ПРОИЗВОДНОЕ 3-ГИДРОКСИПИРИДИНА С АНКСИОЛИТИЧЕСКОЙ И НООТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2018 года по МПК A61K31/4425 C07D213/18 A61P25/22 A61P25/28 

2-Этил-6-метил-3-гидроксипиридин (далее ЭМГП) - аналог витамина В6, изучение его и его солей было начато еще в 80-х годах прошлого столетия [6, 12].

В настоящее время предложены соли ЭМГП с гликолевой, малоновой, винной, этановой и другими органическими карбоновыми кислотами [RU 2246486, опубл. 20.02.2005; RU 2284993, опубл. 10.10.2006; RU 2357955, опубл. 10.06.2009; RU 2365582, опубл. 27.08.2009; RU 2377237, опубл. 27.12.2009; RU 2394815, опубл. 20.07.2010; RU 2442774, опубл. 20.02.2012; RU 2454406, опубл. 27.06.2012; RU 2547728, опубл. 10.04.2015; RU 2540070, опубл. 27.01.2015].

Известно, что соли ЭМГП обладают антиоксидантной [http://www.stm-journal.ru/_resources/item/77/fields/File/STM_2_2010_p22_25.pdf; RU 2444358, опубл. 10.03.2012; RU 2398583, опубл. 10.09.2010; RU 325908, опубл. 10.06.2008], антигипоксической [RU 2284993, опубл. 10.10.2006; RU 2442774, опубл. 20.02.2012; RU 2440132, опубл. 20.01.2012; RU 2398583, опубл. 10.09.2010; RU 2326665, опубл. 20.06.2008], гипогликемической, гиполипидемической, нейропротекторной и вестибулопротекторной [RU 2454406, опубл. 27.06.2012; RU 2547728, опубл. 10.04.2015], метаболической и кардиопротекторной [RU 2365582, опубл. 27.08.2009], анксиолитической [RU 2284993, опубл. 10.10.2006] активностью.

Наиболее широко применяются гидрохлорид ЭМГП (эмоксипин) [10], янтарнокислая соль ЭМГП (мексидол, мексикор) [11] и малонат ЭМГП [9].

Ближайшим аналогом (прототипом) 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина ацексамата (как по химическому строению, так и по фармакологическим свойствам), широко применяющимся в последние годы в медицинской практике, является 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат (мексидол).

Этот препарат рекомендован к применению при острой и хронической недостаточности мозгового кровообращения, связанных с ней заболеваний, в том числе церебральных инсультов и их последствий, при дисциркуляторной энцефалопатии, вегетососудистой дистонии, невротических и неврозоподобных расстройствах с появлением тревоги, эмоционального напряжения [2, 3, 8], при сочетанном ишемическом поражении сердца и мозга [5].

Мексидол оказывает нейропротекторное и ноотропное действие, уменьшает выраженность дефицита функций ЦНС при старении, обладает антиамнестическим действием на различных моделях амнезий и противогипоксическим эффектом. Ноотропный и нейропротекторный эффекты мексидола дополняются анксиолитическим, противосудорожным и антистрессорным действием [4].

Мексидол разрешен для широкого медицинского применения и проявил эффективность при лечении невротических и неврозоподобных расстройствах, однако в клинике препарат не всегда эффективен и более того, мексидол имеет недостаточную ноотропную активность [7], поэтому представляется логичным поиск новых лекарственных средств среди других солей ЭМГП [1].

Целью настоящего изобретения явилось получение нового производного 3-гидроксипиридина - 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина ацексамата (ЭМГПА) с анксиолитической и ноотропной активностью.

Поставленная цель была достигнута путем синтеза новой соли ЭМГП - 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина ацексамата (ЭМГПА).

Синтез осуществляли путем взаимодействия эквимолярных количеств 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина и N-ацетил-6-аминогексановой кислоты. N-ацетил-6-аминогексановую кислоту получали известными методами путем взаимодействия 6-аминогексановой кислоты с ацетилхлоридом или ангидридом уксусной кислоты.

В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, термометром и обратным холодильником, загружают 40 мл спирта этилового, затем при перемешивании постепенно добавляют 2,74 г (0,02 м) 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина, после растворения добавляют 3,46 г (0,02 м) N-ацетил-6-аминогексановой кислоты. Полученный раствор фильтруют, отгоняют растворитель, остаток перекристаллизовывают из изопропилового спирта. Получают 5,6 г белого кристаллического порошка с Т_пл 105-107°С, который растворим в воде.

