КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ БОРЬБЫ С ФУЗАРИОЗОМ Российский патент 2020 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 A01C1/06 A01H5/10 A01P3/00 C12R1/01 

ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0001] Содержание прилагаемого Перечня последовательностей включено здесь во всей его полноте посредством ссылки. Прилагаемый файл под наименованием «SGI1520-lWO_ST25.txt» был создан 24 июля 2012 г. и имеет размер 55 Kб. Этот файл открыт для доступа с помощью Microsoft Word на компьютере с операционной системой Window OS.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0002] Настоящее изобретение относится к биологическим методам борьбы с фитопатогенными болезнями. В частности, изобретение относится к композициям и способам, которые могут использоваться в борьбе с фузариозом злаковых растений, таких как пшеница и ячмень.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Фузариоз, известный также как парша, плесневидная розовая гниль и фузариоз, является болезнью, опустошающей сельскохозяйственные угодья пшеницы, ячменя и многих других злаковых культур во всем мире и, особенно, в США, Европе и Китае. Эта болезнь может достигать эпидемических масштабов и наносить обширные уроны зерновым культурам, особенно пшенице и ячменю, во влажных и полувлажных ареалах выращивания хлебных злаков, включая Индию, Россию, Францию, Германию и Великобританию. В частности, фузариоз или фузариоз пшеницы является одной из наиболее убыточных болезней пшеницы в Соединенных Штатах. В общенациональных масштабах эта болезнь, развившаяся на Среднем Западе и на Высоких Равнинах, принесла производству пшеницы потери, достигающие миллионов долларов, и стала, таким образом, главным препятствием для успешного функционирования этой индустрии в последние годы. Фузариоз, помимо пшеницы, поражает также ячмень, овес, кукурузу и множество других зерновых культур и репродуцируется на них.

[0004] Эта болезнь может вызываться множеством различных фитопатогенов и, в первую очередь, несколькими видами грибов рода Fusarium. В число вероятных возбудителей фузариоза пшеницы входит множество различных видов Fusarium, например, F. culmorum, F. graminearum (телеоморф, Gibberella zeae), F. avenaceum (телеоморф, G. avenacea), F. poae, а также патогены, не относящиеся к роду Fusarium, такие как Microdochium nivale (телеоморф, Monographella nivalis), и Microdochium majus. В Соединенных Штатах, Европе и других наиболее важных агрономических ареалах мира доминирующим возбудителем фузариоза выступает Fusarium graminearum (телеоморф, Gibberella zeae в буквальном смысле).

[0005] Эти патогены, как правило, выживают на растительных остатках. На колоски злаков они попадают и поражают их во время цветения, останавливая или частично задерживая развитие зерна в колосе злака. В результате, попавший на растение патоген может убить часть колоса либо весь колос. Некоторые инфицированные семена имеют настолько низкую энергию прорастания, что зачастую не могут прорасти. Проросшие инфицированные семена часто рано погибают в фазе прорастания вследствие пелликуляриоза или корневой гнили, вызывающих плохой хлебостой выросшего злака. Здоровые сеянцы могут инфицироваться также в фазе появления всходов. Помимо плохого, неэкономичного хлебостоя, потери урожая вследствие поражения патогеном могут быть довольно высокими, если условия благоприятствуют развитию болезни.

[0006] Грибные патогены рода Fusarium распространяются по ареалам культивирования злаков во всем мире и наносят особенно большой ущерб в местах выпадения больших осадков в период между цветением и наливом зерна. Если возбудителем заболевания является Fusarium graminearum, то данная болезнь требует первоочередного вмешательства, не только потому, что она снижает коммерческие показатели пораженного зерна, вдобавок к прямым потерям урожая, но также потому, что заражение грибом Fusarium может приводить к накоплению микотоксинов, трихотеценов, в зернах, создавая, таким образом, угрозу здоровью людей и скота. Трихотецены представляют собой главное микотоксиновое загрязнение зерновых культур во всем мире, способное у нежвачных животных вызывать отказ от пищи, рвоту, диарею и потерю веса и создавать угрозу здоровью для других животных и людей в случаях высоких уровней воздействия этих токсинов. В Соединенных Штатах эта угроза возросла еще больше вследствие недавно произошедшего смещения в штаммах F. graminearum в сторону повышения выработки и силы токсинов. Микотоксинами, обнаруживаемыми чаще всего, являются дезоксиниваленол (DON, известный также как вомитоксин) и зеараленон (ZEA). Дезоксиниваленол является особенно опасным токсином, вызывающим желудочно-кишечные расстройства, которые сопровождаются кровотечениями и другими тяжелыми состояниями у людей и животных, принявших в пищу инфицированные зерна, и в некоторых случаях могут привести к смерти. Поскольку дезоксиниваленол в общем случае является стойким к изменениям pH и к высоким температурам, дезинтоксикация может проходить очень тяжело. Таким образом, зерна, загрязненные выше определенного уровня, не могут использоваться в пивоварении, переработке, корме для скота и, следовательно, должны удаляться в отходы.

