Штамм Pseudonocardia carboxydivorans, обладающий лигно-целлюлозолитической и нефтеокисляющей активностью Российский патент 2019 года по МПК C12N1/14 C12N9/42 B09C1/10 C12R1/645 

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии и касается получения нового штамма актиномицетов рода Pseudonocardia вида Pseudonocardia carboxydivorans, который обладает лигно-целлюлозолитической и нефтеокисляющей активностью и способностью к биодеструкции нефтепродуктов и лигно-целлюлозосодержащих материалов, а также к делигнификации загрязненных водных сред.

Известен штамм актиномицетов, относящийся к роду Pseudonocardia [RU 2288270 С2, 2006], который используется в способе производства амидного соединения с применением микробного катализатора, где микробные клетки, имеющие нитрилгидратазную активность относятся, к одному из членов группы, состоящей из родов Nocardia, Corynebacterium, Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, Rhodococcus, Acinetobacter, Xanthobacter, Streptomyces, Rhizobiwn, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Aeromonas, Citrobacter, Achromobacter, Agrobacterium и Pseudonocardia.

Известен штамм актиномицетов, относящийся к роду Pseudonocardia [RU 2407785 С2, 2010], который способен продуцировать соединение WS727713. Соединение получают путем культивирования в среде штамма актиномицетов рода Pseudonocardia FERM ВР-7570, с последующим выделением и использованием в качестве модулятора рецептора меланокортина при производстве лекарственного или косметического средства и получении фармацевтической композиции.

Известен штамм актиномицетов, относящийся к роду Pseudonocardia, Pseudonocardia sp. N23, который способен использовать 1,4-диоксан в качестве единственного источника углерода и энергии [http://pubmedcentralcanada.ca/pmcc/articles/PMC5668550/].

Известен штамм актиномицетов, относящийся к роду Pseudonocardia, Pseudonocardia autotrophica АС-917 ВКПМ [RU 2616398 CI, 2017], который в составе комплекса биоремедианта способствует рекультивации нефтезагрязненной почвы. Биоремедиант состоит из гидрофобизированного торфа, алюмосиликата осадочного происхождения, травосмеси, а также ассоциации штаммов Rhodococcus erythropolis АС-1226, Pseudomonas fluoresceins В-6735, Pseudonocardia autotrophica АС-917, иммобилизованных на комплекс в составе биоэмульсии и биоудобрения, переработанного в анаэробных условиях навоза.

Известен штамм актиномицетов, относящийся к роду Pseudonocardia, штамм Pseudonocardia carboxydivorans, который способен продуцировать ферментационные антибиотические соединения семейства бранимицина, имеющих антибиотическую или антибактериальную активность in vitro и in vivo против патогенных бактерий [http://www.ved73.ru/profiles/5314/].

В известных штаммах актиномицетов рода Pseudonocardia вида Pseudonocardia carboxydivorans штамма с лигно-целлюлозолитической и нефтеокисляющей активностью не обнаружено.

Техническим результатом настоящего изобретения является выделение нового штамма Pseudonocardia carboxydivorans АИ-2, обладающего лигно-целлюлозолитической и нефтеокисляющей активностью.

Технический результат достигается тем, что выявлен новый штамм актиномицетов Pseudonocardia carboxydivorans АИ-2, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика; автор и депозитор Шарапова И.Э.), с регистрационным номером ВКПМ АС-2046, обладающий лигно-целлюлозолитической и нефтеокисляющей активностью.

Штамм Pseudonocardia carboxydivorans АИ-2 (с регистрационным номером ВКПМ АС-2046) выделен в 2012 году из активного ила очистных сооружений целлюлозно-бумажного предприятия путем высева методом предельных разведений. Выделенную культуру изучали с целью установления ее литической активности и способности к процессам биодеградации-разрушению лигно-целлюлозосодержащих материалов и нефтеуглеводородов. Штамм проявил значительную лигно-целлюлозолитическую и нефтеокисляющую активность, а также способность к биоделигнификации и биодеградации-разрушению лигноцеллюлозы и нефти.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Культурально-морфологические особенности Pseudonocardia carboxydivorans АИ-2 (с регистрационным номером ВКПМ АС-2046).

При росте на плотных питательных средах образует относительно медленно растущие колонии, которые достигают 0,5-2 мм в диаметре на 4-6 сутки. Колонии плотные, кожистые, неправильно округлой формы, бархатистый налет на их поверхности появляется на 6-10 сутки культивирования. На КАА и пептонно-глицериновом агаре, пептонно-глюкозном агаре и среде Сабуро цвет колоний варьирует от бело-розового до мраморно-розового или светло-коричневого. Окраска по Грамму положительная, аэроб, хемоорганотроф.

Физиолого-биохимическая характеристика. Культура утилизирует глюкозу, сахарозу, глицерин, ксилозу, целлюлозу. Слабо гидролизует лактозу и крахмал. В качестве азотного питания использует пептон, нитраты, аммиак, азот аминокислот. Обладает каталазной и протеолитической активностью.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма: среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды - пептон - 5,0 г; глицерин - 5-10 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KNO₃ - 0,5 г; СаСО₃ - 0,1 г; NaCl - 0,5 г, MgSO₄×5H₂O - 0,5 г. 15-25°С, 4-7 суток в условиях жидкофазной ферментации.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 3 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном МГЛА или пептонно-глюкозном агаре в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.

