ЛАКТОФЕРРИН, УЛУЧШЕНИЕ ПАМЯТИ И ПОВЫШЕНИЕ СКОРОСТИ ОБУЧЕНИЯ У ДЕТЕЙ Российский патент 2019 года по МПК A61K38/40 A61P25/00 A23L33/19 A23L29/281 A23C9/20 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение по существу относится к развитию когнитивной функции у детей. Более конкретно, в настоящем изобретении представлено применение лактоферрина для улучшения памяти, и/или повышения скорости обучения, и/или для стимуляции созревания головного мозга у детей в физиологических, т.е. непатологических условиях. В одном аспекте настоящее изобретение демонстрирует возможность использования лактоферрина для улучшения долговременной памяти, например, долговременной памяти местоположения у здорового ребенка.

Уровень техники

Лактоферрин (LF) представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 80 кДа, связанный с фракцией молочной сыворотки и образованный из 703 аминокислотных остатков и одной-четырех молекул концевых остатков сиаловой кислоты (Sia) на их N-связанных олигосахаридных цепях. Первоначально лактоферрин был выделен из молока, но также обнаружен в других физиологических жидкостях, включая слезы, слюну, вагинальные жидкости, семенную жидкость, носовые и бронхиальные секреты, желчь, жидкости желудочно-кишечного тракта и мочу. В особенно большом количестве он присутствует в молозиве (6 г/л) и зрелом молоке (2 г/л) [1-4]. Он относится к семейству трансферринов и также известен как лактотрансферрин (LTF). Лактоферрин выполняет множество биологических функций у детей, таких как регулирование всасывания железа в кишечнике, иммунного ответа, антиоксидантных, антиканцерогенных, противовоспалительных свойств и защиты от микробной инфекции [5, 6].

Материнское молоко рекомендовано всем детям. Однако в некоторых случаях грудное вскармливание является недостаточным, или неуспешным, или не рекомендовано по медицинским показаниям, или мать отказывается от грудного вскармливания либо полностью, либо на период более нескольких недель. Для этих ситуаций были разработаны детские смеси. В настоящее время растворимые детские смеси часто применяются для обеспечения дополнительного или полностью искусственного питания в раннем возрасте. Их можно применять для питания детей вместо или в дополнение к материнскому молоку. Поэтому сегодня их часто разрабатывают так, чтобы по составу и функции они были максимально похожи на материнское молоко.

Недавно были получены доказательства того, что грудное вскармливание может обеспечивать долгосрочные когнитивные преимущества. Однако лежащие в основе механизмы, объясняющие взаимосвязь между грудным вскармливанием и когнитивным развитием, все еще не выяснены. Лактоферрин является вторым по содержанию белков в человеческом молоке и уступает только казеинам [7]. Интересно, что в каждой молекуле лактоферрина присутствует от одного до четырех остатков сиаловой кислоты, и эксперименты на животных позволяют предположить, что сиаловая кислота может участвовать в обучении и памяти [8, 9].

Таким образом, авторы изобретения решили, что лактоферрин может выполнять функцию условного питательного вещества для развития головного мозга и когнитивной функции у детей при быстром росте головного мозга. В таком случае потребление лактоферрина в раннем возрасте должно оказывать значительное воздействие на структуру и функцию головного мозга в период от плода до старшего возраста.

Познание относится к способностям к обработке информации, включая восприятие, обучение, память, рассудительность и решение проблем. Оценка когнитивной функции представляет собой центральный аспект неврологических исследований взаимосвязи между механизмом и функциями. В целом считается, что для обучения и памяти необходимы высшие функции головного мозга, а не приобретение простых нейронных реакций [10, 11].

В частности, память представляет собой психическую способность организма запоминать, хранить и вспоминать информацию. Процессы памяти, которые можно изучать, включают в себя: (1) знание (что запоминать); (2) понимание (что это означает); (3) контекст/функцию (зачем запоминать); и (4) стратегию (как запоминать). Память представляет собой сложный физиологический процесс, который не является независимым от процесса в одной области памяти. Память связана с несколькими другими когнитивными областями, включая сенсорную память, слуховую память и зрительную память.

Аспекты памяти включают в себя:

Память представляет собой процесс, в котором информация кодируется, хранится и извлекается. Кодирование позволяет информации, поступающей из внешнего мира, достигать органов чувств животного в форме химических и физических стимулов. Хранение представляет собой вторую стадию или процесс памяти. Оно подразумевает, что животное, такое как человек, сохраняет информацию в течение периодов времени. Наконец, третий процесс представляет собой извлечение информации, которая была сохранена. Такая информация должна быть локализована и передана обратно в сознание.

Кратковременная память (КВП) позволяет вспомнить что-либо в течение периода от нескольких секунд до минуты без повторения. Кратковременная память кодирует, например, слуховую информацию, поддерживается временными структурами нейронной связи и зависит от областей лобной доли (особенно дорсолатеральной префронтальной коры) и париетальной доли, в которых элементы хранятся в течение лишь нескольких секунд.

Рабочая память в некоторой степени перекрывается с кратковременной памятью. Она определяется как активная система для временного хранения, обработки и манипулирования информацией, необходимой для выполнения сложных когнитивных задач (например, обучения, рассуждения и осмысления).

Рабочая память животного означает кратковременную память на объект, стимул или местоположение, которая применяется в рамках сеанса тестирования, но, как правило, не между сеансами.

Долговременная память (ДВП) поддерживается более стабильными и постоянными изменениями нейронных связей, широко распространенных по всему головному мозгу, и может сохраняться на протяжении всего нескольких дней или вплоть до десятилетий. Долговременная память может хранить гораздо большие объемы информации. Без гиппокампа новые воспоминания не могут храниться в долговременной памяти.

Пространственная память. В когнитивной психологии и неврологии пространственная память является частью памяти, ответственной за регистрацию информации об окружающей среде животного и его пространственной ориентации. Часто ведутся дискуссии о том, что как у людей, так и у других животных пространственные воспоминания обобщаются в виде когнитивной карты. Пространственная память представлена в рамках рабочей, кратковременной и долговременной памяти. Исследование указывает на наличие конкретных областей головного мозга, связанных с пространственной памятью.

Память местоположения, которую также называют памятью местоположения объектов, представляет собой важную форму пространственной памяти, содержащую разные подкомпоненты, каждый из которых обрабатывает конкретные типы информации в рамках памяти, т.е. запоминание объектов, запоминание положений, запоминание местоположения объектов по отношению друг к другу и связывание этих элементов в памяти.

Обучение представляет собой приобретение новых или изменение и укрепление имеющихся знаний, моделей поведения, навыков, ценностей или предпочтений и может включать объединение различных типов информации.

При оценке возможности использования животной модели для изучения когнитивной функции, такой как обучение и память, необходимо определить, какой вид лучше всего подходит.Возможность использования свиней в педиатрических исследованиях головного мозга была обнаружена более 40 лет назад. Это связано со схожестью роста всего головного мозга в момент рождения, макроскопической анатомии, особенностей роста головного мозга новорожденного с таковыми у человека. Пищеварительная система свиньи обладает физиологией и анатомической структурой, схожей с человеческими детьми, и имеет сравнимые требования к питательным веществам. Поэтому поросенок идеально подходит для координированного диетологического, метаболического и молекулярного исследования [8]. Свинья способна заполнить брешь между доклиническими исследованиями на грызунах и клиническими исследованиями у людей [11, 12].

В некоторых исследованиях была рассмотрена потенциальная польза лактоферрина в качестве пищевой добавки:

WO 2010/130641 относится к здоровью и развитию нейронов в кишечнике ребенка. Было показано, что композиции, содержащие лактоферрин, подходят для стимуляции нервной системы кишечника, восстановления пораженной нервной системы кишечника и лечения или профилактики расстройств, связанных с задержкой развития нервной системы кишечника.

