СКАНИРУЮЩИЙ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ МИКРОЖИДКОСТНЫЙ ТЕРМОЦИКЛЕР И СПОСОБЫ СИНХРОНИЗИРОВАННЫХ ТЕРМОЦИКЛИРОВАНИЯ И СКАНИРУЮЩЕГО ОПТИЧЕСКОГО ОБНАРУЖЕНИЯ Российский патент 2019 года по МПК G01N35/00 G01N33/53 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[0001] В соответствии с разделом 119(e) 35-го Кодекса законов США настоящая заявка испрашивает преимущество приоритета относительно находящейся одновременно на рассмотрении Предварительной заявки на патент США №61/476175 с датой подачи 15 апреля 2011 г., названной «Управляемая программным обеспечением последовательность операций по синхронизации термоциклирования и сканирующего оптического обнаружения» и находящейся одновременно на рассмотрении Предварительной заявки на патент США №61/476167 с датой подачи 15 апреля 2011 г., названной «Сканирующий в режиме реального времени 6-цветный микрожидкостный термоциклер», которые во всей своей полноте включены в настоящую заявку посредством ссылки.

Область техники

[0002] Раскрытые здесь устройства и способы в целом относятся к автоматизированному выполнению амплификации нуклеиновой кислоты, например, посредством полимеразной цепной реакции (PCR), и в некоторых случаях посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, проводимой в множестве микрожидкостных реакционных камер в микрожидкостном картридже. Устройство может затем обнаруживать целевые нуклеиновые кислоты, например целевые ампликоны в каждой из реакционных камер.

Уровень техники

[0003] Производство медицинского диагностического оборудования представляет собой критический элемент современной инфраструктуры здравоохранения. Однако в настоящее время проводимые in vitro (в искусственных условиях) диагностические анализы, независимо от того, насколько они стандартны, стали проблемным местом при контроле за пациентом. Этому есть множество причин. Во-первых, многие диагностические анализы могут быть выполнены только на узкоспециализированном оборудовании, которое и дорого и управляемо только обученным медицинским персоналом. Такое оборудование может быть размещено лишь в немногих местах - часто только в одном месте в пределах той или иной городской территории. Это требует от больниц отсылки образцов для анализа в эти места, что приводит к транспортным расходам и задержкам и, возможно, даже к утере образцов или к неправильному обращению с ними. Во-вторых, рассматриваемое оборудование обычно не доступно «по требованию», а вместо этого работает в пакетном режиме, увеличивая, таким образом, продолжительность обработки для многих образцов, поскольку они должны ожидать, пока устройство не соберет нужное количество образцов прежде, чем они могут быть обработаны.

[0004] Учитывая, что проводимые на биологических образцах диагностические анализы могут быть разделены на множество ключевых этапов, часто желательно автоматизировать один или множество этапов. Например, биологические образцы, такие, как полученные от пациента, могут быть использованы в пробах для амплификации нуклеиновой кислоты, чтобы амплифицировать представляющую интерес целевую нуклеиновую кислоту (например, ДНК, РНК и т.п.). После амплификации может быть обнаружено наличие целевой нуклеиновой кислоты или продукта амплификации в реакторе целевой нуклеиновой кислоты (например, целевого ампликона), причем наличие целевой нуклеиновой кислоты и/или целевого ампликона использовано для идентификации и/или количественного определения целевого объекта (например, целевого микроорганизма и т.п.). Часто проведение анализа с амплификацией нуклеиновой кислоты содержит множество этапов, включая экстрагирование нуклеиновой кислоты, амплификацию нуклеиновой кислоты и ее обнаружение. Желательно автоматизировать определенные этапы из этих последовательностей операций.

[0005] Существует потребность в разработке способа и устройства для параллельного выполнения молекулярных диагностических анализов на множестве образцов с амплификацией или без амплификации целевых нуклеиновых кислот и обнаружения на подготовленных биологических образцах. Устройство может быть выполнено с возможностью высокой производительности и работы в коммерческой справочной лаборатории или у постели больного, избавляя, таким образом, от необходимости отсылки образца в специализированное учреждение.

Раскрытие изобретения

[0006] Раскрытые здесь варианты реализации настоящего изобретения относятся к способам и устройствам для одновременного испытания множества образцов. В некоторых вариантах реализации предложено устройство для амплификации и обнаружения нуклеиновой кислоты в режиме реального времени. Устройство может содержать головку обнаружителя, содержащую множество пар источников света и фотоприемников. Головка обнаружителя может быть установлена на направляющей, причем пары фотоприемников с источниками выровнены в виде первого ряда и второго ряда. Устройство может содержать гнездо для микрожидкостного картриджа, содержащего множество независимых реакционных камер, ориентированных в соседних столбцах первого ряда и второго ряда. Устройство может также содержать апертурную пластину, выполненную с возможностью размещения над микрожидкостным картриджем при наличии картриджа в гнезде. Апертурная пластина может содержать множество апертурных отверстий, каждое из которых размещено над каждой камерой из множества реакционных камер при удержании микрожидкостного картриджа в гнезде. Головка обнаружителя может быть размещена над апертурной пластиной с возможностью перемещения вдоль направляющей, так что каждая пара из множества пар фотоприемников с источниками света в первом ряду может быть размещена над каждым апертурным отверстием в первом ряду апертурной пластины и каждая пара из множества пар фотоприемников с источниками света во втором ряду может быть размещена над каждым апертурным отверстием во втором ряду апертурной пластины.

[0007] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения устройство также содержит вторую головку обнаружителя, содержащую множество пар фотоприемников с источниками света, выровненных в виде первого ряда и второго ряда. Вторая головка обнаружителя может быть размещена на направляющей. Устройство может также содержать второе гнездо для микрожидкостного картриджа, содержащего множество независимых реакционных камер, ориентированных в соседних столбцах первого ряда и второго ряда. Устройство может также содержать вторую апертурную пластину, выполненную с возможностью размещения с выравниванием над вторым микрожидкостным картриджем при наличии второго картриджа во втором гнезде, которая может содержать множество апертурных отверстий, каждое из которых размещено над каждой камерой из множества реакционных камер второго микрожидкостного картриджа при удержании второго микрожидкостного картриджа во втором гнезде. Вторая головка обнаружителя может быть размещена над апертурной пластиной с возможностью перемещения вдоль направляющей, так что каждая пара из множества пар фотоприемников с источниками света в первом ряду второй головки обнаружителя может быть размещена над каждым апертурным отверстием в первом ряду второй апертурной пластины и каждая пара из множества пар фотоприемников с источниками света во втором ряду второй головки обнаружителя может быть размещена над каждым апертурным отверстием во втором ряду второй апертурной пластины.

[0008] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения пары фотоприемников с источниками света могут содержать по меньшей мере шесть различных пар фотоприемников с источниками света, работающих на шести различных длинах волн. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения шесть различных длин волны получены посредством источника света, излучающего свет зеленого цвета, источника света, излучающего свет желтого цвета, источника света, излучающего свет оранжевого цвета, источника света, излучающего свет красного цвета и источника света, излучающего свет темно-красного, малинового или кармазинного цвета. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения головка обнаружителя содержит по меньшей мере N рядов пар фотоприемников с источниками света, а обнаружитель выполнен с возможностью перемещения в по меньшей мере в М+N-1 положений по апертурной пластине, содержащей М рядов апертурных отверстий.

[0009] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения апертурная пластина содержит сталь, алюминий, никель или их комбинации. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения толщина апертурной пластины составляет приблизительно 0,25 дюйма (6,4 мм). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения по меньшей мере часть апертурной пластины электрохимически окислена, чтобы быть темнее, чем при отсутствии электрохимического окисления апертурной пластины. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения апертурная пластина прилагает по существу однородное давление к области микрожидкостного картриджа при присутствии картриджа внутри гнезда. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения апертурная пластина выполнена по меньшей мере из одного материала, выбранного из алюминия, цинка или никеля, причем апертурная пластина может дополнительно содержать красящее вещество.

[0010] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения устройство дополнительно содержит пластину нагревателя, причем пластина нагревателя размещена под микрожидкостным картриджем при наличии картриджа в гнезде. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения пластина нагревателя содержит по меньшей мере один материал, выбранный из стекла или кварца. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения апертурная пластина прилагает по существу однородное давление к области микрожидкостного картриджа при присутствии картриджа внутри гнезда. По существу однородное давление может содействовать по существу однородному тепловому контакту между микрожидкостными реакционными камерами и пластиной нагревателя. В этом качестве в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения апертурная пластина создает однородное давление, что может гарантировать, что каждая камера из множества реакционных камер или реакторов в микрожидкостном картридже имеет однородный тепловой контакт или связь с соответствующим элементом из множества нагревательных элементов, размещенных в пределах пластины нагревателя.

[0011] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения устройство дополнительно содержит фотоприемник, причем фотоприемник размещен над апертурной пластиной и микрожидкостная камера выполнена с возможностью получения света от источника света под скользящим углом относительно фотоприемника. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения пластина нагревателя выполнена в виде множества нагревательных элементов, причем каждый элемент из множества нагревательных элементов размещен таким образом, что при наличии микрожидкостного картриджа в гнезде множество нагревательных элементов имеет тепловую связь с каждой камерой из множества реакционных камер, соответственно.

[0012] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения рассмотрен способ, реализованный на одном или множестве компьютерных процессоров для оптимизации протоколов, например, протоколов полимеразной цепной реакции, для одновременного выполнения множества реакций с термоциклированием, причем каждая реакция с термоциклированием содержит один или большее количество этапов обнаружения, а реакции с термоциклированием проводят в множестве реакторов. Способ может включать определение, предоставление или осуществление доступа к данным продолжительности цикла обнаружения, прием или осуществление доступа к данным этапа протокола, связанного с продолжительностью этапа, содержащего время для обнаружения; и определение первой поправки к этому этапу таким образом, что его продолжительность составляет кратную величину от продолжительности цикла обнаружения.

[0013] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает определение второй поправки к этапу, причем время для обнаружения представляет собой кратную величину от продолжительности цикла обнаружения при корректировке этапа посредством первой поправки и второй поправки. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает определение поправки на смещение запуска, основанной на положении реакционной камеры, связанной с протоколом. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения продолжительность цикла обнаружения включает временной промежуток, необходимый для выполнения головкой обнаружителя заранее определенного множества операций обнаружения для реактора. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения продолжительность цикла обнаружения включает время, необходимое для перемещения головки обнаружителя к каждому реактору из множества реакторов и для перемещения головки обнаружителя в начальное положение. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает инициирование протокола.

[0014] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения рассмотрен не носящий временного характера и содержащий команды машиночитаемый носитель, причем команды выполнены с возможностью побуждать один или большее количество процессоров реализовывать следующий способ: определение, предоставление или осуществление доступа к данным продолжительности цикла обнаружения;

прием или осуществление доступа к данным этапа протокола, связанного с продолжительностью этапа, содержащего время для обнаружения,

определение первой поправки к этому этапу таким образом, что его продолжительность составляет кратную величину от продолжительности цикла обнаружения.

[0015] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения этап протокола связан с протоколом, выбранным из множества протоколов, каждый из которых связан по меньшей мере с одной реакцией из множества реакций с термоциклированием, например, это относится к протоколам полимеразной цепной реакции, причем каждая реакция с термоциклированием содержит один или множество этапов обнаружения, и определение первой поправки основано, по меньшей мере частично, на распределении по времени для одного или большего количество этапов обнаружения, связанных с реакциями с термоциклированием в рамках двух или большего количества протоколов из множества протоколов при одновременном выполнении двух или большего количества протоколов из множества протоколов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает определение второй поправки к указанному этапу, причем время для обнаружения составляет кратную величину от продолжительности цикла обнаружения при корректировании этапа посредством первой поправки и второй поправки. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает определение поправки на смещение запуска, основанной на положении реакционной камеры, связанной с протоколом. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения продолжительность цикла обнаружения включает временной промежуток, необходимый для выполнения головкой обнаружителя заранее определенного множества операций обнаружения для одной реакционной камеры. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения продолжительность цикла обнаружения включает время, необходимое для перемещения головки обнаружителя в каждое положение обнаружения из множества положений обнаружения в реакционной камере и перемещения головки обнаружителя в начальное положение. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает инициирование протокола.

[0016] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения рассмотрена система для оптимизации протоколов для множества реакционных камер. Устройство может содержать процессор, выполненный с возможностью реализации следующего: определение, предоставление или осуществление доступа к данным продолжительности цикла обнаружения, прием или осуществление доступа к данным этапа протокола, причем этот этап связан с продолжительностью этапа и включает время для обнаружения, определение первой поправки к этапу таким образом, что его продолжительность этапа составляет кратную величину от продолжительности цикла обнаружения.

[0017] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения этап протокола связан с протоколом, выбранным из множества протоколов. Каждый протокол, выбранный из множества протоколов, может быть связан по меньшей мере с одной реакцией из множества реакций с термоциклированием, например, это относится к протоколу полимеразной цепной реакции, причем каждая реакция с термоциклированием содержит один этап или большее количество этапов обнаружения, и определение первой поправки основано, по меньшей мере частично, на распределении по времени для одного или большего количества этапов обнаружения, связанных с реакциями с термоциклированием в рамках двух или большего количества протоколов из множества протоколов при одновременном выполнении двух или большего количества протоколов из множества протоколов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ также включает операцию определения второй поправки к этапу, причем время для проведения обнаружения составляет кратную величину от продолжительности цикла обнаружения при корректировке этапа посредством первой поправки и второй поправки. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения процессор также выполнен с возможностью определения поправки на смещение запуска, основанной на положении реакционной камеры, связанной с протоколом. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения продолжительность цикла обнаружения включает временной промежуток, необходимый для выполнения головкой обнаружителя заранее определенного множества операций обнаружения для одной реакционной камеры. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения продолжительность цикла обнаружения также включает время, необходимое для перемещения головки обнаружителя в каждое положение обнаружения из множества положений обнаружения в реакционной камере и перемещения головки обнаружителя в начальное положение. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения процессор дополнительно выполнен с возможностью инициирования протокола.

[0018] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения рассмотрен способ одновременного проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени во множестве реакционных камерах для проведения полимеразной цепной реакции, включающий: (а) обеспечение времени сканирования, достаточного для выполнения узлом обнаружителя цикла сканирования, во время которого он способен провести сканирование каждой камеры из множества реакционных камерпредмет по меньшей мере одного обнаруживаемого сигнала и стать готовым к повторению сканирования; (b) обеспечение протокола реакции для каждой из реакционных камер, выполненных с возможностью проведения полимеразной цепной реакции, который включает множество циклов, причем каждый цикл включает время цикла, содержащего по меньшей мере один этап нагревания, по меньшей мере один этап охлаждения и по меньшей мере однин горизонтальный участок температурны, включающий период цикла считывания, во время которого узел обнаружителя должен провести сканирование реакционной камеры на предмет по меньшей мере одного обнаруживаемого сигнала; (с) определение, с использованием процессора, равно ли время цикла для этой реакционной камеры времени сканирования или целому кратному от времени сканирования, и при отсутствии такого равенства коррекция времени сканирования или времени цикла таким образом, чтобы время цикла была равна времени сканирования или составляла целое кратное от времени сканирования; (d) выполнение по меньшей мере этапов (b) и (с) для протокола реакции для каждой камеры из указанного множества реакционных камер, так что время цикла для каждого протокола реакции равно времени сканирования или целому кратному от времени сканирования; и (е) выполнение в режиме реального времени, под управлением процессора, полимеразной цепной реакции в каждой из реакционных камер, при использовании протокола реакции для каждой из реакционных камер, включая выполнение многократных циклов сканирования посредством узла обнаружителя, причем сканирование каждой реакционной камеры, предназначенной для проведения полимеразной цепной реакции, узлом обнаружителя происходит во время каждого периода цикла считывания для этой реакционной камеры.

[0019] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает фазовую корректировку времени цикла протокола реакции по меньшей мере для одной из реакционных камер. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения по меньшей мере один указанный протокол реакции отличен от другого указанного протокола реакции. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения по меньшей мере одно время цикла в одном протоколе реакции отлично от времени цикла в другом протоколе реакции. Таким образом, обеспечивается технический результат в виде обеспечения способа и устройства для параллельного выполнения молекулярных диагностических анализов на множестве образцов с амплификацией или без амплификации целевых нуклеиновых кислот и детектирования на подготовленных биологических образцах с высокой производительностью.

Краткое описание чертежей

[0020] На фиг. 1А показан вид спереди диагностического устройства, используемого в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения.

[0021] На фиг. 1В показан перспективный вид сверху диагностического устройства по фиг. 1А, отображающий некоторые из внутренних компонентов устройства.

[0022] На фиг. 2 показан вид изнутри диагностического устройства по фиг. 1А и 1В.

