Способ снижения летальности от радиационного воздействия у экспериментальных животных Российский патент 2019 года по МПК G09B23/28 G09B23/26 A61F9/07 A61K35/26 A61P37/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к радиологии и экспериментальной медицине и предназначено для снижения летальности от радиационного поражения.

Учитывая активное развитие атомной энергетики, а также ядерного оружия, разработка методик, позволяющих скорректировать последствия радиационного поражения и снизить летальность после воздействия больших доз облучения - крайне актуальный вопрос современной медицины. Кроме того, поскольку в качестве угрозы радиационного воздействия в первую очередь рассматривается неожиданное воздействие радиации, то на первый план выходят не профилактические радиозащитные препараты, а лечебные средства, способные снизить летальность при применении в постлучевой период (Баранов А.Е., Рождественский Л.М. Аналитический обзор схем лечения острой лучевой болезни, используемых в эксперименте и клинике // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2008. - Т. 48. - №. 3. - С. 287-302.).

Гамма-излучение оказывает влияние на весь организм, однако чувствительность разных органов и тканей к радиации неодинакова. Повышенной радиочувствительностью отличаются красный костный мозг, семенники, хрусталики глаз (Василенко И.Я., Василенко О.И. Радиация и человек // Проблемы глобальной безопасности. - 2002. - №. 6. - С. 13-16.). Также к «органам-мишеням» радиационного воздействия можно отнести тимус (Пальцев М.А. и др. Нейроиммуноэндокринные механизмы старения // Успехи геронтологии. - 2009. - Т. 22. - №. 1. - С. 24-36.). Тимус - это центральный орган иммунной системы, и радиационное поражение тимуса не может не отобразиться на Т-клеточном звене иммунитета. Таким образом, при равномерном воздействии радиации в больших дозах (до 10 Гр) часто наиболее значимым звеном патогенеза развития острой лучевой болезни является именно миело- и иммунодепрессия.

В настоящее время широко разрабатываются способы коррекции последствий облучения. Одной из групп препаратов, применяемых в данных способах и направленных на коррекцию последствий лучевого воздействия являются цитокиновые препараты (Neta R., Oppenheim J.J. Cytokines in therapy of radiation injury // Blood, 1988, V. 72, №3, p. 1093-1095; Баранов A.E. и др., Аналитический обзор схем лечения острой лучевой болезни, используемых в эксперименте и клинике // Радиационная биология. Радиоэкология, 2008, Т. 48, №3, с. 287-302). Так, в уровне техники известно применение такого препарата интерлейкина-1-бета, как Беталейкин (патент РФ 98107188/13, от 23.04.1998 г.). Беталейкин применяют в качестве средства экстренной противолучевой терапии при острых аварийных тотальных и субтотальных воздействиях ионизирующего излучения, препарат обладает иммуностимулирующим действием, стимулирует кроветворение и раннее постлучевое восстановление. Недостатком данного препарата является необходимость введения в пределах первых 2 часов после лучевого воздействия, однако очевидно, что в условиях неожиданного облучения, этот срок может быть недостаточным, чтобы обеспечить всех пострадавших препаратом. Кроме того, применение Беталейкина может приводить к развитию пирогенной реакции.

Крайне перспективным видится применение трансплантационного подхода для коррекции последствий острого лучевого поражения. Работы по трансплантации клеток костного мозга и стволовых клеток крови после облучения имеют более чем полувековую историю. Однако, эффективность и целесообразность данной процедуры до сих пор спорна. До 1986 года велись единичные попытки трансплантации аллогенного костного мозга и стволовых клеток крови для коррекции последствий облучения, которые не могли быть однозначно интерпретированы (Баранов А.Е. и др., Аналитический обзор схем лечения острой лучевой болезни, используемых в эксперименте и клинике // Радиационная биология. Радиоэкология, 2008, Т. 48, №3, с. 287-302). После аварии на Чернобыльской АЭС, жертвам этого происшествия было выполнено 13 пересадок аллогенного костного мозга, однако эффективность данной процедуры не была высока (Баранов А.Е. и др., Трансплантация костного мозга после облучения пострадавших при аварии Чернобыльской АЭС, Гематология и трансфузиология, 1989, №3, с. 3-16). Стоит заметить, что основным недостатком данной процедуры является часто развивающийся иммунный конфликт между клетками донора и реципиента, что приводит к реакции «трансплантат против хозяина».

