофобная жидкость может быть полностью или частично удалена.

П р и м е р 1. В качестве сорбента влаги используется высушенная до остаточной влажности менее 0,1% порошкообразная окись алюминия, в качестве гидрофобной жидкости - кукурузное масло. Высушиванию подвергается суспензия микроорганизмов Bifidobacterium bifidum шт. 1, содержащая 10% лактозы, полученная путем глубинного культивирования микроорганизмов, центрифугирования культуральной жидкости и последующего суспендирования осадка в 20% -ном растворе лактозы в соотношении 1 мл раствора на 1 г осадка.

100 мл кукурузного масла помещают в емкость гомогенизатора со стальным вращающимся ножом. При перемешивании вводят 30 г окиси алюминия. После достижения ее равномерного распределения в масле при продолжающемся перемешивании вводят 2 мл суспензии микроорганизмов. Продолжают перемешивание в течение 10 мин, затем образец переносят в колбу и помещают в холодильник с температурой 4^оС. Через сутки проводят тестирование, 0,5 мл смеси помещают в 50 мл физиологического раствора (0,15 М хлористого натрия), содержащего 1% поверхностно-активного вещества Твин-20. Производят перемешивание пипеткой, затем подвергают встряхиванию в течение 15 мин и высевают в пробирки с полужидким агаром (среда Блаурокка с 1,5% добавкой агара). После инкубирования подсчитывают число колоний.

Биологическая концентрация составила 1,3±0,3 ˙10⁸ живых клеток на 1 г смеси, выживаемость 61% . В контрольном образце, полученном путем смешивания суспензии микроорганизмов с окисью алюминия без использования масла, выживаемость составила 8% . Таким образом, в данном случае благодаря применению предлагаемого способа наблюдается повышение выживаемости в 7,6 раза. После хранения в течение месяца при температуре 20^оС жизнеспособность сохранили 85% микроорганизмов, что подтверждает эффективность высушивания. В дополнение, для подтверждения того факта, что микроороганизмы действительно находятся в высушенном состоянии, методом прямого определения давления водяного пара была измерена активность воды в смеси, составившая 0,15, что соответствует сухому состоянию.

П р и м е р 2. В качестве сорбента влаги используется высушенная до остаточной влажности менее 0,1% гранулированная окись алюминия, размер гранул 0,7. . . 1,5 мм, в качестве гидрофобной жидкости - кукурузное масло. Высушиванию подвергается суспензия микроорганизмов Salmonella enteritidis шт. 2 Исаченко, содержащая 10% лактозы, приготовленная аналогично тому, как это описано в примере 1.

100 мл кукурузного масла помещают в емкость гомогенизатора со стальным вращающимся ножом. В масло добавляют 5 г стабилизатора эмульсии - поверхностно-активного вещества Спан-20 (лаурил-сорбитан). При перемешивании вводят 10 мл суспензии микроорганизмов. После получения гомогенной суспензии (через 2-3 мин), последнюю выливают в стакан, содержащий 150 г окиси алюминия, охлажденной до 4^оС. Содержимое стакана тщательно перемешивают стеклянной палочкой и помещают на 23 ч в холодильник при 4^оС; затем производят тестирование. Препарат суспендируют по схеме, изложенной в примере 1, и высевают на плотную питательную среду, разлитую в чашки Петри. После инкубирования подсчитывают число колоний.

Биологическая концентрация составила 6,7±0,4˙ 10⁸ живых клеток на 1 г смеси, выживаемость 79% . В контрольном образце, полученном путем смешивания суспензии микроорганизмов с окисью алюминия в тех же условиях, но без использования масла, выживаемость составила 24% . Таким образом, применение предлагаемого способа дает увеличение выживаемости в 3,3 раза. После хранения в течение месяца при 20^оС жизнеспособность сохранили 87% микроорганизмов.

Данный препарат может успешно использоваться для борьбы с мышевидными грызунами.

П р и м е р 3. В качестве сорбента влаги используется высушенный до остаточной влажности менее 0,1% порошкообразный цеолит, в качестве гидрофобной жидкости - полиэтилсилоксан. Высушиванию подвергается суспензия микроорганизмов Escherichia coli K-12, содержащая 10% сахарозы (30% -ный раствор сахарозы добавляли в соотношении 1: 2 к жидкой культуре микроорганизмов).

100 мл полиэтилсилоксана помещают в емкость гомогенизатора со стальным вращающимся ножом. В жидкость добавляют 5 г поверхностно-активного вещества Спан-80. При перемешивании вводят 10 мл суспензии микроорганизмов. После получения гомогенной суспензии добавляют 30 г предварительно охлажденного до -10^оС цеолита. Перемешивание продолжают в течение 15 мин, затем образец помещают в холодильник при 4^оС на 20 ч, после чего производится тестирование по методу, изложенному в примере 2.

Биологическая концентрация составила 5,4±0,5 х 10⁸ живых клеток на 1 г смеси, выживаемость 35% . В контрольном образце (без использования гидрофобной жидкости) выживаемость составила 2,5% . Таким образом, наблюдается увеличение выживаемости в 14 раз.

