СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО МОНИТОРИНГА ЭНДОСПОР В ВОДНОЙ СРЕДЕ БУМАЖНЫХ ИЛИ КАРТОННЫХ ФАБРИК Российский патент 2020 года по МПК G01N33/34 C12N1/20 C12Q1/68 C12R1/07 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к методу количественного мониторинга эндоспор в водной среде бумажных или картонных фабрик в соответствии с формулой изобретения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Бактериальные клетки обычно присутствуют в водной среде бумажных и картонных фабрик. Рост бактерий в этом процессе, как правило, контролируется и ограничивается различными способами, например, внедрением биоцидов в технологический процесс. Однако некоторые бактерии образуют эндоспоры, которые являются весьма стойкими к типичным методам уничтожения бактерий, таким, как нагрев, дезинфицирующие средства, химические биоциды, обезвоживание, ультрафиолетовое излучение и ионизирующая радиация. Эндоспоры могут оставаться жизнеспособными, но при этом находиться в состоянии покоя в течение длительных периодов, даже в течение многих лет, до тех пор, пока внешние условия не станут благоприятными, после чего происходит трансформация, т.е. прорастание бактериальных эндоспор.

В производстве упаковочного картона для тканей, продуктов питания и/или напитков уровень гигиены конечного продукта представляет особый интерес. Конечный продукт не должен содержать высоких уровней бактериальных эндоспор, поскольку эндоспоры могут загрязнять материалы, которые вступают в контакт с конечным продуктом, например пищевые изделия, упакованные в упаковочный картон для продуктов питания или жидкостей. Например, в случае картона для упаковки пищевых продуктов, который используется в коробках для пиццы, кофейных чашках и т.п., максимальное содержание эндоспор обычно составляет < 1000 КОЕ/г сухого картона, и существуют конечные виды использования, при которых максимально разрешенное содержимое эндоспор составляет < 250 КОЕ/г сухого картона.

Обычно бактериальные эндоспоры детектируются с помощью традиционных способов посева, которые занимают много времени. Как правило, методы посева дают результаты только через 48-72 часов после отбора проб. Понятно, что при непрерывном производстве бумаги или картона эта задержка не является оптимальной. Например, своевременная корректировка программы использования лимитирующих споры биоцидов в целях изменения условий процесса не представляется возможным, поскольку результаты последующего посева можно получить только после указанной задержки. Это делает внедрение биоцидов безосновательно сложным и трудно оптимизируемым. Поэтому существует потребность в быстром мониторинге бактериальных эндоспор в водных процессах бумажных или картонных фабрик.

Сущность изобретения

Цель этого изобретения заключается в минимизации или, возможно, даже устранении недостатков, существующих на предшествующем уровне техники.

Другая цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы обеспечить быстрый и рентабельный способ количественного мониторинга бактериальных эндоспор в водной среде бумажных или картонных фабрик.

Этих цели достигаются с помощью изобретения, имеющего характеристики, приведенные ниже в характеризующих частях независимых пунктов формулы изобретения.

Некоторые предпочтительные варианты осуществления изобретения представлены в зависимых пунктах формулы изобретения.

Типичный способ в соответствии с настоящим изобретением для количественного мониторинга бактериальных эндоспор в водной среде бумажных или картонных фабрик включает в себя по меньшей мере следующие этапы:

-отбор по меньшей мере первой водной пробы из водной среды,

-разрушение бактерий в вегетативной форме в первой пробе путем надлежащей обработки, предпочтительно путем нагрева первой пробы до требуемой повышенной температуры;

-добавление интеркалирующего агента к обработанной первой пробе и предоставление ему возможности взаимодействовать с разрушенными бактериями, и

-определение уровня эндоспор в первой пробе с использованием количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР).

Недавно было удивительным образом обнаружено, что с помощью способа, включающего этапы уничтожения вегетативных форм бактерий, взаимодействие с интеркалирующим агентом и количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (кПЦР) можно получить быстрое определение уровня бактериальных эндоспор в пробе, происходящей из процесса производства бумаги или картона. Этот способ мониторинга дает надежный результат определения уровня эндоспор уровня в водной среде бумажных или картонных фабрик. Таким образом, метод в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает возможность быстрого обнаружения вспышек эндоспор, вызванных неожиданными изменениями в условиях процесса, таких, как флуктуации pH или окислительно-восстановительного потенциала. Таким образом, можно свести к минимуму производство некачественных продуктов, например бумаги или картона для упаковки. Кроме того, можно избежать ошибочного внедрения биоцидов в процесс, например, внедрения неэффективной дозы биоцида, которая может инициировать образование эндоспор в результате, например, окислительного стресса.