Найдено, %: С 61,87; Н 8,53; N 8,96 C₁₆H₂₆N₂O₄

Вычислено, %: С 61,91; Н 8,44; N 9,03; О 20,62

ИК-спектр, v, см^-1: 3270 (NH); 2560 (N⁺); 1610 (С=С аром); 1545 (NHCO).

Подлинность подтверждали методом масс-спектрометрии (МС/МС) с использованием тройного квадрупольного масс-спектрометра АВ Sciex QTrap 3200 MD (АВ Sciex, Сингапур) с электрораспылительным источником ионов (Turbo V с зондом TurboIonSpray): полярность - положительная; раствор 250 нг/мл; растворитель - ацетонитрил с водой 50:50 с добавлением 0,1% муравьиной кислоты; потенциал ввода - 5 В; газ завесы - 20 psi; напряжение источника +5500 В; газ распылителя - 14 psi; энергия столкновения - 30 В; время накопления сигнала - 1 мин; скорость подачи газа - 10 мкл/мин; потенциал декластеризации +84 В.

Для идентификации 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина ацексамата были определены MRM-переходы mz 311,4→m/z 57; m/z 114,1 и m/z 83 (Фиг. 1, Фиг. 2).

Наличие у ЭМГПА анксиолитической и ноотропной активности подтверждали результатами оценки этих видов активности в экспериментах на животных. С этой целью использованы следующие тесты;

- «открытое поле» (ОП) (Хаунина Р.А., Лапин И.П. 1976 г., Воронина Т.А. 1982; Гельман В.Я., Кременевская С.И., 1990);

- «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) (Pellow S. et al., 1985);

- «условный рефлекс пассивного избегания» (УРПИ) (Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П., 1991; Воронина Т.А., Островская Р.У., 2005);

- «экстраполяционное избавление» (ТЭИ) (Бондаренко Н.А. и др., 2003).

Обработку полученных данных проводили с использованием статистических методов оценки результатов исследования, которые позволяют оценить степень фармакологической эффективности.

Эксперименты выполнены с использованием белых беспородных крыс обоего пола. Животных содержали в стандартных условиях вивария в соответствии с действующими Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). Перед постановкой эксперимента грызуны проходили карантин в течение 10-14 дней. Результаты исследования обработаны статистически с применением стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2003. Для ряда выборок вычисляли среднюю арифметическую и среднюю квадратическую ошибку. Определение нормальности распределения переменных проводили на основании гистограмм распределения, величины асимметрии и эксцессы. Для оценки достоверности различий выборок, имеющих нормальное распределение, применяли параметрический t-критерий Стьюдента (парный и непарный). За достоверное принимали различие при уровне вероятности 95% и более (р<0,05).

Изучение анксиолитической активности проводили с использованием тестов «Открытое поле» и «Приподнятый крестообразный лабиринт».

Тест «Открытое поле»

Оценку влияния исследуемого соединения на ориентировочно-исследовательское поведение крыс осуществляли в тестах «открытое поле» и «норковый рефлекс».

Исследования проводили на специальной круглой площадке белого цвета с высокими бортами. Пол площадки имел отверстия и был расчерчен на три ряда секторов одинаковой площади, соизмеримых с размерами крыс. Оценивали влияние ЭМГПА на горизонтальную двигательную активность крыс (по числу выходов подопытных животных в центр площадки и общее число пересеченных квадратов на периферии), на вертикальную двигательную активность (по числу «вертикальных стоек» - вставаний крыс на задние лапки) и на «норковый рефлекс» (по числу обследований подопытными животными отверстий, находящихся в полу площадки).

Анализ результатов экспериментального исследования показал, что при курсовом применении в течение месяца ЭМГПА приводило к существенному изменению ориентировочно-исследовательского поведения подопытных крыс (табл. 1-4).

Было выявлено, что применение ЭМГПА приводит к повышению «норкового» рефлекса, горизонтальной и вертикальной двигательной активности у подопытных животных.

Достоверное повышение уровня ориентировочно-исследовательского поведения подопытных животных, уменьшение тревоги, страха, неуверенности под влиянием исследованной соли ЭМГПА свидетельствует о наличии у нее анксиолитической активности.

Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт»

Влияния ЭМГПА на выраженность эмоциональной реакции страха и тревоги у испытуемых животных и выявления анксиолитической активности оценивали в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт».

Эксперимент проводили в установке (лабиринте), состоящей из центральной площадки размером 10×10 см, от которой крестообразно расходятся под прямым углом четыре рукава размерами 50×10 см каждый. Два противоположный рукава открытых, без стенок и два закрытых, ограниченных по бокам окрашенными в темный цвет бортами высотой 40 см. Лабиринт приподнят над уровнем пола на 80 см.

Крыс помещали на центральную площадку лабиринта мордочкой к открытому рукаву и в течение 5 минут вели наблюдение за ними. В тесте регистрировали: число заходов в закрытые рукава (ЗР) лабиринта, выходов в открытые рукава (ОР), суммарное время пребывания в закрытых и открытых рукавах, вертикальную активность (число стоек), количество «выглядываний» на открытые рукава и число «свешиваний» с них.

При длительном курсовом применении производных 3-оксипиридина были отмечены существенные изменения в поведении подопытных крыс. Было установлено, что через четыре недели применения производных 3-оксипиридина увеличилось число выходов и время нахождения подопытных крыс в открытых рукавах лабиринта. Следует отметить, что мексидол в этом отношении действовал слабее, чем ЭМГПА (табл. 5).

Обращает на себя внимание тот факт, что под влиянием производных 3-оксипиридина увеличилось число «свешиваний» на открытых рукавах (эпизодов, когда животное перегибалось через край открытых рукавов). Под влиянием ЭМГПА число «свешиваний» на открытых рукавах составило в среднем 3,6±0,4 раза. Приведенные данные подтверждают, что новая соль ЭМГПА оказывает выраженное противотревожное действие у грызунов.

Влияние ЭМГПА на частоту дефекации (число фекальных болюсов) и груминг (число актов косметического поведения - умывания) у грызунов исследовали для дополнительной оценки уровня их психоэмоционального напряжения в лабиринте. Отмечено, что ЭМГПА при курсовом применении снижал частоту дефекации и груминг у подопытных животных.

Увеличение времени нахождения в открытых рукавах, числа заходов в них и «свешиваний» с открытых рукавов лабиринта свидетельствует о наличии анксиолитического эффекта у ЭМГПА.

Изучение ноотропного действия

В тестах условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) и экстраполяционного избавления (ТЭИ) оценивали влияние ЭМГПА на обучаемость, формирование и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения.

Тест «Условная реакция пассивного избегания» (УРПИ)

Эксперимент проводили в установке, представляющей собой закрытый ящик, состоящий из двух отсеков, разделенных перегородкой: темного («опасного») с электродным полом и светлого с ярко освещенной платформой. Отсеки сообщаются между собой через отверстие в перегородке, которое имеет выдвижную вертикальную дверцу. Сверху темный отсек снабжен плотно подогнанной открывающейся наверх крышкой.

Тест выполняли в несколько этапов. Первый этап заключался в выработке рефлекса избегания аверсивного фактора, на последующих этапах выполнялась оценка степени обучения животных и сохранность у них памятного следа в динамике через 24 часа, 7 и 14 суток. На этапе обучения животных регистрировали следующие показатели: время от момента помещения животного в середину площадки до первого захода в темный отсек (латентный период первого захода) и количество заходов в него. В эксперименте сравнивали латентный период первого захода животных в темный отсек и количество заходов в него в тесте воспроизведения памятного следа с аналогичными показателями при обучении. Увеличение латентного периода и уменьшение числа заходов указывает на обученность животного и сохранность в памяти информации об аверсивности темного отсека.

Во второй серии экспериментов изучены ноотропные свойства ЭМГПА с использованием амнезирующего воздействия. Крыс подвергали воздействию электросудорожного шока. Электросудорожный шок (ЭШ) вызывается через электроды, наложенные на поверхность ушных раковин (10-100 мА, 0,2-0,5 с) крыс непосредственно после выработки условной реакции пассивного избегания. ЭШ вызывает амнезию УРПИ, которая выражается в уменьшении латентного времени захода в темный опасный отсек и в увеличении времени пребывания в темном отсеке.

Ноотропный эффект во всех случаях выражается в устранении амнезирующего действия ЭШ, что характеризуется увеличением латентного времени захода в темную камеру и уменьшением времени нахождения в ней при воспроизведении рефлекса.