[0007] На сегодняшний день разработано множество различных стратегий по борьбе с фузариозом у сельскохозяйственных культур. Наиболее перспективными среди них являются химические методы, разработка стойких сортов культур, а также традиционные методы севооборота и обработки полей. Среди этих направлений определенную эффективность в снижении заражения фузариозом можно получить от применения химических пестицидов, однако остатки фунгицидов, использованных на поздних стадиях роста культур, как правило, в периоды цветения, всего за несколько недель до сбора урожая, снижают привлекательность этих методов. С другой стороны, альтернативный подход в борьбе с этой болезнью представляют методы традиционной селекции и генной инженерии, благодаря которым происходит заметный прогресс в разработках стойких сортов агрокультур. Генная инженерия позволяет изменять продуцирование фитогормона и осуществлять манипуляции в его сигнальном пути. Достигнутый в последние годы прогресс в области традиционной селекции позволил значительно продвинуться в понимании генетических основ стойкости к фузариозу и получить сведения о множестве генов и локусах количественных признаков (QTL: quantitative trait loci), придающих этой стойкости. Однако прогресс в повышении стойкости агрокультур к фузариозу был медленным, что объясняется, в первую очередь, трудностью изучения данной болезни. Фактически о механизмах, определяющих стойкость или восприимчивость растений к фузариозу, в настоящее время известно сравнительно мало. Кроме того, генетическое разнообразие грибов вида Fusarium, которые являются преобладающими возбудителями болезни, часто создает проблемы в определении того, насколько длительной должна быть эффективность химических фунгицидов и насколько стойкими должны быть защищаемые агрокультуры. В результате, в настоящее время практически все сорта пшеницы в агропромышленном производстве остаются уязвимыми для инфицирования.

[0008] Кроме того, несмотря на определенный успех в борьбе с фузариозом, который могут давать традиционные методы пахотной обработки с закапыванием пожнивных остатков, инфицированных возбудителем, например, F. graminearum, обычная вспашка почвы после жнив является несовместимой с устоявшейся практикой охраны почв, то есть с условием минимальной пахотной обработки. Принимая во внимание вероятность разброса инокулята на большие расстояния и то, что различные культуры могут становиться альтернативными хозяевами патогенов, метод севооборота нередко оказывается неприемлемым. Помимо загрязнения окружающей среды пестицидами, их использование может порождать проблемы, связанные с пестицидостойкостью. Кроме того, с их использованием могут быть связаны также зарегистрированные случаи роста содержания DON в зернах. Помимо этого, расходы и растущие проблемы как в государственном, так и в частном секторах, связанные с загрязнением пестицидами окружающей среды и требованиями к безопасности пищевых продуктов, делают данный способ борьбы с такими болезнями менее привлекательным и заставляют в уходе за агрокультурами применять пестициды как можно меньше.

[0009] Подводя итог, можно сказать, что, несмотря на существенное продвижение в области разработок способов борьбы с фузариозом, уменьшение влияния этой губительной болезни на производство и качество зерна пока остается нерешенной проблемой. Следовательно, для повышения продуктивности производства и качества многих зерновых культур важно вести поиск и разработку новых способов борьбы с фузариозом. Эти проблемы требуют срочного решения не только в Соединенных Штатах, но и на всем земном шаре, включая Азию и Европу.

