Способ применения дигидрохлорида N,N’-бис-(2,3-бутадиенил)-1,4-диаминобутана (MDL72.527) для подавления репродукции вируса гепатита С Российский патент 2018 года по МПК A61K31/13 A61P1/16 A61P31/14 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины, а именно, к новому способу ингибирования репликации вируса гепатита С (ВГС) за счет ингибирования катаболизма биогенных полиаминов спермина и спермидина. Данное изобретение может быть использовано для создания противовирусных препаратов, том числе для терапии ВГС-инфекции.

Уровень техники

Известно, что вирус гепатита С является широко распространенным и опасным патогеном человека. По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) им инфицировано около 71 млн пациентов с хроническим гепатитом С [Hepatitis С. WHO fact sheet #164, октябрь 2017]. Эта же организация оценивает количество смертей от гепатита С как 399 тыс в год [Hepatitis С. WHO fact sheet #164, октябрь 2017]. Первичное заражение вирусом переходит к хроническому гепатиту в 60-80% случаев. Хронический гепатит С резко повышает риски развития у пациента цирроза и рака печени, которые и являются основными причинами его смерти. Так, риск развития цирроза за 20 лет у пациентов с хроническим гепатитом С оценивается как 15-30% [Hepatitis С. WHO fact sheet #164, октябрь 2017].

Терапия хронического гепатита С основана на использовании интерферона альфа и его производных или/и препаратов прямого действия, которые являются ингибиторами РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса (белок NS5B), протеазы (белок NS3) или ингибиторами функций регуляторного белка NS5A [European Association for the Study of the Liver. EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis С virus infection. J. Hepatol., 2014., 60(2)392-420; L.M. Hagan et al., All-oral, interferon-free treatment for chronic hepatitis C: cost-effectiveness analyses. J Viral Hepat. 2013, 20(12), 847-857]. Их использование в различных сочетаниях позволяет излечивать более 95% пациентов с хроническим гепатитом С.Одним из факторов, резко ограничивающих использование таких препаратов, является их крайне высокая стоимость, делающая терапию недоступной для большинства пациентов [L.M. Hagan et al., All-oral, interferon-free treatment for chronic hepatitis C: cost-effectiveness analyses. J Viral Hepat. 2013, 20(12), 847-857]. В то же время отсутствуют лекарственные препараты, одобренные для лечения гепатита С, которые бы блокировали его репродукцию за счет воздействия на белки клетки-хозяина. Считается, что преимуществом таких препаратов может быть воздействие в отношении всех генотипов и изолятов вируса и неспособность последнего вырабатывать к ним резистентность [J.M. Baugh et al. Host-targeting agents in the treatment of hepatitis C: A beginning and an end? Antiviral Res., 100, 555-561].

Соединения такого класса как биогенные полиамины играют важную роль в разнообразных процессах прокариотических и эукариотических клеток [L. Miller-Fleming et al. Remaining Mysteries of Molecular Biology: The Role of Polyamines in the Cell. J. Mol. Biol, 2015., 427, 3389-3406; A.E. Pegg., Mammalian polyamine metabolism and function. IUBMB Life. 2009, 61(9), 880-894]. К этому классу соединений относятся спермин и спермидин, а также их метаболитический предшественник путресцин. Спермин и спермидин присутствуют в клетках и тканях в субмилимолярных и милимолярных концентрациях. Уровни полиаминов в клетках регулируются несколькими ферментами их метаболизма. Скорость-лимитирующая стадия биосинтеза полиаминов заключается в превращении орнитина в путресцин, катализируемая орнитиндекарбоксилазой (ODC). Катаболизм полиаминов происходит по двум путям. Первый заключается в ацетилировании спермина и сперминида спермидин/спермин-К'-ацетилтрансферазой (SSAT) с последующим превращением ацетилполиаминов в спермидин и путресцин, соответственно, при участии ацетилполиаминоксидазы (АРАО). Второй представляет собой прямое превращение спермина в спермидин, катализируемое сперминоксидазой (SMO). Реакции, катализируемые SSAT и SMO, являются скорость-лимитирующими стадиями катаболизма полиаминов.