При моделировании амнезии, вызванной электроконвульсивным шоком, производные 3-оксипиридина статистически значимо увеличивали латентный период первого захода в темный отсек, уменьшали количество заходов в него и число животных в группе с амнезией УРПИ, проявляя таким образом антиамнестический эффект, свидетельствующий об их ноотропной активности.

Увеличение латентного периода захода животными в темный отсек, уменьшение количества заходов в него и время пребывания в нем в динамике и на фоне вызванной амнезии свидетельствует о наличии ноотропного эффекта у ЭМГПА (табл. 6 и 7).

Тест «экстраполяционное избавление» (ТЭИ)

Эксперимент проводили в пластиковом аквариуме цилиндрической формы высотой 32 см, заполненном водой с температурой 18-20°С на 17,5 см. Аквариум содержал стеклянный цилиндрический колпак диаметром 9 см и высотой 18,5 см, края которого погружались в воду на 2,5 см. Эксперимент выполняли в два этапа: выработка у животных условного рефлекса избавления и проверка сохранности навыка экстраполяционного избавления в динамике через 24 часа, 7 и 14 суток.

На этапе обучения регистрировали следующие показатели: время от момента погружения животного в воду до начала активного плавания (латентный период двигательной активности), время иммобилизации (животное пассивно плавает в воде со слегка поднятой головой, все четыре конечности неподвижны), количество прыжков в колпаке (активные попытки выпрыгнуть из воды) и время от момента погружения животного в воду до подныривания под края колпака (латентный период подныривания).

Эксперимент воспроизведения навыка экстраполяционного избавления у животных выполняли следующим образом: обученное животное помещали в аквариум под колпак. В течение трех минут за ним велось визуальное наблюдение. При оценке когнитивных функций регистрировали наиболее значимые показатели: латентный период двигательной активности (характеристика скорости ориентировочных реакций); латентный период подныривания (показатель способности к экстраполяции, чем меньше значение показателя, тем выше скорость решения экстраполяционной задачи). В эксперименте сравнивали показатели, определяющие степень обученности животного и состояние памяти: латентный период подныривания животного при обучении и воспроизведении навыка экстраполяционного избавления (чем значительнее он уменьшается при воспроизведении навыка, тем больше обученность животного и сохранее памятный след).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что животные получавшие производные 3-оксипиридина быстрее решали задачу экстраполяционного избавления аверсивной среды. Латентный период подныривания у них был статистически значимо ниже, чем у контрольных крыс. Наиболее эффективным в этом отношении была соль ЭМГПА (таб. 8).

В тесте экстраполяционного избавления ЭМГПА проявил тенденцию к уменьшению показателя латентного периода подныривания на этапе выработки рефлекса подныривания и на этапах воспроизведения навыка (через 24 часа, 7 и 14 суток после обучения), что указывает о наличия у него ноотропных свойств.

Проведенные исследования показывают, что ЭМГПА обладает анксиолитической активностью и ноотропными свойствами.

Лекарственное средство, содержащие в качестве действующего вещества 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина ацексамат, в зависимости от выбранных носителей и целевых добавок может быть изготовлено в любой твердой или жидкой лекарственной форме.

Список используемой литературы

1. Богомолова О.А., Демидова М.А. Влияние новых производных 3-оксипиридина на ориентировочно-исследовательское поведение крыс // Верхневолжский медицинский журнал. - 2015. - Т. 14. - №4. - С. 33-37.

2. Воронина Т.А., Смирнов Л.Д., Горяйнова И.И. Механизм действия и обоснование применения препарата мексидол в неврологии: методические рекомендации. М.: Ин-т биохимической физики, НИИ фармакологии РАМН. 2002. с. 14.

3. Воронина Т.А. Перспективы применения антиоксидантов при гипоксии мозга. III Росс. конф. Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция. 2002. октябрь. С .7-9.

4. Воронина Т.А., Островская Р.У. Методические указания по изучению ноотропной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. Р.У. Хабриева. - 2-е изд. - М.: ОАО Изд-во «Медицина», 2005. - С. 308- 320.

5. Журздина Я.В. Медведева Л.А. Применение мексидола при хронической ишемии сердца и мозга. III Росс. конгресс по патофизиологии. Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология). 2004, ноябрь 9-12.

