СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАКА С ПРИМЕНЕНИЕМ АНТАГОНИСТОВ АКСИАЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ PD-1 И VEGF АНТАГОНИСТОВ Российский патент 2019 года по МПК A61K39/395 C07K16/28 C07K16/22 A61P35/00 

ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной патентной заявке США 61/653861, поданной 31 мая 2012, которая полностью приведена здесь в качестве ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в формате ASCII через EFS-Web и полностью приведен здесь для ссылки. Указанная копия в формате ASCII, созданная 28 мая 2013, названа P4926R1WO.txt и имеет размер 14,285 байтов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Предоставление двух отдельных сигналов Т-клеткам является широко распространенной моделью лимфоцитарной активации покоящихся Т-лимфоцитов антигенпрезентирующими клетками (АРС). Lafferty et al, Aust. J. Exp. Biol. Med. ScL 53: 27-42 (1975). Данная модель также обеспечивает способность отличать свое от чужого и иммунную толерантность. Bretscher et al, Science 169: 1042-1049 (1970); Bretscher, P.A., P.N.A.S. USA 96: 185-190 (1999); Jenkins et al, J. Exp.Med. 165: 302-319 (1987). Трансдукция первичного сигнала или антигенспецифичного сигнала осуществляется через Т-клеточный рецептор (TCR) после распознавания чужеродного антигенного пептида, презентируемого в контексте главного комплекса гистосовместимости (МНС). Вторичный или костимулирующий сигнал доставляется к Т-клеткам костимулирующими молекулами, экспрессируемыми на антигенпрезентирующих клетках (АРС), и индуцирует Т-клетки для стимулирования клональной экспансии, секреции цитокинов и эффекторной функции. Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14: 233 (1996). В отсутствие костимуляции Т-клетки могут становиться невосприимчивыми к антигенной стимуляции, не обеспечивают формирование эффективного иммунного ответа и также могут приводить к истощению или толерантности к чужеродным антигенам.

В рамках модели с двумя сигналами Т-клетки получают позитивные и негативные вторичные костимулирующие сигналы. Регулирование данных позитивных и негативных сигналов является критически важным для максимизации защитных иммунных ответов хозяина при поддержании иммунной толерантности и недопущении аутоиммунитета. Негативные вторичные сигналы, по-видимому, необходимы для индукции Т-клеточной толерантности, в то время как позитивные сигналы стимулируют активацию Т-клеток. Хотя простая модель с двумя сигналами все же дает правильное объяснение в случае наивных лимфоцитов, иммунный ответ хозяина является динамическим процессом, при этом подвергаемые воздействию антигена Т-клетки также могут получать костимулирующие сигналы. Механизм костимуляции представляет терапевтический интерес, так как показано, что управление костимулирующими сигналами обеспечивает средство для усиления или для прекращения клеточного иммунного ответа. Недавно было обнаружено, что нарушение функции Т-клеток или анергия возникает одновременно с индуцированной и длительной экспрессией ингибирующего рецептора, полипептида 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1). В результате целенаправленное терапевтическое воздействие, направленное на PD-1 и другие молекулы, которые передают сигнал посредством взаимодействий с PD-1, такие как лиганд 1 пептида запрограммированной гибели клеток (PD-L1) и лиганд 2 пептида запрограммированной гибели клеток (PD-L2), относится к области повышенного интереса.

PD-L1 сверхэкспрессируется при многих видах рака и часто связан с плохим прогнозом (Okazaki Т et al., Intern. Immun. 2007 19(7): 813) (Thompson RH et al., Cancer Res 2006, 66(7):3381). Интересным является то, что большинство инфильтрующих опухоли Т лимфоцитов преимущественно экспрессируют PD-1, в отличие от Т лимфоцитов в нормальных тканях и Т лимфоцитов периферической крови, что свидетельствует о том, что повышение уровня PD-1 в индуцирующих опухоли Т клетках может вносить вклад в ухудшение антиопухолевых иммунных ответов (Blood 2009 114(8). Это может быть связано с задействованием передачи сигнала PD-L1, опосредуемым PD-L1, экспрессирующим опухолевые клетки, взаимодействующие с экспрессирующими PD-1 Т клетками, что приводит к ослаблению активации Т клеток и уклонению от иммунного контроля (Keir ME et al., 2008 Annu. Rev. Immunol. 26: 677). Таким образом, ингибирование PD-L1/PD-1 взаимодействия может стимулировать опосредованное CD8+ Т клетками уничтожение опухолей.

Ингибирование передачи аксиального сигнала PD-1 за счет его непосредственных лигандов (например, PD-L1, PD-L2) было предложено в качестве средства стимулирования Т-клеточного иммунитета при лечении рака (например, опухолевого иммунитета). Более того, аналогичное стимулирование Т-клеточного иммунитета наблюдали при ингибировании связывания PD-L1 с его партнером по связыванию В7-1. Оптимальное терапевтическое лечение может включать комбинирование блокады взаимодействия PD-1 рецептор/лиганд с другими противораковыми агентами. Остается потребность в наличии подобной оптимальной терапии для лечения, стабилизации, предотвращения и/или замедления развития различных видов рака.

Все ссылки, публикации и заявки на изобретение, которые указаны здесь, полностью приведены здесь для ссылки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к комбинированному лечению, включающему оксалиплатин, лейковорин и 5-FU и антагонист аксиального связывания PD-1 с или без VEGF антагониста.

Здесь приведены способы лечения рака или замедления развития рака у субъекта, включающие введение субъекту эффективного количества антагониста аксиального связывания PD-1 и оксалиплатина, лейковорина и 5-FU. В некоторых аспектах способ также включает введение VEGF антагониста.

Рак может представлять собой меланому, колоректальный рак, немелкоклеточный рак легкого, рак яичника, рак молочной железы, рак простаты, рак поджелудочной железы, гематологическое злокачественное заболевание или гипернефроидную опухоль почки. Рак может быть раком на ранней стадии или на поздней стадии. В некоторых вариантах изобретения подвергаемый лечению субъект представляет собой человека.

В некоторых вариантах осуществления лечение проводит к устойчивому ответу у субъекта после прекращения лечения. В некоторых вариантах осуществления лечение продуцирует полный ответ, частичный ответ или стабилизацию заболевания у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления антагонист аксиального связывания PD-1 представляет собой антагонист связывания PD-1, антагонист связывания PD-L1 или антагонист связывания PD-L2. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-1 ингибирует связывание PD-1 с PD-L1 и/или связывание PD-1 с PD-L2. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-1 представляет собой антитело (например, антитело MDX-1106, СТ-011 и Merck 3745, описанное здесь), его антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезин, слитый белок или олигопептид. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-L1 ингибирует связывание PD-L1 с PD-1 и/или связывание PD-L1 с В 7-1. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-L1 представляет собой антитело (например, антитело YW243.55.S70 и MDX-1105, описанное здесь), его антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезин, слитый белок или олигопептид. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-L2 ингибирует связывание PD-L2 с PD-1. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-L2 представляет собой антитело, его антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезин (например, AMP-224, описанный здесь), слитый белок или олигопептид.

В некоторых примерах осуществления VEGF антагонист представляет собой антитело, например моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-VEGF антитело связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное анти-VEGF антитело А4.6.1, продуцируемое гибридомой АТСС НВ 10709. Анти-VEGF антитело может представлять собой гуманизированное антитело или антитело человека. В некоторых вариантах осуществления анти-VEGF антитело представляет собой бевацизумаб. В некоторых вариантах осуществления анти-VEGF антитело имеет вариабельный участок тяжелой цепи, включающий следующую аминокислотную последовательность:

и вариабельный участок легкой цепи, включающий следующую аминокислотную последовательность:

В другом аспекте предусмотрен набор, включающий антагонист аксиального связывания PD-1, оксалиплатин, лейковорин и 5-FU с или без VEGF антагониста для лечения или замедления развития рака у субъекта или стимулирования иммунной функции у субъекта, имеющего рак. Набор может включать антагонист аксиального связывания PD-1 и вкладыш, включающий инструкции по применению антагониста аксиального связывания PD-1 в комбинации с оксалиплатином, лейковорином и 5-FU с или без VEGF антагониста для лечения или замедления развития рака у субъекта или стимулирования иммунной функции у субъекта, имеющего рак. Набор может включать VEGF антагонист и вкладыш, включающий инструкции по применению VEGF антагониста в комбинации с антагонистом аксиального связывания PD-1 и оксалиплатином, лейковорином и 5-FU для лечения или замедления развития рака у субъекта или стимулирования иммунной функции у субъекта, имеющего рак. Набор может включать антагонист аксиального связывания PD-1 и VEGF антагонист и вкладыш, включающий инструкции по применению антагониста аксиального связывания PD-1 и VEGF антагониста для лечения или замедления развития рака у субъекта или стимулирования иммунной функции у субъекта, имеющего рак.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1 представляет собой график, показывающий изменения объема опухоли при совместном лечении анти-PD-L1 антителами и FOLFOX. Данные показывают значительное снижение роста опухоли и устойчивых противоопухолевый эффект по сравнению с лечением только анти-PD-L1 или FOLFOX.

Фиг. 2 представляет собой график, показывающий изменения массы тела в группах, подвергаемых лечению, показанному на Фиг. 1.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий изменения объема опухоли при лечении анти-PD-L1 антителами в комбинации с FOLFOX по сравнению с анти-PD-L1 антителами в комбинации с FOLFOX и анти-VEGF антителом. Данные показывают, что дополнительное введение анти-VEGF антитела значительно снижает рост опухоли и приводит к устойчивому противоопухолевому эффекту по сравнению с лечением анти-PD-L1 антителами в комбинации с FOLFOX.

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий изменения массы тела в группах, подвергаемых лечению, показанному на Фиг. 3.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Общие способы

Способы и процедуры, описанные или упомянутые здесь, как правило, хорошо изучены и обычно применяются специалистами в данной области с использованием общепринятой методологии, такой как, например, широко применяемые методологии, описанные у Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3-е изд. (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); и Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

II. Определения

Термин "антагонист аксиального связывания PD-1" означает молекулу, которая ингибирует взаимодействие партнера PD-1 по аксиальному связыванию с одним или несколькими из его партнеров по связыванию для удаления Т-клеточной дисфункции, возникающей вследствие передачи сигнала по сигнальной оси PD-1, что приводит к восстановлению или стимулированию Т-клеточной функции. В соответствии с используемым здесь значением антагонист аксиального связывания PD-1 включает антагонист связывания PD-1, антагонист связывания PD-L1 и антагонист связывания PD-L2.

Термин "антагонисты связывания PD-1" означает молекулу, которая снижает, блокирует, ингибирует, препятствует или нарушает трансдукцию сигнала, возникающую вследствие взаимодействия PD-1 с одним или несколькими из его партнеров по связыванию, такими как PD-L1, PD-L2. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-1 представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-1 с его партнерами по связыванию. В определенном аспекте антагонист связывания PD-1 ингибирует связывание PD-1 с PD-L1 и/или PD-L2. Например, антагонисты связывания PD-1 включают анти-PD-1 антитела, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезины, слитые белки, олигопептиды и другие молекулы, которые снижают, блокируют, ингибируют, препятствуют или нарушают трансдукцию сигнала, возникающую вследствие взаимодействия PD-1 с одним или несколькими из его партнеров по связыванию, такими как PD-L1, PD-L2. В одном варианте осуществления антагонист связывания PD-1 снижает уровень негативного костимулирующего сигнала, опосредуемого за счет или через белки клеточной поверхности, экспрессируемые на Т лимфоцитах, опосредующих передачу сигнала через PD-1, для превращения дисфункциональной Т клетки в менее недисфункциональную. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-1 представляет собой анти-PD-1 антитело. В определенном аспекте антагонист связывания PD-1 представляет собой описанный здесь MDX-1106. В другом определенном аспекте антагонист связывания PD-1 представляет собой описанный здесь Merck 3745. В другом определенном аспекте антагонист связывания PD-1 представляет собой описанный здесь СТ-011.

Термин "антагонисты связывания PD-L1" означает молекулу, которая снижает, блокирует, ингибирует, препятствует или нарушает трансдукцию сигнала, возникающую вследствие взаимодействия PD-L1 с одним или несколькими из его партнеров по связыванию, такими как PD-1, В7-1. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-L1 представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L1 с его партнерами по связыванию. В определенном аспекте антагонист связывания PD-L1 ингибирует связывание PD-L1 с PD-1 и/или В7-1. В некоторых вариантах осуществления антагонисты связывания PD-L1 включают анти-PD-L1 антитела, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезины, слитые белки, олигопептиды и другие молекулы, которые снижают, блокируют, ингибируют, препятствуют или нарушают трансдукцию сигнала, возникающую вследствие взаимодействия PD-L1 с одним или несколькими из его партнеров по связыванию, такими как PD-1, В7-1. В одном варианте осуществления антагонист связывания PD-L1 снижает уровень негативного костимулирующего сигнала, опосредуемого за счет или через белки клеточной поверхности, экспрессируемые на Т лимфоцитах, опосредующих передачу сигнала через PD-L1, для превращения дисфункциональной Т клетки в менее недисфункциональную. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-L1 представляет собой анти-PD-L1 антитело. В определенном аспекте анти-PD-L1 антитело представляет собой описанный здесь YW243.55.S70. В другом определенном аспекте анти-PD-L1 антитело представляет собой описанный здесь MDX-1105.

Термин "антагонисты связывания PD-L2" означает молекулу, которая снижает, блокирует, ингибирует, препятствует или нарушает трансдукцию сигнала, возникающую вследствие взаимодействия PD-L2 с одним или несколькими из его партнеров по связыванию, такими как PD-1. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-L2 представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L2 с его партнерами по связыванию. В определенном аспекте антагонист связывания PD-L2 ингибирует связывание PD-L2 с PD-L1. В некоторых вариантах осуществления антагонисты связывания PD-L2 включают aHTH-PD-L2 антитела, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезины, слитые белки, олигопептиды и другие молекулы, которые снижают, блокируют, ингибируют, препятствуют или нарушают трансдукцию сигнала, возникающую вследствие взаимодействия PD-L2 с одним или несколькими из его партнеров по связыванию, такими как PD-1. В одном варианте осуществления антагонист связывания PD-L2 снижает уровень негативного костимулирующего сигнала, опосредуемого за счет или через белки клеточной поверхности, экспрессируемые на Т лимфоцитах, опосредующих передачу сигнала через PD-L2, для превращения дисфункциональной Т клетки в менее недисфункциональную. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-L2 представляет собой PD-L2 иммуноадгезин. В определенном аспекте PD-L2 иммуноадгезин представляет собой описанный здесь АМР-224.