Избежать/минимизировать данное побочное действие можно, использую трансплантацию от гистосовместимого донора, однако процедура поиска подходящего донора проблематична, что приводит к неизбежному дефициту донорского материла. Другой альтернативой является трансплантация аутологичных клеток костного мозга (собственные клетки костного мозга), которые при трансплантации не вызывают иммунной реакции. Из уровня техники найдена методика ретрансплантации клеток костного мозга, забранных у экспериментальных животных сразу после облучения (Rozhdestvensky L., Sernichenko, А. Experimental approach to improving early postirradiation restorationи in the hemopoietic system of irradiated canines // Journal of radiation research, 2004, V. 45, №. 1, p. 45-51). Методика показала свою эффективность на собаках, однако, недостатком предложенного подхода является необходимость забора костного мозга практически сразу после облучения, что может быть трудноосуществимо в реальных условиях.

Как было указано выше, радиация оказывает выраженное пагубное влияние на ткань тимуса, что является одним из важных факторов, способствующих лимфоцитопении и пострадиацонному иммунодефициту. Из чего можно сделать вывод, что коррекция поражений тимуса - одно из перспективных направлений в разработке радиозащитных препаратов.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ снижения летальности после радиационного воздействия у экспериментальных животных, выбранный нами за прототип, заключающийся в том, что после облучения лабораторному животному проводят аллогенную трансплантацию фрагментов тимуса, забранного от животных препубертатного возраста того же вида, в переднюю камеру глаза через разрезы роговицы длиной 1,5-2 мм, помещая фрагменты трансплантата общим объемом 4±1 мм³ на радужную оболочку глаза с максимальным удалением от разреза (Куликов А.В. и др., Атопически трансплантированные ткани тимуса способны дистантно изменять метаболический статус организма // Биофизика, 2008, Т. 53, вып. 6, с. 1141-1149). Иммунологическая привилегированность передней камеры глаза позволяет избежать отторжения трансплантата без применения иммуносупрессивных препаратов.

Недостатком данного способа является отсутствие указаний о периоперационном применении препаратов с мидриатическим и анестетическим действием. Очевидно, что нанесение на глаз перед операцией мидриатика приводит к уменьшению площади радужной оболочки и помогает избежать повреждений структур глаза, богатых капиллярами; нанесение препарата, обладающего анестетическим действием, снижает чувствительность животного к манипуляции, эти процедуры могу существенно улучшить технический результат способа. Кроме того, в данной работе нет уточнений, где необходимо наносить разрез на роговицу глаза, очевидно, что разрез нанесенный, например, на 6-9 часах по воображаемому циферблату будет приводить к выдавливанию трансплантата при «умывании» животного. Также в прототипе не указано, что непосредственно перед введением трансплантата необходимо аспирировать из передней камеры глаза внутриглазную жидкость по объему равную объему трансплантата, эта манипуляция позволяет избежать повышения внутриглазного давления после введения трансплантата. Кроме того, в статье отсутствуют данные о том, какую часть передней камеры глаза должен занимать трансплантат, другими словами, не указан объем вводимого трансплантата по сравнению с объемом передней камеры глаза, что не позволяет адаптировать методику для животных с существенно большим или меньшим размером передней камеры глаза. Также в статье нет указаний, в какой период после облучение эффективнее всего проводить трансплантацию ткани тимуса в переднюю камеру глаза.

Таким образом, существует потребность в способе снижения летальности облученных животных, лишенном вышеуказанных недостатков.

Техническим результатом изобретения является повышение эффективности способа за счет нанесения на глаз препаратов с мидриатическим и анестетическим действием непосредственно перед операцией, определение наиболее оптимального участка для нанесения разреза на роговице, определения оптимального эффективного объема вводимого трансплантата, аспирации внутриглазной жидкости из передней камеры глаза непосредственно перед введением трансплантата по объему равную объему трансплантата, а также за счет определения оптимального времени проведения манипуляции после облучения.