В настоящем документе термин "эндоспора" понимается как находящаяся в состоянии покоя и неразмножающаяся структура, образованная бактериями. Эндоспора включает ДНК бактерии и часть ее цитоплазмы, покрытые внешней защитой оболочкой. При благоприятных условиях эндоспора может прорасти в метаболически активное, т.е. вегетативное, состояние.

Согласно настоящему изобретению, по крайней мере первая водная проба происходит или отбирается из водной среды бумажной или картонной фабрики. Объем пробы обычно составляет 10-100 мл, предпочтительно 20-30 мл, и, как правило, доступность пробы не является ограничивающим фактором. В качестве примера, в некоторых процессах производства бумаги и картона, в которых требуется поддержание общего уровня содержания эндоспор на очень низком уровне, например < 1000 КОЕ/мл, достигаемое использованием высоких доз биоцидов, можно использовать объем пробы 100 мл. С другой стороны, в технологических водах, где содержание бактериальных клеток может находиться на высоком уровне, т.е. на уровне порядка 10⁸ КОЕ/мл, объем пробы 25 мл может быть сочтен более практичным.

Образец может включать целлюлозные волокна и/или фибриллы и содержать твердые компоненты вплоть до 2-8 весовых %. Проба обычно содержит также различные химические вещества и/или соединения, используемые в бумажном или картонном производстве, например крахмал; частицы неорганического наполнителя; синтетические полимеры, такие как полиакриламид.

На начальном этапе описываемого способа бактерии в вегетативной форме разрушаются путем надлежащей обработки. Надлежащей может быть физическая обработка, при которой проба подвергается, например, радиации, такой как ультрафиолетовое излучение или тепло, или химическая обработка, при которой проба подвергается действию подходящего биоцида в дозировке, которая уничтожает бактерии в вегетативной форме, но не мешает работе интеркалирующего агента во время последующих этапов процесса. Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления, первая проба нагревается до желаемой температуры по меньшей мере 60°С, предпочтительно по меньшей мере 70°С, более предпочтительно по меньшей мере 75°С. Максимальная используемая температура обычно составляет 100°С, предпочтительно 80°С. Повышенная температура пробы поддерживается не менее 10 мин, предпочтительно не менее 15 мин, еще более предпочтительно не менее 20 мин. Иными словами, одним из предпочтительных способов уничтожения бактерий в растительном виде является нагрев пробы до температуры в диапазоне 75-80°С и инкубация пробы при повышенной температуре в течение 15-60 мин, предпочтительно для 20-40 мин. Различные процессы тепловой обработки известны на существующем уровне техники, как при нормальном атмосферном давлении, так и при повышенном давлении. В качестве предпочтительного варианта осуществления шаг тепловой обработки является простым, быстрым и практичным в полевых и/или промышленных условиях, где он может быть выполнен с помощью водяной бани при нормальном давлении. Нагрев первой пробы до повышенной температуры, определенной выше, приводит к пастеризации пробы и разрушает вегетативные бактериальные клетки, присутствующие в образце. После нагрева проба содержит разрушенные, т.е. убитые и лишенные целостности, вегетативные бактериальные клетки и, как правило, интактные бактериальные эндоспоры.

Перед этапом уничтожения, предпочтительно посредством нагрева, первая проба необязательно, но предпочтительно фильтруется для того, чтобы отделить нежелательный твердый материал, например твердые частицы, волокна, фибриллы или т.п., от жидкой фазы образца. Эта предварительная фильтрация для отделения нежелательных твердых тел, как правило, производится быстро и выполняется, например, воронкой Бушнера, с помощью фильтра с размером пор около 3 мм.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, первая проба фильтруется после этапа уничтожения, чтобы отделить разрушенные вегетативные бактериальные клетки, а также эндоспоры, от жидкой фазы образца. Фильтрация может выполняться с использованием фильтра с размером пор, например 0,4 мкм. Бактериальные клетки и эндоспоры собираются и/или пристают к фильтру, что упрощает дальнейшую обработку первой пробы.