"VEGF антагонист" означает молекулу, способную нейтрализовать, блокировать, ингибировать, препятствовать, снижать или нарушать активность VEGF, включая его связывание с одним или несколькими рецепторами VEGF. VEGF антагонисты включают анти-VEGF антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, рецепторные молекулы и производные, которые специфически связываются с VEGF, тем самым препятствуя его связыванию с одним или несколькими рецепторами, антитела против рецептора VEGF и антагонисты рецепторов VEGF, такие как низкомолекулярные ингибиторы VEGFR-тирозинкиназ.

Термины "VEGF" или "VEGF-A" применяются взаимозаменяемо по отношению к состоящему из 165 аминокислот фактору роста эндотелиальных клеток сосудов и родственным, состоящим из 121, 145, 183, 189 и 206 аминокислот фактора роста эндотелиальных клеток сосудов, которые описаны, например, Leung et al. Science, 246: 1306 (1989), and Houck et al. Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991), наряду с их встречающимися в природе аллельными и процессированными формами. VEGF-А является частью семейства генов, которое включает VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F и P1GF. VEGF-А связывается, главным образом, с двумя высокоаффинными тирозинкиназными рецепторами, VEGFR-1 (Fit-1) и VEGFR-2 (Flk-1/KDR), при этом последний рецептор является основным передатчиком митотических сигналов VEGF-А в васкулярные эндотелиальные клетки. Кроме того, нейропилин-1 был идентифицирован как рецептор для изоформ связывающегося с гепарином VEGF-А, при этом он может играть определенную роль в развитии сосудов. Термины "VEGF" или "VEGF-A" также означают VEGF не представляющих собой человека видов, таких как мыши, крысы или приматы. Иногда VEGF определенных видов обозначают hVEGF для VEGF человека или mVEGF для VEGF мышей. Термин "VEGF" также применяется для обозначения усеченных форм или фрагментов полипептида, включающих аминокислоты от 8 до 109 или от 1 до 109 фактора роста васкулярных эндотелиальных клеток человека, состоящего из 165 аминокислот. Ссылка на любую из данных форм VEGF может быть найдена в настоящей заявке, например, под обозначением "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" или "VEGF 165". Положения аминокислот "усеченного" нативного VEGF нумеруются как указано в нативной последовательности VEGF. Например, положение 17 аминокислоты (метионин) в усеченном нативном VEGF также представляет собой положение 17 (метионин) в нативном VEGF. Усеченный нативный VEGF обладает аффинностью связи по отношению к KDR и Fit-1 рецепторам, сравнимой с нативным VEGF.

"Анти-VEGF антитело" представляет собой антитело, которое связывается с VEGF с достаточной аффинностью и специфичностью. Выбранное антитело обычно обладает аффинностью связи по отношению к VEGF, например антитело может связываться с hVEGF со значением Kd, составляющим 100 нМ-1 пМ. Аффинности антител могут быть определены, например, с помощью анализа на основе поверхностного плазмонного резонанса (такого как анализ BIAcore, описанный в публикации РСТ заявки WO 2005/012359); твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA); и анализов на конкурентное связывание (например, RIA). В определенных вариантах изобретения анти-VEGF антитело по изобретению может применяться в качестве терапевтического агента для таргетирования и интерференции заболеваний или состояний, ассоциированных с активностью VEGF. Кроме того, указанное антитело может быть подвергнуто иным анализам биологической активности, например для оценки его эффективности в качестве терапевтического средства. Такие анализы известны из уровня техники и зависят от антигена-мишени и цели применения данного антитела. Примеры включают анализ ингибирования HUVEC; анализы ингибирования роста опухолевых клеток (описанные, например, в WO 89/06692); анализы на антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и комплемент-опосредуемую цитотоксичность (CDC) (патент США 5500362); и анализы на агонистическую активность или на гемопоэз (см. WO 95/27062). Анти-VEGF антитело обычно не связывается с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, а также с другими факторами роста, такими как P1GF, PDGF или bFGF.

"Химерный белок рецептора VEGF" представляет собой молекулу рецептора VEGF, имеющую аминокислотные последовательности, происходящие, по меньшей мере, от двух различных белков, по меньшей мере, один из которых представляет собой белок рецептора VEGF. В определенных вариантах изобретения химерный белок рецептора VEGF обладает способностью связываться с VEGF и ингибировать биологическую активность VEGF.

"Антиангиогенный агент" или "ингибитор ангиогенеза" означает вещество с малой молекулярной массой, полинуклеотид, полипептид, выделенный белок, рекомбинантный белок, антитело или их конъюгаты или слитые белки, которые ингибируют ангиогенез, образование и развитие сосудов или нежелаемую проницаемость сосудов непосредственно или опосредованно. Следует понимать, что агент против ангиогенеза включает такие агенты, которые связывают и блокируют ангиогенную активность ангиогенного фактора или его рецептора. Например, агент против ангиогенеза представляет собой антитело или другой антагонист агента против ангиогенеза, как указанный выше, например антитела против VEGF-A или рецептора VEGF-А (например, KDR рецептор или Flt-1 рецептор), анти-PDGFR ингибиторы, такие как Gleevec™ (иматиниба мезилат). Агенты против ангиогенеза также включают нативные ингибиторы ангиогенеза, например ангиостатин, эндостатин и т.д. См., например, Klagsbrun and D'Amore, Аппи. Rev. Physiol, 53: 217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22: 3172-3179(2003) (например, таблицу 3, в которой перечислены антиангиогенные терапевтические средства для злокачественной меланомы); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22: 6549-6556 (2003) (например, таблицу 2, в которой перечислены известные антиангиогенные факторы) и Sato. Int. J. Clin. Oncol, 8: 200-206 (2003) (например, таблицу 1, в которой перечислены антиангиогенные агенты, применяемые в клинических испытаниях).

Термин "дисфункция" в контексте иммунной дисфункции означает состояние пониженной иммунной реактивности при антигенной стимуляции. Термин включает общие элементы истощения и/или анергии, при которых может происходить узнавание антигена, но формируемый в результате иммунный ответ является неэффективным для контроля инфекции или роста опухоли.

"Стимулирование Т-клеточной функции" означает индуцирование, принуждение или стимулирование Т-клетки так, чтобы она имела устойчивую или амплифицированную биологическую функцию, или обновление или реактивацию истощенных или неактивных Т-клеток. Примеры стимулирования Т-клеточной функции включают: увеличенную секрецию γ-интерферона из Т-клеток CD8⁺, увеличенную пролиферацию, увеличенную реактивность по отношению к антигену (например, уничтожение вирусов или патогенов) по сравнению с данными уровнями до вмешательства. В одном варианте осуществления уровень стимулирования составляет, по меньшей мере, 50%, альтернативно 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. Способ измерения данного стимулирования известен среднему специалисту в данной области.

"Т-клеточное дисфункциональное расстройство" представляет собой расстройство или состояние Т-клеток, характеризующееся пониженной реактивностью к антигенному стимулированию. В определенном варианте осуществления Т-клеточное дисфункциональное расстройство представляет собой расстройство, которое специфично ассоциировано с несоответствующей повышенной передачей сигнала через PD-1. В другом варианте осуществления Т-клеточное дисфункциональное расстройство представляет собой расстройство, при котором Т-клетки являются энергичными или обладают сниженной способностью секретировать цитокины, пролиферировать или осуществлять цитолитическую активность. В определенном аспекте пониженная реактивность приводит к неэффективному контролю патогена или опухоли, экспрессирующей иммуноген. Примеры Т-клеточных дисфункциональных расстройств, характеризуемых Т-клеточной дисфункцией, включают неразрешенную острую инфекцию, хроническую инфекцию и опухолевый иммунитет.

«Опухолевый иммунитет» означает процесс, при котором опухоли ускользают от узнавания и уничтожения. Таким образом, в качестве терапевтической концепции, опухолевый иммунитет "лечится", когда такое ускользание ослабевает и опухоли узнаются и атакуются иммунной системой. Примеры узнавания опухоли включают связывание опухоли, сокращение опухоли и уничтожение опухоли.

"Иммуногенностъ" означает способность определенного вещества провоцировать иммунный ответ. Опухоли являются иммуногенными, при этом стимулирование опухолевой иммуногенности помогает при уничтожении опухолевых клеток за счет иммунного ответа. Примеры стимулирования опухолевой иммуногенности включают лечению анти-PDL антителами оксалиплатином, лейковорином и 5-FU с или без VEGF антагониста.

"Устойчивый ответ" означает устойчивое воздействие в плане снижения роста опухоли после прекращения лечения. Например, размер опухоли может оставаться таким же или быть меньше по сравнению с размером в начале фазы введения. В некоторых вариантах осуществления устойчивый ответ обладает продолжительностью, по меньшей мере, равной продолжительности лечения, по меньшей мере, 1,5Х, 2,0Х, 2,5Х или 3,0Х продолжительности лечения.

Термин "антитело" включает моноклональные антитела (включая полноразмерные антитела, которые имеют Fc участок иммуноглобулина), композиции антител с полиэпитопной специфичностью, полиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела, диатела и одноцепочечные молекулы, а также фрагменты антител (например, Fab, F(ab')₂ и Fv). Термин "иммуноглобулин" (Ig) применяется здесь взаимозаменяемо с термином "антитело".

Основной 4-цепочечный элемент антитела представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Антитело IgM состоит из 5 основных гетеротетрамерных элементов наряду с дополнительным полипептидом, называемым J-цепью, и содержит 10 антигенсвязывающих сайтов, в то время как антитела IgA включают от 2-5 основных элементов из 4 цепей, которые могут полимеризоваться с образованием поливалентных систем в комбинации с J-цепью. В случае IgG 4 цепочечный элемент обычно имеет массу около 150000 дальтон. Каждая L-цепь связана с Н-цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как две Н-цепи связаны друг с другом одной или несколькими дисульфидными связями, в зависимости от изотипа Н-цепи. Каждая Н- и L-цепь также имеет регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая Н-цепь имеет N-конец, вариабельный домен (V_H), за которым следуют три константных домена (C_H) для каждой из α и γ цепей и 4 C_H-домена для изотипов μ и ε. Каждая L-цепь имеет на N-конце вариабельный домен (V_L), за которым следует константный домен на ее другом конце. V_L расположена вдоль V_H, a C_L расположена вдоль первого константного домена тяжелой цепи (C_H1). Полагают, что конкретные аминокислотные остатки образуют зону контакта между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. Спаривание V_H и V_L вместе создает один антигенсвязывающий участок. Структуру и свойства различных классов антител, см., например, в Basic and Clinical Immunology, 8-e изд., Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton and Lange, Norwalk, CT, 1994, стр. 71 и глава 6. L-цепь любого вида позвоночных может быть отнесена к одному из двух явно отличающихся типов, называемых каппа и лямбда, на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей (СН) иммуноглобулины могут быть отнесены к разным классам или изотипам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, имеющие тяжелые цепи, обозначаемые α, δ, ε, γ, и μ, соответственно. Классы γ и α дополнительно подразделены на подклассы на основании относительно малых различий в СН последовательности и функции, например, люди экспрессируют следующие подклассы: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.

"Вариабельный участок" или "вариабельный домен" антитела означает аминоконцевые домены тяжелой или легкой цепи антитела. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи могут быть обозначены как "VH" и "VL", соответственно. Данные домены обычно являются наиболее вариабельными частями антитела (относительно других антител такого же класса) и содержат антигенсвязывающие участки.

Термин "вариабельный" относится к тому факту, что некоторые сегменты вариабельных доменов в значительной степени различаются по последовательности среди антител. V-домен опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела по отношению к его конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределена на протяжении вариабельных доменов. Напротив, она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными участками (HVR), в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называют каркасными участками (FR). Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелых и легких цепей включает четыре FR участка, в основном принимающие конфигурацию бета-слоев, соединенных тремя HVR, которые образуют петли, связывающие, а в некоторых случаях образующие часть бета-слоистой структуры. HVR в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости друг от друга FR участками и с HVR из другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al, Sequences of Immunological Interest, 5-е изд., National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены непосредственно не вовлечены в связывание антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в зависимой от антител клеточной токсичности.

Термин "моноклональное антитело" в соответствии с используемым здесь значением означает антитело, полученное из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций и/или посттрансляционных модификаций (например, изомеризации, амидирования), которые могут присутствовать в малых количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направленными против одного антигенного сайта. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно содержат различные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Кроме своей специфичности, моноклональные антитела имеют преимущество, состоящее в том, что они синтезируются в культуре гибридом, не содержат примесей других иммуноглобулинов. Определение "моноклональное" указывает на свойство антитела как антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, при этом его не следует рассматривать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с настоящемим изобретением могут быть получены множеством способов, включая, например, гибридомный способ (например, Kohler and Milstein., Nature, 256: 495-97 (1975); Hongo et al, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2-е изд. 1988); Hammerling et al, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), способами рекомбинантных ДНК (см, например,, патент США 4816567), способами на основе фагового дисплея (см., например, Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al, J. Mol Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al, J. Mol. Biol 338(2): 299-310 (2004); Lee et al, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); и Lee et al, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), и способами получения антител человека и человекоподобных антител у животных, обладающих частичными или полными локусами иммуноглобулина человека или генами, кодирующими последовательности иммуноглобулина человека (см., например, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al, Year in Immunol. 7: 33 (1993); патенты США 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425 и 5,661,016; Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnol 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); и Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

Термин "голое антитело" означает антитело, которое не конъюгировано с цитотоксическим остатком или радиоактивной меткой.

Термины "полноразмерное антитело", "интактное антитело" или "цельное антитело" применяются взаимозаменяемо по отношению к антителу в его по существу интактной форме, в противоположность фрагменту антитела. В частности, цельные антитела включают антитела с тяжелыми и легкими цепями, включая Fc-участок. Константные домены могут представлять собой константные домены с нативной последовательностью (например, константные домены с нативной последовательностью человека) или их варианты по аминокислотной последовательности. В некоторых случаях интактное антитело может иметь одну или несколько эффекторных функций.

"Фрагмент антитела" включает часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающий и/или вариабельный участок интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv фрагменты; диатела; линейные антитела (см. патент США 5641870, пример 2; Zapata et al, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); одноцепочечные молекулы антител и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Расщепление антител папаином продуцирует два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых "Fab" фрагментами, и остаточный "Fc" фрагмент, обозначение которого отражает способность легко кристаллизоваться. Fab фрагмент состоит из полной L-цепи наряду с доменом вариабельного участка Н-цепи (V_H) и первым константным доменом тяжелой цепи (C_H1). Каждый Fab фрагмент моновалентен в отношении связывания антигена, то есть имеет один антигенсвязывающий сайт. Обработка антитела пепсином продуцирует один большой F(ab')₂ фрагмент, который приблизительно соответствует двум связанным дисульфидом Fab фрагментам, имеющим разную антигенсвязывающую активность, при этом он все еще способен подвергать антиген перекрестному связыванию. Fab' фрагменты отличаются от Fab фрагментов наличием нескольких дополнительных остатков на карбоксильном конце C_H1 домена, включая один или несколько цистеинов из шарнирного участка антитела. Fab'-SH в настоящем описании является обозначением Fab', в котором остаток(ки) цистеина константных доменов несут свободную тиольную группу. F(ab’)₂-фрагменты антител первоначально были получены в виде пар Fab' фрагментов, между которыми присутствовали цистеины шарнира. Также известны другие химические соединения фрагментов антител.