WO 2010/130643 относится к здоровью и развитию головного мозга у детей. Было показано, что композиции с добавлением лактоферрина подходят для лечения или профилактики задержки развития головного мозга или нервной системы, в частности, у детей с задержкой внутриутробного развития (ЗВУР) (как показано в модели индуцированных дексаметазоном преждевременных родов).

WO 2010/130646 относится к здоровью головного мозга и защите головного мозга у взрослых. Было показано, что композиции с добавлением лактоферрина подходят для сохранения когнитивной функции и профилактики снижения когнитивной функции и развития когнитивных расстройств.

WO 2013/076101 относится к белому веществу головного мозга. Было показано, что композиции, содержащие лактоферрин, подходят для стимуляции развития белого вещества головного мозга, лечения или профилактики задержки развития белого вещества головного мозга и лечения или профилактики утраты белого вещества головного мозга.

US 2013/0150306 относится к питательным композициям на основе молока, содержащим лактоферрин. В частности, описано введение лактоферрина, источником которого не является человек, ребенку с целью модулирования физиологического стресса.

Ни в одном из этих исследований не был рассмотрен вопрос памяти и обучения у здоровых детей.

Раскрытие изобретения

Таким образом, задачей настоящего изобретения является представить дополнительные полезные области применения лактоферрина.

Цель настоящего изобретения достигнута посредством объекта изобретения, указанного в независимых пунктах формулы изобретения. В зависимых пунктах формулы изобретения представлены конкретные варианты осуществления изобретения.

Задачу настоящего изобретения решают путем применения лактоферрина для улучшения памяти у здорового ребенка.

В одном варианте осуществления память представляет собой пространственную память, предпочтительно память местоположения.

В одном варианте осуществления память представляет собой долговременную память, предпочтительно долговременную пространственную память, более предпочтительно долговременную память местоположения.

Задачу настоящего изобретения дополнительно решают путем применения лактоферрина для повышения скорости обучения у здорового ребенка.

Задачу настоящего изобретения дополнительно решают путем применения лактоферрина для стимуляции созревания головного мозга у здорового ребенка.

В одном варианте осуществления лактоферрин вводят здоровому ребенку в суточной потребляемой дозе в диапазоне от 100 до 400 мг/кг массы тела/сутки, или от 105 до 350 мг/кг массы тела/сутки, или от 125 до 350 мг/кг массы тела/сутки, или от ПО до 300 мг/кг массы тела/сутки, предпочтительно от 140 до 290 мг/кг массы тела/сутки, или от 120 до 270 мг/кг массы тела/сутки, или от 145 до 285 мг/кг массы тела/сутки.

В предпочтительном варианте осуществления суточная потребляемая доза лактоферрина представляет собой среднюю дозу, например, в диапазоне от 100 до 200 мг/кг массы тела/сутки, или от 100 до 175 мг/кг массы тела/сутки, или от ПО до 160 мг/кг массы тела/сутки, или от 120 до 150 мг/кг массы тела/сутки, предпочтительно 128 мг/кг массы тела/сутки или 145 мг/кг массы тела/сутки. В настоящем документе «среднюю дозу» можно также называть «промежуточной дозой» или «достаточной дозой».

В особенно предпочтительном варианте осуществления лактоферрин вводят здоровому ребенку в средней суточной потребляемой дозе (например, указанной в предыдущем параграфе) для повышения скорости обучения и/или улучшения долговременной памяти.

В другом предпочтительном варианте осуществления суточная потребляемая доза лактоферрина представляет собой высокую дозу, например, в диапазоне от 220 до 320 мг/кг массы тела/сутки, или от 225 до 325 мг/кг массы тела/сутки, или от 250 до 350 мг/кг массы тела/сутки, или от 230 до 310 мг/кг массы тела/сутки, или от 240 до 300 мг/кг массы тела/сутки, предпочтительно 252 мг/кг массы тела/сутки или 285 мг/кг массы тела/сутки.

В конкретном предпочтительном варианте осуществления лактоферрин вводят здоровому ребенку в высокой суточной потребляемой дозе (например, указанной в предыдущем параграфе) для улучшения долговременной памяти, в особенности долговременной памяти местоположения.

В одном варианте осуществления суточную потребляемую дозу лактоферрина разделяют на по меньшей мере две, предпочтительно по меньшей мере три, наиболее предпочтительно четыре части.

В одном варианте осуществления лактоферрин представлен в пригодной к употреблению внутрь композиции, предпочтительно в жидкой пригодной к употреблению внутрь композиции, которую выбирают из группы, состоящей из продуктов питания для человека, питательных композиций для матерей, молока для детей до 1 года, молока для детей старше 1 года, детских смесей и детского питания и напитков.

В одном варианте осуществления лактоферрин присутствует в жидкой пригодной к употреблению внутрь композиции в концентрации в диапазоне от 0,1 до 2 г/л, предпочтительно от 0,25 до 1,5 г/л, наиболее предпочтительно от 0,5 до 1,0 г/л.

В предпочтительном варианте осуществления лактоферрин присутствует в жидкой пригодной к употреблению внутрь композиции в концентрации в диапазоне от 0,3 до 0,7 г/л, предпочтительно в концентрации 0,5 г/л. Предпочтительно данную жидкую пригодную к употреблению внутрь композицию вводят здоровому ребенку для повышения скорости обучения и/или улучшения долговременной памяти.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления лактоферрин присутствует в жидкой пригодной к употреблению внутрь композиции в концентрации в диапазоне от 0,8 до 1,2 г/л, предпочтительно в концентрации 1,0 г/л. Предпочтительно данную жидкую пригодную к употреблению внутрь композицию вводят здоровому ребенку для улучшения долговременной памяти, в особенности долговременной памяти местоположения.

В одном варианте осуществления лактоферрин предлагают здоровому ребенку в виде молока или фракции молочной сыворотки, обогащенной лактоферрином.

В вышеописанных областях применения лактоферрина для улучшения памяти у здорового ребенка лактоферрин можно использовать в пригодной к употреблению внутрь композиции, обогащенной лактоферрином. «Обогащенный» означает, что лактоферрин либо добавляют к композиции так, что полученное содержание лактоферрина в композиции выше, чем содержание лактоферрина в композиции без добавления лактоферрина, или что композицию обработали таким образом, чтобы сконцентрировать естественное содержание лактоферрина в композиции.

Лактоферрин также может быть представлен в виде чистого соединения.

Альтернативно лактоферрин может быть представлен в виде обогащенной лактоферрином фракции, например, обогащенной лактоферрином фракции молока или молочной сыворотки.

В качестве источника молока или молочной сыворотки можно использовать, например, коровье молоко, женское молоко, козье молоко, верблюжье молоко, кобылье молоко и/или ослиное молоко. Также можно использовать молозиво.

Композиции вводят в количестве, достаточном для обеспечения эффективности. Количество, достаточное для достижения этой цели, определяют как «эффективную дозу». Эффективные количества зависят от ряда факторов, известных специалистам в данном области. Точные количества зависят от ряда индивидуальных факторов, таких как стадия развития или вес ребенка.

Типичные обогащенные лактоферрином композиции могут содержать лактоферрин в количестве по меньшей мере 1,6 г/л.

Например, композиция, используемая в настоящем изобретении, может содержать лактоферрин в концентрации по меньшей мере 0,75% (мае), предпочтительно по меньшей мере 1% (мае). В одном варианте осуществления композицию необходимо вводить в количестве, соответствующем употреблению внутрь по меньшей мере 0,25 г лактоферрина, предпочтительно по меньшей мере 0,5 г лактоферрина, более предпочтительно по меньшей мере 1 г лактоферрина в сутки на кг массы тела.

Лактоферрин может присутствовать в композиции в концентрации по меньшей мере 0,01 г на 100 ккал, предпочтительно по меньшей мере 0,1 г на 100 ккал. Например, лактоферрин может присутствовать в композиции в диапазоне от приблизительно 0,01 г до 100 г, предпочтительно от 0,1 г до 50 г, еще более предпочтительно от 2 г до 25 г на 100 ккал композиции.