Этот технический результат достигается за счет того, что в предлагаемом способе снижения летальности после радиационного воздействия у экспериментальных животных, лабораторному животному после облучения проводят трансплантацию измельченных фрагментов аллогенного тимуса, забранного от животных препубертатного возраста того же вида, в переднюю камеру глаза через разрез роговицы длиной 1,7±0,3 мм, помещая трансплантат непосредственно на радужной оболочке глаза максимально удаленно от разреза, животным-реципиентам непосредственно перед операцией закапывают в глаза препараты, обладающие мидриатическим и анестетическим действием, разрез делают на верхне-переднем участке роговицы глаз, на 12-14 часах по воображаемому циферблату на левом глазу или на 10-12 часах по воображаемому циферблату на правом глазу, из передней камеры глаза предварительно аспирируют 5-10% внутриглазной жидкости, при этом общий объем трансплантата равен объему удаленной из передней камеры глаза жидкости, трансплантацию проводят на 3 сутки после радиационного воздействия.

Способ осуществляют следующим образом.

Эскпериментальным животным, подвергшимся облучению, проводят трансплантацию аллогенной ткани тимуса в переднюю камеру глаза на 3 сутки после облучения. В качестве доноров аллогенной ткани тимуса используют экспериментальных животных препубертатного возраста, поскольку именно в этот период потенциал пролиферации клеток тимуса максимален (например, у крыс - это животные в возрасте 30-35 суток - что соответствует массе 100-120 г). Выделение и подготовку ткани тимуса осуществляют непосредственно перед трансплантацией. Для забора тимуса животных-доноров усыпляют путем введения летальной дозы анестетика, после чего извлекают орган, в емкости со средой Игла тимус механически измельчают до фрагментов размером 1,0±0,4 мм³.

Трансплантацию фрагментов тимуса в переднюю камеру глаза животным-реципиентам проводят под общей анестезией (Золетил + Ксилазин). Животным-реципиентам непосредственно перед операцией на глаз наносят препарат с мидриатическим действием (мы использовали по 1 капле 0,1%-раствора атропина), что позволяет уменьшить площадь радужной оболочки и избежать повреждения богатых капиллярами структур глаз; также для снижения чувствительности роговицы перед операцией в глаз закапывают препарат, обладающий анестетическим действием (мы наносили по 1 капле 0,5%-раствора дикаина). Выбор конкретных препаратов внутри указанных фармакологических групп не оказывает существенного влияния на эффективность предлагаемого способа, важен сам факт преоперационного использования данных групп препаратов для достижения предлагаемого технического результата.

На роговицу одного глаза наносят разрез длиной 1,7±0,3 мм. Разрез делают на верхне-заднем участке роговицы, на 10-12 часах по воображаемому циферблату на правом глазу или на 12-14 часах по воображаемому циферблату на левом глазу. Такое расположение разреза позволяет минимизировать риск выдавливания трансплантата при умывании животного и добиться лучшего технического результата. Для сохранения давления в структурах глаза из передней камеры глаза удаляют внутриглазную жидкость в количестве 5-10% от общего объема передней камеры глаза. В разрез роговицы вводят измельченные трансплантируемые фрагменты тимуса, при этом общий объем трансплантата равен объему удаленной из передней камеры глаза жидкости. Фрагменты тимуса помещают как можно дальше от разреза и располагают непосредственно на радужной оболочке. Выбор именно такого диапазона объема вводимого трансплантата по отношению к объему передней камеры глаза обусловлен тем, что при меньшем объеме может быть не достигнут достаточный терапевтический эффект для нейтрализации последствий радиационного воздействия и развившейся у животных лучевой болезни. Оптимальным объемом вносимого трансплантата будет являться 5-10% от объема передней камеры глаза, тогда как при большем - трансплантат может перекрывать зрачок и влиять на зрительную функцию животных-реципиентов. При объеме трансплантата 5-10% от общего объема передней камеры глаза зрительная функция изменена несущественно и при компактном расположении фрагментов тимуса на радужной оболочке, избегая области зрачка, практически сводится к нулю, однако терапевтический эффект в данном случае проявит себя максимально.

Проведение трансплантации по предлагаемому способу отсрочено, а именно на 3 сутки после радиационного воздействия, является очень важным фактором удобства применения для снижения летальности от радиационного воздействия у экспериментальных животных по сравнению с методами, позволяющими снизить летальность только при экстренном их использовании (в первые сутки или даже часы после радиационного воздействия).