Fc фрагмент включает части карбоксильных концов обеих Н-цепей, удерживаемые вместе дисульфидами. Эффекторные функции антител определяются последовательностями в Fc участка - участка, который также распознается Fc рецепторами (FcR), находящимися на некоторых типах клеток.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт узнавания и связывания антигена. Данный фрагмент состоит из димера одного домена вариабельного участка тяжелой цепи и одного домена вариабельного участка легкой цепи в тесной нековалентной ассоциации. В результате фолдинга данных двух доменов образуются шесть гипервариабельных петель (по 3 петли из каждой Н и L цепи), которые предоставляют аминокислотные остатки для связывания антигена и придают антителу специфичность связывания антигена. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, включающая только три HVR, специфичных по отношению к антигену) обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя с более низкой аффинностью, чем полный сайт связывания.

"Одноцепочечные Fv", также сокращенно называемые "sFv" или "scFv", представляют собой фрагменты антител, которые включают V_H и V_L домены антитела, связанные в одну полипептидную цепь. sFv полипептид предпочтительно дополнительно включает полипептидный линкер между V_H и V_L доменами, который позволяет sFv образовывать необходимую структуру для связывания антигена. Обзор sFv см. в публикации Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, T. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, стр. 269-315 (1994).

"Функциональные фрагменты" антител по изобретению включают часть интактного антитела, обычно включая антигенсвязывающий или вариабельный участок интактного антитела или Fc участок антитела, который сохраняет или имеет модифицированную способность связывать FcR. Примеры фрагментов антител включают линейное антитело, молекулы одноцепочечных антител и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.

Термин "диатела" означает небольшие фрагменты антител, полученные посредством конструирования sFv фрагментов (см. предыдущий абзац) с короткими линкерами (около 5-10 остатков) между V_H и V_L доменами, так чтобы добиться межцепочечного, а не внутрицепочечного спаривания V доменов с получением при этом бивалентного фрагмента, т.е. фрагмента, имеющего два антигенсвязывающих участка. Биспецифичные диатела представляют собой гетеродимеры двух "сшитых" sFv фрагментов, в которых V_H и V_L домены двух антител присутствуют в разных полипептидных цепях. Диатела более подробно описаны, например, в ЕР 404097, WO 93/11161, Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

Моноклональные антитела по изобретению, в частности, включают "химерные" антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретного вида или относящихся к конкретному классу или подклассу антител, при этом остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от другого вида или относящихся к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность (патент США №4816567; Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)). Представляющие интерес химерные антитела по изобретению включают приматизированные (PRIMATIZED^®) антитела, в которых антигенсвязывающий участок антитела получен из антитела, продуцируемого, например, при иммунизации макак представляющим интерес антигеном. В соответствии с используемым здесь значением термин "гуманизированное антитело" применяется в качестве подмножества "химерных антител".

"Гуманизированные" формы антител отличных от человека субъектов (например, мышей), представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина отличного от человека субъекта. В одном варианте осуществления изобретения гуманизированное антитело представляет собой иммуноглобулин человека (реципиентное антитело), в котором остатки из HVR (определение приведено ниже) реципиента заменены остатками из HVR отличного от человека вида (донорное антитело), такого как мышь, крыса, кролик или отличный от человека примат, обладающей требуемой специфичностью, аффинностью и/или емкостью. В некоторых случаях остатки каркаса ("FR") иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками отличного от человека вида. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не встречаются ни в реципиентом антителе, ни в донорном антителе. Данные модификации могут быть осуществлены для дополнительного повышения эффективности антитела, например аффинности связывания. Как правило, гуманизированное антитело будет включать по существу все из, по меньшей мере, одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют петлям последовательности иммуноглобулина отличного от человека субъекта и все или по существу все FR участки являются FR участками из последовательности иммуноглобулина человека, хотя FR участки могут содержать одну или несколько замен отдельных FR остатков, которые улучшают эффективность антитела, например аффинность связывания, изомеризацию, иммуногенность и т.д. Количество таких аминокислотных замен в FR обычно составляет не более 6 в Н-цепи и не более 3 в L-цепи. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать, по меньшей мере, часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно константного участка иммуноглобулина человека. Более подробное описание см. в Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). См. также, например, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994); и патенты США 6982321 и 7087409.

"Антитело человека" представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности антитела, продуцированного в организме человека и/или полученного с применением любого способа получения антител человека, как описано здесь. Данное определение антитела человека в частности не включает гуманизированное антитело, включающее антигенсвязывающие остатки отличного от человека субъекта. Антитела человека могут быть получены с использованием различных способов, известных из уровня техники, включая библиотеки фагового дисплея. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol, 222: 581 (1991). Также доступными для получения моноклональных антител человека являются способы, описанные Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, стр.77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147(l):86-95 (1991). См. также van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Антитела человека также могут быть получены путем введения антигена трансгенному животному, которое было модифицировано для получения таких антител в ответ на антигенную стимуляцию, но эндогенные локусы которого были деактивированы, например иммунизированной ксеномыши (см., например, патенты США 6075181 и 6150584 в отношении технологии XENOMOUSE™). См. также, например, Li et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006) в отношении антител человека, созданных с помощью методики гибридом В-клеток человека.

Термин "гипервариабельный участок", "HVR" или "HV" при использовании в настоящем описании означает области вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными по последовательности и/или образуют структурно выраженные петли. Как правило, антитела включают шесть HVR; три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). В нативных антителах Н3 и L3 проявляют наибольшее разнообразие шести HVR, и в частности, полагают, что Н3 играет уникальную роль в придании высокой специфичности антителам. См., например, Xu et al, Immunity 13: 37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Действительно, природные антитела камелид, состоящие только из тяжелой цепи, являются функциональными и стабильными в отсутствие легкой цепи. См., например, Hamers-Casterman et al, Nature 363: 446-448 (1993); Sheriff et al, Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996).

Применяют несколько вариантов определения границ HVR, при этом они рассматриваются в настоящем описании. Определяющие комплементарность участки по Kabat (CDR) основаны на вариабельности последовательностей и являются общеупотребительными (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-e изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Вместо этого Chothia рассматривает положение структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). HVR AbM представляют собой компромисс между HVR по Kabat и структурными петлями по Chothia и применяются в программном обеспечении для моделирования антител AbM Oxford Molecular. "Контактные" HVR основаны на анализе имеющихся комплексных кристаллических структур. Остатки для каждого из данных HVR указаны ниже.

HVR могут включать "удлиненные HVR" следующим образом: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 или 89-96 (L3) в VL и 26-35 (H1), 50-65 или 49-65 (Н2) и 93-102, 94-102, или 95-102 (Н3) в VH. Остатки вариабельных доменов пронумерованы согласно Kabat et al., выше, для каждого из приведенных определений.

Выражение "нумерация остатков вариабельного домена по Kabat" или "нумерация положений аминокислот по Kabat" и его варианты относятся к системе нумерации, применяемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи при обобщении данных об антителах у Kabat et ah, выше. При применении данной системы нумерации реальная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше или может содержать дополнительные аминокислоты, что соответствует укорочению или инсерции в FR или HVR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать инсерцию одной аминокислоты (остаток 52а согласно нумерации по Kabat) после остатка 52 в Н2 и встроенные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с и т.д. согласно нумерации по Kabat) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Kabat может быть определена для антитела путем выравнивания участков гомологии последовательности антитела относительно "стандартной" последовательности, пронумерованной по Kabat.

"Каркасные" или "FR" остатки представляют собой другие остатки вариабельного домена, отличные от HVR остатков, как определено здесь.

"Консенсусный каркас человека" или "акцепторный каркас человека" представляет собой каркас, который имеет наиболее широко встречающиеся аминокислотные остатки при селекции каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека. Селекция последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека обычно осуществляется из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Обычно подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, описанную у Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest 5-e изд.. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Примерами подгруппы в случае VL могут быть подгруппа каппа I, каппа II, каппа III или каппа IV согласно Kabat et al., выше. Кроме того, в случае VH подгруппой может быть подгруппа I, подгруппа II или подгруппа III согласно Kabat et al, выше. Консенсусный каркас человека альтернативно может быть получен из описанного выше, в котором конкретные остатки изменены, например, когда остаток каркаса человека выбирают на основе его гомологии с донорным каркасом путем выравнивания последовательности донорного каркаса с набором различных каркасных последовательностей человека. Акцепторный каркас человека, "образованный из" каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса человека, может включать такую же аминокислотную последовательность или может содержать ранее существующие изменения аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления количество ранее существующих аминокислотных изменений составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее.

"Консенсусный каркас VH подгруппы III" включает консенсусную последовательность, полученную из аминокислотных последовательностей вариабельной подгруппы III тяжелой цепи по Kabat et al., выше. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность консенсусного каркаса VH подгруппы III включает, по меньшей мере, часть или все из следующих последовательностей: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (HC-FR1) (SEQ ID NO: 30), WVRQAPGKGLEWV (HC-FR2), (SEQ ID NO: 31), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (HC-FR3, SEQ ID NO: 32), WGQGTLVTVSA (HC-FR4), (SEQ ID NO: 33).

"Консенсусный каркас VH подгруппы III " включает консенсусную последовательность, полученную из аминокислотных последовательностей в подгруппе I вариабельного участка легкой цепи каппа согласно Kabat et al., выше. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность консенсусного каркаса VH подгруппы I включает, по меньшей мере, часть или все из следующих последовательностей: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (LC-FR1) (SEQ ID NO: 34), WYQQKPGKAPKLLIY (LC-FR2) (SEQ ID NO: 35),

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (LC-FR3)(SEQ ID NO: 36), FGQGTKVEIKR (LC-FR4)(SEQ ID NO: 37).

"Аминокислотная модификация" в конкретном положении, например, Fc участке, означает замену или делецию конкретного остатка или инсерцию, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка рядом с конкретным остатком. Инсерция "рядом" с конкретным остатком означает инсерцию в пределах от одного до двух остатков относительно него. Инсерция может быть N-терминальной или С-терминальной по отношению к конкретному остатку. Предпочтительная аминокислотная модификация согласно изобретению представляет собой замещение.

"Аффинно зрелое" антитело представляет собой антитело с одним или несколькими изменениями в одном или нескольких его HVR, которые приводят к повышению аффинности антитела к антигену по сравнению с исходным антителом, которое не имеет такого изменения (изменений). В одном варианте осуществления аффинно зрелые антитела имеют наномолярные или даже пикомолярные аффинности по отношению к антигену-мишени. Аффинно зрелые антитела получают способами, известными из уровня техники. Например, Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992) описывают аффинное созревание в результате перетасовки доменов VH и VL. Случайный мутагенез HVR и/или каркасных остатков описан, например, у: Barbas et al Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al, J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995); и Hawkins et al, J. Mol. Biol 226: 889-896 (1992).

В соответствии с используемым здесь значением термин "специфично связывается с" или является "специфичным для" относится к измеряемым и воспроизводимым взаимодействиям, таким как связывание между мишенью и антителом, которое является определяющим показателем наличия мишени в присутствии гетерогенной популяции молекул, включающей биологические молекулы. Например, антитело, которое специфично связывается с мишенью (которая может быть эпитопом), представляет собой антитело, которое связывает такую мишень с большей аффинностью, авидностью, легче и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими мишенями. В одном варианте осуществления степень связывания антитела с неродственной мишенью составляет менее чем около 10% относительно степени связывания антитела с данной мишенью, как измерено, например, с помощью радиоиммуноанализа (RIA). В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфично связывается с мишенью, имеет значение константы диссоциации (Kd)≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ или ≤0,1 нМ.. В некоторых вариантах осуществления антитело специфично связывается с эпитопом на белке, который является консервативным в белке, полученном от разных видов. В другом варианте осуществления специфичное связывание может включать, но не обязательно, единственное связывание.

В соответствии с используемым здесь значением термин "иммуноадгезин" означает подобные антителу молекулы, которые сочетают специфичность связывания гетерологичного белка ("адгезин") с эффекторными функциями константных доменов иммуноглобулинов. Структурно иммуноадгезины включают аминокислотную последовательность с требуемой специфичностью связывания, отличающуюся от сайта распознавания антигена и сайта связывания антитела (т.е. являющуюся "гетерологичной"), слитую с последовательностью константного домена иммуноглобулина. Адгезиновая часть молекулы иммуноадгезина обычно представляет собой непрерывную аминокислотную последовательность, включающую, по меньшей мере, сайт связывания рецептора или лиганда. Последовательность константного домена иммуноглобулина в иммуноадгезине может быть получена из любого иммуноглобулина, такого как IgG-1, IgG-2 (включая IgG2A и IgG2B), IgG-3 или подтипы IgG-4, IgA (включая IgA-1 и IgA-2), IgE, IgD или IgM. Продукты слияния Ig предпочтительно включают замещение доменом полипептида или антитела, описанного здесь, по меньшей мере, одного вариабельного участка в молекуле Ig. В особенно предпочтительном варианте осуществления продукт слияния иммуноглобулина включает шарнирный участок, СН2 и СН3, или шарнирный участок, CH1, СН2 и СН 3 участки IgG1 молекулы. Описание получения продуктов слияния иммуноглобулина см. также в патенте США 5428130, выданном 27 июня 1995. Например, иммуноадгезины, пригодные в качестве второго лекарственного средства, применяемого для комбинированной терапии по изобретению, включают полипептиды, которые включают внеклеточную или связывающую PD-1 часть PD-L1 или PD-L2 или внеклеточную или связывающую PD-L1 или PD-L2 часть PD-L, слитые с константным доменом последовательности иммуноглобулина, такие как PD-L1 ECD - Fc, PD-L2 ECD - Fc, и PD-1 ECD - Fc, соответственно. Комбинации иммуноадгезина с Ig Fc и ECD рецепторов клеточной поверхности иногда называют растворимыми рецепторами.

