ПРОТИВОВИРУСНАЯ ЭФФЕКТИВНАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ Российский патент 2018 года по МПК A61K31/439 A61K31/46 A61K33/28 A61P31/12 A61P31/16 A61P31/22 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей атропин или его соль, аконитин и цианид ртути для применения в способе лечения вирусной инфекции, вызванной вирусом герпеса, респираторно-синцитиальным вирусом человека (RSV), риновирусами и/или энтеровирусами.

Предпосылки создания изобретения

Вирусы являются основными возбудителями простудных заболеваний. Среди указанных вирусов лидерами являются риновирусы и коронавирусы, будучи причиной 50-70% всех инфекций дыхательных путей, за которыми следуют вирусы парагриппа, RSV (респираторно-синцитиальный вирус) и энтеровирусы. Помимо этого, сопровождающееся ослабление иммунной системы благоприятствует вирусам простого герпеса (HSV), которые могут проявляться соответствующими симптомами, например, герпес на губах (herpes labialis).

Несмотря на то что существует множество антибиотиков для лечения бактериальных инфекций, лишь относительно небольшое число виростатиков против ограниченного спектра вирусов доступно для лечения заболеваний, ассоциированных с вирусами. Вполне понятно, что антибиотики, которые связаны с многими побочными эффектами, еще меньше способствуют лечению простуды, которая обычно связана с вирусом; но они лишь действуют против возможных бактериальных вторичных инфекций, ассоциированных с длительной простудой. Часто поспешные назначения антибиотиков в большом объеме, кроме того, связано с высоким уровнем развития резистентности или в большинстве случаев совсем не имеет эффекта. Таким образом, требуются эффективные и приемлемые альтернативы.

Такой альтернативой могут быть фитотерапевтические средства и комплексные гомеопатические средства. Действительно, такие альтернативы обсуждались и постоянно рассматриваются, поскольку по отношению к синтетическим средствам они обладают преимуществами в виде более широкого терапевтического спектра, лучшей переносимости и меньшим количеством лекарственных взаимодействий, они также не подвержены риску развития резистентности.

В последние годы все больше и больше появляется публикаций об исследованиях, в которых можно было продемонстрировать противовирусный эффект лекарственных средств на растительной основе. Комплексное гомеопатическое средство Медитонзин® [Meditonsin®] состоит из растительных компонентов, атропина и аконитина, и соли, цианида ртути (цианистая ртуть - Mercurius cyanatus), и уже используется в течение более 60 лет для лечения воспалений горла, полости носа и полости глотки. Клинические исследования подтверждают эффективность в лечении воспалений верхних дыхательных путей и хорошую переносимость.

В ЕР 0513878 описан раствор, содержащий, в числе прочего, 0,10 г хлорида цетилпиридиния, 0,004 г гидрохлорида атропина и 0,004 г цианида ртути(II) (в расчете на 100 мл). Противовирусный эффект раствора против вирусов гриппа, более точно, характеризуется цианидом ртути(II) и хлоридом цетилпиридиния.

Работа Wheeler et al., "The Effect of Atropine Sulfate on the Course of Influenza Virus Infection" [«Действие сульфата атропина на течение вирусной инфекции гриппа»], Science, 08.12.1944, Vol. 100, No. 2606, относится к противовирусному действию сульфата атропина (вирусы гриппа А). Однако фактически используемая концентрация атропина не указана. Кроме того, нет никаких доказательств непрерывного действия атропина против вирусов гриппа А. Напротив, эффект зависит от времени внутрибрюшинного введения по отношению к моменту инокуляции вируса подопытных животных.

В работе Z. Yamazaki et al., "Antiviral Effects of Atropine and Caffeine" [«Противовирусное действие атропина и кофеина»], J. Gen. Virol. (1980), 50, 429-431, описан противовирусный эффект атропина против герпесвирусов и вирусов гриппа. Максимальный эффект достигается при концентрации атропина 2 мМ.

