Штамм "Приволжский" вируса заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) крупного рогатого скота Dermatitis nodularis bovum, рода Capripoxvirus для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота Российский патент 2019 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, к новому генотипу вируса заразного узелкового дерматита (ЗУД КРС), который может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ЗУД КРС.

Заразный узелковый дерматит (нодулярный дерматит) крупного рогатого скота (ЗУД КРС), кожно-узелковая сыпь, лоскутная болезнь кожи, кожная бугорчатка, Dermatitis nodularis bovum - трансграничная, эмерджентная инфекционная болезнь КРС, проявляющаяся персистентной лихорадкой, поражением лимфатической системы, отеком подкожной клетчатки и внутренних органов, образованием кожных узлов (бугров), поражением глаз и слизистых оболочек органов дыхания и пищеварения, потерей продуктивности и живой массы тела [2, 5, 9, 12].

Возбудитель - ДНК-содержащий оболочечный вирус, имеет антигенное родство со штаммами вирусов, вызывающих оспу у овец и коз, которые отличаются на генетическом уровне, и вместе с ним образуют самостоятельный род Capripoxvirus семейства Poxviridae [2, 7, 11].

ЗУД относят к особо опасным болезням животных, способным вызывать эпизоотии и наносить значительный экономический ущерб [10]. В соответствии с новой классификацией он включен в список болезней Международного эпизоотического бюро (МЭБ), подлежащих обязательному уведомлению (нотификации), в категорию «Болезни и инфекции крупного рогатого скота» [2, 9].

В течение длительного времени Россия оставалась благополучной по данному заболеванию. Впервые в Российской Федерации вспышки ЗУД КРС были зарегистрированы на территории Республики Дагестан в 2015 году, которые были вызваны полевым изолятом [3]. Однако уже в 2017 году при лабораторных исследованиях биологического материала, полученного из регионов Приволжского ФО, регистрировали наличие вакциноподобного штамма вируса ЗУД, принадлежащего к генетической линии Neethling. Для выяснения филогенетических свойств полученного штамма вируса ЗУД КРС использовали метод определения первичной нуклеотидной последовательности ряда локусов с помощью секвенирования. Результаты проведенных исследований и анализа фрагмента гена белка наружного капсида зрелого вириона показали, что выявленный штамм принадлежит к группе вакцинных вирусов типа Neethling и имеет 99% уровень гомологии с вакцинным штаммом LSDV Vaccine Neethling LW 1959.

В настоящее время для профилактики данного заболевания применяют как гетерологичные, так и гомологичные вакцины. Применение гомологичных вакцин на основе аттенуированных штаммов вируса ЗУД, по всей вероятности, стало причиной появления новых генотипов вируса ЗУД [13]. Несмотря на то, что возможность мутации между полевыми штаммами вируса и аттенуированными считается незначительной, так как для этого необходимо, чтобы оба вируса размножались одновременно в одних и тех же клетках одного животного, однако же, в случае массовой профилактической вакцинации риск такой мутации существенно возрастает при условии циркуляции полевого вируса.

Известен штамм «ВНД КРС/Дагестан/2015» вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота, выделенный в 2015 году от коров, больных ЗУД КРС на территории Республики Дагестан, репродуцированный в перевиваемой культуре клеток яичников домашней козы (ЯДК-04) и субкультуре тестикул ягненка (ТЯ), с инфекционной активностью 4,5÷5,5 lg ТЦД₅₀/см³ и используемый для изготовления средств диагностики ЗУД КРС [7].

Известен штамм «Волгоградский» вируса нодулярного дерматита, выделенный из патологического материала от больных коров из Волгоградской области, репродуцированный в культуре клеток почки теленка (MDBK) с инфекционной активностью 5,0÷5,5 lg ТЦД₅₀/см³ и используемый для вирусологических, молекулярно-генетических, мониторинговых исследований, изготовления вакцин и диагностических препаратов [8].

Недостатком вышеуказанных штаммов является наличие генетических сигнатур, специфичных только полевым изолятам.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ЗУД КРС, обладающих новыми биологическими, а также генетическими характеристиками, включающими свойства как вакцинных, так и полевых вариантов вируса в нативном виде и пригодных для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ЗУД КРС.

Указанная задача решена путем получения нового мутантного штамма вируса ЗУД КРС «Приволжский», используемого в качестве производственно-контрольного для изготовления средств диагностики заразного узелкового дерматита КРС и лекарственных препаратов, а также их контроля.