"Слитый белок" и "слитый полипептид" относятся к полипептиду, имеющему два участка, ковалентно связанных друг с другом, где каждая из данных частей представляет собой полипептид с различным свойством. Данное свойство может представлять собой биологическое свойство, такое как активность in vitro или in vivo. Также свойство может представлять собой простое химическое или физическое свойство, такое как связывание с молекулой-мишенью, катализ реакции и т.д. Данные две части могут быть непосредственно связаны одной пептидной связью или через пептидный линкер, при этом они будут находиться в рамке считывания друг с другом.

"PD-7 олигопептид" "PD-L1 олигопептид" или "PD-L2 олигопептид" представляет собой олигопептид, который связывается, предпочтительно специфично, с PD-1, PD-L1 или PD-L2 негативным костимулирующим полипептидом, соответственно, включая рецептор, лиганд или сигнальный компонент, соответственно, как описано здесь. Такие олигопептиды могут быть синтезированы химически с применением известной методологии синтеза олигопептидов или могут быть получены и очищены с применением рекомбинантой технологии. Такие олигопептиды обычно имеют длину, по меньшей мере, около 5 аминокислот, альтернативно, по меньшей мере, около 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 аминокислот или более. Такие олигопептиды могут быть идентифицированы с применением хорошо известных способов. В этом отношении следует отметить, что способы скрининга олигопептидных библиотек на олигопептиды, которые способны специфично связываться с полипептидом-мишенью, хорошо известны из уровня техники (см., например, патенты США 5556762, 5750373, 4708871, 4833092, 5223409, 5403484, 5571689, 5663143; РСТ публикации WO 84/03506 и WO 84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 3998-4002 (1984); Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al, J. Immunol. Meth., 102: 259-274 (1987); Schoofs et al, J. Immunol, 140: 611-616 (1988), Cwirla, S.E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378 (1990); Lowman, H.B. et al. Biochemistry, 30: 10832 (1991); Clackson, T. et al. Nature, 352: 624 (1991); Marks, J.D. et al, J. Mol. Biol, 222: 581 (1991); Kang, A.S. et al Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88: 8363 (1991), и Smith, G.P., Current Opin. Biotechnol, 2: 668 (1991).

"Блокирующее" антитело или "антагонистическое" антитело представляет собой антитело, которое ингибирует или снижает биологическую активность антигена, с которым оно связывается. В некоторых вариантах осуществления блокирующие антитела или антитела-антагонисты в значительной степени или полностью ингибируют биологическую активность антигена. Например, VEGF-специфическое антитело-антагонист связывает VEGF и ингибирует способность VEGF индуцировать пролиферацию васкулярных эндотелиальных клеток или индуцировать сосудистую проницаемость. Анти-PD-L1 антитела по изобретению блокируют передачу сигнала через PD-1, так что восстанавливается функциональный ответ Т-клеток после дисфункционального состояния на стимуляцию антигеном.

«Агонистическое» или активирующее антитело представляет собой антитело, которое усиливает или инициирует передачу сигнала антигеном, с которым оно связывается. В некоторых вариантах осуществления антитела-агонисты вызывают или активируют передачу сигнала в отсутствие природного лиганда.

Термин "Fc участок" используют здесь для определения С-терминального участка тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fc участки с нативной последовательностью и варианты Fc участков. Хотя границы Fc участка тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, Fc участок тяжелой цепи IgG человека определяется как участок от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Pro230 до его карбоксильного конца. С-терминальный лизин (остаток 447 по EU системе нумерации) Fc участка может быть удален, например, в процессе продуцирования или очистки антитела, или с помощью рекомбинантной модификации нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Соответственно, композиция интактных антител может включать популяции антител с удалением всех K447 остатков, популяции антител без удаления K447 остатков и популяции антител, имеющие смесь антител с K447 остатком и без него. Подходящие Fc участки с нативными последовательностями для применения в антителах по изобретению включают IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 и IgG4 человека.

Термины "Fc рецептор" или "FcR" описывают рецептор, который связывается с Fc участком антитела. Предпочтительный FcR представляет собой FcR человека с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительный FcR представляет собой FcR, который связывает IgG антитело (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов Fc©RI, Fc©RII и Fc©RIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов, Рс©RII-рецепторы включают Fc©RIIA ("активирующий рецептор") и Fc©RIIB ("ингибирующий рецептор"), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, в основном различающиеся в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор Fc©RIIA содержит иммунорецепторный тирозин-связывающий активирующий мотив (ITAM) в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор Fc©RIIB содержит иммунорецептор мотив ингибирования на основе тирозина (ITIM) в своем цитоплазматическом домене, (см. М. Daeron, Аппи. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997). FcR описаны у Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4: 25-34 (1994); и de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Другие FcR, включая FcR, которые будут идентифицированы в будущем, включены здесь в термин "FcR".

Термин "Fc рецептор" или "FcR" также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG плоду. Guyer et al, J. Immunol. 117: 587 (1976) и Kim et al, J. Immunol. 24: 249 (1994). Известны способы измерения связывания FcRn (см, например, Ghetie and Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997); Ghetie et al, Nature Biotechnology 15. (7): 637-40 (1997); Hinton et al, J. Biol. Chem. 279 (8): 6213-6 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al). Связывание с FcRn in vivo и время полужизни в сыворотке высокоаффинных связывающих полипептидов FcRn человека могут быть проанализированы, например, у трансгенных мышей или в трансфицированных клеточных линиях человека, экспрессирующих FcRn человека, или у приматов, которым вводят полипептиды, имеющие вариант Fc участка. Заявка WO 2004/42072 (Presta) описывает варианты антител с улучшенным или уменьшенным связыванием FcR. См. также, например, Shields et al, J. Biol Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).

Фраза "в значительной степени сниженный" или "в значительной степени отличающийся", используемая здесь, означает достаточно высокую степень различия между двумя числовыми значениями (обычно одно ассоциировано с определенной молекулой, а другое ассоциировано с эталонной молекулой/молекулой для сравнения), так что специалист в данной области может считать различие между двумя значениями статистически значимым в контексте биологического свойства, измеряемого указанными значениями (например, значениями Kd). Разница между указанными двумя значениями составляет, например, более чем около 10%, более чем около 20%, чем около 30%, чем около 40% и/или чем около 50% относительно величины эталонной молекулы/молекулы для сравнения.

Термин "по существу сходный" или "по существу такой же", используемый здесь, означает достаточно высокую степень сходства между двумя числовыми значениями (например, одно ассоциировано с антителом по изобретению, а другое ассоциировано с эталонным антителом/антителом для сравнения), так что специалист в данной области может считать различие между двумя значениями небольшим или биологически и/или статистически не значимым в контексте биологического признака, измеряемого указанными значениями (например, значениями Kd). Разница между указанными двумя значениями составляет, например, менее чем около 50%, менее чем около 40%, менее чем около 30%, менее чем около 20% и/или менее чем около 10% относительно эталонного значения/значения для сравнения.

В соответствии с используемым здесь значением термин "носители" включает фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы, которые являются нетоксичными для клетки или млекопитающего, подвергаемых их воздействию, в используемых дозировках и концентрациях. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный раствор, забуференный по рН. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферы, такие как фосфатный, нитратный буфер и буферные растворы других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярный (содержащий менее чем около 10 остатков) полипептид; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и PLURONICS™.

"Вкладыш" означает инструкции, обычно вкладываемые в коммерческие упаковки лекарственных средств, которые содержат информацию с указаниями, обычно включающуюся в коммерческие упаковки лекарственных средств, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозе, способе введения, противопоказаниях, других лекарственных средствах, сочетаемых с упакованным продуктом, и/или предупреждения, касающихся применения таких лекарственных средств и т.д.

В соответствии с используемым здесь значением термин "лечение" означает клиническое вмешательство с целью изменения естественного течения процесса у субъекта или в клетке, подвергаемой лечению во время протекания клинической патологии. Требуемые эффекты лечения включают снижение скорости прогрессирования заболевания, ослабление или облегчение патологического состояния и ремиссию или улучшенный прогноз. Например, "лечение" субъекта является успешным, если один или несколько симптомов, связанных с раком, снижаются или устраняются, включая, без ограничение, снижение пролиферации (или уничтожение) раковых клеток, снижение симптомов, возникающих вследствие заболевание, увеличение качества жизни страдающих от заболевания субъектов, снижение дозировки иных лекарственных средств, требуемых для лечения заболевания, замедление развития заболевания и/или пролонгирование срока жизни субъектов.

В соответствии с используемым здесь значением "замедление развития заболевания" означает приостановку, задержку, замедление, стабилизацию и/или задержку развития заболевания (такого как рак). Данная задержка может варьироваться по времени в зависимости от истории заболевания и/подвергаемого лечению субъекта. Как известно специалисту в данной области, достаточное или значительное замедление может приводить к предотвращению заболевания, при котором у субъекта не развивается заболевание. Например, может быть замедлено развитие рака на поздней стадии, такое как развитие метастазов.

"Эффективное количество" представляет собой, по меньшей мере, минимальную концентрацию, необходимую для получения измеряемого улучшения или предотвращения конкретного заболевания. Эффективное количество здесь может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и масса пациента, а также способность антитела вызывать требуемый ответ у субъекта. Эффективное количество также представляет собой количество, при котором любые токсические или вредные эффекты лекарственного средства перевешиваются терапевтически полезными эффектами. Для профилактического применения полезные или желательные результаты включают результаты, такие как устранение или снижение риска, уменьшение тяжести или замедление развития заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, возникающие при развитии заболевания. В плане терапевтического применения полезные или желательные результаты включают клинические результаты, такие как уменьшение одного или нескольких симптомов, возникающих вследствие заболевания, повышение качества жизни страдающих от заболевания субъектов, снижение дозы иных лекарственных средств, требуемых для лечения заболевания, увеличение действия иного лекарственного средства, например посредством таргетирования, замедление развития заболевания и/или увеличение срока жизни. В случае рака или опухоли эффективное количество лекарственного средства может приводить к снижению количества раковых клеток; снижению размера опухоли; ингибированию (например, замедлению в некоторой степени или, желательно, остановке) инфильтрации раковых клеток в периферические органы; ингибированию (например, замедлению в некоторой степени или, желательно, остановке) метастазирования опухоли; ингибированию в некоторой степени роста опухоли; и/или облегчению в некоторой степени одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием. Эффективное количество может быть введено в рамках одно или несколько введений. В целях данного изобретения эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для достижения профилактического или терапевтического лечения непосредственно или косвенным образом. Как понимается в рамках клинического контекста, эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может или не может быть достигнуто в комбинации с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, "эффективное количество" может рассматриваться в контексте введения одного или нескольких терапевтических агентов, при этом отдельный агент может рассматриваться в качестве обеспечивающего эффективное количество в случае, если желательный результат может быть достигнут в комбинации с одним или несколькими другими агентами.

В соответствии с используемым здесь значением "в комбинации с" означает введение одного лекарственного средства наряду с другим лекарственным средством. Таким образом, "в комбинации с" означает введение одного лекарственного средства до, одновременно или после введения другого лекарственного средства субъекту.

Термины «рак» и «раковый» означают или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Это определение включает доброкачественные и злокачественные виды рака, а также "дремлющие" опухоли или микрометастазы. Примеры рака включают, без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких типов рака включают плоскоклеточный рак, рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и мелкоклеточную карциному легкого), рак брюшной полости, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка или отделов, относящихся к желудку (включая рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак ободочной кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнных желез, рак почки или относящийся к почке, рак печени, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени и различные типы рака головы и шеи, а также В-клеточную лимфому (включая низкозлокачественную/фолликулярную неходжкинскую лимфому (NHL); мелколимфоцитарную (SL) NHL; среднезлокачественную/фолликулярную NHL; среднезлокачественную диффузную NHL; высокозлокачественную иммунобластную NHL; высокозлокачественную лимфобластную NHL; высокозлокачественную мелкоклеточную NHL с нерасщепленными ядрами; массированное NHL заболевание; оболочечноклеточную лимфому; лимфому, связанную со СПИДом; и макроглобулинемию Вальденстрома); хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL); острый лимфобластный лейкоз (ALL); лейкозный ретикулоэндотелиоз; хронический миелобластный лейкоз; и пострансплантационное лимфопролиферативное нарушение (PTLD), а также аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозом, отеком (таким как связанный с опухолями мозга), и синдром Мейга.

Под "метастазированием" подразумевается распространение рака от его первичного участка в другие области тела. Раковые клетки могут отрываться от первичной опухоли, проникать в лимфатические и кровеносные сосуды, циркулировать в кровотоке и размножаться (метастазировать) в периферических очагах нормальных тканей в других участках тела. Метастазирование может быть локальными или периферическим. Метастазирование представляет собой последовательный процесс, при котором определенная часть опухолевых клеток отрывается от первичной опухоли, перемещается по кровотоку и оседает в отдаленном участке. В данном новом участке обеспечивается кровоснабжение указанных клеток, при этом они могут размножаться с образованием клеточной массы, представляющей угрозу для жизни. Такое поведение опухолевых клеток регулируется стимулирующими и ингибирующими молекулярными механизмами, действующими внутри клетки, и, кроме того, важное значение также имеют взаимодействия между опухолевыми клетками и клетками-хозяевами.

Термин "субъект" означает млекопитающее, включая, без ограничения, являющееся или не являющееся человеком млекопитающее, такое как коровы, лошади, собаки, овцы или кошки. Предпочтительный субъект представляет собой человека. Здесь термин "субъект" также включает пациентов.

В соответствии с используемым здесь значением термин "полный ответ" или "CR" означает исчезновение всех поражений-мишеней; "частичный ответ" или "PR" означает, по меньшей мере, 30% снижение суммы наиболее длинных диаметров (SLD) поражений-мишеней с учетом базовой SLD; а "стабильная болезнь" или "SD" означает отсутствие достаточного уменьшения поражений-мишеней для соответствия PR и отсутствие достаточного увеличения для соответствия PD с учетом наименьшей SLD с начала лечения.

В соответствии с используемым здесь значением термин "прогрессирующее заболевание" или "PD" означает, по меньшей мере, 20% увеличение SLD поражений-мишеней с учетом наименьшей SLD, определенной с начала лечения, или присутствия одного или нескольких новых поражений.

В соответствии с используемым здесь значением "период без прогрессирования" (PFS) означает продолжительность времени в течение и после лечения, при котором подвергаемое лечению заболевание (например, рак) не ухудшается. Период без прогрессирования может включать количество времени, в рамках которого пациенты испытывают полный ответ или частичный ответ, а также количество времени, в рамках которого пациенты испытывают стабильную болезнь.

В соответствии с используемым здесь значением термин "общая степень ответа" (ORR) означает сумму степени полного ответа (CR) и степени частичного ответа (PR).

В соответствии с используемым здесь значением термин "общая выживаемость" означает долю субъектов в группе, которые скорее всего будут живы после определенного периода времени.

