ПРОИЗВОДНЫЕ ФТОРИРОВАННОГО ПОРФИРИНА, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ Российский патент 2019 года по МПК C07B47/00 A61P35/00 

Изобретение относится к новым соединениям, а именно к производным фторированного порфирина и его металлокомплекса общей формулы I, в частности к их малеимидным производным, проявляющим противоопухолевую активность: 5,10,15,20-тетракис(4-N-малеимидо-2,3,5,6-тетрафторфенил)пор-фиринато цинку(II) (Ia) и 5,10,15,20-тетракис(4-N-малеимидо-2,3,5,6-тетрафторфенил)порфирину (Iб).

Заявляемые соединения Ia и Iб наиболее эффективно могут быть использованы в качестве противоопухолевых агентов в фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний. Соединение Iв используется для получения других соединений формулы I.

Заявляемые соединения и их свойства в литературе не описаны.

ФДТ является разновидностью химиотерапии и заключается в локальной активации фотосенсибилизатора (ФС), введенного в опухоль, видимым красным светом, что в присутствии кислорода тканей приводит к развитию фотохимической реакции, разрушающей опухолевые клетки. ФДТ позволяет избежать системного (общего) воздействия на организм, характерного для обычной химиотерапии.

Фотодинамическая терапия известна с 1975 года [T.G. Dougherty, G.B. Grindey, R. Fiel. Photoradiation therapy II. Culture of animal tumors with hematoporphyrin and light. J. Natl. Cancer Inst., 1975, 55, 115-121] и в последующие годы получила широкое распространение в США, Европе, Китае и Японии. В Российской Федерации ФДТ применяют с 1996 г.

Успешное применение метода фотодинамической терапии (ФДТ) для лечения злокачественных новообразований стимулирует поиск новых фотосенсибилизаторов с улучшенными свойствами.

Известно, что в качестве фотосенсибилизаторов для ФДТ успешно используются соединения порфиринового ряда (хлорины, бактериохлорины, порфирины и др.) [М. Ethirajan, Y. Chen, P. Joshi, R. K. Pandey. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy, Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 340-362].

Известно, что введение фтора в молекулы субстанций лекарственных средств повышает их устойчивость к метаболизму, биодоступность, показатели связывания с белками и обеспечивает оптимальные липофильные характеристики конечных продуктов [S. Purser, P.R. Moore, S. Swallow, V. Gouvemeur. Fluorine in medicinal chemistry. Chem. Soc. Rev., 2008, 37, 320-330].

Также известно, что введение малеимидной группы в молекулы порфиринов приводит к увеличению их фотодинамической активности [J. Jin, Y. Zhu, Z. Zhang, W. Zhang. Enhancing the Efficacy of Photodynamic Therapy through a Porphyrin/POSS Alternating Copolymer. Angewandte Chemie International Edition, 2018, 57, 16354-16358].

Известны не содержащие фтора порфирины формулы II, которые включают несколько малеимидных групп, структуры которых близки к структуре заявляемых соединений [Patent Application CN 105968119 А, опубл. 28.09.2016]. Соединения формулы II получают путем взаимодействия малеинового ангидрида с 5,10,15,20-тетракис(п-аминофенил)порфирином и его металлокомплексами.

В литературе не имеется данных о биологической активности соединений формулы II.

До сих пор не были известны производные порфиринов, содержащие наряду с малеимидной группой и порфириновым макроциклом, атомы фтора. Такая совокупность фармакофорных элементов может обеспечить фотоксическое действие в отношении опухолевых клеток.

Задачей настоящего изобретения является создание ранее неизвестных малеимидных производных фторированных порфиринов, содержащих порфириновый макроцикл, атомы фтора и малеимидный фрагмент, которые проявляли бы противоопухолевую активность при использовании в фотодинамической терапии.

Технический результат - получение ранее неизвестных малеимидных производных фторированного порфирина, проявляющих противоопухолевую активность, расширение арсенала агентов для ФДТ.