[0023] На фиг. 3А показан вид сверху одного возможного микрожидкостного устройства внутри некоторых вариантов реализации описанного здесь микрожидкостного картриджа.

[0024] На фиг. 3В показано расположение подложки нагревателя относительно реакционной камеры в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения.

[0025] На фиг. 4А показан внешний вид оптического модуля, содержащего головку обнаружителя в некоторых описанных здесь вариантах реализации настоящего изобретения.

[0026] На фиг. 4В показан вид оптического модуля по фиг. 4А с удаленной боковой крышкой.

[0027] На фиг. 4С показан вид снизу оптического модуля по фиг. 4А.

[0028] На фиг. 5 показана головка обнаружителя, используемая в оптическом модуле в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, вдоль линии 13 по фиг. 4В.

[0029] На фиг. 6 изображено расположение источников света и оптических обнаружителей, используемых в некоторых раскрытых здесь вариантах реализации головки обнаружителя.

[0030] На фиг. 7 показана зависимость интенсивности флуоресценции от времени при использовании полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для целевых нуклеиновых кислот, выполненной в устройстве в соответствии с описанными здесь некоторыми вариантами настоящего изобретения.

[0031] На фиг. 8 показано абстрактное описание некоторых вариантов камеры, апертурных отверстий и нагревающих слоев, имеющих место в некоторых описанных здесь вариантах реализации настоящего изобретения.

[0032] На фиг. 9А-Н показаны различные виды в одном варианте реализации апертурной пластины.

[0033] На фиг. 10 показаны различные размеры для разновидностей апертурной пластины по фиг. 9А-Н.

[0034] На фиг. 11 показан график части профиля температуры для возможного протокола, выполненного в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения.

[0035] На фиг. 12 показана блок-схема, отображающая последовательность операций для определения продолжительностей этапов протокола, смещений и времен обнаружения, выполненных с возможностью оптимизации и регламентации эффективности обнаружителя.

[0036] На фиг. 13 показана часть интерфейса пользователя, предназначенная для выбора продолжительности определенных этапов и подэтапов протокола и определения сопутствующей внутрицикловой поправки.

[0037] На фиг. 14 показан график профиля температуры, содержащий межцикловую поправку.

[0038] На фиг. 15А-С показано множество профилей температуры для множества протоколов, выполненных в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения. Фиг. 15А и 15В отображают характер профилей протокола до введения поправки на смещение запуска. На фиг. 15С показано множество профилей протокола относительно друг друга после введения поправок на смещение запуска.

[0039] На фиг. 16 показан график профиля температуры при активном охлаждении, реализуемом в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения.

Осуществление изобретения

[0040] Некоторые из вариантов реализации настоящего изобретения описывают устройство, называемое здесь термоциклером, способное согласованно нагревать и анализировать микрожидкостные камеры. Амплификация полинуклеотида, например, полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, может быть выполнена в микрожидкостных камерах. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения термоциклер может быть выполнен с возможностью реализации отдельных протоколов термоциклирования и обнаружения во множестве микрожидкостных реакционных камерах в пределах микрожидкостного картриджа. Термоциклирование может быть использовано для амплификации нуклеиновых кислот, например, ДНК, РНК и т.п., например, посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени или посредством других описанных здесь протоколов амплификации нуклеиновой кислоты в пределах микрожидкостных реакционных камер. Термоциклер может содержать головку обнаружителя, содержащую множество обнаружительных пар, например, шесть или больше обнаружительных пар в головке, причем каждая обнаружительная пара содержит светоизлучающий источник, например, светодиод и т.п., и родственный фотодиод. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждая отдельная обнаружительная пара выполнена с возможностью генерации и обнаружения света, излучаемого от флуоресцентной части, например, от флуоресцентной пробы, для указания на наличие целевого полинуклеотида.

[0041] Используемый термин «микрожидкостный» относится к объемам меньше 1 мл, предпочтительно меньше чем 0,9 мл, например, 0,8 мл, 0,7 мл, 0,6 мл, 0,5 мл, 0,4 мл, 0,3 мл, 0,2 мл, 0,1 мл, 90 мкл, 80 мкл, 70 мкл, 60 мкл, 50 мкл, 40 мкл, 30 мкл, 20 мкл, 10 мкл, 5 мкл, 4 мкл, 3 мкл, 2 мкл, 1 мкл, или меньше, или любое промежуточное количество. Следует иметь ввиду, что если определенно не указано обратное, то при использовании здесь термина «полимеразная цепная реакция» охвачена любая разновидность полимеразной цепной реакции, включая, но не ограничиваясь этим, количественную полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени и любую другую форму амплификации полинуклеотида.

[0042] Последовательность операций обнаружения, используемая при анализе, может также быть мультиплексирована, позволяя одновременно проводить множество параллельных измерений для множества реакций. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения эти измерения могут быть взяты от отдельных реакционных камер. В некоторых из этих вариантов реализации происходит выполнение множества полимеразных цепных реакций одновременно в единственной реакционной камере, предназначенной для проведения полимеразных цепных реакций, например, выполнение мультиплексной полимеразной цепной реакции. Протокол полимеразной цепной реакции может включать основные положения для выполнения следующих друг за другом операций отжига и денатурирования полинуклеотидов в реакционной камере до обнаружения. Такие основные положения, включая временную зависимость для нагрева камеры, могут быть названы «протоколом». Некоторые из раскрытых вариантов реализации настоящего изобретения содействуют согласованному нагреванию и/или охлаждению во множестве реакционных камер, выполняющих полимеразную цепную реакцию, содействуя обнаружению посредством матрицы датчиков. В определенных вариантах реализации настоящего изобретения устройство может включить апертурную пластину, содействующую согласованному нагреванию и охлаждению реакционных камер посредством приложения давления к картриджу, содержащему множество реакционных камер для проведения полимеразной цепной реакции. Определенные подробности и способы, предназначенные для обработки полинуклеотидов, могут быть найдены, например, в публикации заявки на патент США №2009-0131650 и в публикации заявки на патент США 2010-0009351, включенных в настоящую заявку посредством ссылки.

[0043] Специалисту в данной области техники понятно, что раскрытые здесь варианты реализации настоящего изобретения применимы для различных типов реакций амплификации нуклеиновых кислот. Например, способы амплификации нуклеиновой кислоты в связи с раскрытыми здесь вариантами реализации могут включать, не ограничиваясь этим: полимеразную цепную реакцию (PCR), амплификацию замещением цепей (SDA), например, амплификацию с множественным вытеснением цепи (MDA), опосредованную петлей изотермическую амплификацию (LAMP), лигазную цепную реакцию (LCR), иммуно-амплификацию и множество основанных на транскрипции процедур амплификации, включая транскрипционно опосредованную амплификацию (ТМА), амплификацию, основанную на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA), самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (3SR) и амплификацию по типу катящегося кольца. См., например, Mullis, «Последовательность операций для амплификации, обнаружения и/или клонирования последовательностей нуклеиновых кислот», Патент США №4683195; Walker «Амплификация замещением цепей», Патент США №5455166; Dean et al., «Амплификация с множественным вытеснением цепи», Патент США №6977148; Notomi et al., «Последовательность операций для синтеза нуклеиновой кислоты», Патент США №6410278; Landegren et al. «Способ обнаружения изменения нуклеотида в нуклеиновых кислотах», Патент США №4 988 617; Birkenmeyer, «Амплификация целевых нуклеиновых кислот при использовании заполняющей гэп лигазной цепной реакции», Патент США №5427930; Cashman, «Способ и устройство иммунологического анализа с блокированным полимеразой полинуклеотидом», Патент США №5849478; Kacian et al., «Способы амплификации последовательности нуклеиновых кислот», Патент США №5399491; Malek et al., «Усовершенствованная последовательность операций по амплификации нуклеиновой кислоты», Патент США №5130238; Lizardi et al., BioTechnology, 6:1197 (1988); Lizardi et al. «Репортерные устройства при репликации типа катящегося кольца», Патент США №5854033.

[0044] В некоторых раскрытых здесь вариантах реализации настоящего изобретения целевая нуклеиновая кислота, например, целевой ампликон, может быть обнаружена при использовании олигонуклеотидной пробы. Предпочтительно, чтобы пробы содержали одну или множество поддающихся обнаружению составляющих, которые могут быть обнаружены посредством раскрытых здесь устройств. Специалист в данной области техники понимает, что множество технологий отбора проб полезны в описанных здесь вариантах реализации настоящего изобретения. В качестве примера, в раскрытых здесь вариантах реализации могут быть использованы пробы «TAQMAN®», пробы типа молекулярного маяка, пробы «SCORPIOIM™» и аналогичные пробы.

[0045] Пробы «TAQMAN®» представляют собой гомогенетические пробы, предназначенные для обнаружения полинуклеотидов (см. Патент США №5723591). В пробах «TAQMAN®» два праймера полимеразной цепной реакции примыкают к центральному олигонуклеотиду пробы «TAQMAN®». Оли гону клеотид пробы содержит флуорофор и гаситель люминесценции. Во время этапа полимеризации из последовательности операций полимеразной цепной реакции активность 5' нуклеазы полимеразы расщепляет олигонуклеотид пробы, приводя к физическому отделению флуорофорной составляющей от гасителя флуоресценции, что увеличивает флуоресцентное испускание. По мере возрастания количества продукта полимеразной цепной реакции происходит увеличение интенсивности испускания на новой длине волны.

[0046] Молекулярные маяки представляют собой альтернативу пробе «TAQMAN®» при обнаружении полинуклеотидов и описаны, например, в Патентах США №6277607, №6150097 и №6037130. Молекулярные маяки представляют собой олигонуклеотидные шпильки, претерпевающие конформационное изменение после прикрепления к идеально согласованной матрице. Конформационное изменение олигонуклеотида увеличивает физическое расстояние между флуорофорной составляющей и составляющей в виде гасителя флуоресценции, присутствующей на олигонуклеотиде. Это увеличение физического расстояния приводит к уменьшению влияния гасителя флуоресценции, увеличивая, тем самым, сигнал, выработанный флуорофором.

[0047] В способе смежных проб происходит амплификация целевой последовательности посредством полимеразной цепной реакции в присутствии двух проб нуклеиновой кислоты, которые выполняют гибридизацию в отношении смежных участков целевой последовательности, причем одна из проб помечена акцепторным флуорофором, а другая проба помечена донорским флуорофором из пары, выполняющей перенос энергии флуоресценции. После гибридизации двух проб с целевой последовательностью донорский флуорофор взаимодействует с акцепторным флуорофором с выработкой обнаруживаемого сигнала. Затем происходит возбуждение образца светом с длиной волны, поглощаемой донорским флуорофором, и обнаружение флуоресцентного испускания от пары, выполняющей перенос энергии флуоресценции, для определения этого целевого количества. В патенте США №6174670 раскрыты такие способы.

[0048] Праймеры типа «Sunrise» используют шпилечную структуру, аналогичную молекулярным маякам, но присоединенную к целевой связывающей последовательности, служащей праймером. При синтезе комплементарной нити праймера происходит разрыв шпилечной структуры с прекращением гашения флуоресценции. Эти праймера обнаруживают амплифицированный продукт и не требуют использования полимеразы с активностью 5' экзонуклеазы. Праймеры типа «Sunrise» описаны Nazarenko et al. (Nucleic Acids Res. 25:2516-21 (1997) и в патенте США №5866336.

[0049] Пробы типа «SCORPION™» комбинируют праймер с добавленной шпилечной структурой, аналогичной праймерам типа «Sunrise». Однако, шпилечная структура пробы «SCORPION™» открыта не посредством синтеза комплементарной нити, а посредством гибридизации части шпилечной структуры с частью целевой структуры, размещенной вниз от части, гибридизированной с праймером.

[0050] Полимеразная цепная реакция с DzyNA включает праймер, содержащий антисенсорную последовательность энзимов ДНК, олигонуклеотид, способный к расщеплению определенных фосфодиэфирных связей в РНК. Праймер связан с целевой последовательностью и управляет реакцией амплификации, производящей ампликон, содержащий активный энзим ДНК. Активный энзим ДНК затем расщепляет субстрат репортерного гена в реагирующей смеси. Субстрат репортера содержит пару флуорофор-гаситель флуоресценции, а расщепление субстрата вырабатывает флуоресцентный сигнал, возрастающий при амплификации целевой последовательности. Полимеразная цепная реакция с энзимом ДНК описана в статье Todd et al., Clin. Chem. 46:625-30 (2000) и в Патенте США №6140055.

[0051] Fiandaca et al. описывают флуорогенный способ анализа полимеразной цепной реакции, использующий меченую гасителем флуоресценции пробу на пептидно-нуклеиновую кислоту (Q-PNA) и меченый флуорофором праймер олигонуклеотида (Fiandaca et al., Genome Research, 11:609-613 (2001)). Происходит гибридизация меченой гасителем флуоресценции пептидно-нуклеиновой кислоты с последовательностью ярлычка на 5' конце праймера.

[0052] Li et al. описывают двухцепочечную пробу, содержащую гаситель флуоресценции и флуорофор на противоположных олигонуклеотидных цепях (Li et al., Nucleic acid Research, 30 (2): e5, 1-9 (2002)). При отсутствии связи с мишенью происходит гибридизация цепей друг с другом и гашение флуоресценции в пробе. Однако при наличии мишени происходит гибридизация по меньшей мере одной цепи к мишени, приводящая к выработке флуоресцентного сигнала.

[0053] Флуорофорные метки и составляющие, применимые в раскрытых здесь вариантах реализации настоящего изобретения, содержат, не ограничиваясь этим, красители семейства флуоресцеина, семейства карбоксиродамина, семейства цианина и семейства родамина. Другие семейства красителей, которые могут быть использованы при реализации настоящего изобретения, включают, например, красители семейства полигалофлуоресцина, красители семейства гексахлорфлуресцина, красители семейства кумарина, красители семейства оксазина, красители семейства тиазина, красители семейства скварена, хелатные красители семейства лантаноидов, семейство красителей, поставляемых под торговым обозначением «Alexa Fluor J» компанией Molecular Probes, и семейство красителей, поставляемых под торговым обозначением «Bodipy J» компанией Invitrogen (Карлсбад, Калифорния). В семейство флуоресцеиновых красителей входят, например, 6-карбоксифлуоресцин (FAM), 2',4',1,4,-тетрахлорофлуоресцин (ТЕТ), 2',4',5',7',1,4-гескахлорфлуоресцин (HEX), 2',7'-диметокси-4'_J5'-дихлоро-6-карбоксиродамин (JOE), 2'-хлоро-5'-флуоро-7',8'-плавленый фенил-1,4-дихлоро-6-карбоксифлуоресцин (NED), 2'-хлоро-7'-фенил-1,4-дихлоро-6-карбоксифлуоресцин (VIC), 6-карбокси-Х-родамин (ROX) и 2',4',5',7'-тетрахлоро-5-карбокси-флуоресцин (ZOE). В семейство карбоксиродаминовых красителей входят тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), тетрапропан-6-карбоксиродамин (ROX), техасский красный, R110 и R6G. В семейство цианиновых красителей входят Су2, Су3, Су3.5, Су5, Су5.5 и Су7. Флуорофоры легко доступны на рынке от, например, компаний PerkinElmer (Фостер-Сити, Калифорния), Molecular Probes, Inc. (Юджин, Орегон.) и Amershem GE Healthcare (Пискэтэуэй, Нью-Джерси).

[0054] Как обсуждено выше, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения пробы, полезные в раскрытых здесь вариантах реализации настоящего изобретения, могут содержать гаситель флуоресценции. Гасители флуоресценции могут представлять собой флуоресцентные гасители или нефлуоресцентные гасители. В список флуоресцентных гасителей входят, не ограничиваясь этим, TAMRA, ROX, DABCYL, DABSYL, цианиновые красители, включая нитротиазоловый синий (NTB), антрахинон, малахитовую зелень, нитротиазоловые и нитроимидазоловые соединения. В качестве примеров нефлуоресцентных гасителей, рассеивающих энергию, поглощенную от флуорофора, можно взять гасители, выпускаемые под торговой маркой «Black Hole™» компанией Biosearch Technologies, Inc. (Новато, Калифорния), под торговой маркой «Eclipse™ Dark» компанией Epoch Bioscience (Бозелл, Вашингтон), под торговой маркой «Qxl J» компанией Anaspec, Inc. (Сан-Хосе, Калифорния), под торговой маркой «Iowa Black» компанией Integrated DNA Technologies (Коралвилль, Айова).

