СПОСОБ АКУСТИЧЕСКОГО НЕИНВАЗИВНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА КЛЕТКИ-МИШЕНИ ТКАНЕЙ ЖИВОТНЫХ СЕМЕЙСТВА СОБАЧЬИХ Российский патент 2018 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, биотехнологии и ветеринарии, а именно к применению акустических волн для неинвазивного воздействия с возможностью разрушения клеток-мишеней биологических тканей с целью управления процессами жизнедеятельности, пролиферативной активностью клеток/культур клеток и тканей и возможности избирательного подавления их функций. Изобретение также может быть использовано в клеточной и молекулярной биологии, представляет интерес для разработки методов экспериментальной медицины, фармакологии, диагностики злокачественных новообразований, индивидуального подбора лекарственных средств.

При воздействии акустических волн за счет сжатия в волне клеточных мембран и реализации пьезоэффекта возможен эффект изменения поверхностного заряда и функционального состояния мембран. Таким образом, мембрана может быть мишенью, на уровне которой реализуются цепи одинаковых в дальнейшем эффектов как для акустических, так и для электромагнитных волн. Клетки, находящиеся в акустической волне, по сравнению с длиной волны являются точечными. Они могут испытывать сжатие и расширение объема, достигающее 20%, что в свою очередь может уменьшить количество активных каналов за счет латеральной диффузии молекул липидного бислоя, изменить проницаемость цитоплазматической мембраны (ЦПМ), ифункциональное состояние клетки [1-10].

В настоящее время нет однозначной теории формирования частотно-зависимых ответов на акустическое воздействие. Ряд исследователей показали существенные отличия на уровне ткани в биологических эффектах непрерывных и модулированных волн различной физической природы. Причем вызываемые изменения при воздействии модулированных волн выше, а степень и выраженность в большой степени зависят от частоты модуляций. Также было показано, что модулированное электромагнитное или УЗ воздействие на некоторых частотах модуляции могут вызывать изменение ферментативной активности как в сторону активирования, так и ингибирования [3, 4].

Из уровня техники известен способ иммунокоррекции при аутоиммунном процессе (патент на изобретение RU 2098139, опубл. 10.12.1997). После премедикации осуществляют перфузию крови больного в вено-венозном варианте через срезы ксеноселезенки, предварительно активированные ультразвуком слабой интенсивности 0,3-0,4 Вт/см² в импульсном режиме 50 имп/с, в течение 8-10 мин. Способ применяется для упрощения процесса гемоперфузии и увеличения сорбционной способности селезенки при лечении псориаза. Данный способ эффективен при проведении перфузии с объемной скоростью 75-80 мм/мин в течение 40-45 мин 2-3 сеансами с интервалом между ними в 3-5 дней в начале курса традиционной комплексной терапии.

Однако указанный способ является затратным за счет использования дорогостоящего стационарного оборудования и материала. Способ требует при его реализации работы специально обученного персонала, сложен в исполнении методики, длителен по времени, осуществим при работе УЗ аппаратуры в импульсном режиме и на срезе одного типа ткани.

Известен способ неинвазивного разрушения расположенных за костями грудной клетки биологических тканей (патент на изобретение RU 2472545 от 20.01.2013 г., Бюл. №2), выбранный в качестве ближайшего аналога. Данный способ основан на воздействии фокусированным УЗ пучком на биологическую ткань для локального разрушения клеток только в месте нахождения основного фокуса, без повреждения в побочных фокусах.

Однако данный способ применяется в УЗ хирургии только для одновременно теплового и механического воздействий, сопровождается сильным разогревом ткани. Ограничение в применении способа акустического разрушения клеток определяется использованием высокоинтенсивного УЗ, возможностью воздействия только на один вид ткани организма человека - костную, причем на всю ткань одновременно, а не на отдельные клетки (остеобласты), генерацией локального избыточного пикового положительного давления 30-80 МПа в месте воздействия [11].