"Химиотерапевтический агент" представляет собой химическое соединение, пригодное для лечения рака. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN®); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL®); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®), СРТ-11 (иринотекан, CAMPTOSAR®), ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; пеметрексед; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; TLK-286; CDP323; пероральный ингибитор интегрина альфа-4; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности, калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Nicolaou et al., Agnew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеинов - энедииновые антибиотики), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (включая ADRIAMYCIN®, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин, липосомный инъекционный доксорубицин-HCl (DOXIL®) и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат, гемцитабин (GEMZAR®), тегафур (UFTORAL®), капецитабин (XELODA®), эпотилон и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин и иматиниб (производное 2-фениламинопиримидина), а также другие ингибиторы c-Kit; средства, подавляющие функции надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®); дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-С"); тиотепа; таксоиды, например паклитаксел (TAXOL®), препарат паклитаксела на основе сконструированных связанных с альбумином наночастиц (ABRAXANE™) и доксетаксел (TAXOTERE®); хлорамбуцил; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин (VELBAN®); платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин (ONCOVIN®); оксалиплатин; лейковорин; винорелбин (NAVELBINE®); новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого агента, указанного выше; а также сочетания двух или более указанных выше средств, такие как CHOP, сокращенное название комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращенное название схемы лечения оксалиплатином (ELOXATIN™) в сочетании с 5-FU и лейковорином.

Также в данное определение включены противогормональные агенты, которые действуют, регулируя, уменьшая, блокируя или ингибируя эффекты гормонов, которые могут стимулировать рост опухоли, и часто применяются в форме системного лечения или лечения на уровне целого организма. Они сами могут являться гормонами. Примеры включают антиэстрогены и селективные модуляторы рецептора эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен (включая тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен (EVISTA®), дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (FARESTON®); антипрогестероны; понижающие регуляторы рецептора эстрогена (ERD); антагонисты рецепторов эстрогена, такие как фулвестрант (FASLODEX®); средства, которые подавляют или выключают яичники, например, агонист лютеинизирующего релизинг-гормона (LHRH), такой как лейпролида ацетат (LUPRON® и ELIGARD®), гозерелина ацетат, бусерелина ацетат и триптерилин; другие антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; и ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, который регулирует образование эстрогена в надпочечниках, например, такие как 4(5)-имидазолы, аминоглютетимид, мегестрола ацетат (MEGASE®), экземестан (AROMASIN®), форместани, фадрозол, ворозол (RIVISOR®), летрозол (FEMARA®) и анастрозол (ARIMIDEX®). Кроме того, такое определение химиотерапевтических средств включает бисфосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS® или OSTAC ®), этидронат (DIDROCAL®), NE-58095, золедроновая кислота/золедронат (ZOMETA®), алендронат (FOSAMAX®), памидронат (AREDIA®), тилудронат (SKELID®) или ризедронат (ACTONEL ®); а также троксацитабин (нуклеозидный аналог цитозина 1,3-диоксолан); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности, олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в каскадах передачи сигнала, вовлеченных в нарушенную пролиферацию клеток, например, такие как PKC-alpha, Raf, H-Ras и рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE® и вакцины для генной терапии, например, вакцина ALLOVECTIN ®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID ®; ингибитор топоизомеразы 1 (LURTOTECAN®); антиэстроген, такой как фулвестрант; ингибитор Kit, такой как иматиниб или EXEL-0862 (ингибитор тирозинкиназы); ингибитор EGFR, такой как эрлотиниб или цетуксимаб; ингибитор против VEGF, такой как бевацизумаб; иринотекан; rmRH (например, ABARELIX®); лапатиниб и лапатиниб дитозилат (двойной низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназ ErbB-2 и EGFR, также известный как GW572016); 17AAG (производное гелданамицина, которое представляет собой яд на основе белка теплового шока (Hsp) 90), и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше.

В соответствии с используемым здесь значением термин "цитокин" является общим термином для белков, высвобождаемых одной популяцией клеток, которые воздействуют на другую клетку в качестве межклеточных медиаторов или оказывают аутокринное влияние на клетки, продуцирующие белки. Примеры данных цитокинов включают лимфокины, монокины; интерлейкины ("IL"), такие как IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A-F, от IL-18 до IL-29 (такой как IL-23), IL-31, включая PROLEUKIN® rIL-2; фактор опухолевого некроза, такой как TNF-α или TNF-β, TGF-β1-3; и другие полипептидные факторы, включая фактор ингибирования лейкоза ("LIF"), цилиальный нейротрофный фактор ("CNTF"), CNTF-подобный цитокин ("CLC"), кардиотрофин ("СТ") и kit-лиганд ("KL").

В соответствии с используемым здесь значением термин "хемокин" означает растворимые факторы (например, цитокины), которые обладают способностью селективно индуцировать хемотаксис и активацию лейкоцитов. Они также запускают процессы ангиогенеза, воспаления, задивления ран и онкогенеза. Примеры хемокинов включают IL-8, гомолог человека кератиноцитного хемоаттрактанта (КС) мышей.

В соответствии с используемым здесь значением и в рамках прилагаемой формулы изобретения формы существительных включают их варианты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное.

Термин "около", относящийся здесь к значению или параметру, включает (и описывает) варианты, которые по сути включают данное значение или параметр. Например, описание со ссылкой на "около X" включает "X".

В соответствии с используемым здесь значением термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям соединения по изобретению. Типичные соли включают, без ограничения, сульфатные, цитратные, ацетатные, оксалатные, хлоридные, бромидные, иодидные, нитратные, бисульфатные, фосфатные, кислые фосфатные, изоникотинатные, лактатные, салицилатные, кислые цитратные, тартратные, олеатные, таннатные, пантотенатные, битартратные, аскорбатные, сукцинатные, малеатные, гентизинатные, фумаратные, глюконатные, глюкуронатные, сахаратные, формиатные, бензоатные, глутаматные, метансульфонатные ("мезилатные"), этансульфонатные, бензолсульфонатные, n-толуолсульфонатные, памоатные(т.е. 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтоат))соли; соли щелочных металлов (например, натрия и калия), соли щелочноземельных металлов (например, магния) и соли аммония. Фармацевтически приемлемые соли могут содержать включение другой молекулы, такой как ацетат-ион, сукцинат-ион или другой противоион. Противоион может представлять собой любую органическую или неорганическую группу, которая стабилизирует заряд в исходном соединении. Кроме того, фармацевтически приемлемая соль может иметь в своей структуре более чем один заряженный атом. В тех случаях, когда многочисленные заряженные атомы являются частью фармацевтически приемлемой соли, они могут иметь многочисленные противоионы. Таким образом, фармацевтически приемлемая соль может иметь один или несколько заряженных атомов и/или один или несколько противоионов.

Если соединение по изобретению является основанием, то желаемая фармацевтически приемлемая соль может быть получена с помощью любого способа из уровня техники, например, обработкой свободного основания неорганической кислотой, такой как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, метансульфоновая кислота, фосфорная кислота и тому подобное, или органической кислотой, такой как уксусная кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, миндальная кислота, фумаровая кислота, малоновая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, гликолевая кислота, салициловая кислота, пиранозидильная кислота, такая как глюкуроновая кислота или галактуроновая кислота, альфа-оксикислота, такая как лимонная кислота или винная кислота, аминокислота, такая как аспарагиновая кислота или глютаминовая кислота, ароматическая кислота, такая как бензойная кислота или циннамовая кислота, сульфоновая кислота, такая как п-толуолсульфоновая кислота или этансульфоновая кислота, или им подобными.

Если соединение по изобретению представляет собой кислоту, то желаемая фармацевтически приемлемая соль может быть получена с помощью любого подходящего способа, например, обработкой свободной кислоты неорганическим или органическим основанием, таким как амин (первичный, вторичный или третичный), гидроксид щелочного металла или гидроксид щелочно-земельного металла или им подобными. Иллюстративные примеры подходящих солей включают, без ограничения, органические соли, полученные из аминокислот, таких как глицин и аргинин, аммиака, первичных, вторичных и третичных аминов и циклических аминов, таких как пиперидин, морфолин и пиперазин, и неорганические соли, полученные из натрия, кальция, калия, магния, марганца, железа, меди, цинка, алюминия и лития.

Выражение "фармацевтически приемлемое" указывает на то, что соединение или композиция должны быть химически и/или токсикологически совместимыми с другими ингредиентами, входящими в состав композиции, и/или с млекопитающим, которое подвергается лечению ими.

Является очевидным, что описанные здесь аспекты и варианты изобретения включают "состоящие" и/или "состоящие по существу из" аспектов и вариантов.

III. Способы

Способы по данному изобретению могут применяться при лечении состояний, при которых увеличенная иммуногенность является желательной, такая как увеличенная опухолевая иммуногенность для лечения рака. Лечению или замедлению прогрессирования может подвергаться ряд видов рака.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет меланому. Меланома может представлять собой рак на ранней стадии или на поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет колоректальный рак. Колоректальный рак может представлять собой рак на ранней стадии или на поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет немелкоклеточный рак легкого.. Немелкоклеточный рак легкого может представлять собой рак на ранней стадии или на поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет рак поджелудочной железы. Рак поджелудочной железы может представлять собой рак на ранней стадии или на поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет гематологическое злокачественное заболевание. Гематологическое злокачественное заболевание может представлять собой рак на ранней стадии или на поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет рак яичника. Рак яичника может представлять собой рак на ранней стадии или на поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет рак молочной железы. Рак молочной железы может представлять собой рак на ранней стадии или на поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет гипернефроидную карциному почки. Гипернефроидная карцинома почки может представлять собой рак на ранней стадии или на поздней стадии.

В некоторых вариантах изобретения подвергаемый лечению субъект представляет собой человека.

Комбинированная терапия по изобретению включает введения антагониста аксиального связывания PD-1 и оксалиплатина, лейковорина и 5-FU. В другом аспекте изобретение относится к комбинированной терапии, включающей введение антагониста аксиального связывания PD-1, VEGF антагониста и оксалиплатина, лейковорина и 5-FU. Антагонист аксиального связывания PD-1 и VEGF антагонист могут быть введены любым подходящим способом, известным из уровня техники. Например, антагонист аксиального связывания PD-1 и VEGF антагонист могут быть введены последовательно (в разные моменты времени) или одновременно (в один момент времени).

В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению могут также включать дополнительного терапевтического вида лечения. Дополнительный вид лечения может представлять собой радиационную терапию, хирургию (например, удаление опухоли молочной железы и мастэктомию), химиотерапию, генную терапию, ДНК терапию, вирусную терапию, РНК терапию, иммунотерапию, трансплантацию костного мозга, нанотерапию, терапию с применением моноклональных антител или их комбинацию. Дополнительная терапия может быть в форме адъювантной или неоадъювантной терапии. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой введение низкомолекулярного ферментативного ингибитора или противометастазного агента. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой введение ограничивающих побочные эффекты агентов (например, агентов, предназначенных для снижения вероятности возникновения и/или тяжести побочных эффектов лечения, таких как противорвотные агенты и т.д.). В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой радиационную терапию. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой хирургию. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой комбинацию радиационной терапии и хирургии. Дополнительная терапия может представлять собой один или несколько описанных выше химиотерапевтических агентов.

В способах по изобретению может применяться любой из описанных ниже антагонистов аксиального связывания PD-1 и VEGF антагонистов. Антагонисты аксиального связывания PD-1

Здесь описан способ лечения или замедления развития рака у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества антагониста аксиального связывания PD-1 в комбинации с оксалиплатином, лейковорином и 5-FU с или без введения VEGF антагониста. Например, антагонист аксиального связывания PD-1 включает антагонист связывания PD-1, антагонист связывания PD-L1 и антагонист связывания PD-L2.

В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-L1 представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-1 с его партнерами по связыванию. В определенном аспекте партнеры-лиганды PD-1 по связыванию представляют собой PD-L1 и/или PD-L2. В другом варианте осуществления антагонист связывания PD-L1 представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L1 с его партнерами по связыванию. В определенном аспекте партнеры PD-L1 по связыванию представляют собой PD-1 и/или В7-1. В другом варианте осуществления антагонист связывания PD-L2 представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L2 с его партнерами по связыванию. В определенном аспекте партнер PD-L2 по связыванию представляет собой PD-1. Антагонист может представлять собой антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноадгезин, слитый белок или олигопептид.

В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-1 выбран из группы, состоящей из MDX-1106, Merck 3475 и СТ-011. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-1 выбран из группы, состоящей из YW243.55.S70 и MDX-1105. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-L2 представляет собой АМР-224. MDX-1105, также известный как BMS-936559, представляет собой анти-PD-L1 антитело, описанное в WO 2007/005874. Антитело YW243.55.S70 (SEQ ID No. 20) представляет собой анти-PD-L1 антитело, описанное в WO 2010/077634 A1. MDX-1106, также известное как MDX-1106-04, ONO-4538 или BMS-936558, представляет собой анти-PD-1 антитело, описанное в WO 2006/121168. Merck 3745, также известное как МК-3475 или SCH-900475, представляет собой анти-PD-1 антитело, описанное в WO 2009/114335. СТ-011, также известное как hBAT или hBAT-1, представляет собой анти-PD-1 антитело, описанное в WO 2009/101611. АМР-224, также известный как B7-DCIg, представляет собой PD-L2-Fc слитый растворимый рецептор, описанный в WO 2010/027827 и WO 2011/066342.

Примеры анти-PD-L1 антител, которые могут применяться в способах по данному изобретению и способы их получения описаны в патентной РСТ заявке WO 2010/077634 А1, которая приведена здесь для ссылки.

В некоторых вариантах осуществления антагонист аксиального связывания PD-1 представляет собой анти-PD-L1 антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-PD-L1 антитело способно ингибировать связывание между PD-L1 и PD-1 и/или между PD-L1 и В7-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-PD-L1 антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-PD-L1 антитело представляет собой фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab, Fab'-SH, Fv, scFv и (Fab')₂ фрагментов. В некоторых вариантах осуществления анти-PD-L1 антитело представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-PD-L1 антитело представляет собой антитело человека.

Анти-PD-L1 антитела, которые могут применяться в рамках данного изобретения, включая композиции, содержащие антитела, как описанные в WO 2010/077634 А1, могут применяться в комбинации с оксалиплатином, лейковорином, 5-FU с или без VEGF антагониста для лечения рака.

В одном варианте осуществления анти-PD-L1 антитело содержит полипептид вариабельного участка тяжелой цепи, включающий HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3 последовательность, при этом:

(a) HVR-H1 последовательность представляет собой GFTFSX₁SWIH (SEQ ID NO: 1);

(b) HVR-H2 последовательность представляет собой AWLX₂PYGGSX₃YYADSVKG (SEQ ID NO: 2);

(c) HVR-H3 последовательность представляет собой RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 3);

при этом: X₁ представляет собой D или G; X₂ представляет собой S или L; X₃ представляет собой T или S.

