Тест-система ИФА для серологической диагностики нодулярного дерматита крупного рогатого скота - Dermatitis nodularis bovum Российский патент 2017 года по МПК G01N33/569 G01N33/543 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности созданию тест-системы ИФА с использованием вируса нодулярного дерматита (ВНД) КРС при разработке и производстве средств диагностики.

Нодулярный дерматит (кожная бугорчатка, узелковый дерматит, кожно-узелковая сыпь, болезнь «кожного отека» у буйволов, «лоскутная» болезнь кожи, вирусная заразная бугорчатка кожи, узелковая экзантема крупного рогатого скота) - болезнь КРС, характеризующаяся лихорадкой, поражением лимфатической системы, отеками подкожной клетчатки и внутренних органов, образованием кожных узелков (бугров), поражением глаз и слизистых оболочек дыхательного и пищеварительного трактов [1, 4].

Возбудитель - ДНК содержащий вирус Dermatitis nodularis bovum (лат.) или Lumpy skin disease virus - LSDV (англ.). В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of viruses (ICTV)), относится к роду Capripoxvirus семейства Poxviridae, который имеет антигенное родство со штаммами вирусов оспы овец (SPPV - sheeppox virus) и оспы коз (GTPV - goatpox virus). Согласно Руководству МЭБ (OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccine for Terrestrial Animals, 2012) у всех штаммов рода Capripoxvirus бычьего, овечьего или козьего происхождения есть общий главный сайт нейтрализации [3, 7].

Заболевание проявляется в теплое время года, в период биологической активности кровососущих насекомых, быстро распространяется и протекает в виде энзоотии и эпизоотии. Болезнь более распространена в низменных районах вдоль водостоков в местах с высокой плотностью кровососущих насекомых [1, 6].

Нодулярный дерматит КРС ежегодно встречается в Израиле, Ливане, Иордании, Палестине, Ираке и Египте. Имеются сведения о возникновении болезни в Турции, Азербайджане, Армении и России [7].

Нодулярный дерматит КРС наносит значительный ущерб животноводству, обусловленный снижением привесов, молочной продуктивности, истощением животных, а в отдельных случаях - их гибелью.

Согласно ранее существовавшей классификации инфекционных болезней нодулярный дерматит относится к группе особо опасных болезней крупного рогатого скота. В настоящее время болезнь включена в список МЭБ и подлежит обязательной нотификации [3]. Узелковый дерматит КРС отсутствует в «Перечне заразных, в том числе особо опасных болезней», по которым устанавливаются ограничения (карантин), утвержденным приказом Минсельхоза РФ №476 от 19 декабря 2011 г.

В связи с возникновением заболевания в Российской Федерации возникла необходимость иметь высокоэффективные диагностические препараты, которые позволили бы идентифицировать возбудителя нодулярного дерматита КРС. Это обстоятельство требует постоянных поисков штаммов, пригодных для изготовления средств диагностики нодулярного дерматита КРС.

Для лабораторной диагностики различных болезней животных используется метод ИФА, главными достоинствами которого являются высокая чувствительность, специфичность и экспрессность.

Для оценки иммунобиологических свойств ВНД КРС, а также для контроля качества антигенного сырья, используемого при производстве диагностических наборов, актуальной является разработка тест-системы для серологической диагностики нодулярного дерматита КРС.

В настоящее время ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современными методами и средствами для серологической диагностики нодулярного дерматита КРС.

Целью изобретения является создание тест-системы ИФА для серологической диагностики нодулярного дерматита КРС.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит специфический антиген ВНД КРС штамм «Э-95», а метод твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта основан на взаимодействии исследуемого антигена вначале с адсорбированными на поверхности улавливающими антителами (специфическая поликлональная сыворотка кролика), затем с детекторными антителами (специфическая поликлональная сыворотка морской свинки). Образовавшийся иммунный комплекс выявляют с помощью антител против IgG морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата.

Технический результат от изобретения заключается в разработке современной, высокоспецифической тест-системы, предназначенной для выявления антигена ВНД КРС методом твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа, вследствие применения штамма ВНД КРС «Э-95» при получении специфических компонентов реакции для ИФА.

В состав предлагаемой тест-системы ИФА входят:

1. Культуральный положительный антиген вируса нодулярного дерматита КРС штамм «Э-95» - 1 см³.