6. Обухова Л.К., Эмануэль Н.М. Роль свободнорадикальных реакций окисления в молекулярных механизмах старения живых организмов // Успехи химии. - 1983. - Т. 52. - С. 353-372.

7. Суслина З.А., Смирнова И.Н., Танашян М.М. и др. Клиническая эффективность мексидола и влияние его на реологические свойства крови и гемоперфузию головного мозга при хронических формах цереброваскулярных заболеваний. - М., 2002. - 19 с.

8. Федин А.И., Румянцева С.А., Миронова О.П., Евсеев В.Н. Применение антиоксиданта «Мексидол» у больных с острым нарушением мозгового кровообращения: методические рекомендации. М.: РГМУ. 2002. с. 16.

9. Справочник лекарственных средств [электронный ресурс] - свободный доступ из сети инернет http://www.vidal,ru/poisk_jpreparatov/etoxydol.htm

10. РЛС. Энциклопедия лекарств. - 16-й вып. / Гл. ред. Г.Л. Вышковский. - М.: «РЛС-2008», 2007. - С. 1014 [электронный ресурс] - свободный доступ из сети инернет http://medi.ru/doc/a070196.htm.

11. РЛС. Энциклопедия лекарств. - 16-й вып. / Гл. ред. Г.Л. Вышковский. - М.: «РЛС-2008», 2007. - С. 537 [электронный ресурс] - свободный доступ из сети инернет http://medi.ru/doc/a070196.htm.

12. Emanuel L.M., Obukhova L.K. Types of experimental delay in aging patterns // Exp. Gerontol. - 1978. - Vol. 13. - P. 25-29.

Примечание: * - различия с контролем (изотонический раствор натрия хлорида) достоверны (р<0,05);

^# - различия с препаратом сравнения (раствором пирацетама 200 мг/кг) достоверны (р<0,05).

Примечание: * - различия с контролем (изотонический раствор натрия хлорида) достоверны (р<0,05);

^# - различия с препаратом сравнения (раствором пирацетама 200 мг/кг) достоверны (р<0,05).

Примечание: * - различия с контролем (изотонический раствор натрия хлорида) достоверны (р<0,05);

^# - различия с препаратом сравнения (раствором пирацетама 200 мг/кг) достоверны (р<0,05).

Примечание: * - различия с контролем (изотонический раствор натрия хлорида) достоверны (р<0,05);

^# - различия с препаратом сравнения (раствором пирацетама 200 мг/кг) достоверны (р<0,05).

Примечание: * - различия с контролем (изотонический раствор натрия хлорида) достоверны (р<0,05);

^# - различия с препаратом сравнения (раствором мексидола 45 мг/кг) достоверны (р<0,05)

Обозначения: ЛП - латентный период (время, с); ТО - темный отсек; КЗ -количество заходов в темный отсек.

* - различия с контролем (изотонический раствор натрия хлорида) достоверны (р<0,05);

^# - различия с препаратом сравнения (раствором мексидола 45 мг/кг) достоверны (р<0,05).

Обозначения: ЛП - латентный период (время, с); ТО - темный отсек; КЗ -количество заходов в темный отсек; N/n - количество животных в группе, посетивших темный отсек (N) из общего числа (n); % - процент животных в группе, посетивших темный отсек.

* - различия с контролем (изотонический раствор натрия хлорида) достоверны (р<0,05);

^# - различия с препаратом сравнения (раствором мексидола 45 мг/кг) достоверны (р<0,05);

Обозначения: ЛП - латентный период (время, с); ДА - двигательная активность; ЛПП - латентный период подныривания (время,»с); ЧП - число прыжков внутри цилиндра.

* - различия с контролем (изотонический раствор натрия хлорида) достоверны (р<0,05)

^# - различия с препаратом сравнения (раствором мексидола 45 мг/кг) достоверны (р<0,05).

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, а именно к созданию нового, малотоксичного (LD₅₀ 520 мг/кг), биологически активного вещества, обладающего анксиолитическим и ноотропным действием. Предлагается новое соединение 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина ацексамат структурной формулы (1) в качестве средства, обладающего анксиолитическим и ноотропным действием. 2 ил., 8 табл.

2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина ацексамат

в качестве лекарственного средства, из группы производных 3-гидроксипиридина, с анксиолитической и ноотропной активностью.