П р и м е р 4. В качестве сорбента влаги используется высушенная до остаточной влажности менее 1% ионообменная смола КБ-4П2, в качестве гидрофобной жидкости - перфтордекалин, в качестве стабилизатора эмульсии - аэросил АМ-1-300. Высушиванию подвергается суспензия микроорганизмов E. coli К-12, содержащая 10% сахарозы.

В стакан с 50 мл перфтордекалина, предварительно охлажденный в водяной бане до температуры 3^оС, вносят 2 мг аэросила. Производят перемешивание при помощи механической мешалки. При перемешивании добавляют 4 мл суспензии микроорганизмов; образуется равномерная эмульсия. К эмульсии добавляют 20 г ионообменной смолы КБ-4П2, предварительно высушенной в сушильном шкафу при температуре 105±3^оС до остаточной влажности менее 1% и охлажденной до 0^оС. Производится перемешивание малой интенсивности в течение 10 мин. Затем образец выдерживают в холодильнике при температуре 4^оС в течение 20 ч, и производится тестиpование.

Нижнюю фракцию смеси, представляющую собой отслоившийся перфтордекалин, удаляют. Оставшуюся часть тщательно перемешивают, отбирают 0,5 мл и разводят в 9,5 мл охлажденной до 4^оС среды культивирования, вновь тщательно перемешивают и производят высев на плотную питательную среду, разлитую в чашки Петри. После инкубирования подсчитывают число колоний.

Биологическая концентрация составила 3,3±0,3х10⁸ живых клеток на 1 г, в контрольном образце (при непосредственном смешивании ионообменной смолы сначала с аэросилом, а затем с суспензией микроорганизмов в тех же количествах и при той же температуре бани) - около 1 млн живых клеток на 1 г; выживаемость 45% и около 0,05% соответственно.

Таким образом, по сравнению с контрольным образцом наблюдается значительное увеличение выживаемости.

П р и м е р 5. В качестве сорбента влаги используется высушенная до остаточной влажности менее 1% ионообменная смола КБ-4П2, в качестве гидрофобной жидкости - перфторгексан, в качестве стабилизатора суспензии - аэросил АМ-1-300. Высушиванию подвергается суспензия микроорганизмов E. coli К-12, содержащая 10% сахарозы.

В стакан с 50 мл перфторгексана, охлажденный в водяной бане до температуры 3^оС, вносится 3 мг аэросила; производится перемешивание при помощи механической мешалки. При перемешивании добавляется 4 мл суспензии микроорганизмов, образуется равномерная эмульсия. К эмульсии при продолжающемся перемешивании добавляют 20 г сухой смолы КБ-4П2. Через 10 мин после введения смолы перемешивание прекращают и образец помещают в холодильник (4^оС) на 21 ч. После выдерживания в холодильнике образец переносят в открытую чашку Петри и дают гидрофобной жидкости испариться при комнатной температуре, после чего производят тестирование образца по методу, описанному в примере 4.

Биологическая концентрация составила 1,2 ±0,1х10⁹ живых клеток на 1 г, выживаемость 43% ; в контрольном образце (без использования гидрофобной жидкости) выживаемость составила менее 0,05% .

Таким образом, по сравнению с контрольным образцом наблюдается значительное увеличение выживаемости.

Как следует из приведенных примеров, предлагаемый способ позволяет существенно повысить выживаемость микроорганизмов в ходе контактной сушки и получить препараты, которые могут быть использованы в ветеринарии и медицине, в практике музейного хранения штаммов, для борьбы с грызунами и в других областях народного хозяйства. (56) 1. Бекер М. Е. Обезвоживание микробной биомассы, Рига, Зинатне, 1967, 361 с.

2. Калуцкий Л. В. , Сидякина Т. М. Сохранение жизнеспособности микроорганизмами в природе и основные подходы к консервированию коллекционных культур. Тезисы докладов 2-й Всесоюзной конференции по анабиозу, Рига, 16-18 октября 1984 г. , с. 19-20.

3. Grivell A. R. Jackon J. F. Microbiol culture preservation with silica gell // J. Gen. Microbiol. , 1969, v. 58, N 3, p. 423-425.

4. Perkins J. Preservation of Nenrospora stock cultures with anhydrous silica gel. //Can. J. Microbiol, 1962, v. 8, р. 591-594.

Использование: микробиология, в частности технология производства сухих биопрепаратов. Сущность изобретения: способ сушки микроорганизмов включает смешивание суспензии микроорганизмов с сорбентом влаги, причем перед смешиванием микроорганизмов с сорбентом последний и/или суспензию микроорганизмов смешивают с гидрофобной жидкостью, содержащей или не содержащей стабилизатор суспензии. 1 з. п. ф-лы.

1. СПОСОБ КОНТАКТНОЙ СУШКИ МИКРООРГАНИЗМОВ, предусматривающий смешивание суспензии микроорганизмов с сорбентом влаги, отличающийся тем, что перед смешиванием микроорганизмов с сорбентом последний и/или суспензию смешивают с гидрофобной жидкостью. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в смесь добавляют стабилизатор суспензии.