Заявленное изобретение осуществляется путем нахождения оптимальных условий ультразвукового воздействия на ткань, приводящего к избирательному изменению цитоморфологии или к разрушению клеток/клеточных структур животных семейства собачьих.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного способа неинвазивного направленного воздействия на клетки ткани животных, безопасного при реализации и не требующего дорогостоящего стационарного оборудования, специально обученного персонала и специально оборудованного помещения; осуществление способа без дополнительных технических средств и химических реагентов; минимальная затрата времени (15-60 с); полная безопасность метода для медицинского персонала и научных сотрудников при максимальном эффекте.

Целью предлагаемого изобретения является плановое неинвазивное воздействие на клетки разных типов и размеров.

Техническим результатом заявленного изобретения является: направленное изменение проницаемости/структуры цитоплазматической и/или ядерной мембраны; регулирование глубины эффекта акустического воздействия; торможение или активация транспортных систем клеток; выборочное разрушение в одной ткани ядер у клеток определенного, заранее заданного размера; направленная супрессия роста клеток, в том числе и ненормированного; нарушение аппарата межклеточного взаимодействия и клеточных контактов; регуляция активности внутриклеточных и мембран-связанных ферментов, что даст возможность проводить купирование заболеваний различной этиологии на клеточном уровне, а также индивидуально оценить репарационную систему клетки.

Заявленный технический результат осуществляется тем, что на клеточную суспензию объемом от 1,0 мл до 1,5 мл, помещенную в кювету, воздействуют модулированной ультразвуковой волной с несущей частотой 0,88 МГц, диапазонами интенсивностей 0,2-0,7 Вт/см² и частот модуляции 10-80 Гц в течение 15-50 с при направлении действия на безъядерные клетки размера 1-9 μ, а также одновременно на ЦПМ и ядра ядросодержащих клеток размера 6,6-19,8 μ, или интенсивностью 0,05-0,7 Вт/см², частотой модуляции 200-900 Гц в течение 15-60 с при выборе в качестве мишени 7,7-17,6 μ - клеток, содержащих ядро, с последующим приготовлением мазков, их окраской дифференциальными красителями, анализом морфологического состояния клеток.

Пробы обрабатывают в абсолютно одинаковых условиях, поддерживают постоянную температуру образцов в кюветах с проточным охлаждением, а также проводят анализ морфологического состояния клеток пробой с трипановым синим [12] и методами световой или фазово-контрастной микроскопии [13, 14].

По окраске клетки в синий цвет, началу деформации, изменению клеточного размера, состоянию и изменению проницаемости ЦПМ, по морфологическим изменениям: деформации или степени изменению структуры ядер, ядерному лизису или разрушению ядер определяют наличие и регулируют направление и глубину эффекта акустического воздействия; оценивают индивидуальную репарационную систему клетки, рост и размножение клеток-мишеней, активность внутриклеточных и мембран-связанных ферментов.

Способ эффективен и информативен при любом количестве исследуемого материала.

Заявленный способ осуществляется следующим образом.

Воздействовали ультразвуком in vitro на жидкую подвижную ткань - кровь, в которой одновременно представлены клетки разного вида, размера и возраста. Для реализации заявляемого изобретения используются любые из отечественных ультразвуковых терапевтических генераторов с излучателями, работающих на несущей частоте 0,88 МГц: УЗТ-1-01Ф; Ультразвук Т-5 и УЗТ-1.02С и др., модифицированные для работы с внешней модуляцией. Экспозиция УЗ: время от 10 с до 60 с, I_SATA - средняя по пространству и времени УЗ интенсивность: 0,05 Вт/см² - 0,7 Вт/см². Диапазон активных частот модуляции 10-80 Гц и 200-900 Гц, модулятор Г3-112 (или любой аналогичный генератор). Объем облучаемых образцов составлял 1-1,5 мл. Мазки крови окрашивали их по методу ДИФФ-КВИК [6] и просматривали под иммерсией («Микмед-5», объектив 100х/1,25, окуляр 10х/18). Контролем служили интактные клетки тех же животных. Для определения изменения проницаемости ЦПМ использовали тест с трипановым синим [12]. О действии УЗ на клетки ткани судили по количественным и качественным морфологическим изменениям. Статистическую обработку данных вели в пакете прикладных программ «Statistica 6.0». Достоверными считали различия при р<0.05.