Пример 1. Эксперимент был проведен на крысе Wistar (возраст животного 3 месяца) облучение осуществляли гамма-лучами ⁶⁰Со с мощностью дозы 1,5-1,6 Гр/мин, доза облучения составила 8 Гр. Через 3 суток после облучения была осуществлена трансплантация ткани тимуса по предлагаемому способу. Из передней камеры левого глаза микропипеткой аспирировали внутриглазную жидкость в количестве 10% от общего объема передней камеры глаза с последующим внесением общего объема трансплантата, равного объему удаленной из передней камеры глаза жидкости. Животное было оставлено на выживание в стандартных условиях вивария с ежедневным контролем. После радиационного воздействия срок жизни животного составил 6 месяцев. Учитывая, что облучение крысы в дозе 8 Гр без лечения приводит к гибели большинства животных в течение месяца, полученный результат говорит о высокой эффективности предлагаемого способа.

Пример 2. Эксперимент проведен на крысе Wistar (возраст животного 3 месяца), облучение осуществляли гамма-лучами 60Со с мощностью дозы 1,5-1,6 Гр/мин, доза облучения составила 8 Гр. Через 3 суток после облучения была осуществлена трансплантация ткани тимуса по предлагаемому способу. Из передней камеры левого глаза микропипеткой аспирировали внутриглазную жидкость в количестве 7% от общего объема передней камеры глаза с последующим внесением общего объема трансплантата, равного объему удаленной из передней камеры глаза жидкости. Фрагменты были расположены компактно, с удалением от области зрачка. Животное было оставлено на выживание в стандартных условиях вивария с ежедневным контролем, нарушения зрительных функций отмечено не было, трансплантат сохранил свою локализацию до конца жизни животного. После радиационного воздействия срок жизни животного составил 13 месяцев. Полученный результат говорит о высокой эффективности предлагаемого способа.

Таким образом, разработанный способ позволяет высокоэффективно снизить летальность экспериментальных животных после облучения, отличается технической простотой, отсутствием отторжения трансплантата без необходимости сопутствующего введения иммуносупрессивных препаратов и поиска гистосовместимого донора.

Изобретение относится к области медицины, а именно к радиологии и экспериментальной медицине. Для снижения летальности от радиационного поражения лабораторному животному после облучения проводят трансплантацию измельченных фрагментов аллогенного тимуса, забранного от животных препубертатного возраста того же вида, в переднюю камеру глаза через разрез роговицы длиной 1,7±0,3 мм. Помещают трансплантат непосредственно на радужную оболочку глаза максимально удаленно от разреза. Животным-реципиентам непосредственно перед операцией закапывают в глаза препараты, обладающие мидриатическим и анестетическим действием. Разрез делают на верхнепереднем участке роговицы глаз на 12-14 часах по воображаемому циферблату на левом глазу или на 10-12 часах по воображаемому циферблату на правом глазу. Из передней камеры глаза предварительно аспирируют 5-10% внутриглазной жидкости. Общий объем трансплантата равен объему удаленной из передней камеры глаза жидкости. Трансплантацию проводят на 3 сутки после радиационного воздействия. Способ позволяет снизить летальность от радиационного воздействия у экспериментальных животных за счет определения оптимального эффективного объема вводимого трансплантата и определения оптимального времени проведения манипуляции после облучения. 2 пр.

Способ снижения летальности от радиационного воздействия у экспериментальных животных, заключающийся в том, что лабораторному животному после облучения проводят трансплантацию измельченных фрагментов аллогенного тимуса, забранного от животных препубертатного возраста того же вида, в переднюю камеру глаза через разрез роговицы длиной 1,7±0,3 мм, помещая трансплантат непосредственно на радужной оболочке глаза максимально удаленно от разреза, отличающийся тем, что животным-реципиентам непосредственно перед операцией закапывают в глаза препараты, обладающие мидриатическим и анестетическим действием, разрез делают на верхнепереднем участке роговицы глаз на 12-14 часах по воображаемому циферблату на левом глазу или на 10-12 часах по воображаемому циферблату на правом глазу, из передней камеры глаза предварительно аспирируют 5-10% внутриглазной жидкости, при этом общий объем трансплантата равен объему удаленной из передней камеры глаза жидкости, трансплантацию проводят на 3 сутки после радиационного воздействия.