Интеркалирующий агент добавляется к обработанному первому образцу, предпочтительно после описанного выше шага фильтрации, и агент может взаимодействовать с разрушенными бактериальными клетками. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, интеркалирующий агент представляет собой пропидиум моноазид (ПМА), этидиум моноазид (ЭМА), етидиум бромид, берберин, профлавин, дауномицин, доксорубицин или талидомид. Предпочтительным интеркалирующим агентом является пропидиум моноазид (ПМА). Интеркалирующий агент предпочтительно добавлять к обработанной первой пробе в таком количестве, чтобы вся ДНК из разрушенных бактериальных клеток взаимодействовала бы с интеркалирующим агентом. Таким образом, можно гарантировать, что ни одна молекула ДНК из вегетативных бактериальных клеток не будет амплифицироваться на следующем этапе кПЦР, и не даст сигнала на этапе кПЦР. Вместе с тем, предпочтительно избегать безосновательного избытка интеркалирующего агента, поскольку он может создать риск того, что интеркалирующий агент диффундирует в эндоспоры и начнет взаимодействовать с ДНК эндоспор. Обычно интеркалирующий агент добавляется к пробе в количестве, которое обеспечивает концентрацию интеркалирующего агента < 100 мкмоль, предпочтительно в диапазоне 10-90 мкмоль, более предпочтительно 25-75 мкмоль, еще более предпочтительно 40-60 мкмоль.

После добавления интеркалирующего агента первая проба инкубируется в темноте. Инкубационный период составляет от 1 до 30 минут, предпочтительно от 2 до 10 минут, более предпочтительно от 4 до 6 минут. Интеркалирующий агент способен создавать ковалетные кросс-сшивки в ДНК разрушенных клеток бактерий под действием интенсивного синего света, предпочтительно имеющего длину волны около 400-500 нм, при комнатной температуре. Синее освещение может быть создано, например, с помощью светодиода. Время экспозиции может составлять 1-30 минут, предпочтительно 2-10 минут, более предпочтительно 4-6 минут.

Предпочтительно не высушивать пробу перед добавлением интеркалирующего агента. Это означает, что данный способ предпочтительно не включает этап сушки образца. Предпочтительно, чтобы промежуток времени между этапом разрушения и добавлением интеркалирующего агента был настолько коротким, насколько это практически возможно.

После того, как первая проба была обработана интеркалирующим агентом, уровень эндоспор определяется в первой пробе с помощью количественной полимеразной цепной реакции, кПЦР. ДНК из эндоспор выделяется и амплифицируется методом кПЦР. Пример подходящего протокола выделения ДНК из клеток, выделенных из данного материала, описывается в работе Rinttilä et al., Development of an extensive set of 16S rDNA-targeted primers for quantification of pathogenic and indigenous bacteria in faecal samples by real-time PCR. J. Appl. Microbiol. 2004; 97(6):1166-1177. В этом примере лизирующие реагенты добавляются в пробирку вместе со стеклянными шариками, после чего клетки разрушаются с помощью гомогенизатора FastPrep, запускаемого трижды с скоростью 6,5 м/с в течение 1 минуты. Пробирки инкубируются при температуре 65 °С в течение 20 мин, при перемешивании на шейкере Thermomixer каждые 2 минуты. Затем добавляется 800 мкл смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (24:23:1), содержимое перемешивается и центрифугируется на 10000g в течение 5 мин. 600 мкл жидкой фазы переносится в новую пробирку и производится экстракция смесью хлороформ: изоамиловый спирт (24:1). 270 мкл 100% изопропанола используется для преципитации ДНК, а жидкая фаза удаляется после центрифугирования при 20000g при +4°C в течение 15 мин. Полученная гранула дважды промывается 1 мл (-20°С) 70% этанола и центрифугируется при 20000g при температуре +4°C в течение 5 минут. После центрифугирования гранула высушивается в вакуумном эксикаторе при ±45 °С в течение 20 минут и растворяется в 45 мкл буфера Трис-ЕДТА при +55 °С в течение 1,5-2 часов. Подходящие способы и процедуры кПЦР как таковые известны квалифицированным специалистам в данной области техники и являются коммерческими доступными. Пример подходящего метода кПЦР описывается в работе Mäkinen, R. et al., Can. J. Microbiol. 59: 407-412 (2013). В данном примере способа количество копий гена 16S рРНК измеряют с помощью системы ABI SDS 7000 (Applied Biosystems, Великобритания), используя SYBR Green I (Roche Diagnostics, Германия) в качестве флуоресцентного маркера. Квалифицированный специалист в данной области техники обладает знаниями о других подходящих процедурах выделения ДНК и/или кПЦР.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, по меньшей мере, вторая водная проба происходит или отбирается из той же водной среды. Предпочтительно, чтобы первая и вторая пробы были взяты в одно и то же время, более предпочтительно, чтобы как первая, так и вторая проба происходили из одного и того же оригинального образца, который был разделен на первую, вторую и возможные последующие пробы для определения уровня содержания эндоспор в водной среде.