Поставленная задача решается малеимидными производными 5,10,15,20-тетракис(-2,3,5,6-тетрафторфенил)порфирина и его цинкового комплекса (Iб и Ia), проявляющими противоопухолевую активность, а также способом их получения, в котором в качестве предшественника используется 5,10,15,20-тетракис(4-амино-2,3,5,6-тетрафторфенил) порфиринато цинк(II) (Iв) (Схема 1).

В качестве исходного соединения используют известный 5,10,15,20-тетракис(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторфенил)порфиринато цинк(II), который получают по известной методике [J.I.T. Costa, А.С.Tome, M.G.P.M.S. Neves, J.A.S. Cavaleiro. 5,10,15,20-tetrakis(pentafluorophenyl) porphyrin: a versatile platform to novel porphyrinic materials. J. Porphyrins Phthalocyanines, 2011, 75, 1116-1133].

Способ получения соединений Ia и Iб включает следующие стадии:

(i) восстановление азидных групп исходного 5,10,15,20-тетракис(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторфенил)порфиринато цинка(II) хлоридом олова в метаноле, которое дает 5,10,15,20-тетракис(4-амино-2,3,5,6-тетрафторфенил)порфиринато цинк(II) (Iв);

(ii) взаимодействие соединения Iв с малеиновым ангидридом в растворе ледяной уксусной кислоты, дальнейшая обработка уксусным ангидридом в присутствии ацетата натрия и последующая стандартная очистка полученного 5,10,15,20-тетракис(4-амино-2,3,5,6-тетрафторфенил) порфиринато цинка(II) (Ia);

(iii) обработка соединения Iа трифторуксусной кислотой в растворе хлористого метилена или хлороформа для удаления атома цинка и получения 5,10,15,20-тетракис(4-N-малеимидо-2,3,5,6-тетрафторфенил)порфирина (Iб).

Изобретение иллюстрируется конкретными примерами его осуществления, приведенными ниже.

Пример 1. Получение 5,10.15.20-тетракис(4-N-малеимидо-2.3,5,6-тетраФторфенил)порфиринато цинка(II) (Ia)

(i) Получение 5,10,15,20-тетракис(4-амино-2,3,5,6-тетрафтор-фенил) порфиринато цинка(II) (Iв)

В 20 мл абсолютного метанола суспендируют 671 мг (3.54 ммоль) хлорида олова(II) в течение 20 мин. К реакционной массе добавляют 500 мг (0.442 ммоль) 5,10,15,20-тетракис(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторфенил)порфиринато цинка(II) в 50 мл абсолютного метанола. Перемешивают в токе аргона 1 час при комнатной температуре. Растворитель удаляют в вакууме, продукт помещают на колонку с силикагелем, хроматографируют на силикагеле 40×60, элюент - хлороформ - ацетон (5: 1), затем хлороформ - ацетон (1: 1). Выход соединения Iв: 415 мг (91.4%). MS (MALDI): m/z [М⁺] для C₄₄H₁₆F₁₆N₈Zn вычислено: 1024.053; найдено: 1024.012. ИК-спектр (KBr), ν, см^-1: 2922 (СН порфирина), 3430 (NH₂ порфирина). Электронный спектр ((СН₃)₂СО), λ_max, нм, (ε 10^-3): 420 (308.0), 551 (33.6). ¹Н ЯМР - спектр ((CD₃)₂CO), 8, м.д.: 9.19 (с, 8Н, β-пиррол), 5.94 (с, 8Н, NH₂). ¹⁹F ЯМР - спектр ((CD₃)₂CO), δ, м.д.: -164.51 (д, J=16.50 Hz, 8F) -143.69 (д, J=16.50 Hz, 8F).

