СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВРОЖДЕННОЙ МИОПАТИИ ЦЕНТРАЛЬНОГО СТЕРЖНЯ Российский патент 2018 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии, патологической анатомии, а также к гистологии, цитологии и клеточной биологии, и может быть использовано для диагностики миопатии центрального стержня.

Миопатия центрального стержня - один из вариантов врожденной непрогрессирующей миопатии, ассоциированный с появлением зон сниженной энзиматической активности в мышечных волокнах. Дифференциальный диагноз миопатии центрального стержня следует проводить с другими болезнями и синдромами, при которых наблюдается феномен возникновения подобных зон. (Dubowitz V., Sewry С.А., Oldfors A. Muscle biopsy. Saunders Elsevier, 2013, pp. 361-371).

Изменения типичные для данной болезни не могут быть установлены при гематоксилин-эозиновой окраске фиксированного в формалине и залитого в парафин материала.

Известен способ морфологического выявления миопатии центрального стержня посредством трансмиссионной электронной микроскопии (Шаталов П.А., Сухоруков B.C., Харламов Д.А., Брыдун А.В., Глинкина В.В., Влодавец Д.В., Виноградская И.С., Суслов В.Б., Лихачева Л.М. Электронно-микроскопические критерии дифференциальной диагностики врожденной миопатии центрального стержня у человека / Вестник РГМУ, 2012, №5, с. 66-70). Срезы толщиной около 80 нм из блоков мышечных биоптатов, залитых в аралдит, готовят на ультратоме как в поперечном, так и в продольном направлении. Анализ изображения проводят с помощью электронного микроскопа JEOL 1200ЕХ или аналогичного ему с гониометром и вращающимся держателем образцов. Признаком миопатии центрального стержня служит обнаружение продольных и поперечных срезов мышечных волокон, характеризующихся наличием очагов атрофии и расщепления миофиламентов, вакуолизацией и деструкцией митохондрий. Однако этот способ имеет недостатки: трудоемкость метода электронной микроскопии, низкая специфичность, повышенная частота как ложно-отрицательных, так и ложно-положительных ответов из-за малого поля зрения.

Таким образом, морфологическая диагностика, обладающая значительно большей чувствительностью, чем молекулярно-генетическое исследование, тем не менее, остается чрезвычайно трудоемким и капризным методом выявления признаков миопатии центрального стержня. В связи с этим чрезвычайно актуально расширение спектра морфологических методов, способных выявлять маркеры центральностержневой миопатии.

Наиболее близким аналогом к патентуемому (прототипом) является способ выявления центральных стержней с помощью метода с нитро-СТ для выявления сукцинатдегидрогеназы (по Нахласу и др., 1957) (Э. Пирс. Гистохимия. Теоретическая и прикладная. Издательство иностранной литературы, Москва, 1962, стр. 844). В соответствии с этим методом срезы из свежезамороженной ткани, изготовленные в криостате и заключенные под покровные стекла, инкубируют при 37°С на воздухе в течение 5-20 минут в среде, включающей в себя 10 мл основного раствора сукцината и 10 мл водного раствора нитро-СТ (1 мг/мл). После чего промывают солевым раствором и фиксируют в 10% формалин-солевом растворе в течение 10 минут. Затем промывают в 15% спирте в течение 5 минут и заключают в глицерин-желатин. В результате синий осадок формазана отлагается в структурах, обладающих сукцинатдегидрогеназной активностью.

Недостатком этого метода является необходимость использования только свежезамороженных срезов непосредственно после взятия мышечной биопсии, а также относительно низкая специфичность и большая вероятность получения ложно-положительных результатов.

Задачей изобретения является создание надежного и чувствительного морфологического метода диагностики врожденной миопатии центрального стержня.

Техническим результатом является повышение надежности диагностики миопатии центрального стержня за счет расширения технических возможностей исследования биоптатов скелетных поперечнополосатых мышц пациентов при использовании иммуногистохимического метода на парафиновых биопсийных препаратах.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для диагностики миопатии центрального стержня у пациента с клинической картиной врожденной миопатии осуществляют забор биоптата скелетной поперечнополосатой мышечной ткани. Проводят иммуногистохимическое выявление маркеров наружной митохондриальной мембраны и митохондриального комплекса IV. Для чего готовят гистологические образцы-срезы, наносят на них усилитель флуоресцентного сигнала, далее на срезы наносят белок-блокатор, обеспечивая уменьшение фонового неспецифического окрашивания. Затем срезы инкубируют с моноклональными антителами мыши к белку наружной митохондриальной мембраны. После промывки наносят на срезы соответствующие вторичные флуоресцентные антитела. После промывки наносят моноклональные антитела к митохондриальному комплексу IV и вновь промывают. После чего наносят на срезы соответствующие вторичные флуоресцентные антитела. После промывки покрывают фотозащитным реагентом и исследуют с помощью люминесцентного микроскопа. При выявлении в центре мышечного волокна локусов округлой и/или овальной формы, характеризующихся отсутствием окраски митохондриального комплекса IV при сохранении в указанных зонах окраски маркера наружной митохондриальной мембраны, диагностируют миопатию центрального стержня.

Способ осуществляется следующим образом.

У больного с признаками врожденной миопатии с целью дифференциальной диагностики проводят иммуногистохимическое выявление двух митохондриальных маркеров - маркера наружной митохондриальной мембраны и митохондриального комплекса IV. Для этого после взятия мышечной биопсии проводят химическую фиксацию материала в 10% нейтральном (рН-7,4) забуференном формалине в течение 24 часов, после чего материал обезвоживают с использованием ксилола и заливают в парафин. С парафиновых блоков получают срезы толщиной 4 мкм, которые наносят на высокоадгезивные стекла, а затем высушивают в течение 24 часов при температуре 48°С.