Количество вегетативных бактерий, т.е. вегетативных бактериальных клеток, определяется непосредственно во втором образце, предпочтительно после этапа предварительной фильтрации, с помощью количественной цепной реакции (кПЦР). Вторая проба не подвергается какому-либо этапу разрушения, например, посредством тепловой обработки или взаимодействия с интеркалирующим агентом.

Детектированный уровень содержания эндоспор из первой пробы сравнивается с детектированным количеством вегетативных бактериальных клеток во второй пробе. Таким образом, можно получить информацию об общем количестве вегетативных бактериальных клеток в водной среде бумажной или картонной фабрики и их долю относительно уровня содержания эндоспор в той же среде.

В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения полученная информация об общем объеме растительных бактерий, а также о количестве эндоспор используется для быстрой корректировки режима внедрения биоцидов для контроля эндоспор в бумажном или картонном производстве. Эта информация позволяет получить ценные знания и информацию о состоянии бактерий в водной среде на бумажной или картонной фабрике, и эти знания могут использоваться, например, для определения правильного режима внедрения биоцидов, для выявления проблемных этапов процесса и/или для обнаружения высокого и/или флуктуирующего уровня содержания спор. Иными словами, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, по крайней мере, один тип биоцида добавляется к водной среде, и количество добавляемого биоцида определяется на основе детектированного уровня содержания эндоспор.

Настоящее изобретение позволяет использовать эффективные биоциды, которые в противном случае могут быть слишком дорогостоящими для непрерывного использования, поскольку дозировка и время добавления биоцида могут быть точно определены на основе информации о количестве бактериальных спор и вегетативных бактериальных клеток в производственном процессе. Биоцид может представлять собой, например, окислительный или неокислительный биоцид. Исходя из полученных результатов определения, дозировка биоцида на одном или нескольких критических этапах технологического процесса корректируется к уровню, уменьшающего уровень эндоспор в готовой бумаге/картоне < 1000 КОЕ/г сухой бумаги/картона, альтернативно < 250 КОЕ/г сухой бумаги/картона.

Общее время с начала этапа разрушения до конца кПЦР может составлять менее 24 часов, предпочтительно 6-24 часа, более предпочтительно 7-9 часов. Это означает, что контроль эффективности биоцидов с использованием настоящего способа выполняться ежедневно или даже несколько раз в день. Предпочтительно, чтобы способ в соответствии с изобретением выполнялся на месте.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, данный способ используется для мониторинга эндоспор, например, Bacillus, Brevibacillus и/или Paenibacillus, которые, как известно, растут в условиях технологического процесса бумажных или картонных фабрик. Эти роды бактерий способны образовывать термотолерантные эндоспоры, которые устойчивы к нагреву в сушильном отсеке бумаго- или картоноделательной машины. Поэтому настоящее изобретение предоставляет хорошую возможность для слежения за уровнем содержания эндоспор этих родов бактерий и для начала специфического и корректного добавления биоцидов.