(ii) Получение 5,10,15,20-тетракис(4-амино-2,3,5,6-тетрафторфенил) порфиринато цинка(II) (Iа)

В смеси 20 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл абсолютного ацетона растворяют 300 мг (0.292 ммоль) 5,10,15,20-тетракис(4-амино-2,3,5,6-тетрафторфенил)порфиринато цинка(II) и добавляют 572 мг (5.84 ммоль) малеинового ангидрида. Реакционную массу перемешивают 72 часа в токе аргона в темноте при комнатной температуре. Растворители отгоняют в вакууме, к остатку добавляют 5 мл уксусного ангидрида и 479 мг (5.84 ммоль) ацетата натрия. Реакционную массу перемешивают 24 часа в токе аргона в темноте при 50-60°С. Растворитель упаривают в вакууме, продукт помещают на колонку с силикагелем, хроматографируют на силикагеле 40×60, элюент - хлороформ - ацетон (5: 1), затем хлороформ - ацетон (5: 2). Выход соединения Ia: 105 мг (26.7%). MS (MALDI): m/z [М⁺] для C₆₀H₁₆F₁₆N₈O₈Zn вычислено: 1344.013; найдено: 1344.000. ИК-спектр (KBr), ν, см^-1: 2925 (СН порфирина), 1760 (С=0), 1611 (С=С малеимида). Электронный спектр ((СН₃)₂СО), λ_max, нм, (ε 10^-3): 419 (238.5), 550 (20.3) ¹Н ЯМР - спектр ((CD₃)₂CO), δ, м.д.: 9.35 (с, 8Н, β-пиррол), 7.46 (с, 8Н, СН=СН). ¹⁹F ЯМР - спектр ((CD₃)₂CO), δ, м.д.: -145.82 (дд, J=23.20, 10.71 Гц, 8 F), -139.18 (дд, J=23.21, 8.93 Гц, 8 F).

Пример 2. Получение 5.10.15.20-тетракис(4-N-малеимидо-2,3,5.6-тетрафторфенил)порфирина (Iб)

В 10 мл хлороформа растворяют 50 мг (0.037 ммоль) соединения Iа добавляют 1 мл трифторуксусной кислоты и перемешивают 1 час при комнатной температуре. Реакционную массу выливают в воду, промывают водой до нейтральной среды, упаривают, пропускают через слой силикагеля 40×60, элюент хлороформ-ацетон 1:1.

Выход соединения Iб: 47 мг (98.6%). MS (MALDI): m/z [М⁺] для C₆₀H₁₈F₁₆N₈O₈ вычислено: 1282.099; найдено: 1282.004. ИК-спектр (KBr), ν, см^-1:

2920 (СН порфирина), 1763 (С=0), 1613 (С=С малеимида). Электронный спектр ((СН₃)₂СО), λ_max, нм, (ε 10^-3): 409 (301.5), 504 (27.4), 581 (12.7). ¹Н ЯМР - спектр ((CD₃)₂CO), δ, м.д.: 9.36 (м, 8Н, β-пиррол), 7.46 (с, 8Н, СН=СН), -2.66 (уш.с, 2Н, NH). ¹⁹F ЯМР - спектр ((CD₃)₂CO), δ, м.д.: -145.82 (дд, J=23.20, 10.71 Гц, 8 F), -139.13 (дд, J=23.20, 10.70 Гц, 8 F).

Все полученные производные Ia-в представляют собой микрокристаллы красно-фиолетового цвета, хорошо растворимые в ацетоне, этилацетате, диметилсульфоксиде.

Ниже представлены результаты серии испытаний биологической активности заявляемых соединений Ia и Iб.

Результаты испытаний показали, что соединения Ia и Iб проявляют значительную активность на культивируемых злокачественных клетках (темновая и световая токсичность в терапевтических концентрациях (до 100 мкМ)), что позволяет считать их перспективными «drug candidates» для дальнейших исследований как противоопухолевых агентов.

Результаты исследования темновой и световой токсичности соединений на культуре опухолевых клеток

Препараты для исследований

Для исследований получены соединения Ia и Iб. Соединения растворяли в ДМСО до концентрации стокового раствора 10 мМ.