Изолят вируса заразного узелкового дерматита, послуживший источником для получения штамма «Приволжский», был выделен из проб биологического материала, полученного от коров с клиническими признаками заразного узелкового дерматита на территории Приволжского ФО Российской Федерации.

Для получения штамма ЗУД КРС, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали субкультуру клеток тестикул ягненка (ТЯ). В результате проведения серии последовательных пассажей изолята на данной культуре клеток был получен штамм вируса ЗУД «Приволжский» имеющий стабильные биотехнологические и антигенные свойства и пригодный для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ЗУД КРС. Накопление вируса ЗУД штамма «Приволжский» в культуре клеток ТЯ обеспечивалось на уровне от 4,5 до 5,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Штамм вируса ЗУД КРС «Приволжский» депонирован в 2019 году в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») под регистрационным номером - №112 - деп / 19-2 - КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Сущность изобретения пояснена на графических изображениях, на которых:

Фиг. 1 - монослой незараженной культуры клеток ЯДК-04 (контроль культуры клеток);

Фиг. 2 - клетки монослоя культуры клеток ЯДК-04, после инфицирования вирусом ЗУД КРС через 48 ч;

Фиг. 3 - монослой незараженной культуры клеток ТЯ (контроль культуры клеток);

Фиг. 4 - клетки монослоя культуры клеток ТЯ, после инфицирования вирусом ЗУД КРС через 48 ч.

Фиг. 5 - монослой незараженной культуры клеток ПБ (контроль культуры клеток);

Фиг. 6 - клетки монослоя культуры клеток ПБ, после инфицирования вирусом ЗУД КРС через 48 ч.

Сущность изобретения пояснена на дендрограмме, отражающей филогенетические взаимоотношения штамма «Приволжский» вируса ЗУД КРС с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса.

Фиг. 7 - по локусу гена белка наружного капсида зрелого вириона (ORF126) штамм «Приволжский» при сравнении с полевыми и вакцинными вирусами ЗУД КРС принадлежит к группе вакцинных вирусов;

Фиг. 8 - по локусу гена белка, связывающего альфа-аманитин (ORF009) штамм «Приволжский» при сравнении с полевыми и вакцинными вирусами ЗУД РКС принадлежит к группе полевых вирусов.

Штамм «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита характеризуется следующими признаками и свойствами:

Морфологические признаки

Штамм «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита КРС относится к семейству Poxviridae, роду Capripoxvirus, виду Dermatitis nodularis bovum или Lumpy Skin Disease, и обладает морфологическими признаками, характерными для представителей каприпоквирусов: вирионы кирпичеобразной формы, имеют двойную липидную оболочку, плотную сердцевину и боковые тельца.

Антигенные свойства

Антигенные свойства вируса ЗУД КРС полностью не изучены. В антигенном отношении вирус ЗУД родственен вирусу оспы овец и оспы коз. В реакции нейтрализации в культуре клеток показать существенное отличие вируса оспы овец от вируса ЗУД не удается [11].

У переболевших животных в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в РМН на культуре клеток ЯДК-04.

Введение штамма «Приволжский» вируса ЗУД крупному рогатому скоту сопровождается образованием у них вируснейтрализующих антител в крови в титре 1:8÷1:128.

Патогенные свойства

Штамм патогенен для крупного рогатого скота. При экспериментальном заражении вируссодержащей суспензией быков черно-пестрой породы 1,5-летнего возраста вызывает следующие клинические признаки: повышение температуры тела (41÷41,5)°С, серозные истечения из носовой полости, угнетение животных, отказ от корма, а также проявление розеол (размером от 0,5 до 3 см, круглой, овальной или неправильной формы) на всем теле животного (круп, задние конечности, в области спины и на голове).

Контагиозность

Штамм контагиозен для крупного рогатого скота. Интактные животные заболевают ЗУД при совместном содержании с инфицированными животными.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Биотехнологические характеристики

Штамм «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита КРС размножается в субкультуре клеток тестикул ягнят (ТЯ), в субкультуре клеток почки барана (ПБ), а также в перевиваемой культуре клеток яичников домашней козы (ЯДК-04) [6]. Репродукция вируса сопровождается специфическим цитопатическим действием, приводящим к округлению, агрегации клеток и деструкции монослоя на 2÷3 сутки культивирования. Вирус накапливается в титре не менее 4,5 lg ТЦД₅₀/см³ и сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).