Направленное действие модулированного УЗ на клетки крови представителей семейства собачьих.

Безъядерные клетки размером 1-9 μ. После обработки ткани интенсивностью 0,2-0,7 Вт/см², частотой модуляции 10-80 Гц в течение 15-50 с (табл. 1) по данным тестов с трипановым синим менялась проницаемость ЦПМ кровяных пластинок (тромбоцитов). После чего шло образование клеточных ассоциаций. В результате облучения интенсивностью 0,2-0,7 Вт/см², частотой модуляции 10-20 Гц в течение 15-50 с менялась проницаемость ЦПМ и эритроцитов (табл. 1). На фоне общего анизоцитоза происходило образование булавовидных утолщений, формирование узоров и геометрических фигур из клеток красной крови, наложение эритроцитов крест-накрест «гантели» (см. рис. 1: Анизоцитоз. Образование геометрических фигур (а) и «гантелей» (б)). Направленное воздействие в экспериментах вначале изменяло форму эритроцитов, без внешних признаков разрушения или цитолиза, затем регистрировали формирование групп вокруг клеток и цитоцепочек. Регистрировали и появление теней клеток или гемолиз.

Ядросодержащие клетки размера 6,6-19,8 μ. После обработки образцов крови интенсивностью 0,05-0,7 Вт/см², частотой модуляции 10-30 Гц, а также 50-100 Гц, 200-900 Гц в течение 15-60 с (табл. 2; рис. 2-4) клетки деформировались, менялся объем, а затем происходило «вспенивание» или вакуолизация цитоплазмы, менялась проницаемость или начинала разрушаться ЦПМ лейкоцитов, происходило разрыхление ядер палочкоядерных и/или юных (молодых) нейтрофилов (рис. 2).С увеличением времени воздействия до 35-50 с менялись глубина и степень изменений. Облучение ткани в зависимости от вида животного и его возраста интенсивностью диапазона 0,05-0,4 Вт/см², частотой модуляции из интервала частот 10-50 Гц, а также 300-900 Гц от 15 до 60 секунд позволяло направленно воздействовать на ядра лейкоцитов: изменять их форму или полностью разрушать. Во всех клетках ткани собачьих происходили одинаковые эффекты: цитолиз, деструкция и агрегация клеток, вспенивание цитоплазмы сначала грануло-, а затем и агранулоцитов, разрыв ЦПМ, деформация и взрыв ядер (на рис. 3, (а) - сегментоядерный нейтрофил; (б) - вспенивание и/или вакуолизация цитоплазмы моноцита). Первые изменения мембран и ядер лейкоцитов в зависимости от вида и размера клетки регистрировались, спустя 10-13 с от начала озвучивания активными частотами. Во многих случаях цитологические изменения столь значительны, что клетки идентифицировать было сложно (рис. 4 - клетки тяжело идентифицировать из-за значительных изменений в цитоплазме и ядре).

Таким образом, в заявленном изобретении раскрыта возможность применения ультразвуковых волн для направленного неинвазивного воздействия на функциональное состояние клеток тканей животной этиологии. Отработаны режимы выборочного изменения состояния клеточных органелл и клеток крови животных семейства собачьих с целью управления процессами жизнедеятельности и избирательного подавления или активации их функций.

Список литературы

1. Олешкевич А.А. Действие непрерывного и модулированного ультразвука на клетки крови животных in vitro / V Съезд биофизиков России. Материалы докладов: в 2 т. - Ростов-на-Дону: ЮФУ - Т. 2: 2015. - С. 107.

2. Олешкевич А.А., Пашовкин Т.Н. Возможность изменения лейкограмм животных при действии непрерывного ультразвука терапевтического диапазона интенсивностей // Аграрная Россия. - №6 (2015). С 13-17.

3. Johns, LD Non-thermal effects of therapeutic ultrasound: the frequency resonance hypothesis // Journal of athletic training. - 2002. - 37(3) - P. 293-299.