В одном определенном аспекте X₁ представляет собой D; Х₂ представляет собой S, а Х₃ представляет собой Т. В другом аспекте полипептид дополнительно включает последовательности каркаса вариабельного участка тяжелой цепи, расположенные между HVR согласно формуле: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4). В другом аспекте каркасные последовательности получены из консенсусных каркасных последовательностей человека. В другом аспекте каркасные последовательности представляют собой консенсусный каркас VH подгруппы III. В другом аспекте, по меньшей мере, одна из каркасных последовательностей является следующей:

HC-FR1 представляет собой EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 4) HC-FR2 представляет собой WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 5)

HC-FR3 представляет собой FTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 6)

HC-FR4 представляет собой WGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 7).

В другом аспекте полипептид тяжелой цепи также объединен с вариабельным участком легкой цепи, включающим HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, при этом:

(a) HVR-L1 последовательность представляет собой RASQX₄X₅X₆TX₇X₈A (SEQ ID NO: 8);

(b) HVR-L2 последовательность представляет собой SASX₉LX₁₀S, (SEQ ID NO: 9);

(c) HVR-L3 последовательность представляет собой QQX₁₁X₁₂X₁₃X₁₄PX₁₅T (SEQ ID NO: 10);

при этом: Х₄ представляет собой D или V; Х₅ представляет собой V или I; Х₆ представляет собой S или N; Х₇ представляет собой А или F; X₈ представляет собой V или L; Х₉ представляет собой F или Т; Х₁₀ представляет собой Y или А; Х₁₁ представляет собой Y, G, F, или S; Х₁₂ представляет собой L, Y, F или W; Х₁₃ представляет собой Y, N, А, Т, G, F или I; Х₁₄ представляет собой Н, V, Р, Т или I; X₁₅ представляет собой A, W, R, Р или Т.

В другом аспекте Х₄ представляет собой D; Х₅ представляет собой V; Х₆ представляет собой S; Х₇ представляет собой A; X₈ представляет собой V; Х₉ представляет собой F; Х₁₀ представляет собой Y; Х₁₁ представляет собой Y; Х₁₂ представляет собой L; Х₁₃ представляет собой Y; Х₁₄ представляет собой Н; X₁₅ представляет собой А. В другом аспекте легкая цепь дополнительно включает последовательности каркаса вариабельного участка легкой цепи, расположенные между HVR согласно формуле: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). В другом аспект каркасные последовательности получены из последовательностей консенсусного каркаса человека. В другом аспекте каркасные последовательности представляют собой консенсусный каркас каппа I VL. В другом аспекте, по меньшей мере, одна из каркасных последовательностей является следующей:

LC-FR1 представляет собой DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 11)

LC-FR2 представляет собой WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 12)

LC-FR3 представляет собой GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 13)

LC-FR4 представляет собой FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 14).

В другом варианте осуществления предусмотрено выделенное анти-PD-L1 антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающие последовательность вариабельного участка тяжелой и легкой цепи, при этом:

(а) тяжелая цепь включает HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, при этом:

(i) HVR-H1 последовательность представляет собой GFTFSX₁SWIH; (SEQ ID NO: 1)

(ii) HVR-H2 последовательность представляет собой AWIX₂PYGGSX₃YYADSVKG (SEQ ID NO: 2)

(iii) HVR-H3 последовательность представляет собой RHWPGGFDY и (SEQ ID NO: 3)

(b) легкая цепь включает HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, при этом:

(i) HVR-L1 последовательность представляет собой RASQX₄X₅X₆TX₇X₈A (SEQ ID NO: 8)

(ii) HVR-L2 последовательность представляет собой SASX₉LX₁₀S; и (SEQ ID NO: 9)

(iii) HVR-L3 последовательность представляет собой QQX₁₁X₁₂X₁₃X₁₄PX₁₅T; (SEQ ID NO: 10)

При этом: X₁ представляет собой D или G; Х₂ представляет собой S или L; Х₃ представляет собой Т или S; X₄ представляет собой D или V; Х₅ представляет собой V или I; Х₆ представляет собой S или N; Х₇ представляет собой А или F; X₈ представляет собой V или L; Х₉ представляет собой F или Т; Х₁₀ представляет собой Y или А; Х₁₁ представляет собой Y, G, F или S; X₁₂ представляет собой L, Y, F или W; Х₁₃ представляет собой Y, N, А, Т, G, F или I; Х₁₄ представляет собой Н, V, Р, Т или I; Х₁₅ представляет собой A, W, R, Р или Т.

В определенном аспекте X₁ представляет собой D; Х₂ представляет собой S и Х₃ представляет собой Т. В другом аспекте Х₄ представляет собой D; Х₅ представляет собой V; Х₆ представляет собой S; Х₇ представляет собой A; X₈ представляет собой V; Х₉ представляет собой F; Х₁₀ представляет собой Y; Х₁₁ представляет собой Y; X₁₂ представляет собой L; Х₁₃ представляет собой Y; Х₁₄ представляет собой Н; Х₁₅ представляет собой А. В другом аспекте X₁ представляет собой D; Х₂ представляет собой S и Х₃ представляет собой Т, Х₄ представляет собой D; Х₅ представляет собой V; Х₆ представляет собой S; Х₇ представляет собой A; X₈ представляет собой V; Х₉ представляет собой F; Х₁₀ представляет собой Y; Х₁₁ представляет собой Y; X₁₂ представляет собой L; Х₁₃ представляет собой Y; Х₁₄ представляет собой Н и Х₁₅ представляет собой А.

В другом аспекте вариабельный участок тяжелой цепи включает одну или несколько каркасных последовательностей, расположенных между HVR следующим образом: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), при этом вариабельный участок легкой цепи включает одну или несколько каркасных последовательностей, расположенных между HVR следующим образом: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). В другом аспекте каркасные последовательности получены из консенсусных каркасных последовательностей человека. В другом аспекте каркасные последовательности тяжелой цепи получены из последовательности подгруппы I, II или III по Kabat. В другом аспекте каркасная последовательность тяжелой цепи представляет собой консенсусный каркас VH подгруппы III. В другом аспекте одна или несколько каркасных последовательностей тяжелой цепи являются следующими:

В другом аспекте каркасные последовательности легкой цепи получены из последовательности каппа подгруппы I, II, II или IV по Kabat. В другом аспекте каркасные последовательности легкой цепи представляют собой консенсусный каркас VL каппа I. В другом аспекте одна или несколько каркасных последовательностей легкой цепи являются следующими:

В другом определенном аспекте антитело дополнительно включает константный участок человека или мыши. В другом аспекте константный участок человека выбран из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. В другом определенном аспекте константный участок человека представляет собой IgG1. В другом аспекте константный участок мыши выбран из группы, состоящей из IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. В другом аспекте константный участок мыши представляет собой IgG2A. В другом определенном аспекте антитело обладает пониженной или минимальной эффекторной функцией. В другом определенном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом "Fc-мутации с утратой эффекторной функции" или агликозилирования. В другом варианте осуществления Fc-мутация с утратой эффекторной функции представляет собой замещение N297A или D265A/N297A в константном участке.

В другом варианте осуществления предусмотрено анти-PD-L1 антитело, включающее последовательность вариабельного участка тяжелой и легкой цепи, при этом:

(a) тяжелая цепь также включает HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3 последовательность с, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно GFTFSDSWIH (SEQ ID NO: 15), AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 16) и RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 3), соответственно, или

(b) легкая цепь также включает HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3 последовательность с, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 17), SASFLYS (SEQ ID NO: 18) и QQYLYHPAT (SEQ ID NO: 19), соответственно.

В определенном аспекте идентичность последовательности составляет 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. В другом аспекте вариабельный участок тяжелой цепи включает одну или несколько каркасных последовательностей, расположенных между HVR следующим образом: (HC-FR1)-(HVR-Hl)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), при этом вариабельный участок легкой цепи включает одну или несколько каркасных последовательностей, расположенных между HVR следующим образом: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). В еще одном аспекте каркасные последовательности получены из консенсусных каркасных последовательностей человека. В другом аспекте каркасные последовательности тяжелой цепи получены из последовательности подгруппы I, II или III по Kabat. В другом аспекте каркасная последовательность тяжелой цепи представляет собой консенсусный каркас VH подгруппы III. В другом аспекте одна или несколько каркасных последовательностей тяжелой цепи являются следующими:

В другом аспекте каркасные последовательности легкой цепи получены из последовательности каппа подгруппы I, II, II или IV по Kabat. В другом аспекте каркасные последовательности легкой цепи представляют собой консенсусный каркас VL каппа I. В другом аспекте одна или несколько каркасных последовательностей легкой цепи являются следующими:

В другом определенном аспекте антитело дополнительно включает константный участок человека или мыши. В другом аспекте константный участок человека выбран из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. В другом определенном аспекте константный участок человека представляет собой IgG1. В другом аспекте константный участок мыши выбран из группы, состоящей из IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. В другом одном аспекте константный участок мыши представляет собой IgG2A. В другом определенном аспекте антитело обладает пониженной или минимальной эффекторной функцией. В другом определенном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом "Fc-мутации с утратой эффекторной функции" или агликозилирования. В другом варианте осуществления Fc-мутация с утратой эффекторной функции представляет собой замещение N297A или D265A/N297A в константном участке.

В другом варианте осуществления предусмотрено выделенное анти-PD-L1 антитело, включающее последовательность вариабельного участка тяжелой и легкой цепи, при этом:

(а) последовательность тяжелой цепи обладает, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно последовательности тяжелой цепи:

(b) последовательности легкой цепи обладают, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно последовательности легкой цепи:

В определенном аспекте идентичность последовательности составляет 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. В другом аспекте вариабельный участок тяжелой цепи включает одну или несколько каркасных последовательностей, расположенных между HVR следующим образом: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), при этом вариабельный участок легкой цепи включает одну или несколько каркасных последовательностей, расположенных между HVR следующим образом: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). В еще одном аспекте каркасные последовательности получены из консенсусных каркасных последовательностей человека. В другом аспекте каркасные последовательности тяжелой цепи получены из последовательности подгруппы I, II или III по Kabat. В другом аспекте каркасная последовательность тяжелой цепи представляет собой консенсусный каркас VH подгруппы III. В другом аспекте одна или несколько каркасных последовательностей тяжелой цепи являются следующими:

В другом аспекте каркасные последовательности легкой цепи получены из последовательности каппа подгруппы I, II, II или IV по Kabat. В другом аспекте каркасные последовательности легкой цепи представляют собой консенсусный каркас VL каппа I. В другом аспекте одна или несколько каркасных последовательностей легкой цепи являются следующими:

В другом определенном аспекте антитело дополнительно включает константный участок человека или мыши. В другом аспекте константный участок человека выбран из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. В другом определенном аспекте константный участок человека представляет собой IgG1. В другом аспекте константный участок мыши выбран из группы, состоящей из IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. В другом аспекте константный участок мыши представляет собой IgG2A. В другом определенном аспекте антитело обладает пониженной или минимальной эффекторной функцией. В другом определенном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом продуцирования в прокариотических клетках. В другом определенном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом "Fc-мутации с утратой эффекторной функции" или агликозилирования. В другом варианте осуществления Fc-мутация с утратой эффекторной функции представляет собой замещение N297A или D265A/N297A в константном участке.

В другом варианте осуществления изобретение относится к композициям, включающим любое из описанных выше анти-PD-L1 антител в сочетании, по меньшей мере, с одним фармацевтически приемлемым носителем.

В другом варианте осуществления предусмотрена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая последовательность вариабельного участка легкой или тяжелой цепи анти-PD-L1 антитела, при этом:

(a) тяжелая цепь также включает HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3 последовательность с, по меньшей мере, 85% идентичностью относительно GFTFSDSWIH (SEQ ID NO: 15), AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 16) и RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 3), соответственно, и

(b) легкая цепь также включает HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3 последовательность с, по меньшей мере, 85% идентичностью относительно RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 17), SASFLYS (SEQ ID NO: 18) и QQYLYHPAT (SEQ ID NO: 19), соответственно.

В определенном аспекте идентичность последовательности составляет 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. В одном аспекте вариабельный участок тяжелой цепи включает одну или несколько каркасных последовательностей, расположенных между HVR следующим образом: (HC-FR1)-(HVR-Hl)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), при этом вариабельный участок легкой цепи включает одну или несколько каркасных последовательностей, расположенных между HVR следующим образом: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). В еще одном аспекте каркасные последовательности получены из консенсусных каркасных последовательностей человека. В другом аспекте каркасные последовательности тяжелой цепи получены из последовательности подгруппы I, II или III по Kabat. В другом аспекте каркасная последовательность тяжелой цепи представляет собой консенсусный каркас VH подгруппы III. В другом аспекте одна или несколько каркасных последовательностей тяжелой цепи являются следующими:

В другом аспекте каркасные последовательности легкой цепи получены из последовательности каппа подгруппы I, II, II или IV по Kabat. В другом аспекте каркасные последовательности легкой цепи представляют собой консенсусный каркас VL каппа I. В другом аспекте одна или несколько каркасных последовательностей легкой цепи являются следующими:

В другом определенном аспекте антитело дополнительно включает константный участок человека или мыши. В другом аспекте константный участок человека выбран из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. В другом определенном аспекте константный участок человека представляет собой IgG1. В другом аспекте константный участок мыши выбран из группы, состоящей из IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. В еще одном аспекте константный участок мыши представляет собой IgG2A. В другом определенном аспекте антитело обладает пониженной или минимальной эффекторной функцией. В другом определенном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом продуцирования в прокариотических клетках. В другом определенном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом "Fc-мутации с утратой эффекторной функции" или агликозилирования. В другом аспекте Fc-мутация с утратой эффекторной функции представляет собой замещение N297A или D265A/N297A в константном участке.

В другом аспекте нуклеиновая кислота дополнительно включает вектор, подходящий для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей любое из ранее описанных анти-PD-L1 антител. В другом определенном аспекте вектор дополнительно включен в клетку-хозяина, подходящую для экспрессии нуклеиновой кислоты. В другом определенном аспекте клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку или прокариотическую клетку. В другом определенном аспекте эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка яичника китайского хомячка (СНО).

Анти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть полечены с помощью известных из уровня техники способов, например с помощью процесса, включающего культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из ранее описанных анти-PD-L1 антител или антигенсвязывающий фрагмент, в форме, подходящей для экспрессии, в условиях, подходящих для продуцирования такого антитела или фрагмента, и извлечение антитела или фрагмента.

В другом варианте осуществления изобретение относится к композиции, включающей анти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предусмотренные здесь, и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель.