В работе et al., "Cytotoxicity, antiviral and antimicrobial activities of alkaloids, flavonoids, and phenolic acids" [«Цитотоксичность, противовирусная и противобактериальная активность алкалоидов, флавоноидов и фенольных кислот»], Pharmaceutical Biology, 2011; 49(4): 396-402, описан, в числе прочего, противовирусный, противобактериальный, противогрибковый эффект многочисленных алкалоидов, а также их цитотоксичность. Описано противовирусный эффект атропина в диапазоне концентраций 0,8-0,05 μг/мл, например, против HSV1.

Исследования, лежащие в основе настоящего изобретения, показали, что, как ни удивительно, смесь атропина, аконитина и цианида ртути обладает сильными противовирусными свойствами. Особое внимание было уделено вопросу о том, в какой концентрации и на какие вирусы смесь действует. Сюда входило тестирование против вирусов простуды и герпесвирусов.

Таким образом, настоящая заявка на патент относится к неожиданному пониманию того, что фармацевтическая композиция, содержащая атропин или его соль, аконитин и цианид ртути, может с успехом применяться для лечения вирусных инфекций.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении демонстрируются противовирусные свойства смеси активных ингредиентов, атропин, аконитин и цианид ртути, в различных диапазонах концентраций. Можно было продемонстрировать, что ингибирование смесью активности всех тестируемых вирусов было от сильного до очень сильного.

Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей атропин или его соль, аконитин и цианид ртути для применения в способе лечения вирусной инфекции.

Краткое описание фигур

На Фигуре 1 показан противовирусный эффект фармацевтической композиции в соответствии с изобретением в зависимости от концентрации, измеренной как относительное ингибирование в процентах. В Таблице 3 представлены соответствующие отдельные значения.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей или, по существу, состоящий из: а) атропина или его соли; b) аконитина; и с) цианида ртути для применения в способе лечения вирусной инфекции.

Термин «фармацевтическая композиция», используемый здесь, включает, в частности, пероральные лекарственные формы, например, твердые, полужидкие или жидкие композиции для приема внутрь. Было установлено, что водный/этиловый раствор для капельного введения особенно эффективен. Например, смеси из 94% (г/г) этанола, 85% глицерина и очищенной воды в весовом соотношении 5:10:85 используются особенно успешно.

Однако в качестве альтернативы возможны и другие лекарственные формы, например, твердые пероральные лекарственные формы, такие как порошки, таблетки или капсулы. В частности, изготовление осуществляется в соответствии со стандартами по изготовлению гомеопатических лекарственных средств согласно Homoopathisches Arzneibuch 2012 (НАВ 2012) [Гомеопатическая фармакопея], официальное издание. Например, в соответствии с указаниями НАВ можно изготавливать тритурации, в которых исходные материалы истирают в порошок с моногидратом лактозы поэтапно. В качестве альтернативы можно прессовать таблетки из соответствующих тритураций. В связи с этим могут использоваться ограниченные добавки стеарата магния или бегената кальция в качестве смазывающего вещества и крахмала в качестве разрыхлителя. В случае гранулирования может использоваться водный раствор лактозы, этанол и подходящие концентрации крахмальных паст.

Кроме того, в соответствии с указанием 10 НАВ могут изготавливаться глобулы, причем сахарные глобулы равномерно смачивают 1/100 массовыми долями соответствующего разбавления и сушат на воздухе.

В дополнение к пероральным лекарственным формам фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может включать парентеральные средства, т.е. жидкие разведения для инъекций, а также жидкие линименты и мази, суппозитории, глазные капли, капли в нос, которые были изготовлены в соответствии с указаниями 11-15 и 45 НАВ. Как указывалось выше, предлагаемая фармацевтическая композиция в наиболее предпочтительном варианте осуществления представляет собой раствор для приема внутрь, который изготовлен в соответствии с указаниями Arzneibuch.