[0055] В некоторых обсужденных выше вариантах реализации настоящего изобретения флуорофор и гаситель флуоресценции использованы вместе и могут быть на одних и тех же или различных олигонуклеотидах. При соединении вместе флуорофор и гаситель флуоресценции могут быть названы донорским флуорофором и акцепторным флуорофором, соответственно. При современном уровне техники известно много удобных пар флуорофор/гаситель (см., например, Glazer et al., Current Opinion in Biotechnology, 1997, 8:94-102; Tyagi et al., 1998, Nat Biotechnol., 16:49-53), легко доступных на рынке, например, от компаний Molecular Probes (Джанкшен-Сити, Орегон) и Applied Biosystems (Фостер-Сити, Калифорния). Примеры донорских флуорофоров, способных к использованию с различными акцепторными флуорофорами, содержат, не ограничиваясь этим, флуоресцеин, Люцифер желтый, В-фикоэритрин, 9-акридинейсотиоцианат, Люцифер желтый VS, 4-ацетамидо-4'-изотио-цианотостилбен-2,2'-дисульфоновую кислоту, 7-диэтиламино-3-(4'-изотио цианатофенил)-4-метилкуманин, сакцинимедил 1-пиренебутират и производные 4-ацетамидо-4'-изотиоцианатоксистилбен-2-,2'-дисульфонной кислоты. Акцепторные флуорофоры обычно зависят от используемого донорского флуорофора. Примеры акцепторного флуорофора содержат, не ограничиваясь этим, LC-Red 640, LC-Red 705, Су5, Су5.5, сульфонил хлорид лиссамин-родамина В, изотиоцианат тетраметил-родамина, изотиоцианат х-родамина, изотиоцианат эритрозина, флуоресцеин, пентаацетат диэтилентриамина или другие хелаты лантаноидных ионов (например, европия или тербия). Донорские и акцепторные флуорофоры легко доступны на рынке, например, от компаний Molecular Probes или Sigma Chemical Со. (Сент-Луис, Миссури). Пары флуорофор/гаситель, пригодные для использования в раскрытых здесь композициях и способах, хорошо известны при современном уровне техники и могут быть найдены, например, в статье S. Marras «Выбор пар флуорофора и гасителя флуоресценции для флуоресцентных проб с гибридизацией нуклеиновой кислоты», доступной в интернете по адресу molecular-beacons.org/download/marras.mmb06%28335%293.pdf (11 апреля 2012 г.).

[0056] Преимущество последовательности операций обнаружения, используемой в раскрытых здесь способах анализа, состоит в том, что она обеспечивает возможность проведения множества параллельных измерений множества обнаруживаемых составляющих, например, множества проб, содержащих различные обнаруживаемые составляющие и т.п. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения эти измерения могут быть выполнены в отдельных реакционных камерах внутри микрожидкостного картриджа, например, в слое камер (слой камер имеет здесь отношение к части микрожидкостного картриджа, содержащего реакционные камеры). В некоторых из этих вариантов реализации множество реакций амплификации выполнено одновременно в одной реакционной камере, например, выполнена мультиплексная полимеразная цепная реакция. Протокол полимеразной цепной реакции может включать основные положения для выполнения поочередного отжига и денатурирования полинуклеотидов в реакционной камере до обнаружения. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения устройство выполнено с возможностью содействия согласованному нагреванию и/или охлаждению во множестве реакционных камерах для выполнения амплификации нуклеиновой кислоты и содействия обнаружению целевых ампликонов в отдельных реакционных камерах, например, посредством обнаружения испускания флуоресцентного излучения при использовании матрицы датчиков.

[0057] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения устройство может содержать апертурную пластину, содействующую согласованному нагреванию и охлаждению реакционных камер посредством приложения давления к картриджу, содержащему множество реакционных камер через множество независимых оптических пар. Предпочтительно, чтобы апертурная пластина была выполнена с возможностью содействия выработке и обнаружению флуоресцентных сигналов от проб внутри множества независимых реакционных камер. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения апертурная пластина выполнена таким образом, что имеют место отдельные апертурные отверстия (или окна), размещенные над каждой из отдельных реакционных камер в микрожидкостном картридже. Диагностическое устройство

[0058] На фиг. 1А и IB показано диагностическое устройство 10, используемое в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения. В варианте реализации по фиг. 1А диагностическое устройство содержит кожух 30 устройства. Кожух 30 может гарантировать наличие управляемой среды для обработки микрожидкостных образцов и препятствование попадания нежелательного света в камеру обнаружения. Кожух 30 может содержать крышку 16 с ручкой 14 и прозрачным окном 12. Крышка 16 может быть опущена для закрытия апертурного отверстия перед диагностическим устройством 10 при работе диагностического устройства.

[0059] Как видно в вариантах реализации настоящего изобретения по фиг. 1А и 1В, диагностическое устройство 10 может содержать две подставки 24а, 24b для образцов в передней части диагностического устройства 10. Однако специалист в данной области техники понимает, что отображение диагностического устройства на фиг. 1А и 1В приведено лишь в качестве примера и что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения устройство может быть выполнено с возможностью размещения более двух подставок для образцов, например, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или большего количества подставок для образцов. Предпочтительно, чтобы устройство было выполнено с возможностью размещения одинакового количества подставок для образцов, например, двух, в микрожидкостных картриджах.

[0060] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждая подставка 24а, 24b для образцов может содержать множество держателей 26. Держатели 26 могут содержать гнезда для хранения диагностических реактивов, например, реактивов для амплификации нуклеиновой кислоты, типа реактивов для проведения полимеразной цепной реакции и т.п. Подставки 24 могут также содержать трубки для образцов (не показаны) и смесительные трубки (не показаны), предназначенные для подготовки готовых к проведению диагностики образцов, например, готовых к амплификации образцов. Устройство может подготовить нужные реактивы на подставках 24а, 24b для образцов, используя дозатор 400. Дополнительное описание различных дозаторов жидкости может быть найдено, например, в публикации заявки на патент США №2009-0130719 и в публикации заявки на патент США №2009-0155123, включенных в настоящую заявку посредством ссылки.

[0061] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения реакционные камеры внутри микрожидкостного картриджа(-ей) содержат один или множество реактивов, буферных растворов и т.д., используемых при амплификации нуклеинов. Например, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения реакционные камеры микрожидкостного картриджа могут содержать, например, праймеры амплификации, пробы, нуклеотиды, энзимы, такие как полимераза, буферные реактивы и т.п. В качестве примера отметим, что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения реакционные камеры могут содержать лиофилизированные реактивы, к которым добавлен обработанный биологический образец (например, раствор экстрагированных нуклеиновых кислот). Подготовленные жидкости могут затем быть перенесены в микрожидкостной картридж и введены в нагревательные / оптические модули 500а, 500b для проведения обработки и анализа.

[0062] На фиг. 1А показан вид спереди диагностического устройства 10, используемого в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения. Как можно видеть на фиг. 1А, диагностическое устройство 10 может содержать дозатор 400 жидкости, размещенный на боковой направляющей 20. Боковую направляющую 20 может представлять собой часть рамы с приводом от двигателя 18, которая может также содержать направляющую 22 в продольном направлении (не показан). Направляющая 22 в продольном направлении может быть связана с боковой направляющей 20 и размещена перпендикулярно к боковой направляющей 20 в диагностическом устройстве 10.

[0063] На фиг. 1А дополнительно показана крышка 28 над нагревательным / оптическим модулями 500а, 500b. Приемные лотки 520а и 520b могут быть размещены ниже или внутри кожуха нагревательных / оптических модулей 500а, 500b. Приемный лоток 520а показан в открытом положении, что делает его готовым к получению микрожидкостного картриджа 200. Приемный лоток 520b показан в закрытом положении. Закрытие лотка не только помещает реактивы в соответствующее положение для обработки, но также дополнительно предохраняет внутреннюю часть нагревательных / оптических модулей от получения какого-либо нежелательного постороннего света. При попадании постороннего света в область обнаружения устройство может идентифицировать ошибочные уровни флуоресценции, полученные в результате воздействия света, не излучаемого реакционной камерой.

[0064] На фиг. 1В показан перспективный вид диагностического устройства 10, отображающий некоторые из внутренних компонент, имеющих место в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения. Для лучшего объяснения определенных особенностей кожух 30 устройства, крышка 16 и крышка 28 нагревательного / оптического модуля, показанные на фиг. 1А, были удалены из вида по фиг. 1В. На фиг. 1В показана рама 18, содержащая боковую направляющую 20 и продольную направляющую 22. Дозатор 400 жидкости может быть размещен на боковой направляющей 20 и может скользить в боковом направлении вдоль длинной боковой направляющей 20. Боковая направляющая 20 может быть соединена с продольной направляющей 22, выполненным с возможностью перемещения в продольном направлении. Таким образом, обеспечена возможность перемещения дозатора 400 жидкости в направлениях вдоль осей X, Y по диагностическому устройству 10. Как описано ниже, также обеспечена возможность перемещения дозатора 400 жидкости вверх и вниз в Z-плоскости по боковой направляющей 20, обеспечивая таким образом возможность перемещения дозатора 400 по трем осям по диагностическому устройству 10.

[0065] На фиг. 1В также показаны нагревательные / оптические модули 500а, 500b с удаленной крышкой 28 нагревательных / оптических модулей по фиг. 1А. Приемные лотки 520а и 520b показаны в открытом положении, причем каждый лоток содержит картридж 200. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждый из приемных лотков может содержать подложку 600 нагревателя (не показана) под каждым микрожидкостным картриджем 200. Каждый нагревательный / оптический модуль 500а, 500b может также содержать обнаружительную головку 700, описанную более подробно ниже.

[0066] Как будет описано более подробно ниже, диагностическое устройство. 10 способно к проведению диагностики в режиме реального времени на одном или множестве образцов. Подлежащий испытаниям образец может сначала быть размещен в трубке для образца (не показана) на подставке 24а или 24b. Диагностические реактивы могут быть размещены в держателях 26 на подставке 24а в диагностическом устройстве 10. Дозатор 400 жидкости способен перемешивать и готовить образец для диагностических испытаний и способен затем подать подготовленный образец в микрожидкостный картридж 200 для проведения термоциклирования и обнаружения анализируемого компонента в нагревательных / оптических модулях 500а, 500b. В качестве альтернативы дозатор 400 жидкости способен подавать образцы нуклеиновой кислоты в реакционные камеры микрожидкостного картриджа, причем реакционные камеры микрожидкостного картриджа уже содержат реактивы для проведения реакции амплификации.

[0067] На фиг. 2 отображен внутренний вид диагностического устройства 10, показывающий подставку 24а, удерживающую множество трубок 32 для образцов и держатели 26 реактивов, а также картридж 200, размещенный в приемном лотке 520а. Приемный лоток 520а показан в открытом положении, простираясь от нагревательного / оптического модуля 500а с прикрепленной крышкой 28. Приемный лоток 520b показан в закрытом положении. В некоторых предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения приемные лотки 520а, b обеспечивают возможность легкого размещения микрожидкостного картриджа 200 пользователем или автозагрузочным устройством. Такая конструкция способна также реализовать мультиплексированное капание образцов посредством использования автоматизированного дозатора 400 жидкости.

Приемный лоток

[0068] Как показано на фиг. 2, отсек 524 с выемкой способен быть частью приемного лотка 520, выполненного с возможностью селективного получения микрожидкостного картриджа 200. Например, отсек 524 с выточкой и микрожидкостный картридж 200 способны иметь край 526, дополнительный по форме таким образом, что микрожидкостный картридж 200 может быть выборочно получен, например, с единственной ориентацией. Например, микрожидкостной картридж 200 способен содержать ориентирующий элемент 202, вставляемый в дополняющий элемент отсека. Ориентирующий элемент 202 может быть, например, выполнен в виде выреза на краю картриджа 200 (как показано на фиг. 3А) или в виде одной или множества выемок, выполненных на одной стороне или на множестве сторон. Специалист в данной области техники легко понимает, что взаимодополняемость между картриджем и приемным отсеком может быть легко достигнута посредством использования других подходящих конфигураций, например, посредством штыря или выступа, входящего внутрь апертурного отверстия. Посредством селективного получения картриджа 200 отсек 524 с выточкой способен помочь пользователю установить картридж 200 таким образом, чтобы оптический модуль 502 должным образом работал на картридже 200. Таким образом, обеспечена возможность безошибочной ориентации картриджей 200.

[0069] Приемный лоток 520 может быть ориентирован так, чтобы различные компоненты устройства, способные работать на микрожидкостном картридже 200 (например, источники тепла, обнаружители, силовые элементы и т.п.), были размещены для работы должным образом на микрожидкостном картридже 200, при получении картриджа 200 в отсеке 524 с выточкой приемного лотка 520. Например, контактные источники тепла на подложке 600 нагревателя могут быть размещены в отсеке 524 с выточкой таким образом, что источники тепла могут быть термически связаны с различными местами на микрожидкостном картридже 200, полученном в приемном лотке 520.

Микрожидкостный картридж

[0070] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения рассмотрен микрожидкостный картридж, выполненный с возможностью проведения амплификации, например, посредством полимеразной цепной реакции, одного или множества полинуклеотидов от одного или множества образцов. Картриджем здесь названо однократно или повторно, полностью или частично, используемое устройство, выполненное с возможностью использования совместно с некоторым другим устройством, которое подходящим и дополняющим образом выполнено с возможностью получения картриджа и работы на нем (например, посредством подачи энергии к картриджу).

[0071] При использовании в настоящей заявке термин «микрожидкостной» имеет отношение к объемам образца и/или реактива и/или амплифицированного полинуклеотида, составляющим от приблизительно 0,1 мкл до приблизительно 999 мкл, например, от 1-100 мкл или от 2-25 мкл, как определено выше. Аналогичным образом, в отношении к картриджу термин «микрожидкостной» означает, что различные компоненты и каналы картриджа, как будет далее описано в настоящей заявке, выполнены с возможностью принимать и/или сохранять микрожидкостные объемы образца, реактива или амплифицированного полинуклеотида и/или содействовать их прохождению. Некоторые варианты реализации настоящего изобретения могут также функционировать с нанолитровыми объемами (в диапазоне 10-500 нанолитров, например, 100 нанолитров).

[0072] На фиг. 3А показан вид сверху микрожидкостного картриджа 200. Картридж 200 может содержать множество дорожек 1706а-с образца. Дорожки могут вести к камерам 1703 для проведения полимеразной цепной реакции, размещенным на «левой» и «правой» сторонах (то есть, в рядах) картриджа. Как показано на фиг. 3а, дорожки могут быть выполнены с впускными апертурными отверстиями 1705 в удобном месте вблизи пользователя. Однако, дорожки, с которыми соединены апертурные отверстия, могут затем иметь независимые пути к отдельным камерам 1703а-с. Например, в варианте реализации настоящего изобретения по фиг. 3а, первая дорожка 1706а связана с первой камерой 1703а с левой стороны, вторая дорожка 1706b связана с первой камерой 1703b с правой стороны, третья дорожка 1706с связана со второй камерой 1703с с левой стороны и т.д. Каждая из микрожидкостных дорожек может также содержать микрожидкостные клапаны 1702, 1704, микрожидкостные затворы и микрожидкостные каналы. Эти затворы и клапаны могут быть управляемы, например, посредством теплового привода для содействия рассчитанному по времени выпуску и управляемой диффузии некоторых жидкостей внутри дорожек 1706 картриджа 200. В этом варианте реализации настоящего изобретения картридж может содержать вентиляционные отверстия 1701, препятствующие блокировке прохождения жидкости внутри картриджа со стороны воздуха. Дальнейшее описание различных компонентов картриджа, например, клапанов, можно найти, например, в публикации заявки на патент США №2009-0130719, включенной в настоящую заявку посредством ссылки.

[0073] Микрожидкостный картридж 200 может содержать ориентирующий элемент 202, например, вырез, соответствующий дополняющему краю в отсеке 524 с выточкой из приемного лотка 520а, b в нагревательных / оптических модулях 500а, 500b. Ориентирующий элемент 202 и дополнительный край 526 обеспечивают возможность безопасного и правильного размещения микрожидкостного картриджа 200 в приемном лотке 520а, b.

[0074] В различных вариантах реализации настоящего изобретения компоненты микрожидкостной сети в дорожках 1706 для образца из картриджа 200 могут быть нагреты посредством их тепловой связи с нагревателями в подложке 600 нагревателя. Подложка 600 нагревателя может быть выполнена с возможностью нагрева смеси образца, содержащей реактивы для амплификации и готовый к амплификации полинуклеотидный образец, и воздействия на эту смесь условий термоциклирования, подходящих для выработки ампликонов из готового к амплификации образца. Подложка 600 нагревателя может быть размещена на картридже 200 в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения или в отсеке 524 с выточкой.