2. Культуральный отрицательный нормальный антиген - 1 см³.

3. Улавливающие антитела - специфическая гипериммунная поликлональная сыворотка кролика - 1 см³.

4. Детекторные антитела - специфическая гипериммунная поликлональная сыворотка морской свинки - 1 см³.

5. Антивидовой конъюгат - иммуноглобулины против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена - 1 см³.

6. 0,05М карбонат-бикарбонатный буфер (рН 9,5-9,6) для разведения антигена - 1,59 г NaCO₃, 2,93 г NaHCO₃ на 1000 см³ воды - хранить при 4-8°С не более недели.

7. Трис-буферный раствор (ТБР) (рН 7,4-7,6) - 8,7 г 0,15 М NaCl, 1,2 г 0,01 М трис НС1 на 1000 см³ воды - хранить при 4-8°С не более недели.

8. Промывочный буферный раствор ТБР с твином-20 (ТБР-Т) - 1000 см³ ТБР, 1 см³ Твин-20 (0,1%-ный раствор).

9. Блокирующий буферный раствор (рН 7,4-7,6), содержащий 10 см³ ТБР, 1 г сухого молока (10%-ный раствор).

10. Буфер для разведений проб и конъюгата, содержащий 100 см³ ТБР-Т, 1 г сухого молока (1%-ный раствор).

11. Раствор АБТС (2,2-азино-ди-(3-этилбензоаминосульфонат) - 50 см³.

12. Раствор, останавливающий окраску - 1%-ный раствор ДСН (додецилсульфат натрия) - 50 см³.

Сущность изобретения поясняется чертежами.

На фиг. 1 - схема твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

На фиг. 2 - схема расположения контрольных и испытуемых проб.

На фиг. 3 - электрофорез антигена ВНД в 12% полиакриамидном геле.

На фиг. 4 - дендрограмма, видовая принадлежность штамма «Э-95» методом секвенирования.

На фиг. 5 - структура штамма «Э-95» ВНД КРС, установленная методом электронной микроскопии.

На фиг. 6 - зависимость между инфекционным титром ВНД (lg ТЦД₅₀) и титром вирусного антигена в ИФА (lg Т_ИФА).

Разработанный метод твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА основан на взаимодействии исследуемого антигена вначале с адсорбированными на поверхности улавливающими антителами (специфическая поликлональная сыворотка кролика), а затем с детекторными антителами (специфическая поликлональная сыворотка крови морской свинки). Образовавшийся иммунный комплекс выявляют с помощью антител против IgG морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена, и хромогенного субстрата. Схема твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА представлена на фиг. 1.

Для сенсибилизации планшета используют специфическую сыворотку крови кроликов в рабочем разведении 1:4000 на карбонатно-бикарбонатном буфере. В каждую лунку вносят по 100 мкл. Планшет инкубируют при температуре 4-8°С в течение 18-20 ч. Не отмывая планшета вносят блокирующий трис-буферный раствор с 10% сухим молоком, инкубируют 1 ч при температуре (37±0,5)°С. После отмывки лунок ТБР-Т вносят положительный и отрицательный контрольные антигены и испытуемые пробы в разведении с 1:2 до 1:256 по 100 мкл на лунку. Разведения готовят на ТБР-Т с добавлением 1% сухого молока и инкубируют 1 ч при температуре (37±0,5)°С. После промывки планшета в каждую лунку вносят рабочее разведение детекторных антител (1:3000), в качестве которых используют специфическую сыворотку крови морской свинки. Разведения готовят на ТБР-Т с добавлением 1% сухого молока и вносят по 100 мкл на лунку, инкубируют 1 ч при температуре (37±0,5)°С. После промывания планшета наносят антивидовой конъюгат в рабочем разведении 1:500 по 100 мкл во все лунки. Планшет инкубируют 1 ч при температуре (37±0,5)°С. Промывку лунок проводят 3-5 раз после каждого инкубирования.

Внесение субстрата. Раствор АБТС вносят по 100 мкл во все лунки планшета. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 мин до полного окрашивания контролей.

Остановку реакции проводят путем внесения 1%-ного раствора ДСН по 100 мкл в каждую лунку.