В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения данный способ используется для производства упаковочной бумаги или картона для продовольствия и/или жидкостей. Как правило, плотность упаковочного картона может составлять 150-400 г/м², предпочтительно 200-360 г/м², более предпочтительно 240-300 г/м². Бумага и картон, предназначенные для упаковки питания и/или жидкостей часто имеют полимерное покрытие или ламинированы фольгой для придания им барьерных свойств. Подходящими полимерами для покрытия являются, например, полиолефины, такие как полиэтилен или полипропилен; поливинилхлорид; поливиниламин; полиэтилентерефталат; полибутилентерефталат.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Некоторые варианты осуществления изобретения описаны в следующих примерах, не ограничивающих сферу применения изобретения.

Пример 1

Это испытание на месте было проведено на бумагоделательной машине для производства щелочной бумаги, на которой изготавливается 3-слойный картон для упаковки продуктов питания, с целью последующего выполнения программы контроля содержания спор с помощью биоцидов. Два цикла отбора проб, утром и во второй половине дня, производили на трех этапах процесса, а именно, на выходах с башен хранения бумажного брака, березовой целлюлозы и сосновой целлюлозы.

Первый литр каждого образца сначала фильтровали с помощью воронки Бушнера с размером пор 3 мм, чтобы удалить волокна и твердые компоненты из образца. После этого полученный фильтрат разливали по шести 50-мл пластмассовым центрифужным пробиркам; 3 пробы параллельно инкубировали при 80°С в течение 15 мин для того, чтобы уничтожить вегетативные бактериальные клетки, а три других образца оставили без обработки. После этого все 6 параллельных образцов были отфильтрованы через фильтры с размером пор 0,4 мкм. Отфильтрованные образцы, подвергнутые тепловой обработке, были окрашены с помощью ПМА (50 мкмоль, 1 мл), для чего были подвергнуты контакту с ПМА в течение 5 минут в темноте, а затем в течение 5 минут подвергались действию синего света, генерируемого светодиодом. После этого ДНК как обработанных, так и необработанных образцов анализировали с помощью способа выделения ДНК и кПЦР как описано ниже.

В кратком изложении, реагенты добавляли в пробирку вместе со стеклянными шариками, а после чего клетки разрушали с помощью гомогенизатора FastPrep, запускаемого трижды с скоростью 6,5 м/с в течение 1 минуты. Пробирки инкубировали при температуре 65°С в течение 20 мин, при перемешивании на шейкере Thermomixer каждые 2 минуты. Затем добавляли 800 мкл смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (24:23:1), перемешивали содержимое и центрифугировали при 10000g в течение 5 мин. 600 мкл жидкой фазы переносили в новую пробирку и производили экстракцию смесью хлороформ: изоамиловый спирт (24:1). 270 мкл 100% изопропанола использовали для преципитации ДНК, а жидкую фазу удаляли после центрифугирования при 20000g при +4°C в течение 15 мин. Полученную гранулу дважды промывали 1 мл (-20 °С) 70% этанола и центрифугировали при 20000g при температуре +4°C в течение 5 минут. После центрифугирования гранулу высушивали в вакуумном эксикаторе при ±45°С в течение 20 минут и растворяли в 45 мкл буфера Трис-ЕДТА при +55°С в течение 1,5-2 часов. ДНК анализировали с помощью кПЦР. Количество копий гена 16S рРНК измеряли с помощью системы ABI SDS 7000 (Applied Biosystems, Великобритания), используя SYBR Green I (Roche Diagnostics, Германия) в качестве флуоресцентного маркера. Общее количество генов 16S рРНК соответствует общему количеству бактерий, а количество генов 16S рРНК бацилл соответствуют количеству бактерий, формирующих эндоспоры. Для сравнения общее количество аэробных бактерий и бактериальных спор измеряли с использованием традиционных способов посева (подсчет на агаре в чашке Петри, +45°С/+37°С, 2 дня инкубации) во внешней лаборатории. Перед определением содержания бактериальных спор образцы были пастеризованы при +80°С в течение 20 минут. Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты (Пример 1)