VEGF антагонисты

Изобретение относится к способам лечения рака или замедления развития рака у субъекта, включающим введение эффективного количества антагониста пути передачи сигнала PD-1 и VEGF антагониста в комбинации с оксалиплатином, лейковорином и 5-FU. Могут применяться любые известные VEGF антагонисты,

(i) VEGF антиген

VEGF антиген для применения для продуцирования антител может представлять собой, например, молекулу VEGF₁₆₅, а также другие изоформы VEGF или его фрагменты, содержащие требуемый эпитоп. Другие формы VEGF, пригодные для получения анти-VEGF антител по изобретению, будут являться очевидными специалистам в данной области.

VEGF человека получен первичным скринингом библиотеки кДНК, полученной от клеток человека, с применением кДНК VEGF коровы в качестве гибридизационного зонда. Leung et al. (1989) Science, 246: 1306. Одна идентифицированная таким образом кДНК кодирует белок из 165 аминокислот, имеющий более 95% гомологии относительно VEGF коровы; данный белок из 165 аминокислот обычно обозначается как VEGF человека (hVEGF) или VEGF₁₆₅. Митотическая активность VEGF человека была подтверждена экспрессией кДНК VEGF человека в клетках-хозяевах млекопитающих. Среды, кондиционированные клетками, трансфицированными кДНК VEGF человека, промотировали пролиферацию эндотелиальных клеток капилляров, в то время как в случае контрольных клеток не действовали. Leung et al. (1989) Science, supra.

Хотя фактор роста эндотелиальных клеток сосудов может быть выделен и очищен из природных источников для последующего терапевтического применения, относительно низкие концентрации белка в фолликулярных клетках и высокая цена как в плане усилий, так и стоимости получаемого VEGF, делает это коммерчески невыгодным. Соответственно, предпринимались дополнительные попытки клонирования и экспрессии VEGF с помощью способов рекомбинантных ДНК. (См., например, Ferrara, Laboratory Investigation 72: 615-618 (1995) и приведенные здесь ссылки).

VEGF экспрессируется в различных тканях в виде множества гомодимерных форм (121, 145, 165, 189 и 206 аминокислот на мономер) в результате альтернативного сплайсинга РНК. VEGF₁₂₁ представляет собой растворимый митоген, который не связывает гепарин; при этом более длинные формы VEGF связывают гепарин с прогрессивно увеличивающейся аффинностью. Гепаринсвязывающие формы VEGF могут быть расщеплены на карбоксиконце плазмином с высвобождением способных(ой) к диффузии форм(ы) VEGF. Секвенирование аминокислот карбоки-терминального пептида показало, что этот пептид образуется после расщепления плазмином в сайте Arg₁₀₀-Ala₁₁₁. Амино-терминальный "белок сердцевины" VEGF (1-110), выделенный в виде гомодимера, связывает нейтрализующие моноклональные антитела (такие как антитела, обозначенные 4.6.1 и 3.2Е3.1.1) и растворимые формы VEGF рецепторов с аффинностью, аналогичной аффинности связывания с интактным VEGF₁₆₅ гомодимером.

Также были идентифицированы некоторые молекулы, структурно связанные с VEGF, включая плацентарный фактор роста (PIGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D и VEGF-E. Ferrara and Davis-Smyth (1987) Endocr. Rev., выше; Ogawa et al. J. Biological Chem. 273: 31273-31281 (1998); Meyer et al. EMBO J., 18: 363-374 (1999). Рецепторная тирозинкиназа, Flt-4 (VEGFR-3) была идентифицирована в качестве рецептора VEGF-C и VEGF-D. Joukov et al. EMBO. J. 15: 1751 (1996); Lee et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1988-1992 (1996); Achen et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 548-553. Было показано, что VEGF-C участвует в регуляции лимфатического ангиогенеза. Jeltsch et al. Science 276: 1423-1425 (1997).

Были идентифицированы два VEGF рецептора, Flt-1 (также называемый VEGFR-1) и KDR (также называемый VEGFR-2). Shibuya et al. (1990) Oncogene 8: 519-527; de Vries et al. (1992) Science 255: 989-991; Terman et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 1579-1586. Было показано, что нейропилин-1 представляет собой селективный VEGF рецептор, способный связывать гепаринсвязывающие изоформы VEGF (Soker et al. (1998) Cell 92: 735-45). Flt-I и KDR принадлежат к семейству рецепторных тирозинкиназ (RTK). RTK составляют большое семейство трансмембранных рецепторов с различной биологической активностью. В настоящее время идентифицировано, по меньшей мере, девятнадцать (19) отдельных подсемейств RTK. Семейство рецепторных тирозинкиназ (RTK) включает рецепторы, которые являются ключевыми для роста и дифференциации различных типов клеток (Yarden and Ullrich (1988) Ann. Rev. Biochem. 57: 433-478; Ullrich and Schlessinger (1990) Cell 61: 243-254). Присущая RTK функция активируется при связывании лиганда, что ведет к фосфорилированию рецептора и множества клеточных субстратов и в последующем к разнообразным клеточным ответам (Ullrich & Schlessinger (1990) Cell 61: 203-212). Таким образом, передача сигнала, опосредованная рецепторной тирозинкиназой, инициируется путем внеклеточного взаимодействия со специфическим фактором роста (лигандом), за которым обычно следует димеризация рецептора, стимуляция присущей белковой тирозинкиназе активности и трансфосфорилирование рецептора. В результате этого создаются сайты связывания для внутриклеточных молекул, передающих сигнал, ведущие к образованию комплексов со спектром цитоплазматических сигнальных молекул, что способствует подходящему клеточному ответу (например, делению клеток, дифференциации, метаболическим эффектам, изменениям внеклеточной микросреды) - см. Schlessinger and Ullrich (1992) Neuron 9: 1-20. Структурно Flt-1 и KDR имеют семь иммуноглобулинподобных доменов во внеклеточном домене, один трансмембранный участок и консенсусную тирозинкиназную последовательность, которая прервана вставочным киназным доменом. Matthews et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9026-9030; Terman et al. (1991) Oncogene 6: 1677-1683.

(ii) Анти-VEGF антитела

Анти-VEGF антитела, которые могут применяться в способах по изобретению, включают любое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с VEGF с достаточной степенью аффинности и специфичности и могут снижать или ингибировать биологическую активность VEGF. Анти-VEGF антитело обычно не связывается с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, и с другими факторами роста, такими как P1GF, PDGF или bFGF.

В определенных вариантах осуществления изобретения анти-VEGF антитела включают, без ограничения, моноклональное антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное анти-VEGF антитело А4.6.1, продуцируемое гибридомой АТСС НВ 10709; рекомбинантное гуманизированное моноклональное анти-VEGF антитело, полученное, как описано у Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599. В одном варианте осуществления анти-VEGF антитело представляет собой "Бевацизумаб (BV)", также известный как "rhuMAb VEGF" или "AVASTIN®". Он включает мутантные каркасные участки IgG1 человека и антигенсвязывающие определяющие комплементарность участки моноклонального анти-hVEGF антитела мыши А.4.6.1, которое блокирует связывание VEGF человека с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая большую часть каркасных участков, происходит от IgG1 человека, при этом около 7% последовательности происходит от антитела А4.6.1 мыши.

Бевацизумаб и другие гуманизированные анти-VEGF антитела также описаны в патенте США 6884879, выданном 26 февраля, 2005. Дополнительные антитела включают антитела серии G6 или В20 (например, G6-31, В20-4.1), как описано в РСТ публикации WO 2005/012359, РСТ публикации WO 2005/044853 и в заявке на патент США 60/991302, содержание которых полностью приведено здесь для ссылки. Описание дополнительных антител см. в патентах США 7060269, 6582959, 6703020; 6054297; в WO 98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; ЕР 0666868 В1; в публикациях заявок на патент США 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409 и 20050112126; и у Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004). Другие антитела включают антитела, которые связываются с функциональным эпитопом на VEGF человека, содержащем остатки F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191, K101, Е103 и С104 или, альтернативно, содержащем остатки F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 и Q89.

В одном варианте осуществления изобретения анти-VEGF антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи, включающий следующую аминокислотную последовательность:

и вариабельный участок легкой цепи, включающий следующую аминокислотную последовательность:

В некоторых вариантах осуществления анти-VEGF антитело включает CDRH1, включающий следующую аминокислотную последовательность: GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 24), CDRH2, включающий следующую аминокислотную последовательность: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 25), CDRH3, включающий следующую аминокислотную последовательность: YPHYYGSSHWYFDV (SEQ ID NO: 26), CDRL1, включающий следующую аминокислотную последовательность: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 27), CDRL2, включающий следующую аминокислотную последовательность: FTSSLHS (SEQ ID NO: 28) и CDRL3, включающий аминокислотную последовательность: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 29).

"Антитело серии G6" в соответствии с данным изобретением представляет собой анти-VEGF антитело, которое получено из последовательности G6 антитела или полученного из G6 антитела в соответствии с любой из Фиг. 7, 24-26 и 34-35 из РСТ публикации WO 2005/012359, полное описание которое приведено здесь для ссылки. См. также РСТ публикацию WO 2005/044853, полное описание которой приведено здесь для ссылки. В одном варианте осуществления антитело серии G6 связывается с функциональным эпитопом на VEGF человека, включающем остатки F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 и Q89.

"Антитело серии В20" в соответствии с данным изобретением представляет собой анти-VEGF антитело, которое было получено из последовательности антитела В20 или из последовательности происходящего от В20 антитела, согласно любой из Фиг. 27-29 РСТ публикации WO 2005/012359, полное описание которой приведено здесь для ссылки. См. также РСТ публикацию WO 2005/044853 и заявку на патент США 60/991302, полное описание которых приведено здесь для ссылки. В одном из вариантов осуществления антитело серии В20 связывается с функциональным эпитопом на VEGF человека, содержащем F17, М18, D19, Y21, Y25, Q89, 191, K101, Е103 и С104 остатки.

"Функциональный эпитоп" в соответствии с данным изобретением означает аминокислотные остатки антигена, которые вносят энергетический вклад в связывание с антителом. Мутация в любом одном из вносящих энергетический вклад остатков антигена (например, аланиновая мутация или гомологичная мутация VEGF дикого типа) будет препятствовать связыванию антитела, так что отношение относительных аффинностей (IC50 мутантного VEGF/IC50 VEGF дикого типа) антитела будет составлять более 5 (см. Пример 2 WO 2005/012359). В одном варианте осуществления отношение относительных аффинностей определяют с помощью анализа ELISA на связывание в растворе, проводимого методом фагового дисплея. Вкратце, 96-луночные планшеты Maxisorp (NUNC) сенсибилизируют в течение ночи при 4°С Fab-формой тестируемого антитела при концентрации 2 мкг/мл в PBS и блокируют PBS, 0,5% BSA и 0,05% твином 20 (РВТ) в течение 2 часов при комнатной температуре. Серийные разведения аланиновых точковых мутантов hVEGF, представленных на фаге (форма с остатками 8-109), или hVEGF дикого типа (8-109), в РВТ сначала инкубируют на Fab-сенсибилизированных планшетах в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем планшеты промывают PBS, 0,05% твином 20 (PBST). Связанный фаг детектируют с применением моноклонального анти-М13 антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (Amersham Pharmacia) и разведенного 1:5000 в РВТ, а затем проявляют с применением субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD) в течение приблизительно 5 минут, после чего реакцию гасят 1,0М H3PO4 и регистрируют спектры на спектрофотометре при 450 нм. Соотношение IC50 значений (IC50,ala/IC50, дикий тип) отражает кратность снижения аффинности связывания (относительной аффинности связывания).

(iii) Молекулы VEGF рецептора

Наиболее охарактеризованные VEGF рецепторы представляют собой VEGFR1 (также известный как Fit-1) и VEGFR2 (также известный как KDR и FLK-1 для гомолога мыши). Специфичность каждого рецептора для каждого члена семейства VEGF варьируется, однако VEGF-А связывается как с Fit-1, так и с KDR. Полноразмерный Flt-1 рецептор включает внеклеточный домен, который имеет семь Ig доменов, трансмембранный домен и внутриклеточный домен с тирозинкиназной активностью. Внеклеточный домен участвует в связывании с VEGF, а внутриклеточный домен участвует в передаче сигнала.

Молекулы VEGF рецептора или их фрагменты, которые специфически связываются с VEGF, могут применяться в способах по изобретению для связывания и секвенирования VEGF белка, тем самым предотвращая передачу его сигнала. В определенных вариантах осуществления молекула VEGF рецептора или ее VEGF-связывающий фрагмент присутствуют в растворимой форме, такой как sFlt-1. Растворимая форма рецептора оказывает ингибирующее действие на биологическую активность VEGF белка вследствие связывания с VEGF, что приводит к предотвращению его связывания с природными рецепторами, присутствующими на поверхности клеток-мишеней. В настоящем изобретении также рассматриваются слитые белки VEGF рецептора, примеры которых описаны ниже.

Химерный белок VEGF рецептора представляет собой молекулу рецептора, имеющую аминокислотные последовательности, происходящие, по меньшей мере, от двух различных белков, по меньшей мере одним из которых является белок VEGF рецептора (например, flt-1 или KDR рецептора), способный связываться с VEGF и ингибировать биологическую активность VEGF. В определенных вариантах осуществления химерные белки VEGF рецептора по изобретению состоят из аминокислотных последовательностей, происходящих только от двух различных молекул VEGF рецептора; однако аминокислотные последовательности, включающие один, два, три, четыре, пять, шесть или все семь Ig-подобных доменов, происходящих от внеклеточного лиганд-связывающего участка flt-1 и/или KDR рецептора, могут связываться с аминокислотными последовательностями, происходящими от других неродственных белков, например последовательностей иммуноглобулина. Другие аминокислотные последовательности, с которыми могут быть объединены Ig-подобные домены, хорошо известны среднему специалисту в данной области. Примеры химерных белков VEGF рецептора включают, например, растворимый Flt-1/Fc, KDR/Fc или FLt-1/KDR/Fc (также известный как VEGF Trap). (См., например, публикацию РСТ заявки WO 97/44453).

Растворимый белок VEGF рецептора или химерные белки VEGF рецептора по изобретению включают белки VEGF рецептора, которые не связаны поверхностью клеток посредством трансмембранного домена. Такие растворимые формы VEGF рецептора, включая химерные белки рецепторов, способны связывать и инактивировать VEGF, а также не включают трансмембранный домен, и поэтому в целом не ассоциируются с клеточными мембранами клеток, в которых экспрессируется данная молекула.