Молекулярно-генетическая характеристика

Согласно анализу гена кодирующего наружный капсидный белок зрелого вириона штамм «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита является вакцинным, поскольку у всех вакцинных вирусов присутствует делеция 27 пар нуклеотидов, тогда как секвенирование локуса гена белка, связывающего альфа-аманитин, показало, что вирус по данному локусу принадлежит к генетической линии полевых изолятов. Данный факт свидетельствует о том, что геном штамма «Приволжский» заразного узелкового дерматита КРС, не имея признаков контаминации, сочетает в составе одной полногеномной последовательности геномные сегменты как вакцинного штамма, так и полевого изолята, это свидетельствует о том, что данный изолят представляет собой новый генотип, возникший путем мутации.

Полногеномный анализ ПЦР показал более тесную нуклеотидную гомологию штамма «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита с вакцинными штаммами (>99,30%), чем с полевыми изолятами (>98,64%). Однако же, филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей (фиг. 7 и фиг. 8) указывает, что полученный штамм не принадлежит на 100% ни к одной из филогенетических групп. Это свидетельствует о том, что геном штамма «Приволжский» заразного узелкового дерматита КРС содержит нуклеотидные последовательности как вакцинного, так и полевого изолята.

Физические свойства

Плавучая плотность в CsCl 1,19 г/см³. Наиболее стабилен при рН 6,6÷8,6.

Устойчивость к внешним факторам

Вирус стабилен в окружающей среде при комнатной температуре с сохранением инфекционной активности до 18 дн., в пораженных участках кожи - не менее 33 дн., в слюне - 11 дн., сперме быков - 22 дн., в культуре клеток при 4°С - 6 мес. Переносит 3-кратное замораживание и оттаивание, чувствителен к эфиру, хлороформу, высокой температуре. Сохраняет жизнеспособность в течение 10 лет при температуре минус 80°С.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - вирус индуцирует образование вируснейтрализующих антител в крови КРС на 14-й день после заражения в титре 1:8÷1:16.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в культурах клеток ТЯ, ПБ и ЯДК-04 в течение 5 серийных пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - патогенен для естественно восприимчивых животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно восприимчивых животных.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.

Сущность предложенного изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного от больных коров, к культурам клеток ТЯ, ПБ и ЯДК-04.

Для получения расплодки вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали в течение часа в термостате при температуре 37°С. После этого вносили поддерживающую среду ПСП с добавлением 1÷2% фетальной сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при 37°С до появления цитопатического действия (ЦПД) вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде агрегатов разного размера и, в дальнейшем, тотальной деструкцией и отслоением монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70-80% (округление, отслоение от стекла и агрегация клеток) культуральные матрасы промораживали при минус 80°С и после оттаивания при комнатной температуре производили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса микротитрованием в культуре клеток ЯДК-04.

Титрование проводили в стерильных 96-луночных плоскодонных культуральных планшетах в объеме 0,2 см³/лунку. Предварительно готовили десятикратные разведения вируссодержащего материала на среде ПСП, начиная с 10^-1 до 10^-7. Подготовленные разведения вируса переносили, начиная с наивысшего разведения, в культуральные планшеты по 0,1 см³. К полученным разведениям вируса добавляли по 0,1 см³ клеточной суспензии ЯДК-04 на среде ПСП с содержанием 1÷2% фетальной сыворотки КРС. Планшет закрывали крышкой, помещали в СО₂ - инкубатор с содержанием 5% СО₂ при температуре 37°С и вели наблюдения с использованием инвертируемого микроскопа. Заключительный учет результатов титрования вируса проводили через 96÷120 ч инкубирования при условии сохранения целостности монослоя клеток в контрольных лунках. Расчет инфекционной активности проводили по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД₅₀/см³.

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 1. Инфекционная активность вируса в культурах клеток ТЯ, ПБ и ЯДК-04 составляла 4,5, 6,0, 5,0 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно.

Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о хорошей адаптационной активности штамма «Приволжский» вируса ЗУД к использованным клеточным культурам.

Проявление ЦПД в культуре клеток ЯДК-04 характеризовалось образованием большого числа сферических клеток. Через 96 ч культивирования большая часть клеток отслаивалась от стекла, собиралась в агрегаты разного размера, часть клеток деградировала до детрита (фиг. 1, фиг. 2).