Срезы депарафинируют поочередно в трех порциях ксилола по 5 минут в каждом, регидрируют трехкратно в 96% спиртовых растворах по 5 минут в каждом, промывают в дистиллированной воде 3 раза по 5 минут. Затем на 30 минут на образцы наносят усилитель флуоресцентного сигнала (Image-iT FX signal enhancer, Thermo Fisher Scientific), с последующей промывкой в фосфатном буфере (PBS).

На следующем этапе на срезы на 30 минут наносят белок-блокатор (Novocastra Protein Block, Leica) для уменьшения фонового неспецифического окрашивания. Затем срезы инкубируют во влажной камере в течение 60 минут при комнатной температуре с моноклональными антителами мыши к белку наружной митохондриальной мембраны (Thermo Fisher Scientific, США; разведение 1:1000). После чего срезы промывают в фосфатном буфере 3 раза по 5 минут и на 60 минут на них наносят соответствующие вторичные флуоресцентные антитела (антитела к моноклональным антителам мыши) (Антитела козы к IgG мыши (Alexa Fluor 488) Thermo Fisher Scientific, США, Разведение 1:2000). Затем срезы промывают в фосфатном буферном растворе 3 раза по 5 минут, после чего инкубируют во влажной камере в течение 60 минут при комнатной температуре с моноклональными антителами мыши к митохондриальному комплексу IV (Thermo Fisher Scientific, США; разведение 1:1000). После чего срезы промывают в фосфатном буфере 3 раза по 5 минут и на 60 минут на них наносят соответствующие вторичные флуоресцентные антитела (антитела к моноклональным антителам мыши) (Антитела козы к IgG мыши (Alexa Fluor 555) Thermo Fisher Scientific, США, Разведение 1:2000). Затем срезы промывают в фосфатном буферном растворе 3 раза по 5 минут и покрывают фотозащитным реагентом ProLong Gold (страна производитель США) и заключают под покровные стекла.

При последующем анализе с помощью люминесцентного микроскопа при миопатии центрального стержня в центральных участках мышечных волокон определяются округлые или овальные локусы отсутствия флуоресценции маркера митохондриального комплекса IV при наличии флуоресценции маркера наружной митохондриальной мембраны. При других формах врожденных миопатий подобный феномен не обнаруживается.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Клинический пример 1.

Пациенту 9 лет с клиникой врожденной миопатии проведено исследование скелетной мышечной ткани по предлагаемому способу. Приводим описание микрофотографии. Скелетная мышечная ткань, увеличение х400. Иммуногистохимическое распределение флуоресцентного маркера наружной митохондриальной мембраны (зеленый) (Фиг. 1). Определяются выраженные округлые скопления маркера наружной митохондриальной мембраны в центре мышечного волокна (стрелка). На этом же срезе было исследовано иммуногистохимическое распределение флуоресцентного маркера митохондриального комплекса IV (красный) (Фиг. 2). Увеличение х400. Определяются зоны отсутствия флуоресценции данного маркера (стрелка). Диагностирована миопатия центрального стержня. При исследовании биоптата скелетных мышц, окрашенного по методу с нитро-СТ для выявления сукцинатдегидрогеназы, диагноз верифицирован.

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии, патологической анатомии, а также к гистологии, цитологии и клеточной биологии, и может быть использовано в диагностике в миопатии центрального стержня. Проводят иммуногистохимическое выявление маркеров наружной митохондриальной мембраны и митохондриального комплекса IV: готовят гистологические образцы-срезы, наносят на них усилитель флуоресцентного сигнала, далее на срезы наносят белок-блокатор, обеспечивая уменьшение фонового неспецифического окрашивания, и затем наносят вторичные флуоресцентные антитела и фотозащитный реагент с последующим исследованием с помощью люминесцентного микроскопа. Осуществление изобретения позволяет повысить надежность диагностики миопатии центрального стержня за счет расширения технических возможностей исследования биоптатов скелетных поперечнополосатых мышц пациентов при использовании иммуногистохимического метода на парафиновых биопсийных препаратах. 2 ил.,1 пр.

Способ диагностики миопатии центрального стержня, при котором у пациента с клинической картиной врожденной миопатии осуществляют забор биоптата скелетной поперечнополосатой мышечной ткани, проводят иммуногистохимическое выявление маркеров наружной митохондриальной мембраны и митохондриального комплекса IV, для чего готовят гистологические образцы-срезы, наносят на них усилитель флуоресцентного сигнала, далее на срезы наносят белок-блокатор для уменьшения фонового неспецифического окрашивания, затем срезы инкубируют с моноклональными антителами мыши к наружной митохондриальной мембране, после промывки наносят на срезы соответствующие вторичные флуоресцентные антитела, после чего инкубируют с моноклональными антителами мыши к митохондриальному комплексу IV, промывают и наносят на срезы соответствующие вторичные флуоресцентные антитела, промывают, покрывают фотозащитным реагентом и проводят люминесцентную микроскопию, а при выявлении в центре мышечного волокна локусов округлой и/или овальной формы, характеризующихся отсутствием флуоресценции маркера митохондриального комплекса IV при сохранении в указанных зонах флуоресценции маркера наружной митохондриальной мембраны, диагностируют миопатию центрального стержня.