Формулировка «по существу состоит из» означает, что фармацевтическая композиция содержит эти компоненты в качестве активных компонентов. Тем не менее, она может дополнительно содержать один или несколько растворителей, эксципиентов и т.д., которые хотя и необходимы для изготовления фармацевтической композиции, не способствуют или не существенно способствуют фармакологической эффективности.

Одним из компонентов фармацевтической композиции является атропин. Атропин - это алкалоид тропана, который представляет собой рацемат изомеров (R) - и (S) - гиосциамин согласно следующей структурной формуле. (R) - форма показана в верхней части, (S) - форма внизу:

Атропин является частью парасимпатолитиков и конкурирует с нейротрансмиттер ацетилхолином на мускариновых рецепторах парасимпатической нервной системы. Физические эффекты при приеме внутрь атропина следующие: повышение частоты сердечных сокращений, расширение бронхов, уменьшение образования слюны и многое другое. Кроме того, были описаны другие, хотя и редкие, области применения, например, применение при спазмах желудочно-кишечного тракта, при затрудненном мочеиспускании и недержании мочи. Однако применение в качестве противовирусного агента до настоящего времени не было описано.

Соль атропина, используемая в соответствии с изобретением, как правило, представляет собой сульфат атропина, например, атропин сульфат моногидрат.

В композиции в соответствии с настоящим изобретением атропин или его соль применяют в концентрации от 1 до 100 μг/мл, предпочтительно от 1 до 10 μг/мл, более предпочтительно от 2 до 7 μг/мл и наиболее предпочтительно от 3,13 до 6,25 μг/мл. В соответствии с изобретением было установлено, что, если сульфат атропина используется в комбинации с другими компонентами фармацевтической композиции, допускается более низкая доза сульфата атропина (см. ниже). Другими словами, при более низкой концентрации можно достичь, по меньшей мере, сопоставимого, возможно, даже значительно лучшего противовирусного эффекта.

В качестве еще одного компонента фармацевтической композиции применяется аконитин. Аконитин является дитерпеноид алкалоидом, который замедляет инактивацию потенциалзависимого натриевого канала и тем самым продлевает приток ионов натрия во время потенциала действия нервов. Он действует в этом отношении прежде всего центрально и периферийно на моторные и сенсорные нервы, сначала стимулирующим образом с последующим параличом. Сердечные импульсы могут включать аритмии, брадикардии и остановку сердца во время диастолы. Для взрослых смертельная доза аконитина составляет приблизительно 5 мг. Аконитин имеет следующую структурную формулу:

Химическая молекулярная формула представляет собой C₃₄H₄₇NO₁₁. Противовирусная эффективность аконитина до настоящего времени не была описана.

Аконитин применяется в качестве активного компонента композиции в соответствии с настоящим изобретением в концентрации 0,05-100 μг/мл, например, 0,5-100 μг/мл, предпочтительно 0,05-5 μг/мл, более предпочтительно 0,5-2 μг/мл и наиболее предпочтительно 0,16-1,56 μг/мл аконитина. Также было установлено, что в комбинации с двумя другими активными компонентами фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением, а именно, цианидом ртути(II) и атропином, может быть достигнут синергический эффект, т.е. сверхаддитивный противовирусный эффект при той же или более низкой дозе отдельных компонентов.

Третьим компонентом фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением является цианид ртути ((Hg(CN)₂). Цианид ртути является высокотоксичным соединением, которое применяется только в гомеопатии для лечения дифтерии, тяжелой ангины и простуд.

Цианид ртути применяется в качестве компонента композиции в соответствии с данным изобретением в концентрации от 0,001 до 10 μг/мл, предпочтительно от 0,001 до 0,1 μг/мл, более предпочтительно от 0,001 до 0,01 μг/мл, наиболее предпочтительно 0,003-0,006 μг/мл цианида ртути в растворе.