Лактоферрин также можно использовать в комбинации с другими соединениями, такими как, например, сиаловая кислота и/или железо.

Особенно предпочтительная композиция, содержащая лактоферрин, может содержать дополнительно сиаловую кислоту в количестве в диапазоне от 100 мг/100 г (мас.) до 1000 мг/100 г (мас.) композиции, например, в диапазоне от 500 мг/100 г (мас.) до 650 мг/100 г (мас.) композиции.

Композиция, используемая в настоящем изобретении, может, например, содержать по меньшей мере приблизительно 0,001% сиаловой кислоты (по массе). В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения композиция может содержать по меньшей мере приблизительно 0,005% или по меньшей мере приблизительно 0,01% сиаловой кислоты (по массе).

Альтернативно или дополнительно композиция, содержащая лактоферрин, может содержать железо в количестве в диапазоне от приблизительно 1 мг/100 г (мас.) до 50 мг/100 г (мас.) композиции, например, от 10 мг/100 г (мас.) до 30 мг/100 г (мас.) композиции.

Одна композиция, содержащая лактоферрин, может содержать, например, приблизительно 852 мг/100 г (мас.) сиаловой кислоты и 22 мг/100 г (мас.) железа.

Композиция настоящего изобретения, содержащая лактоферрин, может иметь калорийную плотность в диапазоне от 30 ккал/100 г до 1000 ккал/100 г композиции, предпочтительно от 50 ккал/100 г до 450 ккал/100 г композиции. Она может, например, иметь калорийную плотность приблизительно 400 ккал/100 г.

Тип композиции конкретно не ограничен. Предпочтительно композиция предназначена для перорального или энтерального введения.

Композицию можно, например, выбирать из группы, состоящей из продуктов питания, продуктов питания для животных, фармацевтических композиций, питательных составов, биологически активных добавок к пище, напитков, пищевых добавок и детских смесей.

В одном типичном варианте осуществления композиция содержит источник белков, источник липидов и источник углеводов.

Например, такая композиция может содержать белок в диапазоне от приблизительно 2 до 6 г/100 ккал, липиды в диапазоне от приблизительно 1,5 до 3 г/100 ккал и/или углеводы в диапазоне от приблизительно 1,7 до 12 г/100 ккал. Если композиция представляет собой жидкость, ее энергетическая плотность может составлять от 60 до 75 ккал/100 мл.

Если композиция представляет собой твердое вещество, ее энергетическая плотность может составлять от 60 до 75 ккал/100 мл.

Предполагается, что тип белка не имеет большого значения для настоящего изобретения. Таким образом, можно использовать источники белка на основе, например, молочной сыворотки, казеина и их смесей. Что касается сывороточных белков, то можно использовать кислую молочную сыворотку или сладкую молочную сыворотку или их смеси, а также альфа-лактальбумин и бета-лактоглобулин в любых пропорциях. Сывороточный белок может представлять собой модифицированную сладкую сыворотку. Сладкая сыворотка представляет собой легкодоступный побочный продукт получения сыра и часто используется при производстве детских смесей на основе коровьего молока. Однако сладкая сыворотка включает в себя компонент под названием казеиногликомакропептид (CGMP), который богат треонином и беден триптофаном, что нежелательно. Удаление CGMP из сладкой сыворотки приводит к получению белка с содержанием треонина, которое ближе к содержанию в человеческом молоке. Затем к данной модифицированной сладкой сыворотке можно добавлять аминокислоты, которые содержатся в ней в малом количестве (главным образом гистидин и триптофан). Процесс удаления CGMP из сладкой сыворотки описан в ЕР 880902, а детская смесь на основе этой модифицированной сладкой сыворотки описана в WO 01/11990. Белки могут быть интактными или гидролизованными или могут представлять собой смесь интактных и гидролизованных белков. Может быть желательно вводить частично гидролизованные белки (степень гидролиза от 2 до 20%), например, субъектам, предположительно подверженным риску развития аллергии на коровье молоко. Если требуются гидролизованные белки, то процесс гидролиза можно проводить по желанию и так, как известно в данной области. Например, гидролизат сывороточного белка можно получить путем ферментативного гидролиза фракции молочной сыворотки в два этапа, как описано в ЕР 322589. Для получения сильно гидролизованного белка сывороточные белки можно подвергать тройному гидролизу с использованием Alcalase 2,4 л (ЕС 940459), затем Neutrase 0,5 л (можно приобрести в компании Novo Nordisk Ferment AG), а затем панкреатина при 55 [град.]С.Если фракция молочной сыворотки, которая используется в качестве исходного материала, по существу не содержит лактозы, то установлено, что в процессе гидролиза блокировка лизина проявляется в гораздо меньшей степени. Это позволяет снизить степень блокировки лизина с приблизительно 15% мас. общего лизина до менее чем приблизительно 10% мас. лизина; например, приблизительно 7% мас. лизина, что значительно повышает питательное качество источника белка.

Композиции, используемые в настоящем изобретении, могут содержать источник углеводов. Можно использовать любой источник углеводов, такой как лактоза, сахароза, мальтодекстрин, крахмал и их смеси.

Композиции, используемые в настоящем изобретении, могут содержать источник липидов. Источником липидов может быть любой липид. Предпочтительные источники жиров включают в себя молочный жир, пальмовый олеин, подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты и сафлоровое масло с высоким содержанием олеиновой кислоты. Также можно добавлять незаменимые жирные кислоты, например, линоленовую кислоту и [альфа]-линоленовую кислоту, и небольшие количества масел, содержащих большие количества арахидоновой кислоты и докозагексаеновой кислоты в готовом виде, таких как рыбьи жиры или микробные масла. Источник липидов предпочтительно имеет соотношение жирных кислот n-6 к n-3 от приблизительно 5:1 до приблизительно 15:1, например, от приблизительно 8:1 до приблизительно 10:1.

Композиции настоящего изобретения могут также содержать все витамины и минералы, которые, как известно, являются обязательными в ежедневной диете, в значимых с точки зрения питания количествах. Для некоторых витаминов и минералов установлены минимальные требования. Примеры минералов, витаминов и других питательных веществ, необязательно присутствующих в детской смеси, включают в себя витамин А, витамин В1, витамин В2, витамин В6, витамин В12, витамин Е, витамин К, витамин С, витамин D, фолиевую кислоту, инозитол, ниацин, биотин, пантотеновую кислоту, холин, кальций, фосфор, йод, железо, магний, медь, цинк, марганец, хлорид, калий, натрий, селен, хром, молибден, таурин и L-карнитин. Минералы обычно добавляют в форме соли. Наличие и количества конкретных минералов и других витаминов различаются в зависимости от множества факторов, таких как возраст, вес и состояние человека или животного, которому вводят композицию.

Композиции могут также содержать по меньшей мере один пробиотический бактериальный штамм. Пробиотик представляет собой препарат из клеток микроорганизмов или компоненты клеток микроорганизмов, которые оказывают благоприятный эффект на здоровье или самочувствие хозяина. Количество пробиотика, при его наличии, также предпочтительно изменяется в зависимости от возраста человека или животного. В целом, содержание пробиотика может увеличиваться при увеличении возраста ребенка, например, с 10<3> до 10<12> КОЕ/г смеси, более предпочтительно от 10<4> до 10<8> КОЕ/г смеси (сухая масса).