При последовательной репродукции вируса ЗУД в культуре клеток ТЯ через 24 ч после заражения в монослое отмечали появление веретенообразных клеток, которые позже округлялись и через 48÷72 ч в большей части отслаивались от стекла (фиг. 3, фиг. 4).

ЦПД в субкультуре клеток ПБ на 2 сутки инкубирования характеризовалось появлением веретенообразных и сферических клеток, которые в большей части отслаивались от стекла, частично агрегировались без образования явного клеточного детрита (фиг. 5, фиг. 6).

Пример 2

Контроль стабильности биологической активности штамма определяли в течение 5 последовательных пассажей в культурах клеток ТЯ, ПБ и ЯДК-04. Результаты изучения стабильности штамма по его биологической активности в течение 5 пассажей представлены в таблице 2.

В ходе проведенных исследований установлено, что штамм вируса ЗУД КРС «Приволжский» в течение 5 последовательных пассажей в культурах клеток ТЯ, ПБ и ЯДК-04 проявлял стабильную биологическую активность, которая находилась в пределах 4,5÷5,5 lg ТЦД₅₀/см³, 5,5÷6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и 5,0÷5,5 ТЦД₅₀/см³, соответственно.

Пример 3

Контроль отсутствия контаминации бактериями, грибами и микоплазмами (микробиологическими методами).

Для проведения испытания на стерильность использовали 5 флаконов с образцом исследуемого штамма «Приволжский» вируса ЗУД. Подтверждение отсутствия контаминации бактериальной, грибной микрофлорой и микоплазмами проводили в соответствии с ГОСТ 28085-13 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности» [1].

Содержимое флаконов растворяли в стерильном физиологическом растворе до первоначального объема перед лиофилизацией (2 см³), т.е. ресуспендировали.

Суспензию из каждого флакона по 1 см³ высевали в 3 пробирки с тиогликолевой средой. Две засеянные пробирки выдерживали в термостате в течение 14 суток: одну - при 21÷22°С, другую - при 37°С, а третью - выдерживали в течение 7 суток при (37±0,5)°С. Затем из нее делали пересев по 0,5 см³ по одной пробирке на следующие среды: МПА, МППБ, МПБ, Сабуро жидкий и по 1 см³ на МППБ.

Пересевы на МПА, МПБ, МППБ выдерживали еще в течение 7 суток при 37°С, а пересев на Сабуро - при 21÷22°С.

При микробиологическом испытании образца штамма проводили контроль стерильности сред: три пробирки с каждой средой выдерживали в термостате в течение 14 суток при 37°С, со средой Сабуро - при 21÷22°С.

Для исключения контаминации микоплазмами суспензию образца штамма по 0,5 см³ высевали в пробирку, содержащую 4,5 см³ жидкой среды Каган 0,3%, и выдерживали в термостате при 37°С.

При отсутствии роста микоплазм в течение 7 суток на жидкой среде (сохранение цвета индикатора) проводили через каждые 7 суток 2 последовательных пассажа на твердую среду Каган 1,3%.

При отсутствии специфических для микоплазм колоний, врастающих в толщу агара, делали заключение о чистоте образца штамма.

В результате исследований установлено, что штамм «Приволжский» вируса ЗУД не контамирован бактериями, грибами и микоплазмами. Высевы ресуспендированного образца штамма вируса на соответствующие питательные среды были без проростов посторонней микрофлоры в течение всех сроков наблюдения.

Пример 3

Получение антигена вируса ЗУД КРС.

Для приготовления антигена для диагностических целей двухсуточную культуру клеток ТЯ, ПБ или ЯДК-04, выращенную в 1,5-литровых клинских матрасах, предварительно слив с них ростовую среду, заражали вируссодержащей суспензией в дозе 0,3-0,5 ТЦД₅₀/кл. Матрасы помещали на один час в термостат при температуре 37°С для контакта клеток культуры с вирусом. После этого вносили поддерживающую среду ПСП с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% культуральные матрасы подвергали троекратному промораживанию при температуре минус 80°С и оттаиванию.

Полученную вируссодержащую культуральную жидкость очищали от балластных белков и фрагментов клеток низкоскоростным центрифугированием при 4800 g в течение 40 минут.

Затем осветленную надосадочную жидкость центрифугировали при 45000 g в течение 45 минут, после чего надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в 10 см³ буферном растворе TNE.