Как указано выше, фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит комбинацию от 1 до 10 μг/мл атропина (или его соли), более конкретно, сульфата атропина, от 0,05 до 5 μг/мл аконитина и от 0,001 до 0,1 μг/мл цианида ртути. Было установлено, что для такой композиции предпочтительно готовить концентрацию каждого отдельного компонента на более низком уровне, чем в случае конкретного отдельного вещества. Например, фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением, например, в виде водного/этилового раствора, может содержать примерно 2-7 μг/мл, предпочтительно, 5 μг/мл сульфата атропина, примерно 0,5-2 μг/мл, предпочтительно 1 μг/мл, аконитина и примерно 0,001-0,1 μг/мл, предпочтительно 0,004 μг/мл, цианида ртути.

Предпочтительная композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит общую концентрацию приблизительно 3-9 μг/мл вышеуказанных ингредиентов. Как видно на Фигуре 1, наилучшие результаты в отношении противовирусной эффективности демонстрируются при общей концентрации 6 μг/мл; однако даже с более низкими значениями, например, при общей концентрации 3 μг/мл, были все же достигнуты отличные ингибирующие значения.

Особенно предпочтительный состав включает раствор этанола, глицерина и воды, в котором содержится примерно 5 μг/мл сульфата атропина, 1 μг/мл аконитина и 0,004 μг/мл цианида ртути. Как описано во введении, такая композиция уже известна и успешно продается на европейском рынке в течение десятилетий под названием «Медитонзин®». Было установлено, что, как ни удивительно, применение тройной комбинации демонстрирует синергетический эффект по отношению к противовирусной активности отдельных компонентов. Как можно заключить из примеров, так называемая смесь «Медитонзин» имеет противовирусный эффект от сильного до очень сильного, в частности против RSV, СА9, HRV14 и HSV1. Это действительно так, особенно если принимать во внимание тот факт, что концентрации отдельных компонентов, как используются в смеси, меньше, чем количества, используемые в каждом случае для индивидуальных тестов.

В Таблице 2 показано сравнение противовирусного эффекта между веществами сульфат атропина, аконитин и цианид ртути, а также их смесью. Приведенный результат измерения - это ингибирование образования бляшек в процентах. Например, ингибирование образования бляшек в процентах для смеси из 5 μг/мл сульфата атропин, 1 μг/мл аконитина и 0,004 μг/мл цианида ртути составляет, основываясь на HSV1, 69,53%. Это, как ни удивительно, высокое значение, если учитывать ингибирование образования бляшек отдельных веществ: приблизительно 35% в случае сульфата атропина, приблизительно 8% для аконитина и даже несколько отрицательное значение для цианида ртути. По сравнению с ожидаемым значением от отдельных измерений, ингибирующий эффект смеси на HSV1 почти в два раза выше. Кроме того, ингибирование образования бляшек почти 70% является отличным значением, которое иллюстрирует высокий терапевтический потенциал применяемой смеси.

Точно такие же удивительные результаты приведены в Таблице 2 в отношении Са9, RSV и HRV14. Здесь также обнаруживается сверхаддитивный эффект отдельных компонентов в смеси, который можно оценить как превышающий примерно в два раза по отношению к отдельным веществам.

Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением (смесь) вводят взрослому пациенту в виде суточной общей дозы примерно 20 μг/мл сульфата атропина, 4 μг/мл аконитина и 0,016 μг/мл цианида ртути. При этом допустимыми являются отклонения приблизительно ±30% от заданного количества.

Другими словами, взрослому пациенту в день вводят приблизительно 2-6 мл фармацевтической композиции, причем композиция имеет указанные выше концентрации. Доза уменьшается в два раза для детей в возрасте от 6 до 12 лет, и еще дополнительно снижается для маленьких детей в возрасте от 1 года, и составляет около 25% для детей в возрасте от 7 месяцев.