Композиции могут также содержать по меньшей мере один пребиотик в количестве от 0,3 до 10%. Пребиотик представляет собой неперевариваемый пищевой ингредиент, который благоприятно влияет на хозяина путем селективной стимуляции роста и/или активности одной или ограниченного числа бактерий в толстом кишечнике и, таким образом, улучшает состояние здоровья хозяина. Такие ингредиенты являются неперевариваемыми в том смысле, что они не расщепляются и не всасываются в желудке или тонком кишечнике и, таким образом, в интактном виде проходят в толстый кишечник, в котором они селективно ферментируются полезными бактериями. Примеры пребиотиков включают в себя некоторые олигосахариды, такие как фруктоолигосахариды (FOS) и галактоолигосахариды (GOS). Можно использовать комбинацию пребиотиков, такую как 90% GOS и 10% короткоцепочечных фруктоолигосахаридов, например, в виде продукта, продаваемого под торговой маркой Raftilose(R), или 10% инулина, например, в виде продукта, продаваемого под торговой маркой Raftiline(R).

Композиции могут необязательно содержать другие вещества, которые могут оказывать благоприятный эффект, такие как нуклеотиды, нуклеозиды и т.п.

Композиции, например, детскую смесь, используемые в изобретении, можно получать любым подходящим образом. Например, детскую смесь можно получать путем смешивания вместе источника белков, источника углеводов и источника жиров в соответствующих пропорциях. В случае использования в смесь можно включать эмульгаторы. На данном этапе можно добавлять витамины и минералы, но обычно их добавляют позднее для предотвращения термического разложения. Перед смешиванием в источнике жиров можно растворять любые липофильные витамины, эмульгаторы и т.п. Затем можно примешивать воду, предпочтительно воду, очищенную обратным осмосом, с образованием жидкой смеси. Затем жидкую смесь можно подвергать термической обработке для снижения бактериальных нагрузок. Например, жидкую смесь можно быстро нагревать до температуры в диапазоне от приблизительно 80<0>С до приблизительно 110<0>С в течение от приблизительно 5 секунд до приблизительно 5 минут. Это можно осуществлять путем нагнетания пара или с помощью теплообменника, например, пластинчатого теплообменника. Затем жидкую смесь можно охлаждать до температуры от приблизительно 60<0>С до приблизительно 85 [град.]С, например, путем резкого охлаждения. Затем жидкую смесь можно гомогенизировать, например, в две стадии: под давлением от приблизительно 7 МПа до приблизительно 40 МПа на первой стадии и от приблизительно 2 МПа до приблизительно 14 МПа на второй стадии. Затем гомогенизированную смесь можно дополнительно охлаждать для добавления любых термочувствительных компонентов, таких как витамины и минералы. На данном этапе для удобства стандартизируют рН и содержание твердых веществ в гомогенизированной смеси. Гомогенизированную смесь переносят в подходящий сушильный аппарат, такой как распылительная сушилка или сублимационная сушилка, и превращают в порошок. Содержание влаги в порошке должно составлять менее чем приблизительно 5% мас. Если необходимо добавить пробиотик (-и), то его (их) можно культивировать в соответствии с любым подходящим способом и подготавливать для добавления к детской смеси путем, например, сушки сублимацией или сушки распылением. Альтернативно бактериальные препараты можно приобрести у специализированных поставщиков, таких как Christian Hansen и Morinaga, в готовом виде и подходящей форме для добавления к продуктам питания, таким как детская смесь. Такие бактериальные препараты можно добавлять к порошковой детской смеси путем сухого смешивания.

Лактоферрин можно добавлять на любой стадии в ходе этой процедуры, но предпочтительно добавлять после этапа нагревания.

Композиция содержит источник белков, который может присутствовать в диапазоне от 1,4 до 100 г/100 ккал, предпочтительно от 1,4 до 6,0 г/100 ккал композиции. Так как лактоферрин представляет собой белок, его следует рассматривать как часть источника белков.

Известно, что сывороточный белок оказывает несколько благоприятных эффектов на здоровье. Например, он легко переваривается. Белковая фракция в молочной сыворотке (приблизительно 10% общего количества сухих веществ в молочной сыворотке) содержит несколько белковых фракций, например, бета-лактоглобулин, альфа-лактальбумин, бычий сывороточный альбумин и иммуноглобулины. В одном варианте осуществления по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере 85% мас. источника белков представляют собой сывороточный белок.

При его наличии, источник липидов может обеспечивать от 30 до 55% общей энергетической ценности композиции. Источник углеводов может обеспечивать от 35 до 65% общей энергетической ценности композиции.

В композицию настоящего изобретения можно также добавлять сиаловую кислоту. Сиаловая кислота представляет собой общий термин для N- или О-замещенных производных нейраминовой кислоты, моносахарида с основной цепью, состоящей из девяти атомов углерода.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение основано на открытии того, что добавление в пищу лактоферрина улучшает память местоположения, повышает скорость обучения и улучшает долговременную память у поросят в физиологических условиях.

В первой серии экспериментов было показано, что лактоферрин улучшает память местоположения у поросят в возрасте от 36 до 38 дней. В частности, оказалось, что 30-минутная долговременная память местоположения у поросят, получавших с пищей высокие дозы лактоферрина (приблизительно от 225 до 325 мг/кг массы тела/сутки), была существенно лучше, чем у поросят в контрольной группе.

Во второй серии экспериментов данные показали, что добавление в пищу лактоферрина сильно стимулирует память и скорость обучения по тестам на поросятах в возрасте от 22 до 32 дней в 8-рукавном радиальном лабиринте. Оказалось, что у поросят, получающих с пищей как средние дозы (приблизительно от 100 до 175 мг/кг массы тела/сутки), так и высокие дозы лактоферрина, улучшается 40-минутная и 3-часовая долговременная память. Интересно, что скорость обучения в наибольшей степени повышалась при средних дозах лактоферрина.

В другой серии экспериментов было показано, что добавление лактоферрина обеспечивает повышающую регуляцию экспрессии в гиппокампе мРНК, кодирующей нейротрофический фактор мозга (BDNF), и активирует сигнальный путь BDNF.

Активация сигнального пути BDNF может наблюдаться при повышающей регуляции ключевых генов в данном пути, например, Trk3, IRS1, GRB2, САМК1, МАРК, SP1 и CREB1.

Также было показано, что добавление лактоферрина повышает уровень фосфорилированного CREB (pCREB) в гиппокампе.

Надежно установлено, что активация сигнального пути BDNF приводит к увеличению фосфорилирования и ядерной транслокации CREB. Также установлено, что фосфорилирование CREB на серине 133 (pCREB) индуцирует транскрипцию гена и играет важную роль в инициации процессов обучения и памяти.

В другой серии экспериментов данные показали, что добавление в пищу лактоферрина приводит к повышению уровня экспрессии полисиалилированной формы молекулы адгезии нервных клеток (NCAM) в гиппокампе и префронтальной коре. Это указывает на то, что фрагмент лактоферрина, содержащий сиаловую кислоту, может быть ключевым фактором в повышении нейропластичности и стимулировании укрепления ДВП.

Лактоферрин для использования в соответствии с настоящим изобретением можно получить из различных источников. Он может быть очищен, например, из молока или молочной сыворотки, или может быть произведен рекомбинантным способом. Преимущество лактоферрина, очищенного из натурального источника, заключается в том, что это натуральный ингредиент, обычно получаемый из пищевой композиции, и его можно использовать в качестве обогащенной фракции в пищевой композиции с дополнительной очисткой или без нее. В качестве натурального источника можно рассматривать человеческое молоко (материнское молоко) или молоко из другого источника, например, коровье молоко, козье молоко, верблюжье молоко, кобылье молоко или ослиное молоко. Дополнительно можно рассматривать молозиво. Преимущество лактоферрина, полученного рекомбинантным способом, заключается в том, что его можно легко производить в высоких концентрациях.

Лактоферрин можно добавлять в композицию так, чтобы итоговое содержание лактоферрина в композиции было выше, чем содержание лактоферрина в композиции без добавления лактоферрина. Альтернативно композицию, в естественных условиях содержащую лактоферрин, можно обработать для концентрирования содержания натурального лактоферрина в композиции с получением, например, обогащенного лактоферрином молока или фракции молочной сыворотки. Лактоферрин также может быть представлен в виде чистого соединения.