Род Pseudonocardia на сегодняшний день насчитывает 10 видов, в число которых входит Pseudonocardia carboxydivorans.

Видовое название Pseudonocardia carboxydivorans. Наименование микроорганизма, опознавательная ссылка, присвоенная депозитором - Pseudonocardia carboxydivorans АИ-2.

Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что штамм принадлежит к следующим систематическим группам: Bacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Pseudonocardia.

Определение филогенетического положения штамма Pseudonocardia carboxydivorans проводили при помощи анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S pPHK. [PCR Protocols. A Guide to methods and applications. Innis M, Gelfand D., Sninsky J. p. 14-15. Условия ПЦР-каталог MBI Fermentas 1998/1999, 146-157. Pavlicek A et al "Fre-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap\jackknife analysis of tree robustness. "Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol (Praha) 1999 45(3) 97-9. Построение деревьев родства - Ribosomal Database Project II (http://www.cme.msu.edu)]. Секвенирование проводится на автоматическом секвенаторе АЕ3000. Для анализа секвенсов используются специализированные филогенетические компьютерные программы. При секвенировании вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК получена следующая собранная нуклеотидная последовательность:

Биотехнологическая характеристика Pseudonocardia carboxydivorans АИ-2 (с регистрационным номером ВКПМ АС-2046).

Пример 1. Штамм обладает каталазной и целлюлазной активностью. Выращивание при 220 об/мин и Т=25±2°С в течение 4-7 суток в колбах с питательной средой состава (%): пептон - 0,5-1; глицерин - 1-3; целлюлоза 1-3; Твин-80 - 0,2; K2HPO4 - 0,1; MgSO4 - 0,05; KNO3 - 0,1; СаСО3 - 0,01; NaCl - 0,05; рН до стерилизации 6,7. В условиях непрерывного перемешивания и аэрации обнаружена каталазная активность, а также общая целлюлазная активность (1,5-5 ед./мл) [Полыгалина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева Л.В. Определение активности ферментов. Справочник. - М.: ДеЛи принт, 2003. - 375 с.].

Пример 2. Лигно-целлюлозолитическая активность. Увлажненные до 60% древесные опилки с фракционным составом 0,1-0,8 см обрабатывали 7-суточной культуральной суспензией штамма Pseudonocardia carboxydivorans с содержанием КОЕ/мл 10⁸ при соотношении 1 г : 10 г древесной массы. Изменение содержания целлюлозы (Кюршнера, азотно-спиртовой метод) и лигнина (Комарова, сернокислый метод) за 20 суток представлено в таблице 2.

Пример 3. Нефтеокисляющая активность. Стерильную водопроводную воду с 0,5%-ым содержанием азофоски загрязняли нефтью 1% от объема воды, обрабатывали 1 мл 4-х суточной культуральной суспензией с содержанием КОЕ/мл 10⁷ и выдерживали в лабораторных условиях 15 суток. Содержание нефти анализировали методом флуориметрии на анализаторе жидкости «Флюорат-02» в соответствии с ПНД Ф 16.1.21-98. Результаты приведены в таблице 3.

Пример 4. Биоделигнификация. Водную среду, содержащую в составе лигносульфонаты, обрабатывали внесением 1 мл культуральной суспензии с титром КОЕ/мл 10⁷. До и после обработки в течении 10 суток в образцах среды с лигниновым компонентом снимали УФ-спектры с помощью спектрофотометра [Берштейн И.Я., Каминский Ю.Л. Спектрофотометрический анализ в органической химии // Л.: Химия, 1986. 305 с.]. Результаты представлены в таблице 4.

Таким образом, выделен новый штамм актиномицетов Pseudonocardia carboxydivorans АИ-2 (с регистрационным номером ВКПМ АС-2046), который обладает полифункциональными свойствами - лигно-целлюлозолитической и нефтеокисляющей активностью. Как видно из представленных в таблицах результатов штамм проявил способность к биосинтезу комплекса литических ферментов, а именно каталазной и целлюлазной, а также значительную активность и способность к биодеградации-разрушению углеводородов нефти и лигноцеллюлозы и может быть использован для очистки от нефти и нефтепродуктов и для делигнификации загрязненных водных сред, а также для биодеградации лигно-целлюлозосодержащих материалов.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Pseudonocardia carboxydivorans, обладающий лигно-целлюлозолитической и нефтеокисляющей активностью, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов с регистрационным номером ВКПМ АС-2046. Изобретение обеспечивает биодеградацию лигно-целлюлозосодержащих материалов и очистку загрязненных водных сред от нефти и нефтепродуктов. 4 табл., 4 пр.

Штамм Pseudonocardia carboxydivorans ВКПМ АС-2046, обладающий лигно-целлюлозолитической и нефтеокисляющей активностью.