[0075] Микрожидкостная сеть в каждой дорожке может быть выполнена с возможностью амплификации нуклеиновой кислоты, например, посредством полимеразной цепной реакции, на готовом к амплификации образце, например, на образце, содержащем нуклеиновую кислоту, извлеченную из образца. Готовый к амплификации образец может содержать смесь реактивов для амплификации и образец с экстрагированным полинуклеотидом. Эта смесь может быть подходящей для воздействия условий термоциклирования с целью выработки ампликонов из образца с экстрагированным полинуклеотидом. Например, готовый к амплификации образец, типа образца, готового к амплификации посредством полимеразной цепной реакции, может содержать смесь реактивов для проведения полимеразной цепной реакции, содержащую полимеразный энзим, нуклеиновую кислоту с позитивной регуляцией, пробу флуорогенной гибридизации, селективную в отношении по меньшей мере части нуклеиновой кислоты с позитивной регуляцией и множества нуклеотидов, и по меньшей мере одну пробу, селективную в отношении целевой полинуклеотидной последовательности. Микрожидкостная сеть может быть выполнена с возможностью переноса теплоты из внешнего источника тепла к смеси, содержащей реактив для проведения полимеразной цепной реакции и образец с экстрагированным полинуклеотидом в условиях термоциклирования, подходящих для выработки ампликонов из образца с экстрагированным полинуклеотидом посредством полимеразной цепной реакции.

[0076] В различных вариантах реализации настоящего изобретения смесь реактивов может содержать флуоресцентные или другие оптически обнаруживаемые метки для обнаружения выработки желательного ампликона. В некоторых вариантах реализации множество наборов праймеров и множество меток может быть использовано в мультиплексном формате анализа, например, в мультиплексированной полимеразной цепной реакции, где каждый ампликон из множества различных ампликонов может быть обнаружен (при его наличии) лишь в одной реакционной камере. Например, одна камера для проведения анализа может содержать матричные нуклеиновые кислоты из образца для испытаний, матричные нуклеиновые кислоты с позитивной регуляцией, одну пару или множество пар праймеров для амплификации определенных целевых последовательностей, одну пробу или множество проб для обнаружения целевых ампликонов и одну пару или множество пар праймеров и пробу для обнаружения ампликонов с позитивной регуляцией. Кроме того, специалисту в данной области техники понятно, что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения микрожидкостный картридж содержит полинуклеотид с негативной регуляцией, не вырабатывающий ампликон с парами праймеров, используемыми для амплификации целевой последовательности или последовательности с позитивной регуляцией.

[0077] В некоторых из показанных вариантов реализации настоящего изобретения камеры 1703а-с, соответственно связанные с каждой дорожкой 1706а-с многодорожечного картриджа 200, могут выполнять независимые реакции амплификации. Результаты реакций для первой колонки камер (1703а, 1703b) для первых двух дорожек (1706а, 1706b) могут затем быть одновременно и независимо измерены посредством головки обнаружителя, содержащей пару из «левого» источника света и «правого» источника света и фотоприемника. Таким образом, каждая камера 1703а-b каждой дорожки 1706а-b способна получать свет от отдельного источника света и быть одновременно наблюдаемой отдельным фотоприемником. Таким образом, ряд комбинаций реакций может быть эффективно выполнен в картридже. Например, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения множество анализов амплификации для обнаружения множества целевых нуклеиновых кислот может быть выполнено на одной дорожке, позитивная регуляция и негативная регуляция на двух других дорожках; или один или множество анализов амплификации для обнаружения одной или множества целевых нуклеиновых кислот, соответственно, в комбинации с внутренней позитивной регуляцией на одной дорожке, и негативной регуляцией на отдельной дорожке. В одном специфическом варианте реализации настоящего изобретения 2, 3, 4, 5, 6 или больше операций анализа мультиплексированы на одной дорожке по меньшей мере с этим количеством флуоресцентно различных флуорофоров в реакционной камере.

[0078] Микрожидкостный картридж 200 может быть выполнен в виде множества слоев. В соответствии с этим, одна особенность настоящего технического решения относится к микрожидкостному картриджу, содержащему первый, второй, третий, четвертый и пятый слои, причем один или множество слоев определяют множество микрожидкостных сетей и каждая сеть содержит различные компоненты, выполненные с возможностью реализации полимеразной цепной реакции на образце, относительно которого должно быть определено наличие или отсутствие одного или множества полинуклеотидов. В другом варианте реализации настоящего изобретения микрожидкостный картридж 200 может содержать множество дорожек, каждая из которых содержит реакционную камеру, вытравленных или запрессованных в одной плоскости, например, в подложке из формованного пластика, причем каждая дорожка закрыта покрывным слоем, например, слоем липкой пластиковой пленки. Рассмотрены варианты реализации настоящего изобретения с 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30 или с большим количеством дорожек на картридж. Например, одна подходящая конструкция представляет собой один картридж 200 с 24 реакционными камерами, размещенными в виде двух рядов по 12 реакционных камер, при необходимости имеющих взаимно ориентированные впускные апертурные отверстия. Дополнительное описание различных картриджей и их компонентов можно найти, например, в публикации заявки на патент США №2008-0182301 и публикации заявки на патент США №2009-0130719, включенных в настоящую заявку посредством ссылки.

Подложка нагревателя

[0079] На фиг. 3В показан вид сверху некоторых вариантов реализации подложки 600 нагревателя. Может быть использован любой тип нагревателя, включая резистивный нагреватель, нагреватель на основе эффекта Пелтье или нагреватель с перемещаемой текучей средой и с предполагаемым пассивным или активным охлаждением. В одном из многих возможных вариантов реализации имеет место множество резистивных нагревателей, имеющих тепловой контакт с каждой реакционной камерой, причем предпочтительно также наличие одного или множества температурных датчиков. Поскольку резистивные нагреватели также проявляют некоторый терморезисторный эффект, то есть, происходит изменение их сопротивления с температурой, сами нагреватели могут служить еще и в качестве температурных датчиков, обеспечивая возможность точного контроля температуры в каждой реакционной камере, упрощая при этом конструкцию устройства. Хотя нагреватели могут быть управляемы совместно друг с другом, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждая реакционная камера может содержать один или множество отдельных нагревателей, имеющих тепловой контакт с ней, таким образом, что нагреватели управляемы по-отдельности и каждая реакционная камера может быть нагрета и охлаждена независимо от других реакционных камер. Это обеспечивает возможность одновременного выполнения различных анализов в каждой из множества реакционных камер. Один специфический узел резистивного нагревателя, предназначенного для использования с индивидуальной реакционной камерой, показан на фиг. 3В. В варианте реализации настоящего изобретения, показанном на фиг. 3В, обеспечена возможность использования любой комбинации верхнего нагревателя/датчика 1604, нижнего нагревателя/датчика 1603, бокового нагревателя/датчика 1601 и центрального нагревателя/датчика 1602 для нагрева размещенной выше реакционной камеры. Для простоты понимания схема камеры 1703 для проведения полимеразной цепной реакции в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения наложена на подложку нагревателя. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения нагреватели в подложке 600 нагревателя могут быть выполнены контактными нагревателями. Такие контактные нагревателя могут содержать (например) резистивный нагреватель (или сеть таких нагревателей), радиатор, жидкостное теплообменное устройство и устройство Пельтье. Размещенный в отсеке 524 с выточкой контактный источник тепла может быть выполнен с возможностью теплового соединения с одним выделенным местом или с несколькими выделенными местами микрожидкостного картриджа 200, полученного в приемном лотке 520а, b, посредством чего происходит селективный нагрев этих выделенных мест. Каждый из контактных источников тепла в подложке 600 нагревателя может быть выполнен с возможностью независимого теплового соединения с различными выделенными местами в микрожидкостном картридже 200, полученном в приемном лотке 520а, b, посредством чего происходит независимый нагрев этих выделенных мест. Предпочтительно выполнение контактных источников тепла с возможностью непосредственного физического контакта с выделенными местами микрожидкостного картриджа 200, полученного в приемном лотке 520а, b. В различных вариантах реализации настоящего изобретения каждый контактный источник тепла может быть выполнен с возможностью нагрева выделенного места со средним диаметром в двух размерностях, составляющим от приблизительно 1 миллиметра (мм) до приблизительно к 15 мм (обычно от приблизительно 1 мм до приблизительно 10 мм), или выделенного места с площадью поверхности, составляющей от приблизительно 1 мм² до приблизительно 225 мм² (в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения от приблизительно 1 мм² до приблизительно 100² мм, или в некоторых других вариантах реализации настоящего изобретения от приблизительно 5 мм² до приблизительно 50 мм²).

[0080] Подложка 600 нагревателя может быть выполнена в форме «дорожек» 1605а, b, параллельных структуре дорожек 1706а-с картриджа 200. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения подложка 600 нагревателя может содержать 24 дорожки 1605а, 1605b нагревателя, соответствующие дорожкам 1706 образца в картридже 200. При размещении микрожидкостного картриджа 200 в отсеке 524 с выточкой приемного лотка 520а, b компоненты картриджа 200 могут быть выровнены рядом с соответствующими нагревателями в подложке 600 нагревателя или поверх их. При размещении микрожидкостного картриджа 200 в отсеке 524 с выточкой нагреватели могут иметь физический контакт с соответствующими компонентами. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения нагреватели имеют тепловое соединение со своими соответствующими компонентами, например, посредством одного или множества промежуточных слоев или материалов, не имея при этом прямого физического контакта. Дальнейшее описание дорожек может быть найдено например, в публикации заявки на патент США №2009-0130719, включенной в настоящую заявку посредством ссылки.

[0081] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения множество нагревателей могут быть выполнены с возможностью одновременной и равномерной активации для выполнения нагрева соответствующих им примыкающих компонентов картриджа микрожидкостной сети в микрожидкостном картридже 200. Каждый нагреватель способен быть независимо управляем процессором и/или схемой управления, используемыми совместно с описанным здесь устройством. Обычно управление нагревом микрожидкостных компонентов (затворов, клапанов, камер и т.д.) в микрожидкостном картридже 200 происходит посредством пропускания электрических токов через имеющие соответствующую конфигурацию и выполненные средствами микротехнологии нагреватели. Под управлением соответствующей электрической схемы дорожки 1706 многодорожечного картриджа способны затем быть нагреты независимо и, таким образом, быть управляемы независимо друг от друга. Кроме того, как описано более подробно ниже, индивидуальные нагреватели 1601-1604 могут быть нагреты независимо и, таким образом, быть управляемы независимо друг от друга. Это может привести к увеличенным энергетической эффективности и степени управляемости устройства, поскольку нагрев не всех нагревателей происходит одновременно, и данный нагреватель получает ток только в течение того промежутка времени, когда нагрев необходим.

[0082] Подложка 600 нагревателя может также содержать один или множество датчиков теплоты. Для уменьшения количества датчиков или нагревателей, необходимых для управления нагревателями в дорожках 1605а, 1605b нагревателей, нагреватели могут быть использованы для определения температуры, а также количества теплоты, и, таким образом, может быть устранена потребность в отдельном специализированном датчике для каждого нагревателя. Например, имеет место изменение импеданса и/или сопротивления некоторых материалов с температурой окружающей среды. В соответствии с этим значение сопротивления нагревателей/датчиков 1601-1604 может быть использовано в качестве показания температуры при отсутствии активного нагрева датчиков.

[0083] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения нагреватели в подложке 600 нагревателя могут быть выполнены с достаточной мощностью, что обеспечивает возможность последовательной или параллельной группировки нагревателей для уменьшения количества управляемых с помощью электроники элементов, уменьшая, таким образом, нагрузку на соответствующую электронную схему. Сгруппированные таким образом нагреватели будут работать под синхронизированным и по существу одновременным управлением.

[0084] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения нагреватели реакционных камер, размещенные на противоположных сторонах нагревателей второй ступени, могут быть сгруппированы и выполнены с возможностью работы под синхронизированным управлением. Например, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения нагреватели 1601-1602, предназначенные для амплификации посредством полимеразной цепной реакции, могут быть сгруппированы и выполнены с возможностью работы под синхронизированным управлением. Альтернативные группировки и конфигурации могут быть применены к другим группам нагревателей в отношении нагревателей 1601-1604, выполненных с возможностью амплификации посредством полимеразной цепной реакции. Нагреватели 1601-1604, предназначенные для амплификации посредством полимеразной цепной реакции, могут быть выполнены с возможностью индивидуальной и независимой работы или они могут быть выполнены с возможностью работы в группах по два (в виде пары), три, четыре, пять или шесть нагревателей.

[0085] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения управление нагревом может быть реализовано посредством периодического включения и выключения подачи тока к соответствующему нагревателю с переменной широтно-импульсной модуляцией (широтно-модулированный сигнал), причем широтно-импульсная модуляция относится к отношению (время во включенном состоянии)/(время в выключенном состоянии) для тока. Ток может быть подан посредством присоединения выполненного средствами микротехнологии нагревателя к источнику высокого напряжения (например, 30 В), который может быть заперт широтно-модулированным сигналом. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения устройство способно содержать 48 генераторов широтно-модулированного сигнала. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения выполнено два генератора широтно-модулированного сигнала, связанных с каждой реакционной камерой. Работа генератора широтно-модулированного сигнала может включать выработку сигнала с выбранным, программируемым периодом (конечным отсчетом) и шагом. Например, сигнал может быть с периодом 4000 мкс и шагом 1 мкс, причем при этом генератор PWTVI может поддерживать счетчик, начинающий показания с нуля и увеличивающий показание с шагом 1 мкс, вплоть до достижения значения 4000 мкс с последующим сбросом на нуль. Таким образом, произведенное количество тепла может быть отрегулировано посредством введения поправки на значение конечного отсчета. Высокое значение конечного отсчета соответствует большему отрезку времени, в течение которого выполненный средствами микротехнологии нагреватель получает ток, и, таким образом, большему количеству произведенного тепла.

[0086] В различных вариантах реализации настоящего изобретения работа генератора широтно-модулированного сигнала может также включать программируемое значение начального отсчета в дополнение к вышеупомянутым значениям конечного отсчета и шага. В таких вариантах реализации настоящего изобретения множество генераторов широтно-модулированного сигнала могут вырабатывать сигналы, которые могут быть селективно не перекрыты (например, посредством мультиплексирования времени во включенном состоянии различных нагревателей) таким образом, что не превышена токовая нагрузка мощности высокого напряжения.

[0087] Множество нагревателей могут быть управляемы посредством различных генераторов широтно-модулированного сигнала с переменными значениями начального и конечного отсчетов. Нагреватели могут быть разделены на батареи, причем батарея определяет группу нагревателей с одинаковым начальным отсчетом. Управление нагревательными элементами и охлаждающими элементами, если они присутствуют, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения обсуждено ниже с дополнительными подробностями.

Оптический модуль

[0088] На фиг. 4А-С показан нагревательный / оптический модуль 500 из устройства 10 обнаружения, выполненный в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения. Нагревательный/оптический модуль 500 может содержать оптический модуль 502 и приемный лоток 520 или часть приемного лотка. На фиг. 4А показан один вариант реализации заключенного в кожух оптического модуля 502, содержащего двигатель 504, внешним образом прикрепленный к нему для выполнения перемещения головки 700 обнаружителя. Головка 700 обнаружителя может быть размещена внутри оптического модуля 502. На фиг. 4А показан приемный лоток 520, связанный с донной стороной 506 оптического модуля 502. Приемный лоток 520, выполнен с возможностью приема картриджа 200, содержащего образцы, на которые должно быть выполнено обнаружение. После получения образцов приемный лоток 520 может быть перемещен (например, посредством механического устройства или вручную) по направляющим 522 в положение под оптическим модулем 502. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, описанных более подробно ниже, приемный лоток может содержать автозагрузочное устройство, автоматически ориентирующее картридж, уже установленный ниже оптического модуля 502. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения отсек 524 с выточкой из приемного лотка 520 может содержать подложку 600 нагревателя. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приемный лоток может затем быть поднят для установки картриджа в контакте с оптическим модулем 502, например, в контакте с пластиной 540 с апертурными отверстиями в основании оптического модуля 502.

[0089] На фиг. 4В показан вариант реализации оптического модуля 502 с передней панелью 508, удаленной для демонстрации внутренних элементов оптического модуля 502. На фиг. 4В показана головка 700 обнаружителя. Как подробно описано ниже, перемещение головки 700 обнаружителя может быть направляемо двигателем 504 с целью бокового перемещения через внутреннюю часть оптического модуля 502 для обеспечения оптического сканирования и обнаружения на картридже 200 при размещении картриджа 200 ниже оптического модуля 502 в приемном лотке 520. На фиг. 4В показана апертурная пластина 540, установленная на нижней стороне 506 оптического модуля 502.