Схема расположения контрольных и испытуемых проб представлена на фиг. 2.

Результат учитывают регистрируя ОП при длине волны 405 нм. Титром антигена считают последнее разведение, ОП которого была больше или равно удвоенному среднему значению ОП отрицательного контроля (реакция с нормальным антигеном).

В результате проведенных экспериментов были оптимизированы условия постановки реакции. Концентрация детекторных антител, определенная в непрямом варианте ИФА, составила 1:3000, а антивидового конъюгата 1:500; рабочее разведение улавливающих антител, определенное путем постановки твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, составило 1:4000. С использованием разработанной методики проведено исследование образцов культуральных антигенов ВНД КРС, а также суспензии из патологического материала от КРС с определением титра инфекционной активности ВНД КРС на культуре клеток.

Разработанный вариант ИФА позволяет тестировать одновременно в формате 96-луночного планшета до 24 проб антигена в разведении с 1:2 до 1:16. Срок годности предлагаемой тест-системы 12 мес со дня изготовления при температуре 4-8°С.

Контроль штамма «Э-95» ВНД КРС на специфичность.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма ВНД КРС «Э-95», был выделен в Эфиопии в 1993 году от коров, больных нодулярным дерматитом. Депонирован 01 декабря 2015 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») под регистрационным номером, авторским наименованием - штамм ВНД КРС «Э-95» (диагностический).

Генотаксономическая характеристика штамма «Э-95» ВНД КРС.

Возбудителем болезни является вирус нодулярного дерматита КРС, который имеет антигенное родство со штаммами вирусов, вызывающих оспу овец и коз, вместе с ним образуют род Capripoxvirus семейства Poxviridae.

В центре вириона находится нуклеоид, содержащий ДНК. К нему прилегают боковые тела, придающие нуклеоиду вид гантели, и наружная двухслойная оболочка. Геном состоит из 150-160 тыс. пар нуклеотидов. ДНК не обладает инфекционностью, 88% массы вириона составляют белки, 5% - ДНК, 4% - липиды и 3% - углеводы.

Видовая принадлежность штамма «Э-95» к вирусу нодулярного дерматита подтверждена методом видовой дифференциации каприпоксвирусов, основанном на ПЦР.

Электрофорез препаратов антигена вируса нодулярного дерматита КРС штамм «Э-95» проводили в 12% полиакриамидном геле при постоянном напряжении 200V. Белковые образцы денатурировали при 100°С за 5 мин в присутствии 0,5М трисHCl (рН 6,8), 4% додецил сульфата натрия, 0,2% бромфенолового синего, 20% глицерина, 4% β-меркаптоэтанола. Молекулярный вес белков определяли в соответствии со стандартными маркерными белками 250 kd, 150 kd, 100 kd, 75 kd, 50 kd, 37 kd, 25 kd, 20 kd, 15 kd и 10 kd (Preciosion Plus Protein Standards, Bio-Rad Laboratories, Inc., USA).

Положительный результат получен на основные структурные белки каприпоксвируса, молекулярный вес которых составляет 67, 32, 26 и 17 kd. В то же время наличие положительной реакции на белок каприпоксвируса с молекулярным весом 32 kd подтверждает специфичность реакции (OIE «Manual of Diagnostic Tests and vaccine for Terrestrial Animals, 2012») (фиг. 3).

Специфический фрагмент ДНК длиной 254 п.н. был получен в ПЦР с праймерами, специфичными для вируса нодулярного дерматита. С двумя другими парами праймеров, специфичными для вируса оспы овец и вируса оспы коз, в ПЦР был получен отрицательный результат. Это подтверждает принадлежность штамма «Э-95» к виду Dermatitis nodularis bovum, свидетельствует об отсутствии контаминации штамма другими каприпоксвирусами.

Дополнительно видовая принадлежность штамма ВНД КРС «Э-95» подтверждена секвенированием. Была определена нуклеотидная последовательность фрагмента открытой рамки считывания 026 (ОРС-026) и проведен ее сравнительный анализ. Он показал, что по первичной структуре ОРС-026 штамм «Э-95» идентичен изолятам и штаммам вируса нодулярного дерматита, представленным в международных базах данных и базе данных ФГБУ «ВНИИЗЖ» (фиг. 4).