Очистку антигена проводили путем центрифугирования с использованием градиента плотности раствора сахарозы (30%, 45% и 60%) при 10600 g в течение 180 минут. Полученный осадок ресуспендировали в TNE буферном растворе в соотношении 1/100 от начального объема.

Полученный данным способом антиген использовали в серологических реакциях для определения уровня антител к вирусу ЗУД КРС, а также для изготовления диагностических сывороток.

Результаты исследований, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о том, что способом, описанным в примере 3, получен антиген с активностью в культуре клеток 7,0 lg ТЦД/см³, в ИФА 1:320÷1:640.

Пример 4

Получение гипериммунной сыворотки.

Штамм «Приволжский» используют для получения высокоактивной гипериммунной сыворотки, предназначенной для оценки иммунобиологических свойств вируса ЗУД КРС, а также контроля качества антигенного сырья, используемого при производстве диагностических препаратов.

Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный антиген вируса ЗУД штамма «Приволжский», из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-70 производства фирмы "SEPPIC" (в соотношении 1:1).

Кроликов иммунизировали в дозе 2 см³ трехкратно по схеме:

1) в мякиши задних конечностей;

2) через 7÷10 дней после первой иммунизации в подколенные лимфоузлы;

3) через 21 день после первой - внутримышечно.

Через 10÷15 дней после окончания гипериммунизации доноров обескровливали и получали сыворотку крови для исследования на наличие антител. Титр антител определяли в РМН и ИФА.

Данные, представленные в таблице 4, свидетельствуют, что способом, описанным в примере 4, получены диагностические сыворотки со специфической активностью 1:1280÷1:2560 в ИФА и 1:128÷1:512 в РМН.

Пример 5

Определение антигенной активности и специфичности штамма «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита КРС.

Антигенную активность штамма «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита КРС определяли на 5 быках. Для заражения животных использовали суспензию вируса (в объеме 2 см³), полученную после проведения 2-х пассажей в культуре клеток ЯДК-04 с титром инфекционной активности 5,0 lg ТЦД₅₀/см³.

После введения вируссодержащей суспензии у животных отбирали кровь для определения титра вируснейтрализующих антител в сыворотке крови.

Вируснейтрализующую активность специфических антител сывороток крови определяли в РМН. С этой целью готовили двукратные разведения испытуемых сывороток крови КРС. К полученным разведениям сывороток добавляли равные объемы вируссодержащего культурального материала с титром инфекционной активности 2,0 lg ТЦД₅₀/см³. Смеси вируса с сывороткой выдерживали в СО₂ - инкубаторе при температуре 37°С в течение одного часа.

После часового контакта во все лунки планшета вносили суспензию культуры клеток ЯДК-04 и помещали в помещали в СО₂ - инкубатор с содержанием 5% CO₂ при температуре 37°С на 96÷120 ч. Наблюдения проводили с использованием инвертируемого микроскопа, регистрируя лунки с выраженным ЦПД вируса и/или с цельным неповрежденным монослоем.

При постановке РМН использовали контроли на токсичность сывороток, контроли культуры клеток и дозы вируса.

Результаты проведенных исследований показали, что титр вируснейтрализующих антител в сыворотках крови КРС находился в пределах 1:8÷1:128.

Специфичность штамма «Приволжский» вируса ЗУД КРС определяли в реакции микронейтрализации (РМН).

Для проведения РМН использовали сыворотки крови КРС, полученные на штамм «Приволжский». В качестве тест-системы использовали суспензию перевиваемой культуры клеток ЯДК-04.

Постановку РМН проводили в 96-луночных планшетах, используя штамм «Приволжский» в последовательных десятикратных разведениях и сыворотку крови КРС с постоянной дозой. В качестве контроля использовали нормальную сыворотку крови КРС. Реакцию учитывали через 5÷6 суток по мере развития цитопатического действия вируса в контрольных лунках, не содержащих исследуемые сыворотки. Титром вируса считали предельное ее разведение, тормозящее развитие цитопатического действия вируса в 50% зараженных лунок с культурой клеток. Индекс нейтрализации рассчитывали по стандартной формуле [4]. Результаты представлены в таблице 5.

Из данных таблицы 5 видно, что цитопатический эффект вируса со специфической сывороткой крови КРС наблюдали в разведениях вируса от 10^-1 до 10^-2, титр вируса составлял 2,00 lg ТЦД₅₀/см³. В лунках, куда вносили вирус с нормальной сывороткой, титр вируса составлял 5,77 lg ТЦД₅₀/см³.