[0090] На фиг. 4С показан вид снизу оптического модуля 502. На фиг. 4С показана апертурная пластина 540 и пластина 546 нормализатора, прикрепленная к дну 506 оптического модуля 502. Пластина нормализатора может быть использована для калибровки пар (источник света - фотоприемник) головки обнаружителя. Пластина 546 нормализатора предпочтительно содержит один компонент или множество компонентов, имеющих известные стандартизированные оптические характеристики, и выполнена с возможностью калибровки, стандартизации или подтверждения правильной работы головки 700 обнаружителя и соответствующей электрической схемы. Пластина 546 нормализатора может быть вытянута в оптический модуль, а головка 700 обнаружителя может быть размещена над пластиной нормализатора. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения перед началом оптических измерений в картридже происходит калибровка головки 700 обнаружителя посредством использования известных свойств пластины 546 нормализатора. При неправильной работе головки 700 обнаружителя могут быть предприняты корректирующие действия, например, введение поправки в измерения или уведомление пользователя об ошибке. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения пластина нормализатора может быть выполнена из оптически прозрачного материала, например, поликарбоната, смешанного с сильно флуоресцирующим красителем или другим стандартизированным хромофором или флуорофором. В одном варианте реализации настоящего изобретения пластина нормализатора содержит стандартизированный хромофор или флуорофор для каждого канала или цвета в головке 700 обнаружителя.

[0091] Как показано на фиг. 4С, апертурная пластина 540 содержит апертурные отверстия 557. Размеры апертурных отверстий 557 таковы, чтобы источники света обнаружителя и фотоприемники имели доступ (посредством оптического возбуждения или рассмотрения) к содержимому реакционных камер картриджа 200 при перемещении обнаружителя по нескольким положениям внутри оптического модуля 502. То есть, при размещении обнаружительной пары (источник света/ фотоприемник) в положении над определенным апертурным отверстием, свет может проходить из источника света и достигать состоящего из камер реактора через апертурное отверстие 557. Флуоресцирующие реактивы в реакционной камере могут затем быть видимы фотоприемником через апертурное отверстие 557.

Головка обнаружителя

[0092] На фиг. 5 показано поперечное сечение головки 700 обнаружителя, проведенное вдоль линии 13 по фиг. 4В. Головка 700 обнаружителя может быть выполнена с возможностью оптического возбуждения и/или слежения за флуоресценцией, испущенной в связи с обнаружением одного или множество полинуклеотидов, присутствующих в реакционных камерах 1703. Отметим, что положительный результат (наличие целевых ампликонов) может быть указан увеличенной флуоресценцией или уменьшенной флуоресценцией, в зависимости от способа анализа. Например, при наличии в пробе флуорофора и гасителя флуоресценции, гаситель флуоресценции способен погасить флуоресценцию при наличии мишени, или в других конструкциях пробы при отсутствии мишени. Устройство может содержать, например, множество обнаружительных пар, например 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или больше пар, таких как обнаружительная пара 726. Каждая обнаружительная пара 726 может содержать источник 726а света, например, светодиод и соответствующий обнаружитель 726b света, например, фотодиод. Источник 726а света способен селективно излучать свет в полосе поглощения флуоресцентной пробы. Обнаружитель 726b света способен селективно обнаруживать свет в полосе излучения флуоресцентной пробы, причем флуоресцентная проба соответствует полинуклеотидной пробе или ее фрагменту. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения источник 726а света может содержать диод, отфильтрованный в соответствии с полосой пропускания и селективно излучающий свет в полосе поглощения флуоресцентной пробы. Обнаружитель 726b света может содержать фотодиод, отфильтрованный в соответствии с полосой пропускания и селективно обнаруживающий свет в полосе излучения флуоресцентной составляющей, например, испускание от флуоресцентной пробы. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения фильтр 726а1, например, полосовой фильтр, может быть поставлен на пути света от источника 726а света. Свет от источника 726а света проходит через фильтр перед прохождением через образец в микрожидкостном канале (глубиной 300g в некоторых вариантах реализации). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения оптическая длина пути для света от реакционной камеры до обнаружителя 726b света может быть очень малой. Падающий свет от источника 726а света вырабатывает флуоресценцию в реакционной камере. Свет от реакционной камеры затем идет к приемнику 726b света. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предприняты меры для предотвращения попадания любого нежелательного света в обнаружитель и отрицательного воздействия, тем самым, на световой сигнал от реакционной камеры.

[0093] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждая пара из множества обнаружительных пар может быть ориентирована вдоль головки 700 обнаружителя в виде рядов. Таким образом, позади пар 726 и 727, показанных на фиг. 5, может быть размещен другой столбец пар с подобной или той же самой ориентацией. Для точности интерпретации набор картриджей или обнаружительных пар вдоль длины картриджа назван «рядом», а вдоль ширины картриджа «столбцом». Таким образом, вертикальное направление на фиг. 3А и 6 определяет «столбец», а горизонтальное направление определяет «ряд». В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения имеет место шесть или больше столбцов таких обнаружительных пар. В этих вариантах реализации настоящего изобретения было бы всего 12 обнаружительных пар (два ряда по шесть пар) с двумя обнаружительными парами на столбец, что обеспечивает возможность проведения 12 отдельных и одновременных операций обнаружения.

[0094] Каждый источник света, например, источник света 726а, может быть выполнен с возможностью излучения света с длиной волны, соответствующей определенной флуоресцентной составляющей, связанной, например, с пробой, содержащейся в реакционных камерах. Каждый обнаружитель света, например, обнаружитель 726b, может быть выполнен с возможностью обнаруживать свет, излучаемый флуоресцентными зондами, связанными со светом, образованным излучателем света в обнаружительной паре. Обнаружительные пары могут быть выполнены с возможностью независимого обнаружения множества флуоресцентных составляющих, например, различных флуоресцентных зондов, имеющих различные флуоресцентные спектры испускания, причем в каждой реакционной камере испускание от каждой флуоресцентной пробы указывает на наличие или отсутствие одного определенного целевого полинуклеотида или его фрагмента. Хотя могут быть использованы и петлеобразные световые пути, в одном варианте реализации использована пара из обнаружителя и излучателя, в которой каждый элемент пары имеет непосредственный оптический контакт с реакционной камерой, предпочтительно одновременно при таком контакте. При необходимости обнаружитель и излучатель пары ориентированы относительно реакционной камеры вдоль линий, по существу пересекающихся под острым углом в реакционной камере. Этот угол может, например, составлять приблизительно от 5 до 70 градусов, предпочтительно приблизительно от 8 до 60 градусов, и более предпочтительно приблизительно от 10 до 50 градусов.

[0095] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения головка обнаружителя содержит два ряда пар из фотоприемников с источниками света, соответствующих двум рядам реакционных камер микрожидкостных картриджей при их наличии в устройстве. Например, головка обнаружителя может содержать первый или верхний ряд из шести пар фотоприемников с источниками света, и второй или нижний ряд из пар фотоприемников с источниками света, выполненных с возможностью опроса первого и второго рядов реакционных камер внутри микрожидкостного картриджа, соответственно.

[0096] На фиг. 6 показано одно возможное расположение фотоприемников с источниками света, осуществленное в некоторых вариантах реализации обнаружителя. Первый столбец содержит излучатели 201а, 201b света на основе красителя ROX и соответствующие обнаружители 207а, 207b. Второй столбец содержит излучатели 201с, 201d света на основе красителя HRM и соответствующие обнаружители 207с, 207d. Третий столбец содержит излучатели 20le, 20If света на основе красителя CY5 и соответствующие обнаружители 207е, 207f. Четвертый столбец содержит излучатели 20lg, 20lh света на основе красителя FAM и соответствующие обнаружители 207g, 207h. Пятый столбец содержит излучатели 201i, 20lj света на основе красителя Q705 и соответствующие обнаружители 207i, 207j. Шестой столбец содержит излучатели 201k, 201l света на основе красителя VIC и соответствующие обнаружители 207k, 2071. В некоторых случаях обнаружители и излучатели выбраны с учетом конкретных флуорофоров, выполненных с возможностью их использования при анализе. В варианте реализации настоящего изобретения, показанном на фиг. 6, пары обнаружителей с источниками света из первого или верхнего ряда представляют собой множество пар фотоприемников с источниками света, например, излучателей 201а, 201с, 20le, 20lg, 20li и 201k и обнаружителей 207а, 207с, 207е, 207g, 207i и 207k. Пары обнаружителей с источниками света из второго или нижнего ряда представляют собой множество пар фотоприемников с источниками света, например, излучателей 201b, 201d, 201f, 201h, 201j и 201l и обнаружителей 207b, 207d, 207f, 207h, 207j и 207l. Сводка свойств взятых в качестве примера излучателей и обнаружителей показана в Таблице 1 ниже.

[0097] Взятая в качестве примера конфигурация фотоприемников и источников света по фиг. 6 способна подавлять взаимные помехи между столбцами обнаружения. Таким образом, диапазон длин волн для каждой пары (излучатель-обнаружитель) может быть выбран таким образом, чтобы обеспечить минимальное перекрытие с соседними парами (излучатель-обнаружитель). Таким образом, например, в том случае, когда СТ# относится к столбцу определенной пары (излучатель-обнаружитель) в головке обнаружителя с 6 столбцами, Ех равно длине волны возбуждения флуорофора, и Em равно излучаемой длине волны, очевидно, что смежные эмиссионные длины волн не смежны друг другу в головке обнаружителя. То, что в строке для HRM в качестве красителя указано «отсутствует», просто означает, что может быть использован ряд красителей, не требуемых для этого специфического примера. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения HRM означает технологию «Расплава с высоким разрешением», и соответствующий источник света для этого фотоприемника может содержать светодиод, излучающий в ультрафиолетовой области спектра. Очевидно, что столбцы могут быть размещены в альтернативных вариантах и что показанные светоизлучающие источники и обнаружители могут быть заменены на альтернативные светоизлучающие источники и обнаружители.

[0098] Показанные в каждой колонке пары излучателя света и фотоприемника могут быть откалиброваны посредством пластины нормализатора. После калибровки, головка обнаружителя может быть перемещена в такое положение, что первый столбец пар излучателя света и фотоприемника размещен над первой группой дорожек таким образом, что каждая пара излучателей света и фотоприемников имеет доступ к реакционной камере дорожек. Затем посредством первого столбца (излучателей/обнаружителей) будет выполнено обнаружение реакционных камер в первой группе дорожек. Затем головка обнаружителя может быть перемещена во второе положение таким образом, что первый столбец размещен над второй группой дорожек, а второй столбец размещен над первой группой дорожек. Обнаружение реакционных камер во второй группе дорожек будет затем выполнено посредством первого столбца (излучателей/обнаружителей), а обнаружение реакционных камер в первой группе дорожек будет затем выполнено посредством второго столбца (излучателей/обнаружителей). Эта последовательность операций может быть продолжена, пока каждый столбец не пройдет над каждой дорожкой. Таким образом, для N столбцов обнаружителей и М столбцов камер обнаружитель выполнит обнаружение по меньшей мере в М+N-1 положениях. Например, в вариантах реализации настоящего изобретения по фиг. 11 имеет место 6 столбцов. Для картриджа с 12 дорожками обнаружитель должен будет совершать перемещение между по меньшей мере 17 положениями (между 18 положениями, если включено и положение для градуировки).

[0099] На фиг. 7 показаны окончательные результаты после работы в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения. Отображены зависимости от времени обнаруженных уровней флуоресценции для каждой пары 801-805 (излучатель света - фотоприемник) для одной реакционной камеры (или реактора), связанной с единственной дорожкой. После достаточного числа итераций (приблизительно 30 в этом примере) по протоколу отжига и денатурирования обнаружители идентифицируют увеличивающиеся уровни флуоресценции внутри реактора.

Обшивка камеры

[0100] Некоторые из настоящих вариантов реализации настоящего изобретения относятся к обшивке, окружающей и включающей слой камер. В частности, в некоторых вариантах реализации рассмотрено выполнение апертурного слоя, характеристики которого весьма содействуют получению надежных результатов в ходе проведения испытаний модуля нагревания/обнаружения, как обсуждено в подробностях ниже.

[0101] На фиг. 8 показана конфигурация обшивки, имеющая место в некоторых вариантах реализации оптического модуля сканирующего термоциклера и связанного с ним приемного лотка и картриджа. При размещении картриджа в непосредственной близости от апертурного слоя 540 оптического модуля 500а, тепловой слой 600, слой камер 200 (который может содержать подложку камеры) и апертурный слой 540 могут быть размещены так, как показано в варианте реализации по фиг. 8. Как сказано выше, слой 200 камер может содержать множество реакционных камер 1703a-d, которые могут быть размещены с возможностью термического управления отдельно от друг друга или в группах. Тепловой слой 600 может содержать множество тепловых блоков 1605а, 1605b, 1605с. Фиг. 8 представляет собой упрощенную, абстрактную диаграмму вышеупомянутого описания, на которой не показаны некоторые особенности микрожидкостного пути. В некоторых вариантах реализации тепловые блоки могут быть и механически и термически изолированы друг от друга (что отображено их физическим разделением на фиг. 4). Однако, в других вариантах реализации каждый из тепловых блоков может быть размещен внутри одного и того же материала подложки, но промежутки между ними такие, что они остаются термически изолированными, как обсуждено выше. Таким образом, для тепловых блоков обеспечена возможность термической изоляции при отсутствии механического разделения.

[0102] Таким образом, каждый тепловой блок может быть связан с одной или несколькими реакционными камерами 1703a-d, независимо от остальных реакционных камер. В соответствии с протоколом, определенным для каждой реакционной камеры, тепловые блоки могут последовательно нагревать и/или охлаждать свою соответствующую камеру нужным образом. Например, тепловой блок 1605с может охлаждать и/или нагревать камеру 1703а таким образом, что температура камеры 1703а по существу независима от состояния охлаждения и теплового состояния камеры 1703а. Хотя нагрев может быть выполнен посредством прохождения электрического тока через микрожидкостную или электронную схему, охлаждение может быть «пассивным» в том смысле, что только конвекция между микрожидкостной камерой и использована для уменьшения температуры камеры. Управление тепловыми блоками 1605а, 1605b, 1605с может быть выполнено посредством устройства управления с обратной связью.

[0103] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения апертурная пластина 540 может быть размещена над слоем 200 камер и может оказывать давление на слой 200 камер, содействуя нагреву и охлаждению микрожидкостного картриджа, например, слоя камер посредством теплового слоя 600. Апертурная пластина может иметь множество апертурных отверстий 557a-d, содействующих наблюдению за отдельными реакционными камерами 1703a-d посредством каждого фотоприемника 726b. В отсутствие апертурной пластины 540 и в зависимости от конфигурации теплового слоя 600 и слоя 200 камер, слой 200 камер может быть подвергнут «короблению» и/или быть достаточно гибким, чтобы тепловая связь между камерами и соответствующими тепловыми блоками была неустойчивой. Неустойчивые нагрев и охлаждение могут привести к менее точному выполнению протоколов и менее точным и надежным результатам. Как описано выше, значительное коробление может ограничить боковое перемещение оптической головки. Таким образом, толщина апертурной пластины должна быть выбрана соответствующей, чтобы содействовать правильному пути света между каждой реакционной камерой, источниками света и фотоприемниками, тем не менее, гарантируя правильный нагрев и охлаждение слоя камер. При слишком толстом апертурном слое расстояние от фотоприемника 726b до камеры может быть слишком большим, что нежелательным образом уменьшает уровень флуоресценции от реакционной камеры. В дополнение к увеличению расстояния до реакционной камеры слишком толстый или слишком тяжелый апертурный слой 540 будет оказывать слишком большое давление на реакционную камеру, приводя к слишком большой конвекции. Наоборот, при слишком тонком апертурном слое 540 он, возможно, не может предотвратить искривления и коробления слоя 200 камер, причем сам апертурный слой 540 может быть подвергнут искривлению и короблению. Коробление апертурных отверстий 557a-d или камер 1703a-d может отклонять свет от источника 726а света и мешать точному отсчету фотоприемником 726b.

[0104] В соответствии с этим в описанных здесь вариантах реализации настоящего изобретения предусмотрены апертурные слои, успешно избегающие описанных выше недостатков. В некоторых вариантах реализации апертурный слой 540 выполнен, по меньшей мере частично, из стали. В этих вариантах реализации сталь обеспечивает адекватные прочность, плотность и сопротивление прогибу, необходимые для работы. Кроме того, сталь обеспечивает низкий уровень самофлуоресценции и поэтому мала вероятность ее отрицательного воздействия на показание фотоприемника 726b. Сталь также может быть подвергнута электрохимической обработке для подавления ее самофлуоресценции и таким образом мала вероятность ее отрицательного воздействия на показание фотоприемника. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения апертурной слой вместо этого выполнен из черного никеля (Ni), то есть, из Ni с красящим веществом, добавленным к нему для уменьшения самофлуоресценции. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения рассмотрены комбинации этих различных материалов и способов электрохимической обработки. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения апертурный слой 540 выполнен из алюминия и при закреплении примыкающими поддерживающими панелями 500, 506, и 546 обеспечивает адекватную прочность. Алюминий может быть нанесен электрохимически с анодной окисной отделкой, например, с черным красящим веществом, добавляемым для уменьшения самофлуоресценции.