Методом ПЦР проводили исследование нуклеиновой кислоты, выделенной из исследуемого образца штамма ВНД КРС «Э-95», на наличие геномов возбудителей инфекционного ринотрахеита, респираторно-синцитиальной инфекции, парагриппа-3, вирусной диареи, ротавирусной инфекции, коронавирусной инфекции и микоплазмоза (М. bovis, М. bovigenitalium, М. dispar) КРС.

В результате контроля было установлено, что штамм ВНД КРС «Э-95» не контаминирован указанными посторонними вирусами и микоплазмами.

Биологические характеристики.

Биологические методы включают адаптацию вируса, выделенного от больных коров, к культуре клеток ЯДК-04 [5]. В процессе адаптации было установлено, что перевиваемая культура клеток ЯДК-04 высокочувствительна к ВНД и оказалась оптимальной при получении расплодки штамма для изготовления антигена.

Штамм ВНД КРС «Э-95» проявляет высокую биологическую и антигенную активность в лиофилизированном виде и в виде культуральной вируссодержащей суспензии, предназначен для изготовления диагностических препаратов, репродуцируется в монослойной культуре клеток ЯДК-04 в течение 2-3 суток инкубирования и накапливается в титре не менее 6,25 lg ТЦД₅₀/см³. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в культуре клеток ЯДК-04 в течение 10 пассажей.

Титр штамма ВНД КРС «Э-95» 6, 7, 8, 9 и 10 пассажей составляет в пределах от 6,25 до 6,5 lg ТЦД₅₀/см³. Данные титрования представлены в таблице 1.

Подтверждение отсутствия контаминации бактериальной, грибной микрофлорой и микоплазмами исследуемого штамма ВНД КРС «Э-95» проводили в соответствии с ГОСТ 28085-13 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности». Установлено, что штамм ВНД КРС «Э-95» не контаминирован бактериями, грибами и микоплазмами.

Физические свойства.

Электронно-микроскопическим методом установлена типичная структура Capripoxvirus штамма «Э-95» ВНД КРС, который имеет размер по большой оси форму эллипса 150×200 нм, по малой оси - сферическую форму 180×200 нм (фиг. 5).

Устойчивость к внешним факторам.

ВНД КРС стабилен между рН 6,6 и 8,6, показывает незначительное снижение титра в течение 5 дней при температуре (37±0,5)°С. Вирус хорошо переносит 3-кратное замораживание и оттаивание, но чувствителен к 20%-ному раствору эфира, хлороформу, высокой температуре, крайне стабилен в окружающей среде и при комнатной температуре инфекционность сохраняется в течение 18 дней, в пораженных участках кожи не менее 33 дней, в слюне - 11, сперме быков - 22 дней, в культуре клеток при 4°С - 6 месяцев, сохраняет жизнеспособность в течение 10 лет при температуре минус 80°С.

В результате проведения последовательных пассажей на культуре клеток ЯДК-04 был получен штамм ВНД КРС «Э-95», имеющий стабильные биотехнологические и антигенные свойства и пригодный для изготовления и получения антигенов и сывороток для диагностики нодулярного дерматита КРС.

Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Получение антигена ВНД КРС.

Для приготовления антигена для диагностических целей ВНД КРС культивируют в матрасах на КК ЯДК-04, с титром инфекционной активности не ниже 5,5 lg ТЦД₅₀/см³. Инфицированную культуру инкубируют при температуре (37±0,5)°С до появления ЦПД вируса более чем 80% монослоя. Затем исходную вируссодержащую суспензию трехкратно замораживают-оттаивают. В полученную вирусную жидкость добавляют натрий хлористый до 0,5М и ПЭГ 6000 до 5% концентрации, растворяют при интенсивном перемешивании и смесь выдерживают в течение 16-18 ч при температуре 4-8°С до формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 80 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,01М фосфатно-буферном растворе (ФБР) в объеме 1/100 от первоначального объема суспензии и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость (первый элюат) осторожно сливают, осадок ресуспендируют в ФБР 1/100 от исходного объема и повторно центрифугируют в том же режиме. В аналогичном режиме обработки получают второй и третий элюаты, которые очищают центрифугированием через 20% сахарозу, приготовленную на ФБР, в течение 2 ч при 20000 об/мин. Полученные осадки (продукт очистки) ресуспендируют в минимальном количестве ФБР.

