СПОСОБ НАПРАВЛЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА КЛЕТКИ ТКАНЕЙ ЖИВОТНЫХ ОТРЯДА НЕПАРНОКОПЫТНЫХ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/49 A61N7/00 

Изобретение относится к медицине, биотехнологии и ветеринарии, а именно к применению акустических волн для неинвазивного воздействия на клетки-мишени биологических тканей с целью управления процессами жизнедеятельности, пролиферативной активностью клеток/культур клеток и тканей и возможности избирательного подавления или активации их функций. Изобретение также может быть использовано в клеточной и молекулярной биологии, представляет интерес для разработки методов экспериментальной медицины, фармакологии, диагностики злокачественных новообразований, индивидуального подбора лекарственных препаратов и герондопротекторов, при тактике радио-, химио- и озонотерапии.

При воздействии акустических волн за счет сжатия в волне клеточных мембран и реализации пьезоэффекта возможен эффект изменения поверхностного заряда и функционального состояния мембран. Таким образом, мембрана может быть мишенью, на уровне которой реализуется цепь цитологических, биохимических и биофизических эффектов. Клетки, находящиеся в акустическом поле, по сравнению с длиной волны являются точечными, испытывая сжатие и расширения объема, достигающее 20%, что, в свою очередь, может уменьшить количество активных каналов при латеральной диффузии молекул липидного бислоя, изменить проницаемость цитоплазматической мембраны (ЦПМ) и функциональное состояние клетки [1-9].

Из уровня техники известен способ иммунокоррекции при аутоиммунном процессе (патент на изобретение RU 2098139, опубл. 10.12.1997). После премедикации осуществляют перфузию крови больного в вено-венозном варианте через срезы ксеноселезенки, предварительно активированные ультразвуком слабой интенсивности 0,3-0,4 Вт/см² в импульсном режиме 50 имп/с, в течение 8-10 мин. Способ применяется для упрощения процесса гемоперфузии и увеличения сорбционной способности селезенки при лечении псориаза. Данный способ эффективен при проведении перфузии с объемной скоростью 75-80 мм/мин в течение 40-45 мин 2-3 сеансами с интервалом между ними в 3-5 дней в начале курса традиционной комплексной терапии.

Однако указанный способ является затратным за счет использования дорогостоящего стационарного оборудования и материала. Способ требует при его реализации работы специально обученного персонала, сложен в исполнении методики, длителен по времени, осуществим при работе УЗ аппаратуры в импульсном режиме и на срезе одного типа ткани.

Известен способ неинвазивного разрушения расположенных за костями грудной клетки биологических тканей (патент на изобретение RU 2472545 от 20.01.2013 г., бюл. №2), выбранный в качестве ближайшего аналога. Данный способ основан на воздействии фокусированным УЗ пучком на биологическую ткань для локального разрушения клеток только в месте нахождения основного фокуса, без повреждения в побочных фокусах.

Данный способ применяется в УЗ хирургии только для одновременно теплового и механического воздействий, сопровождается сильным разогревом ткани. Ограничение в применении способа акустического разрушения клеток определяется использованием высокоинтенсивного УЗ, возможностью воздействия только на один вид ткани организма человека - костную, причем на всю ткань одновременно, а не на отдельные клетки (остеобласты), генерацией локального избыточного пикового положительного давления 30-80 МПа в месте воздействия.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного способа неинвазивного направленного воздействия на клетки ткани животных, безопасного при реализации и не требующего дорогостоящего стационарного оборудования, специально обученного персонала и специально оборудованного помещения; осуществление способа без дополнительных технических средств и химических реагентов; минимальная затрата времени (15-60 с); полная безопасность метода для медицинского персонала и научных сотрудников при максимальном эффекте.

Целью предлагаемого изобретения является плановое неинвазивное воздействие на клетки разных типов и размеров.

Техническим результатом заявленного изобретения является: направленное изменение проницаемости ЦПМ; торможение или активация транспортных систем клеток, фонофорез лекарственных препаратов на клеточном уровне; регуляция активности мембран-связанных ферментов; направленная супрессия роста клеток, в том числе ненормированного, вследствие нарушение аппарата межклеточного взаимодействия и клеточных контактов, опосредованных ЦПМ, что даст возможность проводить купирование заболеваний различной этиологии на клеточном уровне.