[0010] Борьба с фузариозом с помощью биологических агентов стала привлекать к себе внимание, начиная с середины 1990-х годов. Биологические агенты для такой борьбы (BCA: Biological control agents), несмотря на то что количество их в настоящее время весьма ограничено, могут, при своей невраждебности к окружающей среде, быть очень эффективными в снижении уровня заболеваемости, инициируемой патогенами рода Fusarium. Общественное признание, совместимость с другими средствами борьбы с болезнями агрокультур, долговечность и стойкость - все это, наряду с другими положительными факторами, говорит о необходимости разработок стратегий биологической борьбы с фузариозом. Средства такой биологической борьбы могут сыграть важную роль в органической зерновой индустрии. В обычном производстве зерна такие средства могут продлить защиту колосков на время после фазы цветения, когда химические фунгициды применяться больше не могут. На сегодняшний день, в области биологической борьбы уже достигнут значительный прогресс. Так, например, некоторые штаммы споро-продуцирующих бактерий (например, видов Bacillus и Pseudomonas) и дрожжей (например, вида Cryptococcus) демонстрируют качества, требующиеся для борьбы с фузариозом и для снижения микотоксинового загрязнения. Однако, несмотря на этот прогресс, остается неудовлетворенной потребность в улучшенных микроорганизмах для их использования в борьбе с фузариозом. Хотя сами по себе BCA-средства уже признаны более подходящим инструментом для борьбы с фитопатогенами, а BCA-продукты находят на рынке значительно более широкий сбыт, чем когда-либо ранее, все же на сегодняшний день было предпринято совсем мало попыток разработать стратегии и антагонистический микроорганизм для биологической борьбы с фузариозом. Кроме того, жизненный цикл рода Fusarium и других возбудителей фузариоза указывает на то, что эти патогены потенциально могут быть подходящими для использования их в методах биоборьбы с помощью антагонистических микроорганизмов на различных фазах роста и развития. Таким образом, существует потребность в поиске новых средств биологической борьбы, желательно с различными способами активности, а также способов биоборьбы, которые бы позволяли эффективно предотвращать или подавлять развитие фузариоза.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] Изобретение относится к композициям, содержащим микробиологические штаммы и культуры. Некоторые штаммы, культуры и их композиции могут использоваться для борьбы с фузариозом, например, различных сельскохозяйственных культур, включая пшеницу и другие зерновые. Изобретение также относится к композициям для биологической борьбы и способам использования этих композиций для предотвращения возникновения, подавления развития или лечения вызванной патогенами болезни и для сохранения урожая. Изобретение также относится к способам использования таких композиций в качестве средств биологической борьбы в комбинации с другими эффективными в сельском хозяйстве соединениями или композициями для борьбы с вредными фитопатогенами.

[0012] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенным микробным штаммам, обладающим супрессорной активностью по отношению к фузариозу. Микробные штаммы в соответствии с этим аспектом выбираются из группы, состоящей из видов Microbacterium, Bacillus, Mycosphaerella и Variovorax. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения микробные штаммы выбираются из группы, состоящей из вида Mycosphaerella штамм SGI-010-HI 1 (депозит NRRL 50471), вида Microbacterium штамм SGI-014-C06 (депозит NRRL B-50470), вида Variovorax штамм SGI-014-G01 (депозит NRRL B-50469), вида Bacillus штамм SGI-Q15-F03 (депозит NRRL B-50760), вида Bacillus штамм SGI-015-H06 (депозит NRRL B-50761) и их вариантов, обладающих пестицидной активностью. Микробный штамм в соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления может содержать последовательность ДНК, демонстрирующую по меньшей мере 85% идентичность любой из нуклеотидных последовательностей, приведенных в прилагаемом Перечне последовательностей. Изобретение также относится к биологически чистым культурам и обогащенным культурам описанных здесь микробных штаммов.

[0013] В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к композициям, содержащим микробный штамм по изобретению или его культуру и эффективное для сельскохозяйственного производства количество соединения или композиции, выбранных из группы, состоящей из акарицида, бактерицида, фунгицида, инсектицида, микробицида, нематицида, пестицида и удобрения. Указанные композиции в некоторых вариантах осуществления этого аспекта могут быть получены в форме препарата, выбранного из группы, состоящей из эмульсии, коллоида, пылевидного препарата, частицы, гранулы, порошка, спрея и раствора; в некоторых других вариантах осуществления указанные композиции могут содержать носитель. В одном из предпочтительных вариантов носитель является приемлемым для сельскохозяйственного производства. В одном из особенно предпочтительных вариантов осуществления изобретения носителем является семя растения. В других предпочтительных вариантах композицией является препарат покрытия семени. Кроме того, изобретение относится к семенам, покрытым композицией в соответствии с настоящим изобретением.