Лактоферрин может быть представлен в виде ингредиента для пригодной к употреблению внутрь композиции, т.е. композиции для перорального введения. Также можно рассматривать композиции для энтерального введения.

Лактоферрин или пригодную для употребления внутрь композицию, содержащую лактоферрин, предпочтительно вводят ребенку. Также можно рассматривать введение матери в период беременности и/или лактации.

Лактоферрин также может быть представлен в комбинации с другими соединениями, такими как сиаловая кислота и/или железо.

Термин «память» и его различные аспекты используются в пунктах формулы изобретения в соответствии со значением, например, приведенным во вводном разделе.

«Скорость обучения» относится к периоду времени или числу испытаний, необходимых для того, чтобы выполнить обучающее задание.

«Созревание головного мозга» представляет собой главным образом процесс развития головного мозга, включая образование, формирование и перестройку нервной системы, начиная с ранних стадий эмбриогенеза и до последних лет жизни.

«Здоровый ребенок» означает ребенка, который родился доношенным (в случае новорожденного человека - после 37 недель беременности), т.е. в срок, в отличие от преждевременных родов, имел нормальный вес при рождении, не демонстрировал какой-либо когнитивной дисфункции или задержки развития головного мозга при рождении и не имел признаков задержки внутриутробного развития (ЗВУР) или гипоксемии (ишемии) при рождении. Таким образом, в более широком смысле «здоровый» относится к нормальному или физиологическому, т.е. непатологическому, развитию ребенка, в особенности по отношению к когнитивной функции.

Ребенок может быть новорожденным, младенцем, ребенком, начинающим ходить, ребенком дошкольного возраста или ребенком школьного возраста, с момента рождения до возраста 14 лет.

«Новорожденный» по существу определяется как человек в возрасте приблизительно от рождения до 1 месяца. «Младенец» обычно означает человека в возрасте от 6 до 12 месяцев. «Ребенок, начинающий ходить», представляет собой человека в возрасте от 12 до 36 месяцев. «Ребенок дошкольного возраста» представляет собой человека в возрасте от 36 месяцев до 5 лет. «Ребенок школьного возраста» представляет собой человека в возрасте от 5 до 14 лет.

Хотя здоровый ребенок человека является предпочтительным, также могут рассматриваться отличные от человека млекопитающие соответствующего возраста.

Дополнительные преимущества и признаки настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области на основании приведенных ниже примеров и фигур.

Краткое описание фигур

На Фиг. 1 показана одна из четырех разделительных панелей, скрывающих миску с молоком.

На Фиг. 2 показана ситуация, в которой молоко недоступно для поросенка, т.е. миска с молоком закрыта крышкой (Фиг. 2А), и противоположная ситуация, в которой молоко доступно, т.е. миска открыта (Фиг. 2В).

На Фиг. 3 представлена схема теста на память местоположения.

На Фиг. 4 представлена схема теста на память местоположения в случае ошибки (Фиг. 4А) или успеха (Фиг. 4В). Признаком успешной попытки является первая проверка поросенком миски, в которой молоко было доступно во время предыдущей попытки.

На Фиг. 5 показан временной график, используемый в схеме теста на память местоположения.

На Фиг. 6 показан средний (±СО) прирост массы тела в каждой группе в течение исследования. Отсутствовали значимые различия между группами (Р>0,05) на основании общей линейной модели (одномерный дисперсионный анализ (ANOVA)) с коррекцией Бонферрони на множественные сравнения.

На Фиг. 7 показана концентрация в крови гормонов стресса - адренокортикотропного гормона (АКТГ) (Фиг. 7А) или кортизола (Фиг. 7 В), в четырех разных возрастах поросят. Концентрация АКТГ приведена в [пг/мл], а кортизола - в [мкг/мл].

На Фиг. 8 показано общее число успешных попыток в отношении памяти местоположения (10 испытаний).

На Фиг. 9 показано число успешных попыток в отношении памяти местоположения на различных стадиях теста.

На Фиг. 10 показаны данные о кратковременной (КВП) и долговременной (ДВП) памяти местоположения (среднее ± СО). Различные буквы (a, ab, b), которыми отмечены столбцы, относящиеся к 30-минутной ДВП, показывают статистическую значимость между группами (Р=0,046) при использовании однофакторного ANOVA с коррекцией по критерию наименьшей значимой разности (LSD) на множественные сравнения.

На Фиг. 11 показаны данные по рабочей памяти в разные временные интервалы (*Р - 0,026, <0,05; двухфакторный ANOVA).

На Фиг. 12 показаны 8-рукавный радиальный лабиринт и визуальная подсказка для легкого задания и сложного задания.

На Фиг. 13 показана процедура прохождения легкого и сложного заданий в 8-рукавном радиальном лабиринте. ДВП - долговременная память, КВП - кратковременная память.

На Фиг. 14 показана кривая скорости обучения поросят с использованием ошибки и успеха в качестве ковариансы, анализируемая при помощи регрессионной модели Кокса в легкой и сложной задачах соответственно.

На Фиг. 15 показаны относительные уровни мРНК, кодирующей нейротрофический фактор мозга (BDNF), в гиппокампе (среднее ± СО). Добавление лактоферрина существенно повышает уровни экспрессии BDNF в гиппокампе (Р<0,05).

На Фиг. 16 показаны уровни белка BDNF в гиппокампе (среднее ± СО). Средняя доза добавления лактоферрина существенно повышает уровни белка BDNF в гиппокампе (Р<0,05).

На Фиг. 17 показан сигнальный путь BDNF.

На Фиг. 18 показано, что добавление лактоферрина повышает уровень pCREB в гиппокампе (среднее ± СО).

На Фиг. 19 показано, что добавление лактоферрина повышает уровень полисиалилированной формы NCAM (polySia-NCAM) в гиппокампе и префронтальной коре (среднее ± СО).

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: Эксперимент на животных

1.1. Животные

В животной модели использовали поросят из-за большой схожести с детьми человека в отношении физиологии, анатомии и генетики.

Приобрели шестьдесят семь самцов домашних поросят в возрасте 3 дней (Sus scorfa Landrace × Large White F1) от 16 пометов и случайным образом распределили на 4 группы в зависимости от веса и помета. Распределение по группам и информация о питании приведены в таблице 1. Всех животных содержали попарно в среде с контролируемой температурой и 12-часовым циклом дня (08:00-20:00) и ночи (20:00-08:00). Каждый загон для содержания включал «гнездо» (резиновую шину, накрытую чистым полотенцем), лампу для обогрева над гнездом и идентичную деревянную игрушку. Максимальное количество поросят в лаборатории анализа поведения составляло 16. Таким образом, для достижения численности 16 поросят/группа проводили 5 испытаний по 10-16 поросят/испытание. За поросятами следили с помощью системы видеонаблюдения. В каждом испытании два поросенка в возрасте 3 дней умерщвляли и использовали в качестве контроля на исходном уровне (n=10). Протокол исследования был утвержден Комитетом по этичному обращению с животными Сямэньского университета.