Заявленный технический результат осуществляется тем, что воздействие на клеточную суспензию производят непрерывной ультразвуковой волной частотой 0,88 МГц, интенсивностью 0,05-1,0 Вт/см² в течение 15-60 с - на ядросодержащие клетки размером более 7 μ, а на безъядерные клетки размером до 6 μ - интенсивностью 0,7-1,0 Вт/см² в течение 20-40 с; а также импульсным ультразвуком с частотой генерации 2,64 МГц диапазоном интенсивности 0,4-1,0 Вт/см² в течение 20-60 с - на ядросодержащие клетки размером более 7 μ, а на безъядерные клетки размером до 6 μ - интенсивностью 0,7-1,0 Вт/см в течение 25-60 с с последующим приготовлением мазков, их окраской трипановой синью и дифференциальными красителями, анализом состояния цитоплазматических мембран и жизнеспособности клеток.

Заявленное изобретение осуществляется путем ультразвукового воздействия на ткань, приводящего к избирательному изменению цитоморфологии или к разрушению клеток/клеточных структур животных отряда непарнокопытных.

Проведены исследования по определению особенностей поведения клеток крови лошади в УЗ поле, выявлены диапазоны интенсивностей, вызывающих обратимые и необратимые изменения. Обнаружены следующие цитоморфологические эффекты УЗ (несущая частота 880 кГц и 2,64 МГц) на эритроциты: изменение формы, образование симметричных групп вокруг клетки и цепочек эритроцитов без цитолиза, появление теней клеток. Лейкоциты изменялись раньше эритроцитов, спустя 15-30 с от начала инсонации. Действие на гранулоциты, ведущее к изменению ЦПМ, а затем клетки в целом, начиналось раньше, чем на агранулоциты. У всех животных в диапазоне 0,4-1,0 Вт/см², в импульсном и непрерывном режиме УЗ обработки, происходили одинаковые эффекты: деформация и нарушение границ, деструкция и агрегация клеток, разрыв ЦПМ и взрыв ядер, лизис.

Раскрытие изобретения. Кровь брали из яремной вены лошадей во время ежегодного контроля здоровья натощак в утренние часы.

УЗ обработке подвергали только кровь здоровых животных. Группа животных - верховые лошади (n=10). Объем крови от 5 до 10 мл озвучивали в абсолютно одинаковых условиях по методу автора [4]. Контролем служили интактные клетки тех же животных. Источником УЗ могут быть аппараты для ультразвуковой терапии, работающие на частотах генерации 2,64 МГц и 0,88 МГц - УЗТ-3.06 УЗТ - 1-01 Ф; УЗТ-1.02 С, или любой другой прибор отечественного производства. Интенсивность УЗ варьировала от 0,4 Вт/см² до 1,0 Вт/см², что контролировали с помощью дифференциальной термопары, калиброванной по интенсивности. Интенсивность УЗ, прошедшего в ткань in vitro, составляла 90% номинальной интенсивности. Воздействие УЗ волнами проводили в непрерывном (частота 0,88 МГц) и импульсном режиме 10 мс (2,64 МГц). Обработку образцов крови проводили в термостатируемой кювете при температуре 20°С (термостат U-7 с).

Длительность воздействия изменяли в разных сериях от 15 с до 1 минуты. О действии УЗ на клетки крови судили по количественным и качественным изменениям. Изменения проницаемости ЦПМ всех клеток определяли тестом с трипановой синью [10]. Обратимость изменений проверяли через 20 мин. В случае потери жизнеспособности клетки оставались окрашенными в синий цвет. Делали мазки, окрашивали по методу быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов набором Диффквик и определяли лейкограмму стандартным методом [7]. Результат воздействия наблюдали в световой микроскоп (иммерсия, микроскоп «ЛОМО», объектив 100^x/1,25, окуляр 10^х/18). Референсный ряд клеточных размеров по Н.А. Любину [11]. Статистическая обработка данных - в пакете прикладных программ «Statistica 6.0». Достоверными считали различия при р<0,05.

Непрерывный УЗ

Особенности воздействия непрерывного УЗ на мембраны клеток и клетки в целом отражены в таблице 1 и на фотографиях мазков крови лошадей (фиг. 1-3). Некоторые примеры цитоморфологических эффектов.

0,05 Вт/см² 40-50 с. Лейкограмма без особенностей, но от 5% (обработка 40-45 с) до 20% (50 с) лейкоцитов с измененной ЦПМ. Лизис ЦПМ после 60 с обработки.

0,2 Вт/см² 15-45 с. Лейкограмма без особенностей, но происходит изменение объема цитоплазмы лимфоцитов по сравнению с контролем.