IV. Наборы

В другом аспекте предусмотрен набор, включающий антагонист аксиального связывания PD-L1 и/или VEGF антагонист для лечения или замедления развития рака у субъекта или стимулирования иммунной функции у субъекта, имеющего рак. В некоторых вариантах осуществления набор включает антагонист аксиального связывания PD-1 и вкладыш, включающий инструкции по применению антагониста аксиального связывания PD-1 в комбинации с оксалиплатином, лейковорином и 5-FU с/без VEGF антагониста для лечения или замедления развития рака у субъекта или стимулирования иммунной функции у субъекта, имеющего рак. В некоторых вариантах осуществления набор включает оксалиплатин, лейковорин, 5-FU с или без VEGF антагониста и вкладыш, включающий инструкции по применению оксалиплатина, лейковорина, 5-FU с или без VEGF в комбинации с антагонистом аксиального связывания PD-1 для лечения или замедления развития рака у субъекта или стимулирования иммунной функции у субъекта, имеющего рак. В некоторых вариантах осуществления набор включает антагонист аксиального связывания PD-1, оксалиплатин, лейковорин и 5-FU с/без VEGF антагониста и вкладыш, включающий инструкции по применению антагониста аксиального связывания PD-1 и оксалиплатина, лейковорина и 5-FU с/без VEGF антагониста для лечения или замедления развития рака у субъекта или стимулирования иммунной функции у субъекта, имеющего рак. В наборы могут быть включены любые из описанных здесь антагонистов аксиального связывания PD-1 и/или VEGF антагонистов.

ПРИМЕРЫ

Изобретение может быть лучше описано со ссылкой на следующие примеры, которые приведены для иллюстрирования и не должны рассматриваться в качестве ограничивающих.

Пример 1: FOLFOX с или без анти-VEGF антитела стимулировало противоопухолевую активность анти-PD-L1

Для определения способности FOLFOX (оксалиплатин, лейковорин и 5-фторурацил) с или без анти-VEGF антитела стимулировать противоопухолевую активность анти-PD-L1 мышей-моделей колоректального рака подвергали лечению комбинированными лекарственными средствами. Кратко, самкам C57BL/6 мышей подкожно прививали в односторонний торакальный участок 100,000 МС38 колоректальных клеток мыши в 100 мкл сбалансированного раствора Хэнкса:matrigel. При достижении у мышей среднего объема опухоли 220 мм³ их произвольно включали в одну из подвергаемых лечению групп, указанных ниже, на 0 дне эксперимента. Лечение начинали в 1 день эксперимента. Мышей взвешивали, при этом опухоли измеряли 2-3 раза в неделю в течение периода исследования.

Экспериментальные группы:

1) Контроль (изотипное контрольное антитело (анти-gp120 антитело)), 10 мг/кг ip, 100 мкл, вводили три раза в неделю в течение трех недель, n=10

2) анти-PD-L1 антитело, 10 мг/кг ip, 100 мкл, вводили три раза в неделю в течение трех недель, n=10

3) FOLFOX (см. ниже), вводили один раз в неделю в течение двух недель, n=10

4) FOLFOX (см. ниже), вводили один раз в неделю в течение двух недель + анти-PD-L1 антитело, 10 мг/кг ip, 100 мкл, вводили три раза в неделю в течение трех недель, n=10

5) FOLFOX (см. ниже), вводили один раз в неделю в течение двух недель + анти-VEGF антитело, 5 мг/кг ip, 100 мкл, вводили два раза в неделю в течение трех недель, n=10

6) FOLFOX (см. ниже), вводили один раз в неделю в течение двух недель + анти-VEGF антитело, 5 мг/кг ip, 100 мкл, вводили два раза в неделю в течение трех недель + анти-PD-L1 антитело, 10 мг/кг ip, 100 мкл, вводили три раза в неделю в течение трех недель, n=10

ip = внутрибрюшинно

SC = подкожно

В рамках данных исследований дозу FOLFOX выбирали следующим образом: в 1 день эксперимента и 8 день эксперимента мышам вводили оксалиплатин, 5 мг/кг ip в 50 мкл воды и далее немедленно лейковорин, 100 мг/кг ip в 250 мкл воды (вводили в момент времени = 0 час) и 5-FU, 25 мг/кг ip и далее немедленно 5-FU, 25 мг/кг sc (вводили в момент времени = 2 часа). Анти-PD-L1 антитело и анти-gp120 антитело вводили в 1, 3, 5, 8, 10, 12, 15, 17, и 19 день эксперимента (вводили в момент времени = 4 часа). Анти-VEGF антитело вводили в 1, 4, 8, 11, 15, 18 день эксперимента (вводили в момент времени = 6 часов).

Мышей наблюдали на предмет роста опухолей и изменения массы тела. Объемы опухолей измеряли с помощью циркулей UltraCal-IV (Model 54-10-111; Fred V. Fowler Company; Newton, MA). Для подсчета объема опухолей применяли следующую формулу:

Измерения длины и ширины проводили перпендикулярно относительно друг друга. Массу тела животных изменяли с помощью весов Adventura Pro AV812 (Ohaus Corporation; Pine Brook, NJ). Изменение массы тела в процентах подсчитывали с применением следующей формулы:

Данные анализировали с помощью R, версия 2.9.2 (R Development Core Team 2008; R Foundation for Statistical Computing; Vienna, Austria), при этом смешанные модели подвергали нормализации в рамках R с применением пакета nlme, версия 3.1-96 (Pinheiro et al. 2009). Построение кривой осуществляли с помощью Prism, версия 5.0b для Mac (GraphPad Software, Inc.; La Jolla, CA).

Подход на основе смешанных моделей применяли для анализа повторяющихся значений объема опухолей у одних и тех же животных с течением времени (Pinheiro and Bates 2000). Данный подход включает повторные измерения и умеренное количество выпадений из исследования до его окончания по причинам, статистически классифицируемым как случайно отсутствующие данные (MAR). Изменения с фиксированным эффектом по log₂(объем) по времени и доза моделируются в виде суммы основных эффектов и взаимодействия натурального пространственного регрессионного базиса во времени с ауто-определенным натуральным сплайновым базисом в дозе. Было принято, что точки пересечения и скорость роста (углы наклона кривой) среди животных варьируются случайным образом. Ингибирование роста опухолей в виде доли подвергаемой действию контроля группы (%TGI) подсчитывали в виде доли области под сопряженными кривыми (AUC) для соответствующей подвергаемой лечению группы каждый день по сравнению с контролем, в то время как подвергаемые лечению контролем мыши все еще подвергались исследованию, с применением следующей формулы:

В рамках данных исследований Полный Ответ (CR) определяли в виде отдельного животного, размер опухоли которого был ниже Предела Детектирования (LOD) в любой момент времени в рамках периода исследования. Частичный Ответ (PR) определяли как отдельное животное, объем опухоли которого снижался на 50% относительно первоначального объема его опухоли в любой момент времени в рамках периода исследования. Общую Степень Ответа (ORR) определяли как сумму полного и частичного ответов. Время До 5Х Прогрессии (ТТР5Х) определяли как время в днях, затрачиваемое на 5-кратное превышение начального объема величинами объема опухолей в группе (на основе описанного выше анализа на основе смешанного моделирования), округленное до ближайшей половины дня и указанное в виде ТТР5Х значения для данной группы. Также применяли линейный анализ на основе смешанных эффектов для анализа изменений повторяющихся значений массы тела у одних и тех же животных с течением времени.

Блокада PD-1 оси с применением анти-PD-L1 антитела была эффективной в виде терапии с применением одного агента при предотвращении роста опухолей. Комбинированное лечение анти-PD-L1 антителами с оксалиплатином, лейковорином и 5-FU (FOLFOX) значительно ингибировало рост опухолей, что свидетельствует, что данная химиотерапевтическая комбинация стимулирует противоопухолевую активность анти-PD-L1 антител (Фиг. 1). Добавление анти-VEGF в данное комбинированное лечение дополнительно стимулировало данную противоопухолевую активность, также стабильность противоопухолевого ответа даже после прекращения лечения (Фиг. 4).

Пример 2: Фаза 1b исследования MPDL3280A с бевацизумабом с или без модифицированного FOLFOX-6

Основной целью исследования является анализ безопасности, фармакологической и предварительной эффективности MPDL3280A, вводимого с бевацизумабом (группа А) и с бевацизумабом плюс FOLFOX (в частности, модифицированным FOLFOX-6 или mFOLFOX-6; группа В) у пациентов с солидными опухолями, включая метастазирующий колоректальный рак (mCRC). В рамках группы А анализируют MPDL3280A при дозировке 10 мг/кг (или при выбранном уровне дозы, не превышающем MTD или MAD с одним агентом) с бевацизумабом (15 мг/кг) каждые 3 недели (q3w) в течение до одного года. Пациенты, которые не получали оксалиплатин для лечения метастазирующего заболевания, включены в группу В и получают MPDL3280A с бевацизумабом и FOLFOX каждые 2 недели (q2w). Курс приема mFOLFOX-6 состоит из: оксалиплатина (85 мг/м²), вводимого внутривенно (в/в) одновременно с лейковорином (400 мг/м²), вводимым в/в в течение около 120 минут и далее 5-FU (400 мг/м²), вводимого в виде в/в болюса и далее 2400 мг/м² с помощью непрерывной в/в инфузии в течение около 46 часов. Оксалиплатин вводят в рамках до восьми циклов. Лечение может продолжаться в течение до одного года.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для лечения или замедления развития рака у субъекта. Для этого субъекту вводят эффективное количество анти-PD-L1 антитела, VEGF антагониста, оксалиплатина, лейковорина и 5-FU, где анти-PD-L1 антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, при этом (a) вариабельный участок тяжелой цепи включает HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где (i) HVR-H1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15; (ii) HVR-H2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16; (iii) HVR-H3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3; (b) вариабельный участок легкой цепи включает HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, где (iv) HVR-L1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (v) HVR-L2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; (vi) HVR-L3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. Также предложен набор для лечения или замедления развития рака у субъекта. Группа изобретений обеспечивает увеличение опухолевой иммуногенность для лечения рака. 3 н. и 20 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 пр.

1. Способ лечения или замедления развития рака у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества анти-PD-L1 антитела, VEGF антагониста, оксалиплатина, лейковорина и 5-FU, где анти-PD-L1 антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, при этом:

(a) вариабельный участок тяжелой цепи включает HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где

(i) HVR-H1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15,

(ii) HVR-H2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16,

(iii) HVR-H3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3;

(b) вариабельный участок легкой цепи включает HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, где

(iv) HVR-L1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17,

(v) HVR-L2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18,

(vi) HVR-L3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19.

2. Способ по п. 1, где анти-PD-L1 антитело представляет собой моноклональное антитело.

3. Способ по п. 1 или 2, где анти-PD-L1 антитело представляет собой фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab, Fab'-SH, Fv, scFv и (Fab')₂ фрагментов.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где анти-PD-L1 антитело представляет собой гуманизированное антитело.

5. Способ по любому из пп. 1-3, где анти-PD-L1 антитело представляет собой антитело человека.

6. Способ по п. 1, где анти-PD-L1 антитело представляет собой YW243.55.S70.

7. Способ по п. 1, где анти-PD-L1 антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, при этом:

(a) аминокислотная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи обладает по меньшей мере 90% идентичностью относительно аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и

(b) аминокислотная последовательность вариабельного участка легкой цепи обладает по меньшей мере 90% идентичностью относительно аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO: 21.

8. Способ по п. 1, где анти-PD-L1 антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, при этом:

(a) аминокислотная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи обладает по меньшей мере 95% идентичностью относительно аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и

(b) аминокислотная последовательность вариабельного участка легкой цепи обладает по меньшей мере 95% идентичностью относительно аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO: 21.

9. Способ по п. 1, где анти-PD-L1 антитело, включает вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, при этом:

(a) аминокислотная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи обладает по меньшей мере 99% идентичностью относительно аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и

(b) аминокислотная последовательность вариабельного участка легкой цепи обладает по меньшей мере 99% идентичностью относительно аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO: 21.

10. Способ по п. 1, где анти-PD-L1 антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, при этом:

(a) аминокислотная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи обладает по меньшей мере 99% идентичностью относительно аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и

(b) вариабельный участок легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где анти-PD-L1 антитело дополнительно включает константный участок IgG1 человека.

12. Способ по п. 11, где анти-PD-L1 антитело включает Fc-мутацию с утратой эффекторной функции, где Fc-мутация с утратой эффекторной функции представляет собой N297A.

13. Способ по любому из пп. 1-12, где VEGF антагонист представляет собой анти-VEGF антитело.

14. Способ по п. 13, где указанное анти-VEGF антитело связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное анти-VEGF антитело А4.6.1, продуцируемое гибридомой АТСС НВ 10709.

15. Способ по п. 13, где анти-VEGF антитело представляет собой гуманизированное антитело.

16. Способ по п. 13, где анти-VEGF антитело представляет собой бевацизумаб.

17. Способ по п. 13, где анти-VEGF антитело имеет вариабельный участок тяжелой цепи, включающий следующую аминокислотную последовательность:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 22);

и вариабельный участок легкой цепи, включающий следующую аминокислотную последовательность:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 23).

18. Способ по любому из пп. 1-17, где лечение приводит к устойчивому ответу у субъекта после прекращения лечения.

19. Способ по любому из пп. 1-18, где субъект имеет рак, выбранный из группы, состоящей из рака легкого, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака ободочной кишки и колоректального рака.

20. Способ по любому из пп. 1-19, где субъект имеет колоректальный рак.

21. Набор для лечения или замедления развития рака у субъекта, включающий анти-PD-L1 антитело и вкладыш, включающий инструкции по применению анти-PD-L1 антитела в комбинации с VEGF антагонистом, оксалиплатином, лейковорином и 5-FU, где анти-PD-L1 антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, при этом:

(a) вариабельный участок тяжелой цепи включает HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где

(i) HVR-H1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15,

(ii) HVR-H2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16,

(iii) HVR-H3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;

(b) вариабельный участок легкой цепи включает HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, где

(iv) HVR-L1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17,

(v) HVR-L2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18,

(vi) HVR-L3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19.

22. Набор по п. 21 дополнительно включающий VEGF антагонист, оксалиплатин, лейковорин и 5-FU.

23. Набор для лечения или замедления развития рака у субъекта, включающий VEGF антагонист и вкладыш, включающий инструкции по применению VEGF антагониста в комбинации с анти-PD-L1 антителом, оксалиплатином, лейковорином и 5-FU, где анти-PD-L1 антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, при этом:

(a) вариабельный участок тяжелой цепи включает HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где

(i) HVR-H1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15,

(ii) HVR-H2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16,

(iii) HVR-H3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;

(b) вариабельный участок легкой цепи включает HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, где

(iv) HVR-L1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17,

(v) HVR-L2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18,

(vi) HVR-L3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19.