[0014] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения, ингибирования или обработки против развития фитопатогена. Эти способы включают выращивание микробного штамма по изобретению или его культуры в питательной среде или почве растения-хозяина перед или одновременно с выращиванием растения-хозяина в питательной среде или почве, где в некоторых предпочтительных вариантах осуществления данного аспекта изобретения, фитопатоген вызывает фузариоз. В одном из особенно предпочтительных вариантов осуществления фитопатогеном является Fusarium graminearum.

[0015] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения, ингибирования или обработки против развития фузариоза растения. Эти способы включают поставку к растению или к среде, окружающей растение, эффективного количества микробного штамма по изобретению или его культуры. В одном из вариантов осуществления изобретения такой фузариоз вызывается грибом Fusarium graminearum. В некоторых вариантах осуществления этого аспекта микробный штамм или его культуру поставляют к почве, семени, корням, цветку, листу, части растения или всему растению, где в предпочтительном варианте растение является восприимчивым к Fusarium graminearum. В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления изобретения растением является пшеница, кукуруза, ячмень или овес, в другом предпочтительном варианте осуществления микробный штамм по изобретению или его культуру вводят в растение в качестве эндофита.

[0016] В следующем аспекте изобретение относится к растениям неприродного происхождения. Растения неприродного происхождения искусственно инфицируются микробным штаммом по изобретению или его культурой. Кроме того, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления этого аспекта изобретение относится к семени, репродуктивной ткани, вегетативной ткани, частям растения и потомству растения неприродного происхождения.

[0017] В другом аспекте изобретение относится к способу получения сельскохозяйственной композиции. Этот способ включает инокуляцию микробного штамма в соответствии с настоящим изобретением или его культуры в субстрат или на субстрат и выращивание его при температуре 1-37°C до получения клеток или спор в количестве по меньшей мере 10²-10³ на миллилитр или на грамм.

[0018] Этим и другим целям и признакам данного изобретения дано более полное разъяснение в нижеследующем подробном описании и формуле изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[0019] Если не указано иного, то все используемые в настоящем описании термины, относящиеся к данной области техники, условные обозначения и другие научные термины несут общепринятые значения, известные специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Некоторым терминам с общеизвестными значениями здесь даны определения в целях избегания разночтения и/или для облегчения ссылок, и включение здесь таких определений не должно рассматриваться как представляющее существенное отличие от значений, общепринятых среди специалистов. Многие способы и процедуры, которые здесь описаны или на которые делаются ссылки, должны быть специалистам хорошо известными и широко используемыми ими в соответствии с обычными методологиями.

[0020] Если из контекста данного описания ясно не вытекает иного, то единственное число существительных предполагает равным образом их значения во множественном числе. Например, термин «клетка» может означать как одну, так и множество клеток, включая их смеси.

[0021] Выражения «антагонистический микроорганизм» и «микробный антагонист» - оба означают микроорганизм, штамм которого показывает степень ингибирования фузариоза, которая на статистически значимом уровне превышает степень ингибирования от необработанного контроля.

[0022] Антибиотик: термин «антибиотик» в данном описании означает субстанцию, способную убить или ингибировать рост микроорганизма. Антибиотики могут продуцироваться по меньшей мере одним из таких источников: 1) микроорганизмом, 2) процессом синтеза и 3) процессом полусинтеза. Антибиотиком может быть микроорганизм, выделяющий летучее органическое соединение. Кроме того, антибиотиком может быть летучее органическое соединение, выделяемое микроорганизмом.

[0023] Бактерицидный: термин «бактерицидный» в данном описании означает способность композиции или субстанции повысить смертность бактерий или ингибировать скорость их роста. Ингибирование скорости роста бактерий в большинстве случаев может оцениваться по уменьшению количества жизнеспособных бактериальных клеток с течением времени.