Настоящее изобретение далее будет разъяснено со ссылкой на следующие иллюстративные варианты осуществления, в которых будут представлены эффекты композиции в соответствии с настоящим изобретением.

Примеры:

Цель

Целью противовирусного тестирования, представленного ниже, было изучение противовирусного эффекта сульфата атропина, аконитина и цианида ртути и смеси этих трех веществ.

Стратегия тестирования

Противовирусное тестирование сульфата атропина, аконитина и цианида ртути и смеси этих трех веществ разделяется на два этапа. На первом этапе цитотоксичность тестируемых веществ тестируется при разных уровнях разведения для выяснения, с какого уровня разведения тестируемые вещества не оказывают цитотоксического эффекта на не инфицированные вирусом клеточные линии, выступающие в качестве носителя вируса. На втором этапе противовирусный эффект тестируемых веществ исследуется при разных уровнях разведения на используемых в тестировании вирусах, начиная с разведения тестируемого вещества, с которого цитотоксический эффект на клеточные линии не оказывается.

Материалы

Образцы для тестирования

Из сырьевых материалов, сульфата атропина (AT), аконитина (АС) и цианида ртути (QC), приготовили образцы для тестирования на токсичность и последующего тестирования на противовирусный эффект согласно следующей таблице.

Клетки

- Эпителиальные клетки человека (клетки НЕр-2) для инфекций вирусами RSV и HSV1

- Клетки зеленой обезьяны буффало (клетки BGM) для инфекций вирусом СА9

- Клетки HeLa для инфекций вирусом HRV14 (клеточная линия HeLa происходит из эпителиальных клеток человека рака шейки матки)

Вирусы

- Респираторно-синцитиальный вирус человека, длинный штамм (RSV)

- Вирус коксаки человека типа 9 (СА9)

- Герпесвирус человека типа 1 (HSV1)

- Риновирус человека типа 14 (HRV14, главная группа)

Эталонные контрольные образцы и лабораторные внутренние стандарты

- Рибавирин (Virazole®), ICN Pharmaceuticals, против RSV (5 μг/мл)

- Лабораторные внутренние стандарты (L-Std) против инфекций вирусом СА9 (L-Std, 6 μг/мл)

- Ацикловир (2,5 μг/мл) против HSV1

- Оксиметазолин гидрохлорид (OMZ, 10 μ/мл) против HRV14

Анализ на цитотоксичность для исключения возможной интоксикации клеточных культур

Цитотоксичность образцов для тестирования исследовали с помощью МТТ-анализа (тестирование на метаболизм). Анализируемые препараты для исследования метаболической эффективности в МТТ-анализе приготовили на 96-луночных планшетах для микротитрования; такие же анализируемые препараты для микроскопических анализов приготовили на 24-луночных планшетах для микротитрования.

МТТ-анализ

Принцип

Метаболическую эффективность в МТТ-анализе определили при помощи количественного анализа митохондриальной ферментативной активности. Колориметрический анализ Мосманна (Mosmann 1983) включает превращение бесцветной соли МТТ (диметилтиазол дифенилтетразолий бромид) в голубые, не растворимые в воде кристаллы формазана с помощью митохондриальных дегидрогеназ. При этом можно измерить прямую корреляцию между жизнеспособностью или метаболической эффективностью клеток и ферментативной активностью клеток.

Протокол испытаний

Тестирование на токсичность проводили после растворения и подготовки образцов для тестирования в соответствии с разделом 0. После этого следовали дальнейшие градации разведения log2 или log10 для всех тестируемых растворов. Все разведения тестируемого вещества добавляли в параллельные образцы для выращивания клеток BGM, НЕр-2 и HeLa. После этого обработанные клеточные культуры инкубировали в течение в общей сложности 3 дней или 5 дней при 37°С и 5% СО₂. Включенные контрольные образцы представляли собой клетки, содержащие только среду (необработанный контрольный образец) или содержащие 8, 4, 2, 1 и 0,004% этанол в среде (контрольный образец с этанолом).

