СПОСОБ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ТКАНЕВОЙ АДАПТАЦИИ К ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ОРГАНОВ И СИСТЕМ С ПОМОЩЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОМЕНА КОМПЕНСАТОРНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ МИТОХОНДРИЙ В КЛЕТКАХ СООТВЕТСТВУЮЩИХ ТКАНЕЙ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к гистологии, цитологии, клеточной биологии и патологии. В основу работы положена идея объяснения возникновения феномена пролиферации митохондрий как компонента адаптационного синдрома у пациентов с различными заболеваниями.

В настоящее время благодаря выделению особой группы заболеваний, связанных первично с нарушениями энергообмена на клеточном уровне (митохондриальных болезней), разработан полномасштабный комплекс изучения состояния митохондрий в различных органах и системах.

На сегодняшний день в мире накоплен большой диагностический инструментарий для изучения митохондриальных нарушений. Морфологический анализ наряду с биохимическим и молекулярно-генетическим методами традиционно занимает ведущее место в диагностике митохондриальной недостаточности. Наиболее информативным при этом считается анализ митохондрий в биоптатах скелетной мышцы. В первую очередь, это стало возможным благодаря описанию феномена - «рваных кранных волокон» (RRF), представляющим собой аномальные скопления митохондрий в мышечных волокнах. Эти скопления легко визуализируются при некоторых гистологических методах окраски. Их наличие у больных наследственными митохондриальными заболеваниями позволило многим исследователям считать, что наличие таких скоплений есть проявление митохондриальных мутаций.

За последние 15 лет в Московском НИИ педиатрии и детской хирургии накоплен большой материал, позволяющий прийти к заключению о том, что увеличение числа митохондрий в разных органах при различных заболеваниях является процессом, компенсирующим функциональную недостаточность за счет интенсификации энергообмена.

Цель работы - показать, что пролиферация митохондрий является неспецифическим механизмом тканевой адаптации к функциональной недостаточности органов и систем.

Увеличение абсолютного числа этих органелл, в частности феномен - «рваных красных волокон» (RRF) в скелетных мышцах, является проявлением компенсаторных способностей организма, позволяющих справиться с тем или иным функциональным дефектом.

Доказательствами данного положения являются установленные в исследованиях факты.

1. При обследовании семей, в которых имелся больной или больные первичными митохондриальными заболеваниями, очень часто у их родственников, не имевших клинически выраженной митохондриальной недостаточности, определялось значительно увеличенное количество митохондрий в мышечных волокнах, существенно превышающее таковое у самих больных. Особенно часто это касалось матерей больных детей, что вероятно естественно, учитывая материнское наследование митохондриальной ДНК. Эти матери считали себя совершенно здоровыми, и только самое пристальное клиническое обследование позволяло выявлять у них повышенную утомляемость, мышечную слабость и другие признаки энергодефицита. Пролиферация митохондрий в скелетных мышцах матери ребенка с митохондриальной энцефаломиопатией (стрелки) показана на фиг.1. Возраст 36 лет. Клинический диагноз - здорова. Электронная микроскопия. Ув.x50000.

2. Очень часто митохондриальные пролифераты обнаруживаются при немитохондриальных заболеваниях. Причем часто среди этих заболеваний наследственные болезни с хорошо известной первичной мутацией ядерного генома (например, туберозный склероз, синдромы Марфана и Элерса-Данло). В этих случаях накопление количества митохондрий вряд ли может быть связано с мутацией митохондриальной ДНК. Компенсаторная пролиферация митохондрий (стрелки) в скелетных мышцах у больного туберозным склерозом представлена на фиг.2. Возраст 7 лет. Электронная микроскопия. Ув.x10000.

3. При обследовании детей со структурными миопатиями (в частности, с болезнью «центрального стержня») в биопсийном материале скелетной мышечной ткани выявлено, что количество митохондрий достоверно коррелирует со степенью клинической компенсации миопатического симптомокомплекса. Компенсаторная пролиферация митохондрий (стрелки) в скелетных мышцах у больного структурной миопатией с поздним дебютом показана на фиг.3. Возраст больного 16 лет. Электронная микроскопия. Ув.x15000.

4. У нескольких больных с дебютом миопатического симптомокомплекса в возрасте старше 40 лет при биопсии были выявлены морфологически однозначные доказательства структурной (то есть врожденной) миопатии. Помимо этих признаков в мышцах обнаруживались и аномальные скопления митохондрий. Структурно-функциональный мышечный дефект в этих случаях был эффективно компенсирован за счет митохондриальной пролиферации, стимуляции энергообмена и, как следствие, повышенной активностью сохранных сократительных элементов скелетной мышцы. Пролиферация митохондрий (стрелки) в скелетной мышце у взрослого с диагнозом врожденная структурная миопатия и миопатическим синдромом, клинически проявившимся в возрасте 50-ти лет, представлена на фиг.4. Электронная микроскопия. Ув.x30000.

5. Полученные в результате исследований данные свидетельствуют, что количество митохондрий в мышцах достоверно коррелирует с возрастом, что вполне объясняется необходимостью повышения напряженности компенсаторных механизмов.

Все вышеприведенные доказательства касались ситуации, наблюдаемой в скелетной мышечной ткани. Однако расширение спектра исследуемых тканевых элементов организма показывает, что абсолютно аналогичная (а точнее, по нашему мнению, гомологичная) ситуация имеет место и в них.

Рассмотрим несколько примеров.