[0024] Биологическая борьба: термин «биологическая борьба» и его сокращенная форма «биоборьба» в данном описании означают борьбу с патогенном, либо с насекомым, либо с любым другим нежелательным организмом с помощью по меньшей мере одного другого организма, не являющегося человеком. В качестве примера известного механизма биологической борьбы можно привести использование микроорганизмов, которые борются с корневой гнилью путем вытеснения грибов из конкуренции за пространство на поверхности корня, или микроорганизмов, которые либо ингибируют рост патогена, либо убивают его. «Растением-хозяином» в контексте биологической борьбы является растение, восприимчивое к болезни, вызываемой данным патогеном. «Растением-хозяином» в контексте отделения принадлежащего к виду грибов организма от его естественной среды является такое растение, которое поддерживает рост гриба, то есть, например, растение вида, для которого гриб является эндофитом.

[0025] Термин «зерновой» в данном описании означает любой зерновой вид, который может быть восприимчивым к фузариозу. К числу таких восприимчивых зерновых культур относятся пшеница, ячмень, овес и тритикале; при этом пшеница и ячмень являются двумя культурами, для которых данная болезнь представляет особенно значительную экономическую проблему.

[0026] Термин «эффективное количество» означает количество, достаточное для получения полезных или целевых результатов. В отношении борьбы с болезнью, к лечебной обработке, ингибированию болезни или защиты от нее, эффективным является количество, достаточное для подавления, стабилизации, поворота хода болезни вспять, замедления или задержания развития инфекции-мишени или болезненного состояния. Таким образом, выражение «эффективное количество» в данном описании означает такое количество антагонистической обработки, которое является необходимым для снижения уровня развития патогена и/или уровня вызванной патогеном болезни по сравнению с уровнем, который наблюдается у необработанного контроля. Как правило, эффективное количество данной антагонистической обработки дает снижение по меньшей мере на: 20%; как правило, от 30 до 40% и больше; как правило, от 50 до 60% и больше; как правило, от 70 до 80% и больше; или, как правило, от 90 до 95% по сравнению с уровнем болезни и/или уровнем развития патогена, наблюдаемым у необработанного контроля в соответствующих условиях лечебной обработки. Эффективное количество может поставляться за один или больше приемов. Фактическая скорость поставки жидкого препарата обычно лежит в пределах приблизительно от минимум 1×10³ до 1×10¹⁰ жизнеспособных клеток/мл и предпочтительно приблизительно от 1×10⁶ до 5×10⁹ жизнеспособных клеток/мл. В большинстве состояний антагонистические микробные штаммы по изобретению, описанные в Примерах ниже, будут оптимально эффективными при скорости поставки в интервале приблизительно от 1×10⁶ до 1×10⁹ жизнеспособных клеток/мл, если при поставке обеспечивается практически однородный контакт по меньшей мере приблизительно 50% тканей растения. Если антагонисты поставляются в форме твердого препарата, то скорость поставки должна регулироваться таким образом, чтобы обеспечивать количество жизнеспособных клеток на единицу площади поверхности ткани растения, сравнимое с получаемым при вышеупомянутых величинах скорости обработки жидкостью. Как правило, средства биологической борьбы согласно изобретению являются биологически эффективными, если они поставляются в концентрации выше 10⁶ КОЕ/г (колониеобразующих единиц на грамм), предпочтительно, если выше 10⁷ КОЕ/г, еще предпочтительнее, если выше 10⁸ КОЕ/г, и наиболее предпочтительно, если в концентрации 10⁹ КОЕ/г.

[0027] Далее, выражение «эффективный микробный антагонист», используемое по отношению к микроорганизму, означает, что данный микробный штамм демонстрирует степень ингибирования фузариоза, которая на статистически значимом уровне превышает степень ингибирования, наблюдаемую у необработанного контроля. Как правило, эффективный микробный антагонист обладает способностью давать снижение по меньшей мере на: 20% и больше; как правило, от 30 до 40% и больше; как правило, от 50 до 60% и больше; как правило, от 70 до 80% и больше; как правило, от 90 до 95% относительно уровня болезни и/или уровня развития патогена, имеющего место в необработанном контроле при соответствующих условиях лечебной обработки.

[0028] Композиция: термин «композиция» означает комбинацию активного агента по меньшей мере с другим соединением, носителем или композицией, инертным(-й) (например, детектируемым агентом или меткой, жидким носителем и т.п.) или активным, например, пестицидом.