Первоначально вирусный материал очищают от клеточного дентрита центрифугированием в течение 30 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость отбирают, а осадок выбрасывают. Надосадок ультрацентрифугируют 1,5 ч при 25000 об/мин. Получившийся осадок ресуспендируют в ФБР в минимальном объеме, а затем ультрацентрифугируют в градиенте сахарозы 36%-ного раствора в течение 4 ч при 25000 об/мин. Полученный осадок растворяют в ФБР до минимального объема и в дальнейшем используют в качестве антигена для получения положительной сыворотки крови кроликов, морских свинок и постановки реакции ИФА для диагностики нодулярного дерматита КРС.

Пример 2

Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов.

Для получения специфических сывороток крови на штамм ВНД КРС «Э-95» используют клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяют концентрированный очищенный антиген ВНД КРС, полученный как описано в примере 1, из которого готовят эмульсию с использованием адъюванта Фрейнда (в соотношении 1:1). На первом этапе иммунизации эмульсию вводят в мякиши подушечек задних конечностей кролика в объеме 0,5 см³, на 7 день - в подколенные лимфоузлы в объеме 1,0 см³, через неделю - внутримышечно в бедро задней лапы в объеме 1,0 см³ и еще через 7 дней - подкожно в объеме 1,0 см³. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливают и получают сыворотку крови - улавливающие антитела, которую фасуют в 1,0 см стерильные флаконы, лиофильно высушивают, этикетируют и хранят при температуре 4-8°С.

Пример 3

Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок.

Для гипериммунизации морских свинок используют эмульсию очищенного препарата антигена, полученного как описано в примере 1, с адъювантом Фрейнда (в соотношении 1:1). Эмульсию вводят в заднебедренную группу мышц морской свинки в дозе 1,0 см³. Через 21 день инъекцию повторяют. Обескровливают животных спустя 10 дней после окончания гипериммунизации.

Индивидуальные пробы сывороток проверяют на активность и специфичность в непрямом варианте ИФА. Специфическая активность гипериммунных сывороток составляет 1:400-1:3200 (таблица 2).

Полученные гипериммунные сыворотки крови кроликов и морских свинок используют в твердофазном непрямом «сэндвич»-варианте ИФА для диагностики нодулярного дерматита КРС при исследовании патматериала от КРС и культурального ВНД с инфекционной активностью в КК ЯДК-04 в пределах 3,5-6,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Пример 4

Применение тест-системы твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

1. Приготовление рабочих растворов и буферных смесей

Перед постановкой реакции готовят:

Адсорбционный 0,05 М карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ), рН 9,5-9,6, предназначен для растворения и сорбции антигена в лунке планшета. 1,59 г NaCO₃ и 2,93 г NaHCO₃ растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды. Готовый раствор хранят при температуре 4-8°С не более недели.

Трис-буферный раствор (ТБР), рН-7,4-7,6, является основным раствором для приготовления промывочного буфера и буфера для разведения проб и конъюгата: 8,7 г 0,15 М NaCl и 1,2 г 0,01 М трис HCl растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды. Готовый раствор хранят при температуре 4-8°С не более недели.

Промывочный трис - буферный раствор с твином-20 (ТБР-Т) предназначен для удаления из планшета не связавшихся компонентов, а также для разведения антивидового конъюгата: 1000 см³ ТБР и 1 см³ Твин-20 (0,1%-ный раствор).

Блокирующий буферный раствор, рН 7,4-7,6, содержащий 10 см³ ТБР-Т и 1 г сухого молока (10%-ный раствор).

Буфер для разведения проб и конъюгата, рН-7,4-7,6: 100 см³ ТБР-Т и 1 г сухого молока (1%-ный раствор).

В качестве субстрата для пероксидазы хрена используют готовый раствор АБТС (2,2-азино-ди-(3 этилбензотиазолин сульфонат), который прогревают при комнатной температуре до внесения в лунки планшета.

Раствор, останавливающий окраску - 1%-ный раствор ДСН (додецилсульфонат натрия).

Воду для приготовления растворов используют дистиллированную с рН 6,0.

2. Определение рабочего разведения детекторных антител и антивидового конъюгата

Оптимальную концентрацию детекторных антител и антивидового конъюгата определяют путем постановки прямого варианта ИФА. В вертикальные ряды лунок планшета для ИФА вносят по 100 мкл серийных двукратных разведений на карбонатно-бикарбонатном буфере специфической гипериммунной сыворотки морской свинки (детекторные антитела) с 1:200 до 1:25600. Инкубируют в течение 18-20 ч при температуре 4-8°С.

Для блокирования вносят во все лунки планшета по 100 мкл блокирующего раствора, инкубируют в течение 1 ч при температуре (37±0,5)°С, затем стряхивают и промывают 3 раза ТБР-Т.

В горизонтальные ряды лунок планшета вносят по 100 мкл разведений антител против IgG морской свинки на ТБР-Т с добавлением 1% сухого молока с 1:100 до 1:12800, инкубируют при температуре (37±0,5)°С в течение 1 ч, затем стряхивают и промывают 3 раза ТБР-Т.

Во все лунки планшета вносят по 100 мкл субстрата АБТС, инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку 100 мкл 1%-ного раствора ДСН. Реакцию учитывают с помощью многоканального спектрофотометра, регистрируя оптическую плотность (ОП) при длине волны 405 нм.

За рабочее разведение каждого из титруемых компонентов (детекторные антитела и антивидовой конъюгат) принимают последнее разведение каждого из них, обеспечивающее ОП 1,0-1,5 ед.

3. Определение рабочего разведения улавливающих антител и антигена

Определение рабочего разведения улавливающих антител (специфическая сыворотка кролика) проводят путем постановки твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА по блок-схеме («шахматный» порядок постановки), используя серийные разведения тестируемых антител и антигенсодержащего культурального препарата с использованием детекторных антител морской свинки и антивидового конъюгата в рабочих разведениях.

В вертикальные ряды планшета вносят по 100 мкл двукратных серийных разведений улавливающих антител на карбонатно-бикарбонатном буфере с 1:100 до 1:204800, инкубируют в течение 18-20 ч при температуре 4-8°С.

Для блокирования вносят во все лунки планшета по 100 мкл блокирующего раствора. Планшет инкубируют в течение 1 ч при температуре (37±0,5)°С, затем стряхивают и промывают 3 раза ТБР-Т.

В горизонтальные ряды сенсибилизированного планшета вносят по 100 мкл антигенсодержащую суспензию (антигенсодержащего культурального препарата) в разведениях с 1:2 до 1:256 на ТБР-Т с добавлением 1% сухого молока. Планшет инкубируют при температуре (37±0,5)°С в течение 1 ч, затем стряхивают и промывают 3 раза ТБР-Т.

Рабочее разведение антивидового конъюгата готовят, исходя из его активности, и вносят во все лунки планшета по 100 мкл на ТБР-Т с добавлением 1% сухого молока. Планшет инкубируют при температуре (37±0,5)°С в течение 1 ч, затем стряхивают и промывают 5 раз ТБР-Т.

В лунки планшета вносят по 100 мкл субстрата АБТС, инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку 100 мкл 1%-ного раствора ДСН.

Реакцию учитывают с помощью многоканального спектрофотометра, регистрируя ОП при длине волны 405 нм.

За рабочее разведение улавливающих антител принимают последнее разведение, обеспечивающее ОП 1,0-1,5 ед.

Реакция с нормальным антигеном не должна превышать фоновый уровень.

4. Сенсибилизация планшета

Рабочее разведение улавливающих антител готовят на карбонатно-бикарбонатном буфере и вносят по 100 мкл на лунку планшета. Планшеты инкубируют при температуре 4-8°С в течение 18-20 ч. Затем содержимое планшета удаляют.

5. Блокирование

Для блокирования мест неспецифического связывания на твердофазном сорбенте вносят по 100 мкл блокирующего раствора в лунки планшета и инкубируют в течение 1 ч при температуре (37±0,5)°С. Затем содержимое планшета удаляют и отмывают ТБР-Т не менее 3 раз.

6. Внесение исследуемых и контрольных образцов

На ТБР-Т с добавлением 1% сухого молока готовят последовательные двукратные разведения исследуемых образцов антигена и контрольных (отрицательного и положительного) препаратов, которые затем переносят в вертикальные ряды планшета в объеме 100 мкл на лунку. Инкубируют в течение 1 ч при температуре (37±0,5)°С, после чего содержимое планшета удаляют и промывают ТБР-Т не менее 3 раз.

7. Внесение детекторных антител

Во все лунки планшета вносят рабочее разведение детекторных антител в объеме 100 мкл и инкубируют в течение 1 ч при температуре (37±0,5)°С. Затем содержимое планшета удаляют и промывают ТБР-Т не менее 3 раз.

8. Внесение антивидового конъюгата

Рабочее разведение антител против IgG морской свинки готовят на ТБР-Т с добавлением 1% сухого молока и вносят по 100 мкл в лунки планшета. Планшет инкубируют в течение 1 ч при температуре (37±0,5)°С, затем содержимое планшета удаляют и отмывают ТБР-Т не менее 5 раз.

9. Внесение субстрата и остановка реакции

В лунки планшета вносят по 100 мкл готового субстрата АБТС. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку 100 мкл 1%-ного раствора ДСН.

10. Учет результатов реакции

Результат реакции учитывают с помощью многоканального спектрофотометра при длине волны 405 нм.

Титром испытуемого образца считают его последнее разведение, в котором величина оптической плотности двукратно превышает ОП отрицательного контроля.

Пример 5

Контроль активности и специфичности штамма в реакции твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

При исследовании методом твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА антигена ВНД КРС «Э-95» было показано его специфическое взаимодействие только со специфическими компонентами реакции в разведении 1:4 и выше.

При определении специфичности метода непрямого «сэндвич»-варианта ИФА с различными гетерологичными антигенами было показано, что активность улавливающих антител с гетерологичными антигенами не превышала фоновый уровень.

Положительная реакция в ИФА вируссодержащих материалов составляет 1:4-1:32 (таблица 3).

Были установлены позитивно-негативные пороговые значения результатов реакции ИФА: титр <1:2 - отрицательно, 1:2 - сомнительно, 1:4 и выше - положительно. Как видно из данных, представленных в таблице, все пробы №1-12 с титром инфекционной активности 3,5-6,5 lg ТЦД₅₀/см³ были положительные в ИФА.

При использовании вышеуказанных компонентов ИФА в том числе буферных растворов можно исследовать 22 антигена ВНД КРС.

При определении гетерологичных антигенов ротавируса, вируса инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота, коронавируса КРС, вируса ящура - реакция была отрицательной, что свидетельствовало о специфичности реакции.

Пример 6

Определение диагностической чувствительности твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Данные исследования диагностической чувствительности твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА представлены в таблице 4.

Из данных таблицы следует, что в логарифмической размерности оценка среднего контраста исследуемых величин имела величину 3,910. Коэффициент вариации выборки составил 9,6%. Ошибка измерения среднего контраста была ±0,240.

В биологическом смысле это означает, что на одну оценочную единицу lg Т_ИФА в среднем приходилось 3,910 lg ТЦД₅₀ (т.е. 8128 ТЦД₅₀). С учетом стандартной ошибки измерения, данный показатель находился в границах 4677÷14125 (ТЦД₅₀). Установленные величины характеризуют относительную чувствительность разработанной тест-системы.

На фиг. 6 представлена зависимость между инфекционным титром ВНД (lg ТЦД₅₀) и титром вирусного антигена в ИФА (lg Т_ИФА). Дана диаграмма разброса значений lg Т_ИФА(♦) соответственно величинам lgTЦД₅₀. Приведена регрессионная модель вида lgТ_ИФА=0,219 (lgTЦД₅₀)±0,041, где lg Т_ИФА ^_ прогнозируемая оценка титра в ИФА для заданного lg ТЦД. Указан коэффициент адекватности регрессионной модели R²=0,402.

Дополнительно при оценке диагностической чувствительности тест-системы для серологической диагностики нодулярного дерматита крупного рогатого скота исследовали 13 проб, из которых 8 - вируссодержащей суспензии культурального вируса, а также 5 проб из узлов, образовавшихся на коже 5 голов крупного рогатого скота.

Диагностическая чувствительность реакции составила 100%.