1.2. Протокол кормления лактоферрином

Коровье молоко с лактоферрином (бета-лактоферрин) приобретали в компании DMV International. Каждого поросенка (в возрасте от 3 дней до 38 дней) кормили стандартным заменителем свиного молока, содержащим белок сои / молочную сыворотку / казеин (50:38:12). Количество лактоферрина в конечном молоке было разным в зависимости от группы (см. таблицу 1): 0,05 г/л (группа 1, контрольная группа без добавления лактоферрина, n=16), 0,5 г/л (группа 2, средняя доза, n=17), 1 г/л (группа 3, высокая доза, n=15). Все поросята в группах 1-3 выполняли обучающие задания. Группа 4 (n=16) получала лактоферрин в той же дозе, что и группа 3 (1 г/л), но не выполняла обучающие задания (выступала в качестве группы ложного контроля). Эти концентрации представляли приблизительное потребление лактоферрина в контрольной группе, группе со средней дозой и группе с высокой дозой, которое составляло 15, 145 и 285 мг/кг массы тела/сутки соответственно. Заменители свиного молока готовили так, что общее потребление белка оставалось одинаковым независимо от количества добавленного лактоферрина. Для поддержания нормальных темпов роста поросята получали 285 мл молока/кг массы тела/сутки в первые 2 недели исследования и 230 мл/кг массы тела/сутки в остальные недели. Кормление осуществляли в 08:00, 13:00, 18:00 и 22:30, причем в последнее кормление каждой свинье давали дополнительные 50 мл молока. Ежедневно регистрировали массу тела, потребление молока и состояние здоровья поросят.

1.3. Масса тела

Массу тела поросят измеряли каждое утро перед кормлением. Результаты показали, что средняя (±СО) начальная масса тела была одинаковой в каждой группе (1,908±0,044 кг), и животные набирали массу аналогичными темпами (Фиг. 6). Хотя к концу исследования прирост массы тела происходил быстрее в группе 3, чем в других группах, различия между группами на 23-й день (Р=0,937), 29-й день (Р=0,899) и 36-й день (Р=0,888) не были значимыми. Наши результаты отличаются от предыдущего сообщения, в соответствии с которым дети, получавшие смесь с лактоферрином и железом, имели большую массу тела, чем дети, получавшие смесь с добавлением только железа [13].

1.4. Гормоны стресса

Хорошо известно, что переживание стресса может влиять на процессы обучения и памяти. «Стресс» по существу определяется как любое состояние, которое нарушает физиологический или психологический гомеостаз организма [14]. Результаты множества различных типов экспериментов показывают, что гормоны стресса коры надпочечников, высвобождаемые во время или после ярких эмоциональных переживаний, играют большую роль в укреплении долговременных видов памяти. Стрессовые события активируют гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую (НРА) ось, что приводит к медленному повышению уровней кортикостерона или кортизола в плазме [15]. В большом числе экспериментов по изучению влияния гормонов стресса коры надпочечника на память были представлены исчерпывающие доказательства того, что эпинефрин и глюкокортикоиды модулируют укрепление долговременной памяти у животных и человеческих индивидов [16]. В связи с этим отслеживались уровни гормонов стресса в крови поросят.

Образцы крови отбирали у каждого поросенка в возрасте 3, 17, 28 и 39 дней. Образец центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин при 4°С, а затем плазму крови хранили при -80°С до анализа. Два гормона стресса, адренокортикотропный гормон (АКТГ) и кортизол, измеряли в плазме крови с использованием электрохемилюминесцентного иммунологического анализа на электрохимическом люминесцентном иммунном анализаторе Roche (Roche Е601, Чжуншаньская больница). Все анализы выполняли опытные лаборанты, соблюдая все инструкции производителя. Контроль качества выполняли для всех аналитических серий с использованием контрольных материалов, предоставленных соответствующими производителями. В результате не было обнаружено влияния на уровень гормонов стресса в крови (Фиг. 7; Р>0,05, двухфакторный ANOVA).

1.5. Статистический анализ

Различия в памяти между группами оценивали с использованием общей линейной модели (одномерный ANOVA) при необходимости с коррекцией Бонферрони на множественные сравнения. Все статистические анализы выполняли с использованием SPSS для WINDOWS 19 (SPSS Inc, г. Чикаго, штат Иллинойс, США). Использовали уровень значимости 0,05.

ПРИМЕР 2: Влияние лактоферрина на память местоположения у поросят

2.1. Тест на память местоположения

Тест на память местоположения проводили с поросятами в возрасте 36 дней. Поросятам позволили ознакомиться с областью тестирования. Поросята в группе 1 (контроль, n=16), группе 2 (средняя доза, n=17) и группе 3 (высокая доза, n=18) прошли тест на память местоположения. Во время теста четыре закрепленных разделительных панели (0,3×0,35×0,50 м) (Фиг. 1) поместили в передний левый угол (положение 1), левый угол (положение 2), переднюю центральную область тестирования (положение 3) и правый задний угол (положение 4), причем разделительные панели 1,2 и 4, повернутые к двери, находились на расстоянии 0,7, 0,8 и 0,9 м от боковых стенок (Фиг. 3). В области выполнения задания находились четыре миски, скрытые четырьмя разделительными панелями, но доступ к молоку имелся только в одной миске (Фиг. 2В), тогда как молоко в других трех мисках было недоступно (Фиг. 2А). Поросята не могли видеть миски при нахождении перед разделительными панелями. Им нужно было подойти к разделительным панелям сзади, чтобы найти доступное или недоступное молоко. Миску с доступным молоком случайным образом меняли в каждом испытании. Для каждого поросенка проводили 10 испытаний, включая 4 испытания утром, 4 испытания днем и 2 испытания следующим утром. Ожидали, что «более умные» поросята найдут доступное молоко быстрее, не возвращаясь ни к одной миске с недоступным молоком. Ошибку фиксировали, когда поросенок возвращался в любое местоположение с недоступным молоком. Поведение поросят в области выполнения теста регистрировали путем непосредственного наблюдения, а также на видеопленку для дополнительных анализов. Все тесты проводили обученные сотрудники.

Запоминание местоположения регистрировали, когда поросята входили в область выполнения теста и сначала проверяли место, где во время предыдущего испытания находилась миска с доступным молоком (Фиг. 4В). Тестировали два типа памяти местоположения: кратковременную память (КВП) и долговременную память (ДВП). В данном исследовании определили КВП как память в течение 2 последовательных испытаний с интервалом 5 мин или менее. Любые виды памяти местоположения, которая длится более 5 мин, рассматривали как ДВП. В данном исследовании задействовали три типа ДВП: (1) 30-минутную ДВП (утром); (2) 4-часовую ДВП (первое испытание днем); (3) 16-часовую ДВП (первое испытание следующим утром). График теста на память местоположения показан на Фиг. 5.

2.2. Результаты

Общее различие в памяти местоположения между группами показано в таблице 2. В группах со средней дозой и высокой дозой память местоположения была лучше, чем в контрольной группе, но различие не достигало статистической значимости (Р>0,05). Однако когда проанализировали данные с учетом коэффициента успешности, сравнив общее теоретическое число успешных попыток с реальным числом успешных попыток, выполненных поросятами, в группах со средней дозой и высокой дозой наблюдалось на 30% больше успешных попыток, чем в контрольной группе (таблица 2).

Среднее число успешных попыток в 9 испытаниях памяти местоположения показано на Фиг. 8. Хотя группы, получавшие лактоферрин, показывали более высокие результаты в отношении памяти местоположения, чем контрольная группа, в статистическом анализе не был достигнут уровень значимости (Р>0,05).

Также обнаружили, что группы, получавшие лактоферрин, показывали более высокие результаты в отношении памяти местоположения, чем контрольная группа, когда рассматривали первые 5 испытаний в качестве обучения на фазе приобретения навыков, а последние 5 испытаний - в качестве обучения на фазе воспроизведения (Фиг. 9).

Любую память местоположения с интервалом не более чем 5 мин определяли как кратковременную память местоположения. Виды памяти с интервалом более чем 5 мин определяли как долговременную память местоположения. Общее число успешных попыток в отношении кратковременной и долговременной памяти местоположения представлено в таблице 3.

Эти результаты демонстрируют, что группы, получавшие лактоферрин, показывали более высокие результаты в тестах как на кратковременную, так и на долговременную память. В частности, в группе с высокой дозой была показана существенно лучшая 30-минутная долговременная память, чем в контрольной группе (Р=0,046) (Фиг. 10).