1. В гладкой мышечной ткани мочевых путей (при гидронефрозе у детей, при аденоме простаты у пожилых мужчин и при некоторых других заболеваниях) иногда можно наблюдать такие морфологические изменения: на фоне общего снижения гистохимической активности митохондриальных ферментов видны отдельные миоциты с резко увеличенным содержанием метки. То есть на фоне общего тканевого энергодефицита появляются клетки с резко увеличенным числом митохондрий (та же ситуация, что и в скелетной мышце). Интересно, что у таких больных хирургическое оперативное лечение значительно менее эффективно - коррекция макроскопического дефекта (обструкции или расширения стенки) не приводит к существенному восстановлению функции, так как гладкомышечная ткань функционально дефектна. И в этом отношении также понятно, что адаптационный потенциал митохондриальной пролиферации должен максимально использоваться. Пролиферация митохондрий (стрелки) в нефроцитах у ребенка с инфантильным нефротическим синдромом представлена на фиг.5. Электронная микроскопия. Ув.x20000.

2. То же можно видеть в таких энергозависимых структурах, как почечный эпителий. Авторами обнаружены митохондриальные пролифераты в нефроцитах у детей при различных почечных заболеваниях, характеризующихся функциональной недостаточностью почек, в частности при инфантильном нефротическом синдроме.

3. При биопсии кожи у больных с синдромами Элерса-Данло и Марфана, у которых функциональные нарушения определяются в том числе и со стороны кожи, в базальном слое эпидермиса (где еще не начинаются процессы физиологической клеточной дистрофии) можно также наблюдать процессы митохондриальной пролиферации.

4. При электронно-микроскопическом и цитохимическом анализе лимфоцитов периферической крови детей с хроническими воспалительными заболеваниями, в частности болезнями верхних дыхательных путей, при которых можно предполагать наличие функциональной недостаточности иммунокомпетентных клеток, определяется увеличение количества митохондрий.

Описание метода

1. Гистологический (электронно-микроскопический) метод

В качестве материала исследования используется биоптат какой-либо ткани, либо цитологический материал, число митохондрий в одной клеточной единице которого заранее известно или для которого параллельно оценивается контрольный материал. Для ультраструктурного анализа образцы ткани фиксируются в растворах глутарового альдегида и четырехокиси осмия, заливаются в эпонаралдитовую смесь смол, контрастируются уранилацетатом и цитратом свинца и изучаются при помощи электронного микроскопа. При анализе оценивается число качественно не измененных митохондрий в клетке. Повышенное по сравнению с нормой (контролем) число сохранных митохондрий свидетельствует о компенсаторной пролиферации этих органелл.

2. Гистологический (гистохимический) метод

Для выявления активности митохондриального фермента сукцинатдегидрогеназы проводится гистохимическая реакция по Нахласу и др.

Срезы инкубируются при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 5-20 минут в среде, содержащей смесь 10% водного раствора нитросинего тетразолиевого и забуференный раствор сукцината натрия (0,2М раствор сукцината, смешанный с равным объемом 0,2М фосфатного буфера, рН 7,6) в соотношении 1:1. После промывки солевым раствором срезы фиксируются 10% формалин-солевым раствором в течение 10 мин. После промывки в 15% спирте в течение 5 минут срезы заключаются в глицерин-желатин.

Визуально определяется количество гранул формазана, выпавших в осадок и соответствующих количеству митохондрий.

3. Цитохимический метод

Цитохимическое выявление активности митохондриального фермента - сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах периферической крови осуществляется наборами реактивов фирмы ООО МНПК "Химтехмаш", ГосНИИ "ИРЕА" (метод Пирса (1957) в модификации Нарциссова Р.П., (1986) с последующей визуальной и компьютерной морфометрией (пакет программ "Видеотест", методика Сухорукова B.C., Тозлиян Е.В.) [Сборник под редакцией В.С.Сухорукова, Е.А.Николаевой «Нарушение клеточного знергообмена у детей», МНИИПиДХ МЗ РФ, Атес Медика Софт, Москва 2004, 79 стр.]. Число гранул в лимфоците соответствует числу митохондрий. На фиг.6 показана вариабельность количества митохондрий (стрелки) при различных патологических состояниях в лимфоцитах периферической крови. Цитохимическое выявление активности сукцинатдегидрогеназы с возможностью оценки количества митохондрий в лимфоцитах. Ув.x1000.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гистологии, цитологии, клеточной биологии, и касается объяснения возникновения феномена пролиферации митохондрий как компонента адаптационного синдрома у пациентов с различными заболеваниями. Оценка тканевой адаптации к функциональной недостаточности органов и систем основана на выявлении увеличения абсолютного числа митохондрий в клетках соответствующих тканей с помощью цитохимических, гистохимических и электронно-микроскопических методов. Анализ гистохимических, гистологических показателей биоптатов скелетной мышцы, а также цитохимических характеристик ферментов биоэнергетического обмена лимфоцитов периферической крови показывает, что процесс пролиферации митохондрий является неспецифическим механизмом тканевой адаптации к функциональной недостаточности органов и систем. Применение настоящего способа позволяет проводить оценку степени тканевой адаптации к функциональной недостаточности органов и систем и осуществлять соответствующую лечебную коррекцию. Метод может быть внедрен в схему диагностики и лечения детей. 6 ил.

Способ оценки тканевой адаптации к функциональной недостаточности органов и систем, отличающийся тем, что он основан на выявлении увеличения абсолютного числа митохондрий в клетках соответствующих тканей с помощью цитохимических, гистохимических и электронно-микроскопических методов.