Изменение их концентраций часто имеет место при развитии разнообразных заболеваний, включая онкологические, аутоиммунные и бактериальные инфекции [L. Miller-Fleming et al. Remaining Mysteries of Molecular Biology: The Role of Polyamines in the Cell. J. Mol. Biol, 2015, 427, 3389-3406; R.A. Casero and A.E. Pegg. Polyamine catabolism and disease. Biohem J. 2009. 421, 323-338; V. Broshtilova et al, Polyamine metabolism changes in psoriasis. Indian J Dermatol. 2013, 58(4), 306-309] В связи с этим, одним из перспективных подходов к лечению онкологических и аутоиммунных заболеваний считается воздействие на уровни полиаминов при помощи химических ингибиторов или индукторов ферментов их метаболизма. К таким соединениям относят DFMO и DENSpm [L. Miller-Fleming et al. Remaining Mysteries of Molecular Biology: The Role of Polyamines in the Cell. J. Mol. Biol, 2015, 427, 3389-3406; R.A. Casero and A.E. Pegg. Polyamine catabolism and disease. Biohem J. 2009. 421, 323-338; R.A. Casero Jr and L.J. Maton. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases. Nat Rev Drug Discovery. 2007, 6, 373-390]. DFMO является необратимым ингибитором ODC и вследствие этого блокирует биосинтез полиаминов, a DENSpm представляет собой индуктор SSAT, способный вызывать ускорение катаболизма полиаминов. Оба вещества вызывают снижение уровней полиаминов и поэтому рассматриваются как потенциальные противораковые препараты.

Данные о связи полиаминов с вирусными инфекциями немногочисленны. С 1990х годов опубликовано всего несколько работ, описывающих взаимосвязь полиаминов с вирусами Эбола и Марбурга [М.Е. Olsen et al, mBio. 2016, 7(4), e00882-16], Зика и Чикунгунья [B.C. Mounce et al, Interferon-Induced Spermidine-Spermine Acetyltransferase and Polyamine Depletion Restrict Zika and Chikungunya Viruses. Cell Host & Microbe, 2016, 20, 167-177] и вируса гепатита С [О.А. Smirnova et al. Biochemical and Biophysical Research Communicationsio 2017, 483, 904-909]. Кроме того, показано, что дифторметилорнитин (DFMO, eflornithine), ингибитор биосинтеза полиаминов обладает противовирусной активностью против широкого спектра вирусов, не включающего впрочем вируса гепатита С [B.C. Mounce et al. Inhibition of polyamine biosynthesis is a broad-spectrum strategy against RNA viruses. J.Virol, 90 (21), 9683-9692]. Описана также противовирусная активность DENSpm (индуктора катаболизма полиаминов) против вирусов коксаки и везикулярного стоматита [B.C. Mounce et al. Inhibition of polyamine biosynthesis is a broad-spectrum strategy against RNA viruses. J.Virol, 90 (21), 9683-9692].

Раскрытие изобретения

Сущность изобретения заключается в использовании дигидрохлорида N,N'-бис-(2,3-бутадиенил)-1,4-диаминобутана (MDL72.527), известного ингибитора сперминсинтазы и ацетилполиаминоксидазы и представляющего собой производное путресцина, для подавления репликации вируса гепатита С.

Задачей предлагаемого изобретения является создание новых, высокоэффективных, селективных и малотоксичных антивирусных агентов для лечения вируса гепатита С.

Результатом является новый способ блокирования репродукции вируса гепатита С при помощи дигидрохлорида N,N'-бис-(2,3-бутадиенил)-1,4-диаминобутана (MDL72.527). Найдено, что при использовании данного вещества возможно ингибировать репликацию вируса в неинфекционной системе репликона вируса и в инфекционной системе репродукции вируса (HCVcc). Следует отметить, что до настоящего момента ингибиторы ферментов катаболизма полиаминов не рассматривались как противовирусные агенты. Более того, это является первым примеров использования веществ - регуляторов метаболизма полиаминов для подавления репродукции вируса гепатита С.

Краткое описание фигур

Фиг 1. Показывает относительные уровни РНК вируса гепатита С в клетках Huh7, несущих полноразмерный репликон вируса в контроле (H2O) и в присутствии 25 мкМ MDL72.527. Уровни РНК вируса нормализованы на уровни мРНК (3-актина. За "1" принят относительный уровень РНК ВГС в отсутствии MDL72.527.

Фиг 2. Показывает относительные уровни РНК вируса гепатита С в клетках Huh7.5, обработанных 1-100 мкМ MDL72.527, инфицированных вирусом гепатита С через 24 ч после внесения веществ и выдержанных в течение дополнительных 6 суток. Уровни РНК вируса нормализованы на уровни мРНК р-глюкоронидазы. За "1" принят относительный уровень РНК ВГС в клетках в отсутствии MDL72.527.

Осуществление изобретения

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, предназначенными для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но которые при этом не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.