Кроме того, группы, получавшие лактоферрин, показывали более высокие результаты в испытаниях памяти местоположения, чем контрольная группа, за исключением испытаний 5 и 6 (Фиг. 11). В частности, в испытании 7 группа, получавшая лактоферрин, показывала существенно более высокие результаты, чем контрольная группа (Р=0,026, двухфакторный ANOVA).

ПРИМЕР 3: Влияние лактоферрина на скорость обучения и память у поросят

3.1. Тест на обучение и память

Для тестирования когнитивных функций способности к обучению и памяти использовали способ с 8-рукавным радиальным лабиринтом [8]. Поросят помещали в 8-рукавный радиальный лабиринт по отдельности. Проводили два теста: «легкое задание» (задание 1) и более «сложное задание» (задание 2) (Фиг. 12). В обоих тестах в одном рукаве находилось доступное молоко, а в остальных 7 рукавах находилось недоступное молоко, так что все рукава имели одинаковый запах для предотвращения обучения по обонянию (Фиг. 12). В обоих тестах визуальную подсказку, содержащую 3 черных точки, помещали случайным образом на дверь с доступным молоком (соответствующим молоку их группы) в рукаве. В легком задании визуальную подсказку с одной черной точкой помещали на остальные 7 дверей с недоступным молоком (количество и тип молока были такими же, как и у доступного молока). В сложном задании визуальную подсказку с 2 черными точками помещали на остальные 7 дверей. Положение визуальной подсказки с 3 черными точками в испытаниях меняли в заранее определенном случайном порядке. Сорок испытаний для каждого из задания 1 и задания 2 проводили в течение 10-дневного периода, начиная с 22-го дня (поросенок в возрасте 22 дней).

Оценку способности к обучению определяли на основании числа испытаний, выполненных для успешного усвоения визуальной подсказки. Усвоение количественно оценивали с помощью числа ошибочных и успешных поисков рукава с доступным молоком во время каждого испытания. Каждый раз, когда поросенок входил или полностью просовывал голову в неправильную дверь, фиксировали ошибку. Когда поросенок входил в правильную дверь, фиксировали успех. Критериями усвоения визуальных подсказок были следующие: (А) максимум 1 ошибка в течение 3 последовательных испытаний; (В) отсутствие ошибок в течение 3 последовательных испытаний; (С) максимум 1 ошибка в течение 4 последовательных испытаний; (D) отсутствие ошибок в течение 4 последовательных испытаний; (Е) максимум 1 ошибка в течение 5 последовательных испытаний; (F) отсутствие ошибок в 5 последовательных испытаниях. Расположенная сверху видеокамера вела непрерывную запись во время теста на обучение и память, а обученный наблюдатель одновременно регистрировал результаты вручную. Все тесты выполнял обученный персонал, у которого отсутствовала информация об уровне потребления лактоферрина. Результаты подтверждали с помощью независимого анализа видеоматериала. Для снижения стресса и ознакомления поросят с протоколом теста позволяли двум поросятам из одного загона входить в лабиринт, чтобы они научились открывать и закрывать дверь, перед тестом на обучение (8 испытаний).

В день выполняли 4 испытания утром и 4 испытания днем. Одного поросенка подвергали двум последовательным испытаниям. Длительность интервала ожидания (смена визуальной подсказки и размещение свежего молока) для двух испытаний составляла 5 мин (5-минутная кратковременная память). В течение 5-минутного периода поросенка помещали в зону ожидания (за пределами области проведения теста). Через сорок минут (40-минутная долговременная память) поросенка снова помещали в радиальный лабиринт для проведения еще 2 последовательных испытаний. Днем поросенок повторял утренний сеанс тестирования. Интервал ожидания между утренним и дневным тестами составлял 3 ч (3-часовая долговременная память). На следующий день через 16 ч повторяли то же задание, что и во время теста в предыдущий день (16-часовая долговременная память). Общее число испытаний с легкими и сложными заданиями составило 40. Через сорок восемь часов после завершения легких и сложных испытаний поросят, которые удовлетворяли критерию обучения, подвергали испытаниям снова по той же схеме, что и для «48-часовой долговременной памяти». Число ошибок при поиске доступного молока регистрировали в виде индекса памяти. Процедура выполнения легкого и сложного заданий показана на Фиг. 13.

В легком обучающем задании на Фиг. 14 добавление лактоферрина существенно повышает скорость обучения с учетом общего числа ошибок в первых 20 испытаниях (обучение на фазе приобретения навыков) в качестве ковариансы для анализа (Р<0,05). В сложном обучающем задании добавление bLF существенно повышает скорость обучения с учетом общего числа успешных попыток в первых 40 испытаниях (подкрепление) в качестве ковариансы для анализа.

3.2 Результаты

Скорость обучения (на основании числа испытаний для усвоения визуальных подсказок) в группе со средней дозой была наибольшей по сравнению с таковой в группе с высокой дозой и контрольной группе. При использовании числа ошибок в день в качестве показателя обучения результаты показали, что поросята в контрольной группе совершили больше ошибок в тесте со сложным заданием. Различие между группами было значимым на 4-й день (Р<0,05, общая линейная модель), что было отнесено на счет фазы воспроизведения процесса обучения. Наблюдали тенденцию к улучшению памяти в группах, получавших лактоферрин, во время интервала сохранения, который составлял 5 мин, 40 мин и 3 ч. Значимое улучшение памяти обнаружили через 40 мин и 3 ч, но не через 16 ч и 48 ч. Результаты предполагают, что максимальное время интервала сохранения (способность к запоминанию), требуемое для воспроизведения в памяти визуальной подсказки, составляло 3 ч для поросят в возрасте 38 дней. Однако отсутствовали реакции на дозу в тесте на память в различные периоды интервала сохранения.

ПРИМЕР 4: Экспрессия гена BDNF в гиппокампе

Экспрессию гена нейротрофического фактора мозга (BDNF) определяли, подвергая ткани гиппокампа поросят в возрасте 38 дней количественному анализу ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Как показано на Фиг. 15, добавление лактоферрина существенно повышало относительные уровни мРНК, кодирующей BDNF, в гиппокампе. Более того, уровни белка BDNF в гиппокампе были существенно повышены при добавлении лактоферрина в средней дозе (Фиг. 16).

Таким образом, была обнаружена корреляция между данными о поведении и результатами экспрессии гена BDNF, что свидетельствует о том, что принимаемый с пищей лактоферрин, вероятно, действует путем повышения экспрессии BDNF.

ПРИМЕР 5: Экспрессия ключевых генов в сигнальном пути BDNF.

Экспрессию ключевых генов в сигнальном пути BDNF определяли, подвергая ткани гиппокампа поросят в возрасте 38 дней анализу на генных микрочипах Affymetrix. Ключевые проанализированные гены перечислены в таблице 4.

Как видно по результатам, показанным в таблице 4, добавление лактоферрина увеличивало экспрессию BDNF, GRB2, IRS1, Trk3, RAPGEF1(C3G), САМК, МАРКИ, МАРК12, CREB1, SP1, МУС, и ESR1 в гиппокампе. Все они представляют собой ключевые гены в сигнальном пути BDNF. Сигнальный путь BDNF показан на Фиг. 17.

Как указано выше, надежно установлено, что активация сигнального пути BDNF приводит к увеличению фосфорилирования и ядерной транслокации CREB. Также установлено, что фосфорилирование CREB на серине 133 (pCREB) индуцирует транскрипцию гена и играет большую роль в инициации процессов обучения и памяти.

Краткая информация о генах, участвующих в сигнальном пути нейротрофина BDNF, которые подвергались повышающей или понижающей регуляции при употреблении лактоферрина в пище

ПРИМЕР 6: Уровень pCREB в гиппокампе

Уровень pCREB определяли, подвергая ткани гиппокампа поросят в возрасте 38 дней анализу методом Вестерн-блоттинга.