Изучение темновой токсичности (цитотоксичности)

Для экспериментов использована линия НСТ116 (рак толстой кишки). Клетки НСТ116 культивировали в среде DMEM с добавлением следующих компонентов до конечных концентраций: 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 mМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия), инкубация проводилась при 37°С, 5% CO₂ в увлажненной атмосфере. В экспериментах использованы клетки в логарифмической фазе роста.

МТТ-тест для исследования цитотоксичности

Цитотоксическое действие соединений исследовали в МТТ-тесте (по восстановлению желтой соли 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола в темно-синий кристаллический формазан митохондриями живых клеток). По результатам исследования цитотоксичности построены кривые выживаемости и определены значения IC₅₀.

Клетки рассевали в лунки 96-луночного планшета (NUNC, США) (5000 клеток в 190 мкл культуральной среды), инкубировали 24 часа при 37°С, 5% CO₂, в увлажненной атмосфере. Вносили по 5-10 мкл раствора исследуемых веществ в культуральной среде, приготовленных серийными разведениями из исходного раствора, до 10 конечных концентраций.

Контролем в эксперименте служили клетки без препарата (интактные).

Клетки инкубировали 72 ч при 37°С, 5% CO₂, в увлажненной атмосфере. За 1 ч до окончания инкубации в лунки вносили по 20 мкл водного раствора МТТ (5 мг/мл, ПанЭко, Россия). После окончания инкубации культуральную среду отбирали, клетки ресуспендировали в 100 мкл ДМСО и измеряли оптическую плотность раствора на планшетном спектрофотометре Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 570 нм. Процент клеток, выживших при действии каждой дозы соединения, подсчитывали как частное от деления средней оптической плотности в лунках после инкубации с данной дозой к средней оптической плотности контрольных лунок (значения последних приняты за 100%). Результаты представлены в таблице.

Изучение световой токсичности

Клетки НСТ116 рассеивали на 35-мм чашках Петри (50000 клеток в 2 мл культуральной среды).

Растворы исследуемых соединений концентрацией 10 мМ вносили в культуральную среду с клетками до конечной концентрации 5 мкМ и 10 мкМ. Культуры инкубировали при 37°С, 5% CO₂ в течение 24 часов. Затем среду удаляли и добавляли 2 мл фосфатно-солевого буфера. Освещали белым светом в течение 20 мин. Для исключения теплового эффекта между чашкой и лампой помещали чашку с водой. Первая чашка - интактная. После облучения наблюдали за клетками в микроскоп. Изменений обнаружено не было. Остальные чашки с концентрациями соединений 5 и 10 мкМ соответственно облучали белым светом в течение 20 минут. Для исключения теплового эффекта между чашкой и лампой помещали чашку с водой. После освещения клетки округлились. Из чашек осторожно удаляли фосфатно-солевой буфер, добавляли свежую культуральную среду и инкубировали сутки, после наблюдали за клетками в микроскоп. Видели полную гибель клеток. Выявлен фототоксический эффект при освещении клеток НСТ116 в присутствии 5 мкМ и 10 мкМ Iб, менее выраженный эффект - при воздействии светом на чашки с 10 мкМ Ia.

Таким образом, проявленная активность заявляемых соединений Iа и Iб (темновая и световая токсичность в терапевтических концентрациях (до 100 мкМ) на культивируемых злокачественных клетках позволяет считать их перспективными для дальнейших исследований в качестве противоопухолевых агентов для ФДТ.

Изобретение относится к новым производным фторированного порфирина и его металлокомплекса общей формулы I. Технический результат: получены новые производные фторированного порфирина, проявляющие противоопухолевую активность. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

1. Производные фторированных порфиринов общей формулы I

где R = при М = Zn и М = 2Н.

2. Соединения по п. 1, проявляющие противоопухолевую активность.