[0029] Выделенный микробный штамм, выделенная культура, биологически чистая культура и обогащенная культура: используемый в данном описании термин «выделенный» в применении к микроорганизму (например, бактерии или микрогрибу) означает микроорганизм, который был отделен и/или очищен от среды, где он природно возникает. Аналогично этому, термин «выделенный штамм» микроба означает штамм, который был отделен и/или очищен от своей естественной среды. Таким образом, термин «выделенный микроорганизм» не включает в свое значение микроорганизм, пребывающий в среде, в которой он нормально возникает. Кроме того, термин «выделенный» не обязательно отражает степень, до которой данный микроб был очищен. Термин «по существу чистая культура» микробного штамма означает культуру, которая по существу не содержит других микробов, кроме целевого микробного штамма или штаммов. Другими словами, «по существу чистая культура» микробного штамма по существу не содержит загрязнений, которые могут включать микробные загрязнения, а также нежелательные химические загрязнения. Кроме того, используемый здесь термин «биологически чистый» штамм означает штамм, выделенный из материалов, с которыми он нормально ассоциируется в природных условиях. Следует заметить, что штамм, ассоциированный с другими штаммами или соединениями, или материалами, которые в природных условиях нормально не встречаются, также имеет определение «биологически чистый». Вполне понятно, что монокультура того или иного штамма является «биологически чистой». Используемый здесь термин «обогащенная культура» выделенного микробного штамма означает микробную культуру, содержащую более 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% выделенного штамма.

[0030] Используемый здесь термин «эндофит» означает эндосимбионт, живущий внутри растения на протяжении по меньшей мере части своей жизни, не вызывая очевидной болезни. Трансмиссия эндофитов может происходить либо по вертикали (непосредственно от родителя к потомству) либо по горизонтали (от индивида к неродственному индивиду). Переданные по вертикали грибные эндофиты являются, как правило, бесполыми и переносятся от материнского растения к потомству путем проникновения в семена хозяина через грибные гифы. Бактериальные эндофиты могут переноситься по вертикали также от семян к саженцам (Ferreira et al., 2008). В противоположность этому, горизонтально передаваемые эндофиты, как правило, имеют пол и переносятся спорами ветром и/или насекомыми-переносчиками. Эндофиты возделываемых зерновых привлекли к себе большое внимание в связи с их способностью бороться как с болезнью, так и с заражением насекомыми, а также активировать рост растений.

[0031] Функционально сравнимый протеин: используемый здесь термин «функционально сравнимый протеин» относится к протеинам, имеющим по меньшей мере одну общую характеристику. Такими характеристиками могут быть подобие друг другу последовательностей, биохимическая активность, подобие друг другу схем транскрипции и фенотипичная активность. Как правило, функционально сравнимые протеины имеют некоторое подобие между собой последовательностей или являются подобными по меньшей мере по одному биохимическому признаку. В рамках этого определения функционально сравнимыми считаются гомологи, ортологи, паралоги и аналоги. Кроме того, функционально сравнимые протеины, в общем случае, имеют схожую по меньшей мере одну биохимическую и/или фенотипичную активность. Функционально сравнимые протеины придают одной и той же характеристике подобие, но не обязательно в одинаковой степени. Как правило, функционально сравнимые протеины дают одни и те же характеристики, которые в количественном измерении у одного из сравниваемых протеинов, составляют по меньшей мере 20% от таковых у другого, чаще от 30 до 40%; еще чаще от 50 до 60%, еще чаще от 70 до 80%, еще чаще от 90 до 95% и, как правило, от 98 до 100% от таковых у другого.

[0032] Фунгицидный: используемый здесь термин «фунгицидный» означает способность композиции или субстанции снизить скорость роста грибов или повысить смертность грибов.

[0033] Гриб Fusarium: в контексте данного изобретения термин «гриб Fusarium» включает в себя как половую (телеоморфную) фазу этого организма, так и бесполую (анаморфную) его фазу, называемые также фазами, соответственно, совершенных и несовершенных грибов. Например, анаморфной фазой гриба Fusarium graminearum является Gibberella zeae, то есть возбудитель фузариоза. Эта болезнь, как правило, возникает, когда цветок или семенная шапка инокулируется конидиями, выпускаемыми несовершенной формой, или аскоспорами, выпускаемыми совершенной формой этого гриба.