Общее содержание аэробных бактерий
(необработанные образцы) Бактериальные споры
(подвергнутые нагреванию и
окрашенные образцы) Способ посева Способ согласно изобретению Способ посева Способ согласно изобретению КОЕ/мл Общее содержание генов 16S рРНК/пробу Содержание генов бациллярных 16S рРНК/мл КОЕ/мл Содержание генов бациллярных 16S рРНК/мл Образцы, отобранные утром Башня для хранения бумажного брака <100 <5×10³ <2×10³ <10 <2×10³ Березовая целлюлоза <100 6×10³ 5×10³ <10 <2×10³ Сосновая целлюлоза <100 8×10³ 2×10³ <10 <2×10³ Образцы, отобранные во второй половине дня Башня для хранения бумажного брака <100 <5×10³ <2×10³ <10 <2×10³ Березовая целлюлоза <100 2×10⁴ 4×10³ <10 <2×10³ Сосновая целлюлоза <100 6×10³ <2×10³ <10 <2×10³

Результаты, полученные способом посева, свидетельствуют о том, что в течение дня отбора проб микробиологический статус процесса находился на хорошем уровне, поскольку как общее содержание аэробов (<100 КОЕ/мл), так и содержание эндоспор (<10 КОЕ/мл) были ниже предельного детектируемого уровня. Кроме того, бациллярные гены 16S рРНК не были обнаружены ни в пробах, подвергнутых тепловой обработке и окрашиванию, ни в необработанных пробах, таким образом, результаты способа в соответствии с изобретением свидетельствуют о том, что в течение дня отбора проб эндоспоры не присутствовали в процессе. Эта хорошая микробиологическая ситуация в технологическом процессе отразилась также в готовом картоне; количество спор аэробных бактерий составило менее 250 КОЕ/г готового картона (результаты не приведены). Интересно, что полученные результаты из башен входной целлюлозы показали некоторое содержание (2×10³-5×10³) генов 16S рРНК генов, следовательно, обе эти целлюлозные башни содержат бактерии Bacilli, которые могут образовывать эндоспоры в неблагоприятных условиях роста, например, в случае внезапного изменения pH или окислительно-восстановительного шока. Таким образом, описанный метод соответственно изобретению может эффективно использоваться для мониторинга микробиологического качества важнейших технологических этапов, а также для быстрого, т.е. в течение рабочего дня, обнаружения потенциального образования спор. Это обеспечивает экономически осуществимый способ корректировки программы контроля содержания спор с помощью биоцидов и, в конечном счете, минимизации производства загрязненного спорами картона и, следовательно, уменьшения случаев жалоб на производителя картона.

Пример 2

Это испытание на месте было проведено на бумагоделательной машине для производства щелочной бумаги, на которой изготавливается 3-слойный коробочный картон, чтобы оценить эффективность программы использования биоцидов против бактерий, образующих споры, в башне хранения бумажного брака. В общей сложности было произведено шесть циклов отбора проб на выходе из башни хранения бумажного брака.

Технологические пробы отбирали и обрабатывали как описано в примере 1. Результаты приведены в таблице 2.

Полученные результаты из таблицы 2 показывают, что башня хранения бумажного брака содержит много бактерий; общее количество аэробных бактерий варьировало между 5×10⁶-1×10⁷ КОЕ/мл, всего общее содержание генов 16S рРНК составило 5×10⁷-3×10⁸, а содержание бациллярных генов 16S рРНК составило 1×10⁶-4×10⁷ в течение всех трех дней отбора проб. Таким образом, результаты указывают на то, что для эффективного контроля общего содержания бактерий и бацилл в частности в башне хранения бумажного брака требуются дополнительные биоциды. Интересно, что содержание генов 16S рРНК было высоким (1×10^6-4×10⁷) во всех необработанных образцах, что указывало на то, что в башне хранения бумажного брака присутствовало много бактерий в вегетативной форме. Однако содержание бациллярных генов 16S рРНК значительно варьировало от низкого (2×10²) до высокого (2×10⁶) в образцах, подвергнутых тепловой обработке и окрашиванию, что свидетельствует о флуктуациях уровня содержания зрелых спор в башне хранения бумажного брака. Известно, что склонность к споруляции, то есть формированию новых спор, у бактерий Bacilli тонко регулируется и зависит от условий технологического процесса. Результаты, полученные способом традиционного посева, не показали такого потенциала к споруляции, поскольку количество обнаруженных спор варьировало в диапазоне <10-300 спор/мл. Используя описанный способ согласно изобретению, можно следить за микробиологическим состоянием на критических этапах процесса и быстро, т.е. в течение рабочего дня, детектировать образование новых спор в технологическом процессе. Это позволяет эффективно и экономически обоснованно контролировать процесс, свести к минимуму производство зараженного спорами картона, и, наконец, уменьшает количество жалоб на производителя картона.