Пример 1 Оценка цитотоксичности MDL72.527

Цитотоксичность препарата оценивали путем добавления его разведений в воде к клеткам печени/гепатомы Huh7 или Huh7.5 в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки телят и 2 мМ глутамин, помещенной в лунки 96-луночного планшета ("ТРР", Швецария), до конечных концентраций 5-100 мкМ (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°С в течение 3 суток. Посевная концентрация составляла 4×10⁴ клеток на лунку. Контролем служили клетки без добавления препарата. Жизнеспособность клеток подсчитывали через 72 ч после внесения веществ при помощи окраски живых клеток красителем МТТ с последующим количественным измерением образующегося формазана. Токсичность различных доз препарата определяли по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным результатам строили дозозависимую кривую и определяли концентрацию, на 50% снижающую жизнеспособность клеток (ЦТД₅₀). Даже при 100 мкМ концентрации количество жизнеспособных клеток не достигало 50% от контроля.

Пример 2

Оценка способности MDL72.527 подавлять репродукцию вируса гепатита С в неинфекционной системе репликона вируса in vitro

Влияние исследуемых соединений на репродукцию вируса гепатита С в системе репликона в культуре клеток Huh7 исследовали путем добавления его разведений в воде к клеткам печени/гепатомы Huh7, несущим репликон I389/NS3-3'/LucUbiNeo/ET [Frese et al, J. Gen Virol, 2003, 74, 1253-1259] в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки телят и 2 мМ глутамин, помещенной в лунки 6-луночного планшета ("ТРР", Швецария), до конечной концентрации 25 мкМ (по три лунки) с последующим культивированием при 37°С в течение 3 суток. Посевная концентрация составляла 5×10⁵ клеток на лунку. Контролем служили клетки без добавления препарата. Титр репликона определяли лизированием клеток, выделением тотальной РНК, получением соответствующей кДНК при помощи гексамерного олигонуклеотида случайной последовательности и обратной транскриптазы Mint (Евроген, Москва) и измерением уровня РНК вируса полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени, нормируя уровни мРНК вируса на урвони мРНК Р-актина.

Из Фиг. 1 видно, что MDL72.527 эффективно подавлял репликацию вируса гепатита С, снижая титр его РНК на два порядка.

Пример 3

Оценка способности MDL72.527 подавлять репродукцию вируса гепатита С в инфекционной клеточной системе вируса in vitro

Влияние исследуемых соединений на репродукцию вируса гепатита С в инфекционной системе репликации вируса в культуре клеток Huh7.5 исследовали путем добавления его разведений в воде к клеткам Huh7.5 в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки телят и 2 мМ глутамин, помещенной за 24 ч в лунки 6-луночного планшета ("ТРР", Швецария), до конечных концентраций 1-100 мкМ (по три лунки на каждую дозу) с внесением вируса гепатита С (множественность инфекции составляла 0,1 вирион/клетка) через 24 ч после добавления вещества и инкубированием в течение дополнительных шести дней. Посевная концентрация составляла 3×10⁵ клеток на лунку. Контролем служили клетки без добавления препарата. Титр РНК вируса определяли лизированием клеток, выделением тотальной РНК, получением соответствующей кДНК при помощи гексамерного олигонуклеотида случайной последовательности и обратной транскриптазы Mint (Евроген, Москва) и измерением уровня РНК вируса полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени, нормируя уровни мРНК вируса на урвони мРНК Р-глюкоронидазы. Противовирусную активность различных доз препарата определяли по титру РНК вируса относительно контроля.

Из Фиг. 2 очевидно, что MDL72.527 эффективно подавлял репликацию вируса гепатита С, снижая титр его РНК в клетках.

Изобретение относится к медицине и касается способа подавления репликации вируса гепатита С при помощи ингибитора ферментов катаболизма биогенных полиаминов N,N'-бис(2,3-бутадиенил)-1,4-бутандиамин гидрохлорида (MDL72.527). Соединение подавляет репродукцию вируса гепатита С в микромолярных концентрациях в культурах инфицированных клеток и в культуре клеток, несущих субгеномный репликон вируса. Способ позволяет расширить арсенал противовирусных средств. 3 пр., 2 ил.

Способ применения дигидрохлорида N,N'-бис-(2,3-бутадиенил)-1,4-диаминобутана (MDL72.527) для подавления репродукции вируса гепатита С путем добавления к клеткам печени/гепатомы, несущим репликон вируса гепатита С или инфицированных данным вирусом.