Индекс нейтрализации составил 2,88 lg ТЦД₅₀/см³, это свидетельствует о том, что тип исследуемого вируса соответствует типу специфической сыворотки.

Пример 5

Изучение биологических свойств штамма «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита КРС (определение патогенности для КРС).

При внутривенном заражении КРС (5 голов) очищенной вируссодержащей культуральной жидкостью в объеме 2 см³ с титром инфекционной активности 5,0 lg ТЦД₅₀/см³ инкубационный период составил 8÷9 дней. На 10 сутки после заражения у животных наблюдали характерные клинические признаки ЗУД: появление множественных бугров размером от 0,5 до 1 см и эрозий (на мошонке, слизистой оболочке ноздрей и носовом зеркале, размером до 1÷2 см в диаметре).

На 14 сут количество нодул увеличилось в 2÷3 раза. Они были круглой, овальной и неправильной формы (размер от 1 до 3 см) и локализовались по всему телу и регистрировались на слизистой ноздрей и носовом зеркале. В отдельных местах нодулы объединялись и образовывали конгломераты размером до 5÷6 см. Конъюнктива глаз была гиперемирована. Поверхностные лимфатические узлы (предлопаточный, подчелюстной, подколенный и паховый) были увеличены примерно в 1,5 раза.

На 20 сут у животных клинические признаки заболевания сохранялись и характеризовались образованием множественных узлов размером от 0,5 до 2,5 см и более, расположенными по всей поверхности тела. Слизистая носовых ходов была гиперемирована, на мошонке наблюдались единичные эрозии, лихорадка сохранялась. Кроме того, наблюдали отеки подгрудка, суставов, множественные поражения на слизистой носовых ходов.

На 40÷45 сут на месте образования первых нодул в области морды, мошонки и внутренней поверхности бедра происходило образование струпьев.

Таким образом, при заражении естественно восприимчивых животных вируссодержащим материалом воспроизведена генерализованная форма инфекции. Специфичность заболевания животных подтверждена ПЦР исследованиями биоматериала и методом вирусовыделения в культуре клеток.

Для изучения контагиозности штамма «Приволжский» вируса ЗУД КРС было сформировано 3 группы животных (быки черно-пестрой породы), по 5 голов в каждой группе.

Животным первой группы вводили внутривенно очищенную культуральную вируссодержащую жидкость в объеме 2 см³ с титром инфекционной активности 5,0 lg ТЦД₅₀/см³, животные второй группы являлись контрольными и содержались в одном боксе с инфицированными животными на протяжении всего опыта. Третья группа животных была сформирована на 36-е сутки с момента начала опыта и также являлась контрольной, данная группа содержалась вместе с зараженными животными и животными второй группы. Животные содержались в специализированном лабораторно-виварном комплексе, обеспечивающем защиту от проникновения насекомых и грызунов.

За животными вели наблюдение в течение 64 суток. При этом ежедневно проводилась термометрия и регистрация клинических признаков данного заболевания, а также отбор проб биоматериала.

Через 10 дней после инфицирования у животных первой группы отмечали развитие характерных клинических симптомов ЗУД: множественные бугры (нодулы) в области шеи, лопаток, крупе, на боках размером 0,5÷1,5 см, отдельные до 2,5÷3 см; эрозии на мошонке, слизистой оболочке ноздрей и носовом зеркале, размером до 1÷2 см в диаметре.

Через 21 день после инфицирования животных первой группы (или через 11 дней после развития характерной клинической картины) у контрольных животных второй группы регистрировали в ПЦР выделение генома ЗУД с носовыми истечениями.

Через 30 дней после инфицирования животных первой группы (или через 20 дней после развития характерной клинической картины) у контрольных животных второй группы развивались характерные клинические симптомы ЗУД: увеличенные лимфоузлы, множественные узелковые поражения кожи, размером 0,5÷1,5 см, иногда до 3÷4 см, эрозийные поражения слизистых оболочек носа.

Через 36 дней после инфицирования животных первой группы (или через 26 дней после развития характерной клинической картины) в бокс, где содержались животные группы 1 и 2 были дополнительно введены 5 здоровых животных (группа 3), с целью повторного воспроизведения опыта:

- через 6 дней после постановки (42÷й день опыта), у животных третьей группы регистрировали в ПЦР выделение генома ЗУД в окулярных смывах;

- через 24 дня после постановки (60÷й день опыта), у животных третьей группы регистрировали характерные симптомы ЗУД: множественные узелковые поражения кожи, размером 0,5÷1,5 см, иногда до 2÷2,5 см, эрозийные поражения слизистых оболочек.