4. Пашовкина M.С., Пашовкин Т.H. Изменение относительной активности холинэстеразы при действии модулированного сверхвысокочастотного электромагнитного излучения в опытах in vitro. - Радиационная биология. Радиоэкология, 2011, том 51, №3, С. 1-5.

5. Олешкевич А.А., Пашовкин Т.Н. Возможность изменения лейкограмм животных при действии непрерывного ультразвука терапевтического диапазона интенсивностей // Аграрная Россия. - №6 (2015). С 13-17.

6. Способ диагностики наличия заболевания у животных по изменению лейкограммы после ультразвукового воздействия / Олешкевич А.А., Пашовкин Т.Н. Российская Федерация, МПК G01N 33/49 №2574881.

7. Oleshkevich, АА. Studies of frequency-dependent changes under modulated ultrasound exposure on cells in suspension // International Journal of BioMedicine. N.-Y.: "Int. Medical Research and Development Corporation". - V. 4, Issue 1, March 2015. - P. 30-34.

8. Олешкевич А.А., Пашовкин Т.H. Количественный анализ действия модулированного ультразвука на некоторые клетки тканей животных // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. - 2014 - №5. - С. 27-33.

9. Олешкевич А. А., Василевич Ф. И. Направленное действие модулированного ультразвука на клетки крови собак при смешанной инвазии // РВЖ. МДЖ. - 2015 - №5 - С. 19-22.

10. Олешкевич А.А., Кутликова И.В. Влияние ультразвука на лимфоциты и сегментоядерные нейтрофилы // Научное обозрение. - 2015. - №13. - С. 145-150.

11. Хохлова В.А., Сапожников О.А., Гаврилов Л.Р. и др. Способ неинвазивного разрушения расположенных за костями грудной клетки биологических тканей. - RU 2472545 от 20.01.201, Бюл. №2.

12. Скибо Ю.В., Абрамова З.И. Методы исследования программируемой клеточной гибели. Казань, 2011. - 61 с.

13. Бурмистров Е.Н. Шанс Био: лабораторная диагностика. - М.: Капиталпринт 2006. - 154 с.

14. Кудрявцев А.А. Клиническая гематология животных. М.: Колос, 1974. - 399 с.

Изобретение относится к медицине, биотехнологии и ветеринарии и предназначено для направленного изменения проницаемости клеточных мембран. Способ включает воздействие на клеточную суспензию модулированной ультразвуковой волной с несущей частотой 0,88 МГц, диапазонами интенсивностей 0,2-0,7 Вт/см² и частот модуляции 10-80 Гц. Время экспозиции 15-50 с при направлении действия на безъядерные клетки размера 1-9 μ. Одновременно осуществляет воздействие на ЦПМ и ядра ядросодержащих клеток размера 6,6-19,8 μ, или интенсивностью 0,05-0,7 Вт/см², частотой модуляции 200-900 Гц в течение 15-40 с при выборе в качестве мишени 7,7-17,6 μ - клеток, содержащих ядро. Готовят мазки, окрашивают их дифференциальными красителями, проводят анализ морфологического состояния клеток. Способ позволяет расширить арсенал диагностических и экспериментальных методов. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 ил.

1. Способ оценки индивидуальной репарационной системы клетки тканей животных семейства собачьих, включающий воздействие на клеточную суспензию модулированной ультразвуковой волной с несущей частотой 0,88 МГц, диапазонами интенсивностей 0,2-0,7 Вт/см² и частот модуляции 10-80 Гц в течение 15-50 с при направлении действия на безъядерные клетки размера 1-9 μ, а также одновременно на ЦПМ и ядра ядросодержащих клеток размера 6,6-19,8 μ, или интенсивностью 0,05-0,7 Вт/см², частотой модуляции 200-900 Гц в течение 15-40 с при выборе в качестве мишени 7,7-17,6 μ-клеток, содержащих ядро, с последующим приготовлением мазков, их окраской трипановым синим и анализом морфологического состояния клеток по окраске клетки в синий цвет, началу деформации, изменению клеточного размера или объема цитоплазмы, состоянию и изменению проницаемости ЦПМ.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что для воздействия используется клеточная суспензия объемом от 1,0 мл до 1,5 мл.