Таблица 2. Результаты для примера 2

Общее содержание аэробных бактерий
(необработанные образцы) Бактериальные эндоспоры
(подвергнутые нагреванию и
окрашенные образцы) Способ посева Способ согласно изобретению Способ посева Способ согласно изобретению Башня для хранения бумажного брака
Отбор проб КОЕ/мл Общее содержание генов 16S рРНК/пробу Содержание генов 16S рРНК бактерий Bacilli
,
генов/мл КОЕ/мл Содержание генов 16S рРНК бактерий Bacilli
,
генов/мл 7 октября, утро 7×10⁶ 3×10⁸ 4×10⁷ 3×10² 2×10⁶ 7 октября, вторая половина дня 5×10⁶ 2×10⁸ 3×10⁷ 5×10¹ 1×10⁵ 5 ноября, первая половина дня 8×10⁶ 1×10⁸ 2×10⁶ 2×10¹ 6×10⁴ 5 ноября, вторая половина дня 1×10⁷ 2×10⁸ 1×10⁶ 2×10¹ 1×10⁴ 11 ноября, первая половина дня 6×10⁶ 5×10⁷ 1×10⁶ <10 2×10² 11 ноября, вторая половина дня 5×10⁶ 9×10⁷ 9×10⁶ 2×10¹ 1×10³

Пример 3

Это лабораторное испытание было проведено для оценки эффективности биоцида для контроля содержания спор, действие которого направлено против аутентичной популяции бактерий в пробе брака, взятой из бумагоделательной машины для производства щелочной бумаги, на которой изготавливается 3-слойный картон для упаковки продуктов питания. Первую пробу брака сохранили без изменений, а ко второй пробе добавили биоцид для контроля образования спор с дозировкой 150 частей на миллион. Хранение происходило при температуре +45 °С без смешивания. Общее количество аэробных бактерий и их спор определяли с использованием традиционных способов посева (подсчет на агаре в чашке Петри, +45 °С/+37 °С, 2 дня инкубации) в начале испытания (необработанная проба) и после 3-дневного периода контакта (обработанная и необработанная проба), а также производили измерения pH и окислительно-восстановительного потенциала.

Результаты приводятся в таблице 3.

Таблица 3. Результаты для примера 3

Начало испытания Время контакта 3 дня Общее содержание аэробных бактерий
(КОЕ/мл) Бактериальные споры
(КОЕ/мл) pH окислительно-восстановительный потенциал
(мВ) Общее содержание аэробных бактерий
(КОЕ/мл) Бактериальные споры
(КОЕ/мл) pH Окислительно-восстановительный потенциал (мВ) Необработанная проба брака 3×10⁷ <10 8,2 134 3×10⁷ 5×10³ 6,5 -107 Проба брака, обработанная биоцидом Нет данных Нет данных Нет данных Нет данных <100 <10 7,3 83

Полученные результаты свидетельствуют о сильной контаминации необработанной пробы в течение трех дней контакта; общее количество аэробных бактерий было высоким (3×10⁷ КОЕ/мл), а уровень спор аэробных бактерий возрос до 5×10³ КОЕ/мл. Кроме того, показатели pH (8,2->6,5) и окислительно-воостановительного потенциала (134 мВ -> -107 мВ) заметно снизились. Напротив, добавка 150 частей на млн тестируемого биоцида против спор эффективно защитила пробу бумажного брака; общее содержание аэробных бактерий (< 100 КОЕ/мл) и спор бактерий (< 10 КОЕ/мл) остались ниже предела обнаружения, а показатель pH (7,3), так же как и окислительно-воостановительный потенциал (83 мВ) остались на хорошем уровне. Результаты, таким образом, свидетельствуют о том, что тестируемый биоцид для контроля содержания спор в дозировке 150 частей на млн может использоваться для контроля образования новых спор в бумажном браке. Из литературных данных и собственных лабораторных результатов (данные не приведены) известно, что подобная обработка неэффективна для убийства зрелых бактериальных спор. Поэтому для эффективного контроля над содержанием спор в процессе производства бумаги экономически более целесообразно контролировать образование новых спор, чем пытаться уничтожить зрелые споры.