0,2 Вт/см² 60 с. У 20% сегментоядерных нейтрофилов и эозинофилов лизис ЦПМ. Остальные виды лейкоцитов без особенностей. Изменения лейкограмм в пределах референсного ряда.

0,4 Вт/см² 30 с. (Фиг. 1) Лейкограмма без особенностей. Начало разрушения лейкоцитов. Сегментоядерные нейтрофилы (Фиг. 1, верх) и лимфоциты с признаками клеточного лизиса и деструкции. После 45 с - изменения в ядрах лимфоцитов и объема их цитоплазмы.

1,0 Вт/см² 20 с. Изменение проницаемости ЦПМ эритроцитов и тромбоцитов, разрушение ЦПМ лейкоцитов. 30-40 с и – агрегация тромбоцитов и лизис лейкоцитов (Фиг. 2). 60 с – тромбоциты в огромных группах. Сохранны только лимфоциты, но 90% из них без цитоплазмы. Других лейкоцитов в мазке нет. Под действием непрерывного УЗ в крови лошади регистрировали изменения эритроцитов. Так, после облучения интенсивностью 1,0 Вт/см² более 30 с обнаружены включения в клетки, агрегация. При этом происходили дегенеративные изменения лейкоцитов. На Фиг. 3 показана агрегация клеток: тромбоцитов и лимфоцит в окружении эритроцитов.

Импульсный УЗ

Изменения клеток крови после инсонации импульсным УЗ начинали регистрировать при больших интенсивностях УЗ (Табл. 2 и фиг. 5-7) вследствие уменьшения тепловой компоненты в момент действия излучателя.

0,4 Вт/см², 20 с. Дегенеративные изменения нейтрофилов и эозинофилов (Фиг. 4). 30 с - лизис цитоплазмы и дегенеративные изменения ядер лейкоцитов всех видов. Тромбоциты и эритроциты без особенностей. 60 с - полный лизис лейкоцитов, изменение проницаемости ЦПМ тромбоцитов, деформация ЦПМ эритроцитов (лизис лимфоцита на Фиг. 5).

0,7 Вт/см², 25 с. Лизис наиболее крупных видов лейкоцитов-моноцитов, дегенеративные изменения нейтрофилов и эозинофилов (Фиг. 6).

Обратимые изменения проницаемости ЦПМ тромбоцитов при сохранении их жизнеспособности. Начало цитоморфологических изменений эритроцитов: единичные клетки имеют булавовидные утолщения.

0,7 Вт/см², 60 с. Лизис лейкоцитов. Изменение формы эритроцитов. Появление цитоцепочек (фиг. 7) и теней клеток. Возможен гемолиз.

1,0 Вт/см², при облучении более 20 с идентифицировать клетки сложно. Происходят необратимые изменения лейкоцитов. 30 с - вспенивание цитоплазмы и разрыв ядер. Агрегация тромбоцитов. 60 с – лизис ядер и цитоплазмы лейкоцитов.

Выводы

1. УЗ воздействие на образцы клеточных суспензий in vitro УЗ волной частоты генерации 2,64 МГц в импульсном режиме, I_sata 0,7-1,0 Вт/см² при длительности 25-60 с последовательно изменяет проницаемость, а затем и структуру ЦПМ безъядерных клеток размера 4,5-5,8 мкм.

2. Действие импульсным УЗ (2,64 МГц) диапазоном интенсивности 0,4-1,0 Вт/см² в течение 20-60 с на ядросодержащие клетки размером более 7 μ изменяет проницаемость, структуру ЦПМ, после чего вызывает их разрушение.

3. Интенсивность 0,05-1,0 Вт/см² непрерывной ультразвуковой волны частотой 0,88 МГц при облучении в течение 15-60 с суспензии ядросодержащих клеток размером более 7 μ действует на проницаемость и структуру ЦПМ, а затем и на всю клетку в целом, изменяя ее морфологию.

4. Воздействовать на мембраны безъядерных клеток размером до 6 μ непрерывной ультразвуковой волны частотой генерации 0,88 МГц можно направленно интенсивностью 0,7-1,0 Вт/см² в течение 20-40 с.

Список литературы

1. Олешкевич А.А. Действие непрерывного и модулированного ультразвука на клетки крови животных in vitro / V Съезд биофизиков России. Материалы докладов: в 2 т. - Ростов-на-Дону: ЮФУ. - Т. 2: 2015. - С. 107.