Оценка

Исследование в МТТ-анализе проводили в день 1 и день 3 или день 1 и день 5 после добавления вещества. С этой целью обработанные клетки инкубировали в течение еще 2-4 часа с МТТ-раствором и после солюбилизации кристаллов формазана в диметилсульфоксиде (DMSO) оптическую плотность (OD) супернатантов клеточной культуры определяли в фотометре при 570 нм (RF690nm). По оценке, чем больше было поврежденных клеток, тем меньше было образовавшихся кристаллов формазана и ниже OD. Микроскопическую оценку измененной морфологии клеток проводили в день 3 или день 5 после добавления вещества с помощью критерия неизмененной морфологии клеток или с помощью увеличенных клеток с вакуолизацией в газон отдельных клеток.

Расчет относительной жизнеспособности в процентах (статистика Excel 2000)

Значения OD для необработанных контрольных образцов были определены как 100% жизнеспособность. Значения OD для анализируемых препаратов были соответственно представлены как значения в процентах (% токсичности). При помощи множества параллельных образцов можно было определить 50% ингибирующую дозу (IC₅₀) на кривых доза-ответ различных образцов для тестирования вплоть до концентрации, при которой совершенно отсутствует связанное с тестируемым веществом воздействие для использования в противовирусном тестировании.

Данные микроскопического исследования относительно анализа морфологии клеток

В параллельных препаратах для определения метаболической эффективности в ферментативном МТТ-анализе влияние тестируемых веществ на клетки определяли с помощью микроскопической оценки морфологии клеток в день 3 или в день 5 после подготовки анализа по следующим критериям:

- никаких изменений в морфологии клеток (-),

- клетки с незначительным формированием вакуолей (+),

- увеличенные клетки и интенсивное формирование вакуолей (++),

- закругленные клетки (+++)

- разрушенный газон клеток (++++),

- фиксированный газон клеток благодаря возможным поверхностно-активным ингредиентам (F) и

- благодаря осаждению компонентов среды на газоне клеток (N).

Тестирование противовирусного эффекта

Противовирусную активность исследовали количественно в анализах на уменьшение образования бляшек и в вирусспецифических ферментных иммуноанализах.

Примененные анализы

Анализ на уменьшение образования бляшек (БОЕ/мл)

Принцип

Для проведения анализов на уменьшение образования бляшек конфлюэнтно растущие клетки (газон клеток) были инфицированы раствором определенного вируса (M.O.I. = множественность инфекции). После одночасовой инкубации инокулят вируса удалили и клетки (газон клеток) отмыли. Затем инфицированные вирусом клетки покрыли физиологическими концентрациями вещества и добавили компонент твердой среды (агароза или метилцеллюлоза) и затем культивировали. Твердый компонент в наложенной среде ограничивает область инфекции, и поэтому формируется очаг инфицированных вирусом клеток («бляшка»). Различные анализируемые препараты культивировали до тех пор, пока можно было наблюдать под микроскопом число бляшек набора (M.O.I.) в необработанных вирусом контрольных образцах.

Оценка

Путем фиксации и окрашивания газона клеток можно было визуализировать вирусные бляшки в виде ярких колец в газоне клеток темного цвета. Число бляшек определяли с помощью системы обработки изображений.

Расчет ингибирования в процентах (% ингибирования, статистика Excel 2000)

Число бляшек в необработанном контрольном образце определили как 100% инфекцию. В отличие от этого число бляшек в различных анализируемых препаратах оценили таким образом, чтобы ингибирующие эффекты анализируемых веществ можно было показать как ингибирование вещества в процентах (% ингибирования).