Несмотря на то, что изобретение было описано со ссылкой на варианты осуществления, в настоящее время представляющиеся наиболее практичными и предпочтительными, следует понимать, что изобретение не должно ограничиваться вариантами осуществления, описанными выше, однако предполагает также различные модификации и эквивалентные технические решения в пределах сферы охвата формулы изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ количественного мониторинга бактериальных эндоспор в водной среде бумажных и картонных фабрик. Способ включает отбор двух водных проб промышленной водной среды; в первой пробе разрушают вегетативные формы бактерий путем нагрева не менее чем 60°С, добавляют интеркалирующий агент, инкубируют в темноте в течение 1-30 мин, определяют уровень эндоспор с использованием количественной полимеразной цепной реакции. Проводят сравнение уровня эндоспор из первой пробы с количеством вегетативных бактериальных клеток во второй пробе. Результаты используют для корректировки режима введения биоцидов для контроля эндоспор. Способ обеспечивает контроль микробиологического состояния процессов в бумажном или картонном производстве. 9 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

1. Способ количественного мониторинга бактериальных эндоспор в водной среде бумажных или картонных фабрик, включающий по меньшей мере следующие этапы:

-отбор по крайней мере первой водной пробы и по меньшей мере второй водной пробы из промышленной водной среды;

-разрушение бактерий в вегетативной форме в первой пробе путем надлежащей обработки, выбранной из воздействия на пробу ультрафиолетового излучения, или проведения химической обработки, где пробу подвергают воздействию биоцида в дозе, которая уничтожает бактерии в вегетативной форме, но эта доза не мешает работе интеркалирующего агента во время последующих этапов процесса, или путем нагрева первой пробы до требуемой повышенной температуры, составляющей не менее 60°С;

-добавление интеркалирующего агента, выбранного из пропидиума моноазида (ПМА), этидиума моноазида (ЭМА), етидиума бромида, берберина, профлавина, дауномицина, доксорубицина и талидомида, к обработанной первой пробе и предоставление ему возможности взаимодействовать с разрушенными бактериями, и

- инкубирование первой пробы в темноте в течение 1-30 мин после добавления интеркалирующего агента;

-определение уровня эндоспор в первой пробе с использованием количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР);

отличающийся тем, что

- определяют количество бактериальных клеток в вегетативной форме во второй пробе;

- сравнивают детектированный уровень эндоспор из первой пробы с детектированным количеством вегетативных бактериальных клеток во второй пробе; и

результаты используют для получения информации для корректировки режима введения биоцидов для контроля эндоспор в бумажном или картонном производстве.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по крайней мере один тип биоцида добавляется к водной среде и количество добавляемого биоцида определяется на основе детектированного уровня содержания эндоспор.

3. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что разрушение бактерий в вегетативной форме производится путем нагрева первой пробы до требуемой температуры не менее 70°С, предпочтительно не менее 75°С.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что первая проба дополнительно фильтруется до этапа уничтожения, например, нагреванием с целью удаления твердых частиц из образца.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что интеркалирующий агент представляет собой пропидиум моноазид (ПМА).

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что интеркалирующий агент добавляется в концентрации < 100 мкмоль, предпочтительно в диапазоне 10-90 мкмоль, более предпочтительно 25-75 мкмоль, еще более предпочтительно 40-60 мкмоль.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что после добавления интеркалирующего агента первая проба инкубируется в темноте в течение 2-10 мин, более предпочтительно 4-6 мин.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что после инкубации в темноте первая проба подвергается действию света с длиной волны около 400-500 нм в течение 1-30 мин, предпочтительно 2-10 мин, более предпочтительно 4-6 мин.

9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что общее время с начала этапа разрушения до конца кПЦР составляет менее 24 часов, предпочтительно 6-24 часа, более предпочтительно 7-9 часов.

10. Способ по п. 9, характеризующийся тем, что бактериальные эндоспоры представляют собой эндоспоры бактерий родов Bacillus, Brevibacillus и/или Paenibacillus.