Результаты изучения контагиозности штамма «Приволжский» вируса ЗУД КРС позволили сделать вывод о выявлении у возбудителя свойств, ранее не характерных для болезни - кроме основного, трансмиссивного пути распространения, полученный штамм приобрел выраженное свойство контактного пути заражения (передачи).

Пример 6

Идентификация и филогенетическое родство штамма (ПЦР).

Видовая принадлежность штамма «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита КРС к вирусу ЗУД подтверждена методом локусного секвенирования по Сангеру (Applied Biosystems, США). Установлено, что штамм «Приволжский» принадлежит к группе вирусов ЗУД КРС.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение штамма «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) крупного рогатого скота для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота:

1. ГОСТ 28085-13 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности».

2. Кодекс здоровья наземных животных МЭБ / Т. 1. - 23 изд. - Paris, 2014. - Гл. 1.2. Критерии включения болезней, инфекций и инфестаций в список МЭБ. - С. 5.

3. Кононов А.В., Кононова С.В., Шумилова И.Н. [и др.] Культурально-биологические свойства возбудителя нодулярного дерматита крупного рогатого скота, выделенного на территории Российской Федерации в 2015 году: научное издание / // Ветеринария сегодня. - 2016. - №3. - С. 8-18.

4. Троценко, Н.И. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н.И. Троценко, Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская. - М.: Колос, 2000. - 272 с.

5. Официальный сайт Международного эпизоотического бюро (МЭБ) - URL: http://www.oie.int/eng/info/

6. Пат. 235537 РФ, МПК C12N 5/06 Линия клеток яичников домашней Capra hircus L. ЯДК-04 для репродукции вирусов животных / Герасимов В.Н., Герасимова Н.И., Дьяконов Л.П., Груздев К.Н., Захаров В.М., Манин Б.Л. - №2006114337/13; заявл. 26.04.2006, опубл. 10.10.2008

7. Пат. 2606254 РФ, МПК C12N 7/00 Штамм вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота Dermatitis nodularis bovum, рода Capripoxvirus для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота / С.В. Кононова, А.В. Кононов, И.Н. Шумилова [и др.] - №2606254; заявл. 11.05.2016, опубл. 10.01.2017.

8. Пат. 2647757 РФ, МПК C12N 7/00 Штамм " Волгоградский " вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота для вирусологических, молекулярно-генетических, мониторинговых исследований, изготовления вакцин и диагностических препаратов / С.П. Живодеров, Н.И. Сальников, Т.Р. Усадов [и др.] - №201615397; заявл. 21.11.2016, опубл. 19.03.2018.

9. Россельхознадзор / Официальный сайт федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору. - URL: http://www.fsvps.ru/fsvps/iac/foreign.html

10. Beard, P.M. Lumpy skin disease: a direct threat to Europe. // Vet Rec., 2016, V. 28, P. 557-558.

11. Evaluation of different diagnostic methods for diagnosis of lumpy skin diseases in cows / W.S. Awad, A.K. Ibrahim, K. Mahran [et al.] // Trop. Anim. Health. Prod. - 2010. - Vol. 42. - P. 777-783.

12. M, M. Epidemiological and Molecular Studies on Lumpy Skin Disease Outbreaks in Turkey during 2014-2015 // Transbound Emerg Dis. 2016 (in Press).

13. Sprygin A, Pestova Y, Prutnikov P, Kononov A. Detection of vaccine lumpy skin disease virus in cattle and Musca domestica L. flies in an outbreak of lumpy skin disease in Russia in 2017. Transboundary and Emerging Diseases. 2018. doi: 10.1111/tbed.12889.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота (ЗУД КРС). депонирован в Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №112-деп / 19-2 - КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Штамм репродуцируется в культурах клеток ТЯ, ПБ и ЯДК-04 в течение 2÷3 суток и накапливается в титре от 4,5 до 6,0 lg ТЦД₅₀/см³, сохраняет исходные характеристики при пассировании в культурах клеток ТЯ, ПБ и ЯДК-04 в течение 5 пассажей. 8 ил., 5 табл., 6 пр.

Штамм «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота сем. Poxviridae, род Capripoxvirus, депонированный в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №112 - деп / 19-2 - КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота.