Способ прогнозирования скорости прогрессирования рассеянного склероза у больных, получающих терапию препаратами интерферона-бета Российский патент 2019 года по МПК C12Q1/68 C12N1/00 

Изобретение относится к медицине, а именно неврологии, и может быть использовано для прогнозирования скорости прогрессирования рассеянного склероза (PC) у больных, получающих терапию препаратами интерферона-бета.

Все лица с установленным диагнозом PC получают терапию препаратами, изменяющими течение рассеянного склероза (ПИТРС) по федеральной льготе, согласно реестру пациентов по государственной программе «Семь нозологий» и приказом министерства здравоохранения РФ от 15.02.13 №69н (в ред. Приказа Минздрава России от 10.04.15 №181н) «О мерах по реализации постановления правительства российской федерации от 26 апреля 2012 г. N 404 «Об утверждении правил ведения федерального регистра лиц, больных гемофилией, муковисцидозом, гипофизарным нанизмом, болезнью Гоше, злокачественными новообразованиями лимфоидной, кроветворной и родственных им тканей, рассеянным склерозом, лиц после трансплантации органов и (или) тканей».

Одними из основных стартовых препаратов для лечения PC, зарегистрированных в РФ, являются препараты интерферона-бета, эффективность которых доказана в ряде фундаментальных исследований [А.Н. Бойко Выбор оптимального препарата для лечения рассеянного склероза. Медицинский совет. 2015; 5: 78-88]. Назначение препарата происходит на основе течения заболевания, выраженности клинических симптомов, а также с учетом противопоказаний. Оценка эффективности препарата происходит через 6-12 месяцев после его назначения, но нередко препарат оказывается неэффективным у конкретного больного и подлежит замене на другой, что негативно сказывается на состоянии больного. При динамическом наблюдении за эффективностью ПИТРС, тяжесть состояния оценивается в ходе неврологического осмотра при помощи шкалы функциональных систем Kurtzke с расчетом балла по Expanded Disability Status Scale (EDSS). Скорость прогрессирования PC определяется, как отношение балла EDSS к длительности заболевания. Значение скорости прогрессирования можно рассчитать только в процессе длительного наблюдения за больным. Скорость прогрессирования ≤0,25 балла/год считается низкой, скорость прогрессирования >0,25 балла/год, но ≤0,75 балла/год определяется, как умеренная; высокой считается скорость >0,75 балла/год [Гончарова З.А. Клинико-эпидемиологическая характеристика рассеянного склероза (проспективное 20-летнее исследование): Автореф. дис. д-ра мед. наук. Иваново 2012].

Недостатки: данный способ применим только в процессе лечения больного PC препаратами интерферона-бета, способ субъективный, т.к. зависит от квалификации врача.

Технический результат: возможность прогнозирования скорости течения PC до назначения лечения препаратами интерферона-бета, объективизация способа.

Указанный результат достигается за счет определения генетических маркеров в ДНК больного PC.

Способ осуществляют следующим образом:

У обследуемого больного из вены в пластиковую вакуумную пробирку с антикоагулянтом ЭДТА набирают 5-7 мл крови, вне зависимости от времени суток и приема пищи.

Далее производят выделение ДНК из пробы при помощи коммерческого набора ДНК-Экстран-1 ЗАО «Синтол», Россия (Кат. номер - ЕХ-509).

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразную цепную реакцию проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ThermoFisherScientific, AppliedBiosystems, США (Кат. номер - 4351379), где в качестве праймеров использованы участки ДНК: гена KIF1B С/Т (rs10492972), ZFHX4 C/G(rs11787532), STARD13 G/T(rs9527281), CIT С/Т(rs7308076), ZFAT A/C(rs733254).

Проводят реакцию амплификации с использованием набора 2,5х Реакционная смесь для проведения ПЦР, ЗАО «Синтол», Россия (Кат. номер - М 428).

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad, США [Руководство по эксплуатации систем ПЦР реального времени с флуоресцентной детекцией CFX96 Touch, CFX96 Touch Deep Well, CFX Connect и CFX384 Touch].

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап - активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°С; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°С), отжиг праймеров (20 с при 60°С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу FAM - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу VIC или HEX - для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (Cq1 для канала FAM, Cq2 для канала VIC (HEX) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов (Cq1/Cq2), полученных по двум каналам детекции, определяют состояние генов (генотип) KIF1B в исследуемом участке ДНК С/Т (rs10492972), ZFHX4 C/G (rs11787532), STARD13 G/T (rs9527281), CITC/T (rs7308076), ZFATA/C (rs733254), а также гена ZFAT в исследуемом участке ДНК А/С (733254) методом аллельной дискриминации. Возможны два генотипа: гомозиготный - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготный - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам определяют параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливают гетерозиготное или гомозиготное, состояние генов KIF1B С/Т (rs10492972), ZFHX4 C/G (rs11787532), STARD13 G/T (rs9527281), CIT C/T (rs7308076), ZFAT A/C (rs733254).

В случае гетерозиготного генотипа для определения доминирующей аллели определяют числовое значение соотношения номеров пороговых циклов амплификации по каналам FAM и VIC (HEX). Для полиморфизма rs10492972 гена KIF1B, если Cq1/Cq2≤1,047, то преобладает аллель Т, если Cq1/Cq2>1,047, то доминирует аллель С. Для полиморфизма rs11787532 гена ZFHX4, если Cq1/Cq2≤1,017, то преобладает аллель G, если Cq1/Cq2>1,017, то доминирует аллель С. Для полиморфизма rs9527281 гена STARD13, если Cq1/Cq2≤0,894, то преобладает аллель Т, если Cq1/Cq2>0,894, то доминирует аллель G. Для полиморфизма rs7308076 гена CIT, если Cq1/Cq2≤0,957, то преобладает аллель Т, если Cq1/Cq2>0,957, то доминирует аллель С. Для полиморфизма rs733254 гена ZFAT, если Cq1/Cq2≤1,033, то преобладает аллель С, если Cq1/Cq2>1,033, то доминирует аллель А.

После определения доминирующей аллели каждого из полиморфизмов на каждого пациента составляют формулу гаплотипа, где в зависимости от преобладающей аллели гетерозиготный генотип записывают следующим образом Т>С или С>Т для rs10492972 гена KIF1B; G>C или C>G для rs11787532 гена ZFHX4; T>G или G>T для rs9527281 гена STARD13; Т>С или C>Т для rs7308076 гена CIT; А>С или C>A для rs733254 гена ZFAT.

Конкретная формула гаплотипа, указывающая на высокую скорость прогрессирования PC, определена методом множественного анализа частоты встречаемости аллелей с использованием программного пакета SNPstats, Institut Catala d'Oncologica, Испания.

При наличии генотипа Т/Т или Т>С rs10492972, генотипа G/G или G>C rs11787532, генотипа Т/Тили T>G rs9527281, генотипа С/С или C>Т rs7308076, генотипа А/А или А>С rs733254, то есть наличия гаплотипа TGTCA, прогнозируют высокую скорость прогрессирования PC у больных, получающих терапию препаратами интерферона-бета.

Пример 1

Больная З., 41 год. Дебют PC в возрасте 39 лет с чувствительных нарушений. Диагноз PC установлен в 2015 году, длительность заболевания на момент осмотра составила 2,5 года. С момента дебюта принимает Интерферон-бета 1а, на фоне чего имела 3-4 обострения, купированные приемом кортикостероидной терапии. На момент осмотра в неврологическом статусе отмечается умеренный тетрапарез с акцентом в ногах и слева, стволовые нарушения, чувствительные нарушения, умеренные тазовые нарушения по типу императивных позывов и недержания; выраженный астенический синдром. Способность к передвижению ограничена 200 м. Балл по EDSS -5,5. Скорость прогрессирования высокая -2,2 балла в год.

Диагноз: PC, рецидивирующе-ремиттирующее течение, с высокой скоростью прогрессирования (наличие в геноме гаплотипа TGTCA).

Рекомендована замена медикаментозной терапии.

Пример 2

Больной П., 40 лет. Дебют PC в возрасте 36 лет с координаторных нарушений. Диагноз PC установлен в 2014 году, длительность заболевания на момент осмотра составила 4 года. ПИТРС принимает в течение 3,5 лет (Интерферон-бета 1а). На фоне терапии имелось одно обострение, купированное не полностью. В статусе отмечается умеренный спастический тетрапарез с акцентом в ногах, выраженный атактический синдром, легкие стволовые нарушения, умеренные чувствительные и тазовые нарушения. Балл по EDSS-4,0. Скорость прогрессирования -1,0 балл в год.

Диагноз: PC, рецидивирующе-ремиттирующее течение, с высокой скоростью прогрессирования (наличие в геноме гаплотипа TGTCA).

Рекомендована замена медикаментозной терапии.

Пример 3

Больной С., 52 года. Дебют PC в возрасте 32 лет в виде ретробульбарного неврита. Диагноз PC установлен в 1995 году, длительность заболевания на момент осмотра составила 20 лет. В течение 6 лет получает Интерферон-бета1а. За время приема препарата 3 обострения, купированные курсами кортикостероидной терапии. На момент осмотра в неврологическом статусе отмечаются умеренные двигательные нарушения в виде тетрапареза с акцентом справа; умеренного атактического синдрома, умеренных тазовых нарушений по типу императивных позывов, нарушения зрения. В ходьбе ограничен незначительно, проходит более 500 м без отдыха. Балл по EDSS-4.0. Скорость прогрессирования низкая, 0,2 балла в год.

Диагноз: PC, рецидивирующе-ремиттирующее течение, с низкой скоростью прогрессирования (присутствие гаплотипа TCGTC, отсутствие в геноме гаплотипа TGTCA). Назначенная терапия эффективна.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ прогнозирования скорости прогрессирования рассеянного склероза у больных, получающих терапию препаратами интерферона-бета. Изобретение дает возможность прогнозирования скорости течения PC до назначения лечения препаратами интерферона-бета и осуществляется следующим образом: образец ДНК, выделенный из периферической венозной крови больного PC, исследуют по полиморфизмам, используя в качестве праймеров участок ДНК генов KIF1B С/Т (rs10492972), ZFHX4 C/G (rs11787532), STARD13 G/T (rs9527281), CIT C/T (rs7308076), ZFAT A/C (rs733254), для каждого из указанных полиморфизмов устанавливают гетерозиготный или гомозиготный генотип и определяют доминирующую аллель, а при наличии гетерозиготного генотипа ее определяют путем соотношения пороговых циклов амплификации по каналам FAM и VIC (HEX), определяют гаплотип как сочетание пяти доминирующих аллелей и при наличии в геноме больного PC гаплотипа TGTCA прогнозируют высокую скорость прогрессирования рассеянного склероза у больных, получающих терапию препаратами интерферона-бета. 3 пр.

Способ прогнозирования скорости прогрессирования рассеянного склероза у больных, получающих терапию препаратами интерферона-бета, характеризующийся тем, что образец ДНК, выделенный из периферической венозной крови больного PC, исследуют по полиморфизмам, используя в качестве праймеров участок ДНК генов KIF1B С/Т (rs10492972), ZFHX4 C/G (rs11787532), STARD13 G/T (rs9527281), CIT C/T (rs7308076), ZFAT A/C (rs733254), для каждого из указанных полиморфизмов устанавливают гетерозиготный или гомозиготный генотип и определяют доминирующую аллель, а при наличии гетерозиготного генотипа ее определяют путем соотношения пороговых циклов амплификации по каналам FAM и VIC (HEX), определяют гаплотип как сочетание пяти доминирующих аллелей и при наличии в геноме больного PC гаплотипа TGTCA прогнозируют высокую скорость прогрессирования рассеянного склероза у больных, получающих терапию препаратами интерферона-бета.