[0105] Оптико-осветительное устройство может быть разработано так, что возбуждающий свет, падающий на реакционную камеру или реактор, падает вдоль области, подобной форме реактора. Поскольку реактор может быть длинным и узким, пятно освещения также может быть длинным и узким, то есть, также расширенным. Таким образом, форма апертурных отверстий 557a-d может быть разработана с учетом и размеров размещенной снизу реакционной камеры и взаимных положений соответствующих излучателя света и фотоприемника. Длина пятна может быть отрегулирована посредством изменения множества параметров, включая: диаметр отверстия, где размещен фотоприемник 726b (трубка, удерживающая фильтр и линзу, может иметь диафрагмирующий эффект); расстояние от фотоприемника 726b до реактора полимеразной цепной реакции; и использование соответствующих линз в фотоприемнике 726b.

Силовой элемент

[0106] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приемный лоток 520 устанавливает слой 200 камер в непосредственной близости к тепловому слою 600 или апертурному слою 540, но не выполняет механического соединения и/или тем самым не размещает слои в контакте друг с другом. Таким образом, слой 200 камер может быть термически, но не механически соединен с тепловым слоем 600. В других вариантах реализации приемный лоток устанавливает и механический и тепловой контакт теплового слоя 600 со слоем 200 камер, а также механический контакт слоя камер с апертурным слоем 540. В различных вариантах реализации настоящего изобретения устройство может содержать один или множество силовых элементов (не показаны), выполненных с возможностью оказания давления на приемный лоток 520 для выполнения тепловой связи источников тепла с микрожидкостным картриджем 200, размещенным в приемном лотке 520. Приложение давления может быть важно для обеспечения надежного теплового контакта между подложкой нагревателя и реакционными камерами, затворами, клапанами и т.д. в микрожидкостном картридже 200. При нахождении приемного лотка 520 в закрытом положении, то есть размещенным под апертурной пластиной 540 оптического модуля 502, силовой элемент, например, блок двигателя, размещенный ниже приемного лотка 520, может начать перемещение вверх к оптическому модулю 502, перемещая, тем самым, приемный лоток 520 ближе к оптическому модулю 502. При перемещении приемного лотка 520 вверх к оптическому модулю 502, картридж 200 может начать контактировать с нижней поверхностью апертурной пластины 540. Картридж 200 может продолжить движение вверх, пока достаточное давление не будет оказано на картридж 200. Как обсуждено выше, апертурная пластина 540 способна оказывать одинаковое давление во всех точках сверху картриджа 200 и, таким образом, прижимать картридж 200 к подложке 600 нагревателя посредством однородного давления. Как уже указано, могут быть выбраны характеристики апертурного слоя, способствующие проведению этой операции. Например, выбор материала апертурной пластины 540 может обеспечить очень небольшой изгиб картриджа 200 при его прижатии.

[0107] Приложение однородного давления со стороны картриджа 200 к подложке 600 нагревателя обеспечивает возможность однородного нагрева для каждого из компонентов картриджа при необходимости. Хотя между нагревателями в подложке 600 нагревателя и компонентами (клапаны, затворы, камеры и т.д.) микрожидкостных сетей в картридже 200 могут быть реализованы однородные давление и контакт, нагреватели, как это обсуждено выше, не обязательно должны быть активизированы одновременно. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приложение однородного давления не обязательно приводит к одинаковому нагреву различных компонентов картриджа 200. В некоторых вариантах реализации и активация определенного нагревателя в подложке 600 нагревателя и давление, прилагаемое апертурной пластиной 540 к картриджу 200, активизируют определенный компонент картриджа 200.

[0108] На фиг. 9А-Н показаны масштабные чертежи, относящиеся к одному возможному варианту реализации апертурной пластины. В этом варианте реализации посредством химической обработки может быть нанесено покрытие, предназначенное для регулирования отражающих свойств апертурного слоя. Могут быть выбраны некоторые части 9002, не предназначенные для нанесения покрытия посредством химической обработки. Покрытие может быть нанесено на поверхность пластины 540 или осаждено повсюду по ее материалу. В некоторых вариантах реализации материал пластины 540 может представлять собой сталь. В других вариантах реализации пластина 540 может быть выполнена из алюминия. В некоторых других вариантах реализации пластина 540 может быть выполнена из никеля. В некоторых других вариантах реализации материал пластины может представлять собой комбинацию двух или множества материалов, включая, например, алюминий, никель или сталь.

[0109] В варианте реализации настоящего изобретения по фиг. 9А-Н размеры пластины были выбраны так, чтобы удовлетворять обсужденным выше ограничениям относительно прилагаемого к камере давления и оптического пути к обнаружительным парам. Толщина материала пластины 540 сначала равна 0,3125 дюймов с последующим уменьшением до желаемой толщины посредством машинной обработки. Как указано выше, большая часть пластины имеет толщину, приблизительно равную 0,25 дюйма (6,4 мм). Однако эта толщина способна к изменению, например, толщина над апертурными отверстиями 557 может составлять 0,19 дюйма (4,8 мм). Как указано выше, такая толщина над апертурным отверстием содействует беспрепятственному прохождению оптического пути между фотоприемником и источником света к содержимому реакционной камеры.

[0110] В целом размеры апертурной пластины 540 выбраны таким образом, что в комбинации со свойствами материалов, из которых выполнена апертурная пластина 540, пластина 540 обеспечивает достаточное давление, прилагаемое к пластине нижележащей камеры, для содействия соответствующему нагреву и охлаждению, а также обеспечения достаточной жесткости, препятствующей короблению или деформации пластины камеры. Такая деформация может привести к блокировке источника света и оптического пути от фотоприемника к реакционной камере. Кроме того, размеры пластины не должны приводить к неблагоприятному расстоянию от реакционной камеры слоя камер до пары (источник света- фотоприемник) через апертурные отверстия 557. Аналогично, размеры апертурной пластины 540 не должны блокировать оптический путь от пары (источник света-фотоприемник) до содержимого реактора камеры.

[0111] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения пластина 546 нормализатора может быть присоединена к апертурной пластине посредством вставления винтов в положениях 9001 или посредством других средств крепления через апертурное отверстие. В других вариантах реализации эти позиции могут содействовать проведению методик более широкой калибровки через эти апертурные отверстия над пластинами нормализатора, чем при использовании остальных апертурных отверстий.

[0112] На фиг. 10 приведены различные размеры на видах апертурной пластины по фиг. 9А-Н. Как обсуждено выше, в этом варианте реализации покрытие, наносимое химической обработкой, может быть сначала нанесено для предотвращения окисления основных материалов, например, алюминия, никеля или стали, также обеспечивая усиленное электрическое заземление для правильной работы электроники. Только на те поверхности, которые могут быть подвергнуты воздействию оптической операции, затем селективно нанесено покрытие посредством черного анодирования.

Согласованность диагностического анализа

[0113] В некоторых из настоящих вариантов реализации изобретения рассмотрены способы, гарантирующие проведение согласованных диагностических анализов посредством проведения испытаний на одном и том же нагревателе/обнаружителье и на различных нагревателях/обнаружителях. В частности, рассмотрены варианты реализации устройства и последовательности операций, предназначенные для определения продолжительности и поправок для множества протоколов полимеразной цепной реакции, то есть, для синхронизации обнаружения между ними. Дополнительно, были обсуждены способы корректировки времени охлаждения реактора для гарантии получения более согласованных результатов.

[0114] На фиг. 11 показан профиль температуры для реакционной камеры, работающей по определенному протоколу 2000. Как показано выше, работающее устройство может содержать много различных протоколов со многими различными продолжительностями, работающих одновременно в различных реакционных камерах. Протокол 2000 содержит множество идентичных циклов нагрева/охлаждения, причем каждый цикл содержит горизонтальный участок денатурирования 2000В и горизонтальный участок 2000D отжига, на которых значение температуры постоянно в течение некоторого времени. Этим циклам может предшествовать апериодический цикл протокола, например, инкубационный период. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения протокол может быть определен как набор значений температур и временных промежутков. Таким образом, протокол может первоначально определить только, что камера должна быть удержана при температуре 95°C в течение времени В и затем удержана при температуре 61°C в течение времени D. Некоторые варианты реализации настоящего изобретения предполагают группировку этих сегментов в «этапы» и «подэтапы» для содействия пользователю и автоматизированного управления. Например, цикл нагрева и охлаждения 2000В и D может быть назван «этапом», а временной промежуток В с температурой 95°C и временной промежуток D с температурой 61°C могут быть названы «подэтапами». В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения пользователь может указать продолжительности подэтапов. В других вариантах реализации настоящего изобретения эти продолжительности могут быть извлечены из базы данных. Как правило, эти продолжительности установлены или на основании стандартного протокола или посредством ввода пользователем, иногда использующим известный «рецепт» температур и длительности горизонтального участка. В дополнение к этим подэтапам профиль температуры из протокола будет также содержать переходные участки, например, переходной участок 2000А с перепадом температур от 61°C до 95°C и переходной участок 2000С с перепадом температур от 95°C до 61°C. Продолжительность этих переходных участков может зависеть от материалов реакционной камеры и окружающей ее среды и от характера используемых нагревательных элементов.

[0115] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения тепловая траектория и для нагревания и для охлаждения может быть определена для всей реакции еще до начала работы. В некоторых устройствах имеет место контроль и коррекция зависимости температуры от времени в ходе реакции для минимизации переходных температур и учета изменений в эффективности различных нагревательных элементов. Другими словами, некоторые устройства используют устройства управления с обратной связью для управления целевой температурой, причем фактический контур зависимости температуры от времени может претерпевать изменение от цикла к циклу. Такие поправки могут приводить к различному суммарному времени реакции и, что более важно, к различной суммарной эффективности реакции. В соответствии с этим, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения описанные здесь устройства и способы преимущественно представляют собой устройства, в которых контур зависимости температуры от времени для всей реакции в каждой независимой реакционной камере (или в группе камер) заранее установлен до начала испытаний. Это не только выгодным образом обеспечивает возможность синхронизации многократных этапов обнаружения для множества различных реакторов, но при этом также обеспечивает возможность более строгого контроля параметров, что минимизирует различия в эффективности реакции, которые могут возникать в результате различных контуров зависимости температуры от времени. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения описанные здесь устройства и способы создают по окончании реакции отчет о погрешностях при отличии измеренной температуры от ожидаемого значения температуры по окончании испытаний.

[0116] В различных точках протокольного температурного профиля 2000 пользователь или рецепт могут указывать на проведение обнаружения. Например, в некоторых протоколах обнаружение может быть запрошено в конце сегмента 2000D. При произвольном указании на операции обнаружения в каждом протоколе, головка обнаружителя будет должна выполнять перемещение между положениями неэффективным образом и может даже счесть невозможным выполнение обнаружения в запрашиваемые моменты времени. Таким образом, в случае одновременной инициации каждого из множества протоколов и их параллельной одновременной реализации в каждой из реакционных камер в картридже, будет чрезвычайно неэффективным для обнаружителя удовлетворять требованиям на запрос обнаружения от каждого протокола. В частности, по завершении калибровки обнаружительу будет нужно сначала совершить перемещение к положениям, подходящим для выполнения обнаружения для каждой пары (источник света / обнаружитель) в его матрице для первого профиля. Однако ко времени окончания обнаружения каждый из остающихся протоколов будет входить в период, в котором обнаружение не может быть выполнено. Поэтому будет иметь место период «времени простоя», в ходе которого обнаружитель не способен выполнять операции обнаружения и должен вместо этого просто простаивать, ожидая возможности выполнения следующей операции обнаружения. Это «время простоя» неэффективно и неоправданно затягивает последовательность операций диагностирования. Кроме того, при необходимости проведения последовательных операций обнаружения «время простоя» способно приводить к нерегулярным и апериодическим операциям обнаружения одной и той же камеры, возможно, приводя к несогласованным показаниям.

[0117] В некоторых из вариантов реализации настоящего изобретения рассмотрена автоматизированная коррекция частей профиля 2000, предназначенная для содействия эффективному обнаружению с помощью множества протоколов. Это может быть достигнуто посредством разрешения пользователю редактировать (или устройству автоматически редактировать) длину сегмента 2000В или 2000D.

[0118] Следует иметь ввиду, что пока имеет место по меньшей мере минимальная продолжительность горизонтального участка, некоторое незначительное увеличение продолжительности горизонтального участка может быть обеспечено в большинстве протоколов амплификации. Эта гибкость применима ко всей эффективной приспособляемости различных выполняемых одновременно анализов, при выполнении в режиме реального времени управления амплификацией посредством считывания результатов для различных проб при использовании сканирующей головки обнаружителя.

[0119] При необходимости выполнения операции обнаружения в течение, например, сегмента 2000В, устройство или пользователь могут по мере необходимости увеличивать продолжительность сегмента 2000В для приспособления перемещения головки обнаружителя и координации считывания результатов для множества выполняемых одновременно анализов. Продолжительность сегментов 2000А и 2000С может быть вычислена при использовании заранее определенной стандартной скорости охлаждения на основании предыдущих температур и включена в анализ. Некоторые варианты реализации настоящего изобретения не позволяют пользователю редактировать эти сегменты, и они вместо этого учтены устройством внутренним образом.

[0120] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения определенные устройством поправки к протоколу могут быть по меньшей мере в трех различных формах. Первая поправка может представлять собой «внутрицикловую поправку», при которой горизонтальные участки, такие как 2000В и 2000D, протокола продлены таким образом, что весь цикл операции 2000A-D достигает желательной продолжительности, в некоторых случаях равной целому кратному от продолжительности цикла обнаружения. Эта поправка описана со ссылками на фиг. 13. По завершении введения внутрицикловой поправки устройство затем вводит «межцикловую поправку». Межцикловая поправка обеспечивает возможность выполнения событий обнаружения внутри каждого цикла из множества циклов с временными интервалами, отстоящими друг от друга на интервалы, целые кратные от желательной продолжительности (например, целые кратные от продолжительности цикла обнаружения). Это поправки обсуждены со ссылками на фиг. 14. Третья поправка может представлять собой «поправку на смещение запуска», которая может зависеть только от дорожки, используемой для выполнения протокола. Эти поправки обсуждены со ссылками на фиг. 15А-С.

Краткий обзор поправок к протоколу

[0121] На фиг. 12 показана блок-схема последовательности 4000 операций, используемой в некоторых раскрытых вариантах реализации настоящего изобретения для определения соответствующих времен обнаружения для обнаружителя и профилей протокола. Последовательность 4000 операций может быть осуществлена посредством программного обеспечения, технических средств или микропрограммной комбинации этих двух подходов. Например, последовательность операций может быть реализована в любой программируемой пользователем вентильной матрице, микроконтроллере или в программном обеспечении, выполняемом на процессоре компьютера. Части последовательности операций могут быть выполнены универсальным процессором, например, микроконтроллером, в то время как другие части могут быть выполнены специализированными техническими средствами, программным обеспечением или микропрограммными устройствами. Последовательность операций начинается на стадии 4001 с определения продолжительности цикла обнаружения (или использования заранее определенной продолжительности цикла обнаружения, например, уже занесенной в память) для устройства (стадия 4002). Продолжительность цикла обнаружения может представлять собой время, необходимое обнаружительу для перемещения в каждое из положений обнаружения (обнаружение с каждой из пар (излучатель/обнаружитель) в головке обнаружения в каждом из шести столбцов по фиг. 6), выполнения всех необходимых операций обнаружения и возврата в начальное положение. При необходимости может быть обеспечена возможность внесения пользователем или устройством поправок в процедуру обнаружения для изменения продолжительности цикла обнаружения. Например, пользователь может пожелать выполнять обнаружение при использовании только части обнаружителей. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения продолжительность цикла обнаружения составляет приблизительно 10 секунд при наличии шести столбцов обнаружительных пар и использовании всех шести столбцов.

[0122] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения в последовательности операций может быть сначала определено множество «внутрицикловых поправок» для одного или множества протоколов (стадия 4003). Как обсуждено ниже со ссылками на фиг. 13, продолжительность этапа или подэтапа может представлять собой время, необходимое для выполнения определенного этапа или подэтапа в пределах протокола. Время цикла может быть определено посредством комбинации спецификаций пользователя и определяемых устройством ограничений. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения устройство требует, чтобы время цикла было целым кратным от продолжительности цикла обнаружения. «Внутрицикловые поправки» могут быть введены для удовлетворения этому ограничению. Например, при продолжительности цикла обнаружения в 12,2 секунд, время цикла для выполнения этапа протокола могут быть равны 22,4, 33,6, 44,8 секунд, или иметь любую продолжительность типа N*12,2, где N равно целому число, большему нуля. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения это ограничение необходимо накладывать лишь при выполнении обнаружения внутри цикла.

[0123] Таким образом, внутрицикловые поправки гарантируют, что цикл протокола равен целому кратному от продолжительности цикла обнаружения. Однако обнаружение можно быть запрошено в любой точке внутри цикла. При продолжительности цикла обнаружения в 10 секунд самое раннее время для выполнения обнаружения отстоит на 10 секунд от момента инициации протокола. Затем операции обнаружения могут быть выполнены через промежутки времени, целые кратные циклу обнаружения (через 20, 30, 40 секунд и т.д.).

[0124] Таким образом, еще одна поправка, а именно «межцикловая поправка» (стадия 4004), может затем быть введена, чтобы гарантировать, что запрашиваемая операция обнаружения происходит в соответствующее время. Эти «межцикловые поправки» могут быть включены в протокол в качестве дополнительных задержек между этапами или подэтапами протокола. Другими словами, протокол полимеразной цепной реакции, однажды подвергнутый внутрицикловым поправкам, может содержать «правильные» стадии цикла. Протокол полимеразной цепной реакции может затем быть образован посредством соединения вместе каждого из этапов и добавления переходных участков от этапа к этапу. «Межцикловые поправки» (стадия 4004) обеспечивают возможность возникновения времен обнаружения при желательных целых кратных от продолжительности цикла обнаружения после того, как циклы были соединены вместе.

[0125] Например, для устройства с продолжительностью цикла обнаружения в 10 секунд протокол может содержать этап, имеющий свое первое обнаружение через 18 секунд после запуска цикла. Продолжительность цикла (продолжительность всего этапа) может составлять 30 секунд (возможно, после внесения внутрицикловой поправки). Таким образом, хотя время цикла в целом должным образом приведена в соответствие с 10-секундной продолжительностью цикла обнаружения (3×10=30 секунд), первое обнаружение само по себе не приведено должным образом в соответствие с обнаружением (18 секунд не кратно 10 секундам). Устройство добавит 2 секунды, представляющие собой «межцикловую поправку», к самому первому моменту обнаружения, так что первое обнаружение произойдет через 20 секунд после старта протокола. Это может быть выполнено посредством удержания окончательной температуры на предыдущем этапе в течение дополнительных 2 секунд посредством «поправки заполнения». В отсутствие предыдущего этапа устройство вставило бы 2-секундное удержание при температуре окружающей среды в начало первого прогона цикла. Таким образом, при начале работы устройства в момент времени ТО первая операция обнаружения произойдет в момент времени ТО+20 секунд, а вторая операция обнаружения произойдет в момент времени ТО+50 секунд и т.д.

[0126] Вследствие введения внутрицикловой и межцикловой поправок протокол теперь в такой форме, что операции обнаружения будут запрошены лишь в моменты времени, удобные для перемещения головки обнаружителя к реакционной камере, выполняющей протокол. При выполнении всех протоколов в реакционных камерах, размещенных в первом столбце картриджа (и при достаточном количестве обнаружителей, присутствующих в головке обнаружителя) одних лишь внутрицикловых и межцикловых поправок будет достаточно для модификации протокола должным образом с целью эффективного обнаружения (первый столбец здесь относится к столбцу дорожек, например, дорожек 1706а и 1706b с соответствующими камерами 1703а и 1703b на фиг. 3А). Однако, поскольку протоколы работают в разных столбцах картриджа, кроме того необходимо сместить инициирование протокола для компенсации задержки головки обнаружителя при достижении места расположения камеры.

[0127] Таким образом «поправки на смещение запуска» были добавлены к протоколу на основании места расположения камеры, в которой выполнен протокол. Эти «поправки на смещение запуска» (этап 4005) описаны более подробно со ссылками на фиг. 15А-С. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения эти поправки внесены во время выполнения и основаны исключительно на месте расположения дорожки выполнения. Например, никакие поправки не нужны для протокола, выполняемого в дорожках, размещенных в первом столбце камеры, поскольку протокол, выполняемый в камерах этих дорожек, будет иметь отложенное время старта, равное +0 секунд. Каждый последующий столбец дорожек получает задержку в 400 миллисекунд, определяемую его расстоянием от первого столбца, вследствие времени, необходимого для проведения операций обнаружения (две операции обнаружения по 100 миллисекундах каждая, выполняемые асинхронно в этом варианте реализации настоящего изобретения) и перемещения обнаружителя двигателем (200 миллисекунд). В этом примере с продолжительностью цикла обнаружения, равной 10 секунд, первая возможная операция обнаружения для каждого столбца дорожек такова: для столбца 1 его первая операция обнаружения происходит в момент времени 10 секунд, для столбца 2 его первая операция обнаружения происходит в момент времени 10,4 секунды, для столбца 3 его первая операция обнаружения происходит в момент времени 10,8 секунды и т.д. Ожидаемое упорядочение может быть достигнуто посредством задержки старта должным образом упорядоченного протокола на время, необходимое для определенной дорожки. Хотя в этом специфическом примере предположено, что протокол уже упорядочен (посредством поправок 4003 и 4004), специалист в данной области техники очевидно понимает, что другие варианты реализации могут определять смещения, предугадывая будущие поправки.

[0128] Хотя стадии описаны в порядке 4003, 4005 и 4004, специалисту понятно, что эти стадии могут быть организованы в любом другом подходящем порядке и у устройства нет никакой необходимости последовательного выполнения каждой стадии. Однако в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, например, в описанном выше варианте, необходимо внести межцикловые поправки после внесения внутрицикловых поправок, поскольку межцикловая поправка зависит от внутрицикловой модификации. Напротив, поправка на сдвиг запуска (стадия 4005), возможно, не зависит ни от какого предыдущего определения. Таким образом, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения поправку на сдвиг запуска (4005) необходимо определить только однажды в течение работы, тогда как внутрицикловые поправки (4003) и межцикловые поправки (4004) могут быть внесены для каждого этапа цикла в протоколы.

[0129] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, после установления должным образом протокольных времен последовательность операций выполнена с возможностью последующего инициирования протоколов (стадия 4006). В некоторых вариантах реализации процессор может просто поместить значения смещения в ячейку памяти для извлечения их оттуда отдельным специализированным компонентом устройства, который непосредственно инициирует каждый протокол.

Внутрицикловые поправки

[0130] «Внутрицикловые поправки» представляют собой поправки к значениям интервалов этапа или подэтапа, которые могут быть определены пользователем или получены из базы данных таким образом, чтобы продолжительность этапа в целом была равна целому кратному от заранее определенной продолжительности. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения (см. фиг. 13) пользователь имеет возможность определить некоторые особенности протокольного профиля, например, желательные времена для подэтапа протокола, используя интерфейс пользователя или графический интерфейс пользователя (GUI). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения устройство может затем подтвердить выбор пользователя. После вычисления длин сегмента для каждого из подэтапов программное обеспечение устройства подтвердит время цикла этапа и укажет на необходимость каких-либо поправок. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения «правильное» время цикла этапа представляет собой время цикла этапа, равную целому кратному от продолжительности цикла обнаружения. При неправильного времени цикла этапа пользователя попросят внести поправки для этого этапа (5003b). При отсутствии необходимости поправки пользователь может быть уведомлен, что этап выровнен должным образом (5003а).

[0131] В примере по фиг. 13 пользователю нужен инкубационный этап 5001, содержащий один подэтап продолжительностью 900 секунд. Пользователь запросил, чтобы этап 5001 был выполнен только один раз (5010) и поэтому содержал единственный цикл этапа. В этом примере цикл обнаружения составляет 10 секунд. Пользователь не указал, что какое-либо обнаружение должно быть выполнено и, соответственно, этап правильный, поскольку этот этап не требует поправки на положение головки обнаружителя. При отсутствии запроса на обнаружение устройство регистрирует запрошенные интервалы времени для будущих рассмотрений смещения, но не может налагать какие-либо ограничения, требующие, чтобы временной интервал был кратен времени обнаружения (хотя величина продолжительности может быть рассмотрена при определении последующей межцикловой поправки). Если, однако, в этом примере пользователь запросил обнаружение в течение этого этапа, этап все же правильный при отсутствии любых других задержек, поскольку 900 секунд кратно циклу обнаружения, составляющему 10 секунд. Так или иначе, в иллюстрируемом варианте реализации настоящего изобретения устройство определило, что входные данные для этого этапа правильные.

[0132] В примере, поясняемом на фиг. 13, этап 5002 с полимеразной цепной реакцией содержит два подэтапа, причем в первом подэтапе камера должна быть выдержана при температуре 95°C, а во втором подэтапе камера должна быть выдержана при температуре 61°C. Пользователь запросил выполнение 45 циклов на этом этапе 5011. Пользователь запросил продолжительность первого подэтапа в 2 секунды и продолжительность второго подэтапа в 10,2 секунд, что в общей сложности составляет 12,2 секунд. Как обсуждено выше со ссылками на фиг. 7, устройство способно также рассчитать время перехода от 95°C к 61°C и прибавить эту продолжительность к запросам пользователя. В этом примере нагрев от 61°C до 95°C занимает 4,25 секунд, а охлаждение от 95°C до 61°C занимает 7,05 секунд. Эти значения могут быть сохранены внутренним образом в памяти устройства или определены динамически на основании данных, введенных пользователем. Наконец, в некоторых вариантах реализации при запросе на проведение обнаружения в течение подэтапа 5004, как пользователь запросил здесь, устройство добавляет дополнительную задержку ко времени выдержки для этого подэтапа. В этом примере эта задержка составляет 2,2 секунды, что представляет собой минимальное время, необходимое для обеспечения возможности обнаружительу проводить перемещение и обнаружение с каждым из шести столбцов пар (излучатель света - фотоприемник) в головке обнаружителя. Таким образом, в этом примере каждое обнаружение цвета требует 200 миллисекунд времени экспозиции и 200 миллисекунд для перемещения двигателя между столбцами (5 переходов * 200 миллисекунд + 6 обнаружений * 200 миллисекунд = 2,2 секунды).

[0133] Таким образом, полная продолжительность этапа в целом составляет:

[0134] 4,25 (нагрев) + 2,0 (денатурирование) + 7,05 (охлаждение) + 10,2 (отжиг) + 2,2 (обнаружение) = 25,7 секунды.

[0135] Поскольку 25,7 секунды не кратно времени обнаружения в 10 секунд, необходимо введение поправки. Как указано в 5003b, устройство сообщает пользователю, что он может или удалить 5,7 секунды из продолжительности этапа или добавить дополнительные 4,3 секунды для достижения продолжительности, целой кратной продолжительности цикла обнаружения (то есть, продолжительности, целой кратной 10 секундам). Это «внутрицикловые поправки к этапу» будут включены в протокол после выбора пользователем.

[0136] Очевидно, что устройство способно учитывать ряд других факторов, не указанных в настоящем примере, предоставляя пользователю некоторый диапазон поправок. Например, дополнительные задержки, обусловленные перемещением двигателя или подготовкой к инкубации, могут быть учтены в проводимом устройством анализе.

Межцикловые поправки

[0137] Как упомянуто выше, «межцикловые поправки» представляют собой поправки к первому циклу подэтапа, предназначенные для создания задержки между этапами цикла. «Межцикловые поправки» могут зависеть от расчета времени предыдущих этапов и конечной температуры непосредственно предшествующей операции (при ее наличии). «Межцикловая поправка» 6005, определенная для достижения правильного времени обнаружения, будет описана со ссылками на фиг. 14.

[0138] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения поправка 6005 определена посредством определения сначала времени, необходимого для изменения температуры при нагреве или охлаждении от конца предыдущего этапа до температуры первого подэтапа в следующем этапе. При необходимости какого-либо дополнительного времени для упорядочения, температура начиная с конца предыдущего этапа может быть поддержана в течение этого времени. Пример упорядочения между температурой в конце этапа удержания температуры при 75°C и температурой первого подэтапа (95°C) показан на фиг. 14. Происходит подъем температуры со скоростью 8°C/сек от 75°C до 95°C (от точки 6001b до точки 6001с), причем остальное время, необходимое для упорядочения, затрачено на удержание температуры 75°C после конца предыдущего этапа (от точки 6001а до точки 6001b). Этот период может быть назван «межцикловой поправкой». Для достижения продолжения упорядочения обнаружения между этапами, может быть необходим сдвиг (или задержка) запуска цикла этапа после окончания предыдущего этапа посредством такой «межцикловой поправки». Затем может быть рассчитано время, необходимое для подъема или спада температуры от конца предыдущего этапа до температуры первого подэтапа следующего этапа. При необходимости какого-либо дополнительного времени для упорядочения, температура начиная с конца предыдущего этапа может быть поддержана в течение времени «межцикловой поправки». В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения устройство может принимать во внимание эти обстоятельства, получая вводимые пользователем данные через графический интерфейс 5000 пользователя и вводя их в предлагаемые графы 5003b.

Поправки смещения запуска

[0139] На фиг. 15А показаны начинающиеся циклы двух отдельных протокольных профилей 3001 и 3005. В каждый из этих протоколов, возможно, были внесены межцикловые и внутрицикловые поправки, но смещение запуска еще не было применено. В этом примере профиль 3001 включает этап со временем цикла в 30 секунд (интервал от момента времени 0 до момента времени 30). Момент 3020а обнаружения или запрос на проведение обнаружения имеет место через 30 секунд. Отметим, что в соответствии с обсужденными выше межцикловыми поправками небольшая задержка может быть включена в протокол 3001 как раз перед первым подъемом температуры для упорядочения первого обнаружения 3020а. Как обсуждено выше, межцикловые и внутрицикловые поправки облегчают проводить запросы на обнаружение в моменты времени, целые кратные от продолжительности цикла обнаружения. Здесь, при продолжительности цикла обнаружения в 10 секунд, запросы 3020а и 3020b происходят в моменты времени, целые кратные от 10 секунд, и составляющие 30 и 60 секунд.

[0140] Второй протокол включает профиль 3005, отличный от профиля 3001. Профиль 3005 содержит этап инициализации, длящийся от 0 до 30 секунд. В профиле 3005 затем следуют множество 50-секундных циклов с первым обнаружением в момент 40 секунд. Эти циклы представляют собой полимеразную цепную реакцию с тремя температурами, куда входят денатурация при высокой температуре, отжиг и обнаружение при низкой температуре и затем расширение при средней температуре. Как и раньше, первый цикл инициализации может содержать для упорядочения вначале небольшую межцикловую задержку. Пользователь должен иметь ввиду, что его межцикловая задержка может быть вставлена в ряде позиций в этапе инициализации для обеспечения упорядочения обнаружения.

[0141] На фиг. 15В показано множество вариантов этих двух протоколов по фиг. 15А. При наличии возможности одновременного выполнения операций обнаружения на всех дорожках во всех столбцах камер, профили, показанные на фиг. 15В, будут подходящими. Однако, вследствие временной задержки, необходимой головке обнаружителя для проведения сканирования по столбцу камер с каждым из его столбцов обнаружительных пар, необходимо сместить каждый из протоколов 3001-3007, основанных на месте расположения камеры, в которой они выполнены. Для простоты предположено, что каждый из протоколов 3001-3007 работает в соседнем столбце. При работе протокола 3001 в первом столбце камер протокол 3002 работает во втором столбце камер, протокол 3003 в третьем столбце камер, протокол 3004 в четвертом столбце камер и т.д.

[0142] На фиг. 15С показано выполнение протоколов 3001-3007 с «поправками смещения запуска» 3010-3015, введенными для обеспечения упорядочения обнаружения. Смещение запуска демонстрирует перемещение обнаружителя через дорожки картриджа и синхронизацию этого перемещения с операциями обнаружения, требуемыми каждым из протоколов выполнения. Таким образом, протокол 3001 будет запрашивать обнаружение, используя первый столбец головки обнаружителя по запросу 3020а. При перемещении головки обнаружителя для выравнивания второго столбца головки обнаружителя относительно камеры протокола 3001 первый столбец головки обнаружителя будет размещен над камерой, относительно которой, предпочтительно, теперь также запрошено обнаружение 3021а. Затем происходит продолжение последовательности операций, причем первый столбец головки обнаружителя теперь считывает протокол 3003 по запросу 3022а, второй столбец считывает протокол 3002 и третий столбец считывает протокол 3001. Очевидно, что приведенное на фиг. 15С смещение показано без соблюдения масштаба (в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения величина этого смещения может быть порядка - 400 миллисекунд) и было показано в таком виде лишь для целей объяснения.

[0143] Таким образом, при выбранных должным образом «поправках смещения запуска» устройство обеспечивает возможность согласованных времен обнаружения в каждом из реакторов. Как показано на фиг. 15С, упорядоченные и эффективные операции обнаружения выполнены вдоль линий 3007a-d при реализации определенного технического решения устройством обнаружителя. Таким образом, операция обнаружения для определенного реактора будет происходить в одно и то же время при переходе от цикла к циклу. Подробности в одном варианте реализации настоящего изобретения, связанные с определением этих технических решений, будут описаны со ссылками на фиг. 16.

Активное охлаждение

[0144] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения при активном нагревании реакторной камеры, то есть, при активном приложении нагревателей к камере, охлаждение реакторной камеры может быть выполнено пассивным образом при использовании одной лишь конвекции для охлаждения содержимого реактора. Для дополнительного обеспечения согласованных диагностических рабочих характеристик некоторые варианты реализации настоящего изобретения предусматривают активное вмешательство в последовательности операций охлаждения, что обеспечивает возможность согласованного поведения. На фиг. 16 показан профиль температуры 7001, содержащий компонент охлаждения. Профиль 7001 содержит время 7006 подъема, горизонтальный участок 7005 и период 7002/7003 охлаждения.