Иммуноферментный анализ (ELISA) (анализ продуцирования вируса)

Принцип

В используемом в данном описании методе сэндвич-ELISA микротест-полоски покрыты антителами против конкретных вирусов. Вирусы, расположенные в супернатанте клеточной культуры инфицированных клеточных линий, связываются с фиксированными на твердой фазе антителами. Чтобы визуализировать реакцию, использовали меченые патоген-специфические детекционные антитела с фермент пероксидазой, эти антитела направлены против соответствующих вирусов. На следующем этапе добаляют субстрат/хромоген и перекись водорода и тетраметилбензидин, что приводит к реакции фермент-субстрат-хромоген с образованием синего красителя. Интенсивность цвета определяется фотометрически (поглощение) в фотометре на длине волны 450 нм (OD450); это пропорционально содержанию вирусного антигена.

Процедура

Продуцирование вируса в инфицированных и обработанных клетках проанализировали путем определения вирусных белков (консервативные вирусспецифические антигены в случае RSV) в ELISA. С этой целью конфлюэнтно растущие, чувствительные к вирусу, клетки (газон клеток) инфицировали определенным вирусным раствором (M.O.I.). После одночасовой инкубации инокулят вируса удалили и газон инфицированных клеток отмыли. После этого добавили физиологические концентрации вещества. Различные анализируемые препараты культивировали до тех пор, пока можно было наблюдать под микроскопом от 70% до 90% ЦПЭ [СРЕ] в необработанных вирусом контрольных образцах. Вновь синтезированные вирусы были расположены на этом этапе в супернатанте клеточной культуры. После этого содержащие вирусы супернатанты клеточной культуры удалили для анализа вирусных белков в ELISA.

Расчет ингибирования в процентах (% ингибирования, статистика Excel 2000)

Значения поглощения (OD 492nm) необработанных контрольных образцов по оценке фотометра после ферментной реакции в ELISA, определили как 100% инфекцию. В противоположность этому OD различных анализируемых препаратов оценили таким образом, чтобы ингибирующие эффекты анализируемых веществ можно было показать как ингибирование вещества в процентах (% ингибирования).

Протокол испытаний

Инфицированные вирусом клетки обработали тестируемыми веществами непосредственно после инфицирования. С этой целью чувствительные к вирусу клетки были инфицированы различными приготовленными вирусными растворами (НЕр-2: RSV, HSV1; BGM: СА9; HeLa: HRV14). Для противовирусного тестирования были приготовлены различные вирусные инфекции с промежуточной дозой инфекции (M.O.I. множественность инфекции) 0,0004 (RSV, HSV 1, HRV14) или 0,0003 (СА9).

Тест-растворы с различными уровнями разведения добавляли к инфицированным клеткам после проверки на возможную интоксикацию в анализах на жизнеспособность клеток. Серия разведения начиналась с не токсичных для клеток концентраций 50 μг/мл (образцы для тестирования №1 и №2), 2 μг/мл (образец для тестирования №3) и 6 μг/мл (образец для тестирования №4). Разведение проводили в градациях log2 или log₁₀. В Таблице 1 показаны концентрации образца для тестирования, используемые в противовирусном тестировании.

Количественный анализ противовирусной активности был выполнен в анализе на уменьшение образования бляшек путем подсчета вирусных бляшек в день 3 до дня 5 после подготовки анализа с помощью системы обработки изображений. Кроме того, в случае с RSV в дополнение к экспериментам, связанным с анализом вирусных бляшек, супернатанты клеточной культуры инфицированных и обработанных клеток были протестированы на содержание вновь синтезированных вирусных белков в ферментном иммуноферментном анализе (ELISA) в аналогично реализованных анализируемых препаратах.