2. Максутова Д.Ж Применение фокусированного ультразвука под контролем магнитно-резонансной томографии // Проблемы репродукции / Russian Journal of Human Reproduction. 2009. №2. С. 30-36.

3. Олешкевич A.A., Носовский A.M., Каминская Е.В. Экспериментально-теоретическое обоснование методов увеличения продукции клеток различной этиологии после обработки акустическими (ультразвуковыми) волнами. Ч. 1. Метод интенсификации процессов метаболизма бактериальных клеток в суспензии // Биомедицинская радиоэлектроника, 2014. - №2. - С. 53-57.

4. Олешкевич А.А., Каминская Е.В., Носовский A.M. Экспериментально-теоретическое обоснование методов увеличения продукции клеток различной этиологии после обработки акустическими (УЗ) волнами. Ч. 2. Методика акустической стимуляции клеток животного происхождения // Биомед. радиоэлектр. 2014. - №.3. - С. 33-39.

5. Botyan N.I., Akopyan V.B., Oleshkevich A.A. Cytostatic effect of ultrasound combined with medicine on photobacteria // V National conference on biomedical physics & engineering, Bulgaria, 1989, p. 109-110.

6. Шарый Н.И., Ковалева B.M., Крюкова Г.В. Влияние многократного действия УЗ на культуры клеток человека // Гигиена и санитария. 1979. №2. С. 48-50.

7. Олешкевич А.А., Пашовкин Т.Н. Возможность изменения лейкограмм животных при действии непрерывного ультразвука терапевтического диапазона интенсивностей // Аграрная Россия. - №6 (2015). С. 13-17.

8. Пашовкин Т.Н., Садикова Д.Г. Расслаивание, разделение и концентрирование клеток в поле стоячих ультразвуковых волн // Акустич. ж-л. Т. 55. 2009. №4-5. С. 575-585.

9. Акопян В.Б., Ершов Ю.А. Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами МГТУ им. Н.Э. Баумана. М., 2005. 223 с.

10. Скибо Ю.В., Абрамова З.И. Методы исследования программируемой клеточной гибели: Учебно-методическое пособие «Теория апоптоза» / Ю.В. Скибо, З.И. Абрамова. - Казань: ФГАОУ ВПО КФУ, 2011. - 61 с.

11. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у сельскохозяйственных и лабораторных животных при патологиях // Н.А. Любин, Л.Б. Конова. Ульяновск, 2005 г. - 112 с.

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для направленного воздействия на клетки тканей животных отряда непарнокопытных. Для этого проводят воздействие на клеточную суспензию непрерывной ультразвуковой волной частотой 0,88 МГц, интенсивностью 0,05-1,0 Вт/см² в течение 15-60 с - на ядросодержащие клетки размером более 7 μ, а на безъядерные клетки размером до 6 μ - интенсивностью 0,7-1,0 Вт/см² в течение 20-40 с; а также импульсным ультразвуком с частотой генерации 2,64 МГц диапазоном интенсивности 0,4-1,0 Вт/см² в течение 20-60 с - на ядросодержащие клетки размером более 7 μ, а на безъядерные клетки размером до 6 μ - интенсивностью 0,7-1,0 Вт/см² в течение 25-60 с с последующим приготовлением мазков, их окраской трипановой синью и дифференциальными красителями, анализом состояния цитоплазматических мембран и жизнеспособности клеток. Изобретение обеспечивает направленное изменение проницаемости цитоплазматической мембраны клетки, торможение или активацию транспортных систем клеток, регуляцию активности мембран-связанных ферментов. 7 ил., 2 табл.

Способ направленного воздействия на клетки тканей животных отряда непарнокопытных, включающий воздействие на клеточную суспензию непрерывной ультразвуковой волной частотой 0,88 МГц, интенсивностью 0,05-1,0 Вт/см² в течение 15-60 с - на ядросодержащие клетки размером более 7 μ, а на безъядерные клетки размером до 6 μ - интенсивностью 0,7-1,0 Вт/см² в течение 20-40 с; а также импульсным ультразвуком с частотой генерации 2,64 МГц диапазоном интенсивности 0,4-1,0 Вт/см² в течение 20-60 с - на ядросодержащие клетки размером более 7 μ, а на безъядерные клетки размером до 6 μ - интенсивностью 0,7-1,0 Вт/см² в течение 25-60 с с последующим приготовлением мазков, их окраской трипановой синью и дифференциальными красителями, анализом состояния цитоплазматических мембран и жизнеспособности клеток.