[0145] Температура окружающей среды в месте расположения блока нагревания/обнаружения может быть не одинаковой. То есть, устройство, работающее в южной Аризоне, не может быть подвергнуто воздействию той же самой температуры окружающей среды, как устройство, работающее в северной Аляске. Таким образом, при самой высокой температуре окружающей среды, при которой устройство, как ожидают, будет работать, профиль 7001 может иметь кривую 7003 охлаждения. В более прохладной окружающей среде вместо этого может иметь место профиль 7002 охлаждения. Для компенсации этой разницы некоторые варианты реализации настоящего изобретения предусматривают контроль профиля охлаждения реактора посредством датчиков температуры, возможно, тех, что были описаны со ссылкой на фиг. 3d. При обнаружении отклонений от максимального профиля 7003 достаточное нагревание может быть приложено таким образом, чтобы профиль 7002 следовал вместо профиля 7003. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения нагрев может быть применен периодически в моменты времени 7004а-с, а в других вариантах реализации нагрев может быть применен непрерывно. Таким образом, согласованные профили могут быть достигнуты независимо от географического местоположения термоциклера или рабочей температуры окружающей среды.

[0146] В некоторых из этих вариантов реализации закон охлаждения Ньютона может быть применен для определения момента приложения нагревателей:

T(t)=Т_а+(Т(0)-Т_а)е^-rt

[0147] где: T(t) - температура в момент времени t, Т(0) - начальная температура, Т_а - параметр температуры окружающей среды, r - параметр константы затухания и t - время. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения значения 50,2 градуса по Цельсию и 0,098 могут быть использованы в качестве параметра температуры окружающей среды и параметра константы затухания во времени, соответственно. В этом варианте реализации параметр температуры окружающей среды выбран так, чтобы превышать любую ожидаемую рабочую температуру окружающей среды, обеспечивая, таким образом, возможность полного контроля над циклом охлаждения посредством приложения по меньшей мере некоторого небольшого количества теплоты во время каждого цикла охлаждения, независимо от температуры окружающей среды, для согласования фактического охлаждения с кривой охлаждения максимального профиля 7003 в каждом случае.

[0148] Используемый термин «входные данные» может представлять собой, например, данные, полученные с клавиатуры, от шарового регулятора, «мыши», устройства опознавания речевых команд или другого устройства, способного к передаче информации от пользователя к компьютеру. Входное устройство может также быть сенсорным экраном, связанным с дисплеем, причем в этом случае пользователь реагирует на подсказки на дисплее, касаясь экрана. Пользователь может вводить текстовую информацию через входное устройство, например, клавиатуру или сенсорный экран.

[0149] Настоящее изобретение работает с многочисленными другими средами или конфигурациями вычислительных устройств универсального или особого назначения. Примеры известных вычислительных устройств, сред и/или конфигураций, подходящих для использования с настоящим изобретением, содержат, не ограничиваясь этим, микроконтроллеры, персональные компьютеры, компьютеры-серверы, карманные компьютеры или ноутбуки, мультипроцессорные устройства, устройства на основе микропроцессоров, программируемую бытовую электронику, сетевые персональные компьютеры, миникомпьютеры, суперкомпьютеры, распределенные вычислительные сети, содержащие любое из вышеупомянутых устройств или систем.

[0150] При использовании здесь термин «команды» относится к осуществляемым компьютером операциям для обработки информации в устройстве. Команды могут быть осуществлены в программном обеспечении, встроенных программах или технических средствах и содержать любой тип программируемой операции, предпринимаемой компонентами устройства.

[0151] Термин «микропроцессор» или «процессор» может относиться к любому обычному одноядерному или многоядерному микропроцессору общего назначения, например, к процессорам Pentium®, Intel® Core™, процессору 805, процессору MIPS® или процессору ALPHA®. Кроме того, микропроцессор может быть любым обычным микропроцессором специального назначения, например, процессором цифрового сигнала или графическим процессором. Термин «процессор» может также относиться, не ограничиваясь этим, к микроконтроллерам, программируемым пользователем вентильным матрицам (FPGAs), специализированным интегральным схемам (ASICs), сложным программируемым логическим интегральным схемам (CPLDs), программируемым логическим матрицам (PLAs), микропроцессорам или к другим подобным устройствам обработки.

[0152] Устройство содержит различные модули, подробно описанные ниже. Как может быть понято специалистом в данной области техники, каждый из модулей содержит различные подпрограммы, процедуры, определительные формулировки и макросы. Каждый из модулей обычно отдельно скомпилирован и связан в единую выполняемую программу. Поэтому последующее описание каждого из модулей использовано для удобства описания функциональных возможностей предпочтительного устройства. Таким образом, последовательности операций, выполняемых каждым из модулей, могут быть произвольным образом перераспределены на один из других модулей, объединенных вместе в виде единственного модуля, или сделанными доступными в виде, например, совместно используемой динамически подключаемой библиотеки.

[0153] Некоторые варианты реализации устройства могут быть использованы совместно с различными операционными устройствами, например, SNOW LEOPARD®, iOS®, LINUX, UNIX или MICROSOFT WINDOWS®, или с любой другой подходящей операционной системой.

[0154] Некоторые варианты реализации устройства могут быть написаны на любом обычном языке программирования, например, на ассемблере, С, С++, Basic, Pascal или Java, и выполнены под управлением обычной операционной системы и т.п., или на любом другом подходящем языке программирования.

[0155] Кроме того, модули или команды могут быть занесены в одно или множество программируемых запоминающих устройств, например, на флеш-карты, компакт-диски, жесткие диски и универсальные цифровые диски. Один вариант реализации содержит программируемое запоминающее устройство с хранящимися в нем командами.

[0156] Хотя вышеупомянутые последовательности операций и способы описаны выше, как включающие определенные этапы, и описаны в определенном порядке, следует иметь ввиду, что эти последовательности операций и способы могут содержать дополнительные этапы или могут опускать некоторые из описанных этапов. Кроме того, каждый из этапов из последовательности операций не обязательно должен быть выполнен в описанном порядке.

[0157] Хотя вышеприведенное описание показало, описало и подчеркнуло новые особенности настоящего изобретения в применении к различным вариантам реализации настоящего изобретения, очевидно, что различные изъятия, замены и изменения в форме и деталях показанных устройства или последовательности операций могут быть выполнены специалистами в данной области техники без отступления от сути изобретения. Очевидно, что данное изобретение может быть воплощено в форме, не отражающей все сформулированные здесь функциональные особенности и преимущества, поскольку некоторые функциональные особенности могут быть использованы или применены на практике отдельно от других.

[0158] Этапы способа или алгоритма, описанных в связи с раскрытыми здесь вариантами реализации настоящего изобретения, могут быть воплощены непосредственно в технических средствах, в программном модуле, выполняемом процессором, или в комбинации этих двух средств. Программный модуль может быть размещен в оперативной памяти (RAM), флэш-памяти, постоянном запоминающем устройстве (ROM), стираемом программируемом постоянном запоминающем устройстве (EPROM), электрически стираемом программируемом постоянном запоминающем устройстве (EEPROM), в регистрах, на жестком диске, устранимом диске, компакт-диске или в любой другой форме среды хранения информации, известной при современном уровне технологии. Образцовая среда хранения информации может быть связана с процессором таким образом, что процессор способен считывать информацию со среды хранения информации и записывать информацию в нее. В альтернативном варианте среда хранения информации может быть неотъемлемой частью процессора. Процессор и среда хранения информации могут быть размещены в специализированной интегральной схеме. Эта специализированная интегральная схема может быть размещена в терминале пользователя. В альтернативном варианте процессор и среда хранения информации могут быть размещены как дискретные компоненты в терминале пользователя.

Группа изобретений относится к области амплификации нуклеиновой кислоты. Способ управления множеством протоколов амплификации нуклеиновой кислоты во множестве реакторов, реализованный на одном или большем количестве компьютерных процессорах, в котором каждый из указанных протоколов содержит один или большее количество циклов этапов, причем каждый из указанных циклов этапов содержит этап нагрева и этап охлаждения, при этом этап нагрева и/или этап охлаждения содержит внутри себя время для выполнения обнаружения нуклеиновой кислоты. При этом способ включает определение, предоставление или осуществление доступа к данным продолжительности цикла обнаружения, включающего временной промежуток, необходимый для перемещения головки обнаружителя к каждому из указанного множества реакторов и выполнения головкой обнаружителя обнаружения нуклеиновой кислоты в каждом из указанного множества реакторов, прием или осуществление доступа к данным по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения цикла этапов одного из указанного множества протоколов, где по меньшей мере один этап нагрева или охлаждения имеет продолжительность этапа и содержит внутри себя время для обнаружения нуклеиновой кислоты, и определение первой поправки по времени для указанного по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения путем увеличения указанной продолжительности этапа по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения так, чтобы время цикла этапов протокола составляло кратную величину от продолжительности цикла обнаружения нуклеиновой кислоты. Также раскрывается энергонезависимый машиночитаемый носитель и система управления множеством протоколов амплификации нуклеиновой кислоты в множестве реакторов. Группа изобретений обеспечивает возможность высокой производительности и работы в коммерческой справочной лаборатории или у постели больного. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 16 ил., 1 табл.

1. Способ управления множеством протоколов амплификации нуклеиновой кислоты во множестве реакторов, реализованный на одном или большем количестве компьютерных процессоров, причем

каждый из указанных протоколов содержит один или большее количество циклов этапов, причем каждый из указанных циклов этапов содержит этап нагрева и этап охлаждения, при этом этап нагрева и/или этап охлаждения содержит внутри себя время для выполнения обнаружения нуклеиновой кислоты, и

причем способ включает

определение, предоставление или осуществление доступа к данным продолжительности цикла обнаружения, включающего временной промежуток, необходимый для перемещения головки обнаружителя к каждому из указанного множества реакторов и выполнения головкой обнаружителя обнаружения нуклеиновой кислоты в каждом из указанного множества реакторов,

прием или осуществление доступа к данным по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения цикла этапов одного из указанного множества протоколов, где по меньшей мере один этап нагрева или охлаждения имеет продолжительность этапа и содержит внутри себя время для обнаружения нуклеиновой кислоты, и

определение первой поправки по времени для указанного по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения путем увеличения указанной продолжительности этапа по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения так, чтобы время цикла этапов протокола составляло кратную величину от продолжительности цикла обнаружения нуклеиновой кислоты.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий

определение второй поправки по времени для указанного по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения путем увеличения указанной продолжительности этапа по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения так, чтобы время для обнаружения нуклеиновой кислоты внутри по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения составляло кратную величину от продолжительности цикла обнаружения при корректировке по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения посредством первой поправки по времени и второй поправки по времени.

3. Способ по п. 1, дополнительно включающий

определение поправки на смещение времени запуска на основании положения реактора, связанного с протоколом.

4. Способ по п. 1, в котором

продолжительность цикла обнаружения дополнительно содержит время, необходимое для перемещения головки обнаружителя в начальное положение.

5. Способ по п. 1, в котором

протокол содержит протокол полимеразной цепной реакции.

6. Способ по п. 1, дополнительно включающий инициирование указанного протокола.

7. Энергонезависимый машиночитаемый носитель, содержащий команды, выполненные с возможностью побуждать один или большее количество процессоров управлять множеством протоколов амплификации нуклеиновой кислоты во множестве реакторов, причем каждый протокол содержит один или большее количество циклов этапов, причем каждый цикл этапов содержит этап нагрева и этап охлаждения, при этом этап нагрева и/или этап охлаждения содержит внутри себя время для выполнения обнаружения нуклеиновой кислоты, причем команды выполнены с возможностью побуждать один или большее количество процессоров:

определять, предоставлять или осуществлять доступ к данным продолжительности цикла обнаружения, включающего временной промежуток, необходимый для перемещения головки обнаружителя к каждому из указанного множества реакторов и выполнения головкой обнаружителя обнаружения нуклеиновой кислоты в каждом из указанного множества реакторов,

принимать или осуществлять доступ к данным по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения цикла этапов одного из указанного множества протоколов, где по меньшей мере один этап нагрева или охлаждения имеет продолжительность этапа и содержит внутри себя время для обнаружения нуклеиновой кислоты,

определять первую поправку по времени для указанного по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения путем увеличения указанной продолжительности этапа по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения так, чтобы время цикла этапов протокола составляло кратную величину от продолжительности цикла обнаружения нуклеиновой кислоты.

8. Энергонезависимый машиночитаемый носитель по п. 7, в котором

каждый протокол из указанного множества протоколов содержит одно или большее количество обнаружений нуклеиновой кислоты, при этом определение первой поправки по времени основано по меньшей мере частично на времени для одного или большего количества обнаружений нуклеиновой кислоты, связанных с по меньшей мере двумя или большим количеством протоколов из указанного множества протоколов при одновременном выполнении двух или большего количества протоколов из указанного множества протоколов.

9. Энергонезависимый машиночитаемый носитель по п. 7, в котором

указанные команды дополнительно выполнены с возможностью побуждать один или большее количество процессоров определять вторую поправку по времени для указанного этапа путем увеличения указанной продолжительности этапа по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения так, чтобы время для обнаружения нуклеиновой кислоты внутри указанного по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения составляло кратную величину от продолжительности цикла обнаружения при корректировке указанного по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения посредством первой поправки по времени и второй поправки по времени.

10. Энергонезависимый машиночитаемый носитель по п. 7, в котором

указанные команды дополнительно выполнены с возможностью побуждать один или большее количество процессоров определять поправку на смещение времени запуска на основании положения реактора, связанного с протоколом.

11. Энергонезависимый машиночитаемый носитель по п. 7, в котором

продолжительность цикла обнаружения дополнительно включает время, необходимое для перемещения головки обнаружителя в начальное положение.

12. Энергонезависимый машиночитаемый носитель по п. 7, в котором

протокол представляет собой протокол полимеразной цепной реакции.

13. Энергонезависимый машиночитаемый носитель по п. 7, в котором

указанные команды дополнительно выполнены с возможностью побуждать один или большее количество процессоров инициировать указанный протокол.

14. Система управления множеством протоколов амплификации нуклеиновой кислоты в множестве реакторов, причем каждый протокол содержит один или большее количество циклов этапов, причем каждый цикл этапов содержит этап нагрева и этап охлаждения, при этом этап нагрева и/или этап охлаждения содержит внутри себя время для выполнения обнаружения нуклеиновой кислоты, при этом указанная система содержит:

процессор, выполненный с возможностью реализации следующего:

определение, предоставление или осуществление доступа к данным продолжительности цикла обнаружения, включающего временной промежуток, необходимый для перемещения головки обнаружителя к каждому реактору из указанного множества реакторов и выполнения головкой обнаружителя обнаружения нуклеиновой кислоты в каждом реакторе из указанного множества реакторов,

прием или осуществление доступа к данным по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения цикла этапов одного из указанного множества протоколов, где указанный по меньшей мере один этап нагрева или охлаждения имеет продолжительность этапа и содержит внутри себя время для обнаружения нуклеиновой кислоты, и

определение первой поправки по времени для указанного по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения путем увеличения указанной продолжительности этапа по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения так, чтобы время цикла этапов протокола составляло кратную величину от продолжительности цикла обнаружения нуклеиновой кислоты.

15. Система по п. 14, в которой

каждый протокол из множества протоколов содержит одно или большее количество обнаружений нуклеиновой кислоты, при этом определение первой поправки по времени основано по меньшей мере частично на времени для одного или большего количества обнаружений нуклеиновой кислоты, связанных с по меньшей мере двумя или большим количеством протоколов из указанного множества протоколов при одновременном выполнении двух или большего количества протоколов из указанного множества протоколов.

16. Система по п. 14, в которой процессор дополнительно выполнен с возможностью определения второй поправки по времени для указанного по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения путем увеличения указанной продолжительности этапа указанного по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения так, чтобы время для обнаружения нуклеиновой кислоты внутри этапа составляло кратную величину от продолжительности цикла обнаружения при корректировке указанного по меньшей мере одного этапа нагрева или охлаждения посредством первой поправки по времени и второй поправки по времени.

17. Система по п. 14, в которой

процессор дополнительно выполнен с возможностью определения поправки на смещение времени запуска на основании положения реактора, связанного с протоколом.

18. Система по п. 14, в которой

продолжительность цикла обнаружения дополнительно включает время, необходимое для перемещения головки обнаружителя в начальное положение.

19. Система по п. 14, в которой

протокол представляет собой протокол полимеразной цепной реакции.

20. Система по п. 14, в которой

процессор дополнительно выполнен с возможностью инициирования указанного протокола.