Как показано на Фиг. 18, добавление лактоферрина существенно увеличивало уровень pCREB в гиппокампе.

На основании результатов из примеров 4-6 было сделано предположение о том, что влияние добавления лактоферрина на познание и память может по меньшей мере частично являться результатом его положительного влияния на уровни BDNF и последующего влияния BDNF на каскад сигнальной трансдукции BDNF и уровни pCREB.

ПРИМЕР 7: Уровень PolySia-NCAM в гиппокампе и префронтальной коре.

Уровень PolySia-NCAM определяли, подвергая ткани гиппокампа и префронтальной коры поросят в возрасте 38 дней анализу методом Вестерн-блоттинга.

Как показано на Фиг. 19, добавление лактоферрина повышало уровень PolySia-NCAM в гиппокампе и префронтальной коре.

Таким образом, обнаружена корреляция между данными о поведении и уровнем PolySia-NCAM, что позволяет предположить, что потребляемый с пищей лактоферрин может по меньшей мере частично действовать путем повышения уровней polySia-NCAM. Это указывает на то, что фрагмент лактоферрина, содержащий сиаловую кислоту, может играть ключевую роль в увеличении нейропластичности и ДВП.

Потенциальное ограничение количественной оценки общего уровня polySia-NCAM, который повышается при добавлении лактоферрина, заключается в том, что данный гликан может образовывать комплексы с другими нейротрофическими факторами, и, следовательно, его может быть сложно количественно оценить с помощью стандартного электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). Таким образом, результаты, описанные в настоящем документе, в отношении повышенных уровней poly-Sia-NCAM в гиппокампе и префронтальной коре, вероятно, отражают сниженный уровень данного гликана, повышающую регуляцию которого фактически осуществляет лактоферрин.

Литература

[1]. Fischer R, Debbabi H, Blais A, Dubarry M, Rautureau M, Boyaka PN, Tome D: Uptake of ingested bovine lactoferrin and its accumulation in adult mouse tissues. Int Immunopharmacol 2007, 7(10):1387-1393.

[2]. Ji B, Maeda J, Higuchi M, Inoue K, Akita H, Harashima H, Suhara T: Pharmacokinetics and brain uptake of lactoferrin in rats. Life Sci 2006, 78(8):851-855.

[3]. Lonnerdal B, Liao YL, Du XG: miR-214 Regulates Lactoferrin Expression and Pro-Apoptotic Function in Mammary Epithelial Cells. JNutr 2010, 140(9):1552-1556.

[4]. Roseanu A, Brock JH: What are the structure and the biological function of lactoferrin in human breast milk? Iubmb Life 2006, 58(4):235-237.

[5]. Rascon-Cruz Q, Gonzalez-Chavez SA, Arevalo-Gallegos S: Lactoferrin: structure, function and applications. Int JAntimicrob Ag 2009, 33(4).

[6]. Faldyna M, Adlerova L, Bartoskova A: Lactoferrin: a review. Vet Med-Czech 2008, 53(9):457-468.

[7]. Hettinga K, van Valenberg H, de Vries S, Boeren S, van Hooijdonk T, van Arendonk J, Vervoort J: The host defense proteome of human and bovine milk. PLoS One 2011, 6(4):e19433.

[8]. Wang B, Yu B, Karim M, Ни H, Sun Y, McGreevy P, Petocz P, Held S, Brand-Miller J: Dietary sialic acid supplementation improves learning and memory in piglets. Am J Clin Nutr 2007, 85(2):561-569.

[9]. Mikkelsen TL, Bakman S, Sorensen ES, Barkholt V, Frokiaer H: Sialic acid-containing milk proteins show differential immunomodulatory activities independent of sialic acid. JAgric FoodChem 2005, 53(20):7673-7680.

[10]. Kornum BR, Knudsen GM: Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neurosci Biobehav Rev 2011, 35(3):437-451.

[11]. Gieling ET, Nordquist RE, van der Staay FJ: Assessing learning and memory in pigs. Animal Cognition 2011, 14(2):151-173.

[12]. Lind NM, Moustgaard A, Jelsing J, Vajta G, Cumming P, Hansen AK: The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neurosci Biobehav R 2007, 31(5):728-751.

[13]. Hernell O, Lonnerdal B: Iron status of infants fed low-iron formula: no effect of added bovine lactoferrin or nucleotides. Am J Clin Nutr 2002, 76(4):858-864.

[14]. Ryan PJ, Ma S, Olucha-Bordonau FE, Gundlach AL: Nucleus incertus-an emerging modulatory role in arousal, stress and memory. Neurosci Biobehav Rev 2011, 35(6):1326-1341.

[15]. Schwabe L, Joels M, Roozendaal B, Wolf ОТ, Oitzl MS: Stress effects on memory: An update and integration. Neurosci Biobehav Rev 2011.

[16]. van Liempt S, Vermetten E, Lentjes E, Arends J, Westenberg H: Decreased nocturnal growth hormone secretion and sleep fragmentation in combat-related posttraumatic stress disorder; potential predictors of impaired memory consolidation. Psychoneuroendocrino 2011.

Настоящее изобретение относится к развитию когнитивной функции у детей. Предложено применение лактоферрина для повышения скорости обучения здорового ребенка. Технический результат: показано снижение числа ошибок у поросят в тесте со сложным заданием на 4-й день кормления молоком, содержащим 0,5 г/л или 1 г/л лактоферрина; предположено, что влияние лактоферрина на память – результат его положительного влияния на уровни гена BDNF и последующего влияния BDNF на каскад сигнальной трансдукции BDNF и уровни pCREB в гиппокампе. 9 з.п. ф-лы, 19 ил., 7 пр., 4 табл.

1. Применение лактоферрина для повышения скорости обучения здорового ребенка.

2. Применение по п. 1, при котором лактоферрин вводят здоровому ребенку в суточной потребляемой дозе в диапазоне от 100 до 400 мг/кг массы тела/сутки, предпочтительно от 125 до 350 мг/кг массы тела/сутки, наиболее предпочтительно от 145 до 285 мг/кг массы тела/сутки.

3. Применение по п. 2, при котором суточная потребляемая доза лактоферрина находится в диапазоне от 100 до 200 мг/кг массы тела/сутки, предпочтительно суточная потребляемая доза составляет 145 мг/кг массы тела/сутки.

4. Применение по п. 2, при котором суточная потребляемая доза лактоферрина находится в диапазоне от 250 до 350 мг/кг массы тела/сутки, предпочтительно суточная потребляемая доза составляет 285 мг/кг массы тела/сутки.

5. Применение по п. 4, при котором суточную потребляемую дозу лактоферрина разделяют на по меньшей мере две, предпочтительно по меньшей мере три, наиболее предпочтительно четыре части.

6. Применение по п. 1, при котором лактоферрин представлен в пригодной к употреблению внутрь композиции, которую выбирают из группы, состоящей из продуктов питания для человека, молока для детей до 1 года, молока для детей старше 1 года, детских смесей, детского питания и напитков и диетического питания для матерей.

7. Применение по п. 6, при котором лактоферрин присутствует в жидкой пригодной к употреблению внутрь композиции в концентрации в диапазоне от 0,1 до 2 г/л, предпочтительно от 0,25 до 1,5 г/л, наиболее предпочтительно от 0,5 до 1,0 г/л.

8. Применение по п. 7, при котором лактоферрин присутствует в жидкой пригодной к употреблению внутрь композиции в концентрации в диапазоне от 0,3 до 0,7 г/л, предпочтительно в концентрации 0,5 г/л.

9. Применение по п. 7, при котором лактоферрин присутствует в жидкой пригодной к употреблению внутрь композиции в концентрации в диапазоне от 0,8 до 1,2 г/л, предпочтительно в концентрации 1,0 г/л.

10. Применение по пп. 1, 2 или 6, при котором лактоферрин представлен в виде молока или фракции молочной сыворотки, обогащенной лактоферрином.