Тест-систему проверяли с помощью активных противовирусных веществ: рибавирин (Virazole®) против RSV, ацикловир (Zovirax®) против HSV1 и оксиметазолин гидрохлорид (OMZ) против HRV14. Концентрация 10 μг OMZ /мл, 5 μг рибавирина на мл или 2,5 μг ацикловира на мл при использовании M.O.I. 0,0004 дала в среднем снижение инфекционности примерно 50-60%. В случае с СА9 были учтены лабораторные внутренние стандарты. Лабораторные внутренние стандарты были установлены такие, чтобы можно было продемонстрировать 50% - 70% снижение инфекционности. Кроме того, в дополнение к положительным контрольным образцам в тест-систему был включен этанольный растворитель различных тест-растворов в конечной концентрации 0,8% (№1, №2), 0,0043% (№3) и 0,048% (№4) EtOH в среде (MEM). Это дало возможность установить, что никакого влияния на развитие вирусных бляшек или на инфекционность вирусов не было.

Синергетический эффект смеси сульфата атропина, аконитина и цианида ртути

В Таблице 2 приведены значения для противовирусного эффекта, измеренные на основании процентного ингибирования активности вируса, сульфата атропина, аконитина и цианида ртути, а также смеси этих трех веществ. В отношении отдельных веществ приводятся только те значения измерений, которые были измерены в диапазонах концентраций, соответствующих таковым отдельных веществ в смеси. В смеси присутствовали следующие концентрации веществ: 5 μг/мл сульфата атропина, 1 μг/мл аконитина и 0,004 μг/мл цианида ртути.

Таблица 2 четко показывает, что, во-первых, общий эффект смеси больше, чем собственный эффект веществ, и, во-вторых, противовирусный эффект смеси основан не на добавлении противовирусного эффекта отдельных веществ, а на синергическом эффекте. Например, если имеется дополнительный эффект в отношении противовирусного эффекта на HSV1, значения измерения смеси должны были бы составить от 22,69 до 51,73, но это не так. На самом деле, смесь демонстрирует значение 69,53.

Настоящее изобретение относится к медицине, конкретно к фармацевтической композиции, содержащей атропин или его соль; аконитин и цианид ртути для применения в способе лечения вирусной инфекции, вызванной вирусом герпеса, респираторно-синцитиальным вирусом человека (RSV), риновирусами и/или энтеровирусами. Композиции обладают широким терапевтическим спектром, лучшей переносимостью и меньшим количеством лекарственных взаимодействий и не подвержены риску развития резистентности. 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

1. Фармацевтическая композиция для использования в способе лечения вирусной инфекции, содержащая

a) от 1 до 10 μг/мл атропина или его соли;

b) от 0,05 до 5 μг/мл аконитина; и

c) от 0,001 до 0,1 μг/мл цианида ртути,

отличающаяся тем, что вирусная инфекция вызвана вирусом герпеса, RSV (респираторно-синцитиальным вирусом человека), риновирусами и/или энтеровирусами.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что вирусная инфекция вызвана HRV14 (риновирусом человека типа 14), HSV1 (вирусом простого герпеса типа 1) и/или СА9 (вирусом Коксаки человека типа 9).

3. Фармацевтическая композиция по одному или нескольким из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что композиция присутствует в виде водного/этанольного раствора и содержит примерно 5 μг/мл сульфата атропина, примерно 1 μг/мл аконитина и примерно 0,004 μг/мл цианида ртути.

4. Фармацевтическая композиция по одному или нескольким из пп. 1-2, отличающаяся тем, что композиция содержит 2-7 μг/мл, наиболее предпочтительно 3,13-6,25 μг/мл сульфата атропина.

5. Фармацевтическая композиция по одному или нескольким из пп. 1-2, отличающаяся тем, что композиция содержит 0,5-2 μг/мл, наиболее предпочтительно 0,16-1,56 μг/мл аконитина.

6. Фармацевтическая композиция по одному или нескольким из пп. 1-2, отличающаяся тем, что композиция содержит 0,001-0,01 μг/мл, наиболее предпочтительно 0,003-0,006 μг/мл цианида ртути.

7. Фармацевтическая композиция по одному или нескольким из пп. 1-2, отличающаяся тем, что композицию вводят в виде суточной дозы примерно 20 μг/мл сульфата атропина, 4 μг/мл аконитина и 0,016 μг/мл цианида ртути.