Таким образом предлагаемая «Тест-система ИФА для серологической диагностики нодулярного дерматита крупного рогатого скота - Dermatitis Nodularis Bovum» является чувствительной и специфичной, позволяющая быстро в течение 24 ч провести диагностику нодулярного дерматита КРС - нового для Российской Федерации заболевания - отвечает современным требованиям и может быть внедрена в практику ветеринарных лабораторий.

Источники информации

1. Гуненков В.В. Заразный узелковый дерматит крупного рогатого скота // Сборник науч. тр. ВГНКИ. - М., 2005. - Т. 66. - С. 46-54.

2. Косарева О.А., Константинов А.В., Кукушкина М.С. Чувствительность перевиваемой культуры клеток гонад козы к вирусу нодулярного дерматита крупного рогатого скота // Ветеринарная патология. - 2011. - №3. - С. 95-97.

3. Кодекс здоровья наземных животных МЭБ / Т.1. - 23 изд. - Paris, 2014. - Гл. 1.2. Критерии включения болезней, инфекций и инфестаций в список МЭБ. - С.5.

4. Нодулярный дерматит (бугорчатка), клинические признаки при экспериментальном заражении крупного рогатого скота / О.А. Косарева, М.С. Кукушкина, А.В. Константинов и др. // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2010. - Т. 8. - С. 73-84.

5. Патент РФ 2335537, МПК C12N 5/06. Линия клеток яичников козы домашней Capra hircus L. ЯДК-04 для репродукции вирусов животных. Заявка №2006114337/13 от 26.04.2006, опубл. 10.10.2008.

6. Evaluation of different diagnostic methods for diagnosis of lumpy skin diseases in cows / W.S. Awad, A.K. Ibrahim, K. Mahran [et al.] // Trop. Anim. Health. Prod. - 2010. - Vol. 42. - P. 777-783.

7. Официальный сайт Международного эпизоотического бюро (МЭБ) - URL: http://www.oie.int/eng/info/

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к созданию тест-системы ИФА с использованием вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота при разработке и производстве средств диагностики. Тест-система для серологической диагностики нодулярного дерматита КРС содержит культуральный положительный антиген вируса нодулярного дерматита КРС штамма «Э-95», культуральный отрицательный нормальный антиген, улавливающие антитела - специфическую гипериммунную поликлональную сыворотку кролика, детекторные антитела - специфическую гипериммунную поликлональную сыворотку морской свинки, антивидовой конъюгат - иммуноглобулины против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена, 0,05М карбонат-бикарбонатный буфер, трис-буферный раствор, промывочный буферный раствор, блокирующий буферный раствор, буфер для разведений проб и конъюгата, раствор АБТС и раствор, останавливающий окраску, – 1%-ный раствор ДСН. Изобретение обеспечивает создание современной, высокоспецифической тест-системы, предназначенной для выявления антигена вируса нодулярного дерматита КРС методом твердофазного непрямого «сэндвич» - варианта ИФА, вследствие применения штамма «Э-95» при получении специфических компонентов реакции для ИФА. 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 табл., 6 пр.

1. Тест-система ИФА для серологической диагностики нодулярного дерматита крупного рогатого скота, представляющая собой непрямой вариант твердофазного ИФА, содержащая культуральный положительный антиген вируса нодулярного дерматита КРС, культуральный отрицательный нормальный антиген, улавливающие антитела - специфическую гипериммунную поликлональную сыворотку кролика, детекторные антитела - специфическую гипериммунную поликлональную сыворотку морской свинки, антивидовой конъюгат - иммуноглобулины против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена, 0,05М карбонат-бикарбонатный буфер, трис-буферный раствор, промывочный буферный раствор с твином-20, блокирующий буферный раствор, буфер для разведений проб и конъюгата, раствор АБТС, раствор, останавливающий окраску - 1%-ный раствор ДСН, отличающаяся тем, что в качестве культурального положительного антигена вируса нодулярного дерматита КРС содержит антиген вируса нодулярного дерматита КРС штамма «Э-95», депонированного в Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» под регистрационным номером, авторским наименованием - штамм ВНД КРС «Э-95» (диагностический).

2. Тест-система по п. 1, позволяющая обнаружить и определить количество антигена вируса нодулярного дерматита КРС в патологическом материале и инфицированных препаратах клеточных культур в титре 1:4-1:32.