[0034] Мутант: используемый здесь термин «мутант» или «вариант» по отношению к микроорганизму означает модификацию родительского штамма, в котором целевая биологическая активность является подобной активности, выражаемой родительским штаммом. Например, в случае Microbacterium «родительским штаммом» называется оригинальный штамм Microbacterium до мутагенеза. Мутанты или варианты могут возникать в природе без вмешательства человека. Они могут быть получены также путем обработки одним или множеством способов и составов, известных специалистам в данной отрасли. Например, родительский штамм может быть обработан химикатом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанид, этилметансульфон, или же гамма-, рентгеновским либо ультрафиолетовым излучением, или любыми другими средствами, хорошо известными специалистам в данной отрасли.

[0035] Нематоцидный: термин «нематоцидный» в данном описании означает способность субстанции или композиции повысить смертность или ингибировать скорость роста нематодов.

[0036] Патоген: термин «патоген» в данном описании означает организм, такой как водоросль, паукообразное, бактерия, гриб, насекомое, нематод, растение-паразит, дрожжи, простейшее животное или вирус, способный продуцировать болезнь у растения или животного. Термин «фитопатоген» в данном описании означает патогенный организм, инфицирующий растение.

[0037] Процент идентичности: «процент идентичности последовательности», в соответствии с данным описанием, определяют путем локального сопоставления двух оптимально выровненных последовательностей на участке выравнивания, определяемом длиной локального выравнивания двух последовательностей. При оптимальном выравнивании двух последовательностей данная аминокислотная последовательность на участке выравнивания может содержать добавки или делеции (например, пробелы или оверхэнги) в сравнении с эталонной последовательностью (которая не содержит добавок или делеций). Локальное выравнивание двух последовательностей проводится только по тем сегментам каждой последовательности, которые предположительно являются достаточно подобными по определенному критерию, выбираемому в соответствии с алгоритмом, используемым для выравнивания (например, программой BLAST). Процент идентичности вычисляют путем определения количества совпадений позиций, в которых в обеих последовательностях размещаются идентичные основания нуклеиновых кислот или остатки аминокислот, деления полученной величины совпадений на общее количество позиций на данном участке выравнивания и умножения полученного результата на 100. Оптимальное выравнивание последовательностей может осуществляться с помощью алгоритма локальной гомологии Смита-Ватермана (Smith and Waterman, Add. APL. Math. 2:482, 1981) или алгоритма глобальной гомологии Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970), методом исследования подобия Пирсона-Липмана (Pearson and Lipman, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988), эвристической имплементации этих алгоритмов (NCBI BLAST, WU-BLAST, BLAT, SIM, BLASTZ) или путем визуальных исследований. Если две последовательности были выбраны для выравнивания, то для проведения их оптимального выравнивания предпочтительно использовать алгоритмы GAP и BESTFIT. Как правило, по умолчанию задают величины 5.00 для веса пробелов и 0.30 для длины веса пробелов. Термин «существенная идентичность последовательностей» между полинуклеотидными или полипептидными последовательностями относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащему последовательность, которая имеет по меньшей мере 50% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичность в сравнении с эталонной идентичностью, определенную с помощью компьютерной программы.

[0038] Анализ нуклеинокислотных и аминокислотных последовательностей может проводиться путем сопоставления их с соответствующими нуклеинокислотными или аминокислотными последовательностями, хранящимися в публичных или частных базах данных. Такие исследования могут проводиться с помощью программы NCBI BLAST v 2.18 Национального центра информации по биотехнологиями (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool). Программа NCBI BLAST доступна в сети Интернет по адресу blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (National Center for Biotechnology Information). В программе NCBI BLAST могут использоваться, как правило, следующие параметры: Опции фильтров устанавливают по умолчанию «default»; Матрицу выравнивания (Comparison Matrix) устанавливают на «BLOSUM62»; Издержки на пробелы (Gap Costs) устанавливают на «Existence: 11, Extension: 1», Размер слова (Word Size) устанавливают на 3, Порог ожидания Expect (E threshold) устанавливают на 1e-3, а минимальную длину локального выравнивания устанавливают на 50% длины анализируемой последовательности. Идентичность и сходство последовательности могут определяться также с помощью программы GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. USA).

[0039] Термин «пестицидный» в данном описании означает способность данной субстанции или композиции снизить скорость роста организма-вредителя, то есть нежелаемого организма, или повысить смертность организма-вредителя.

[0040] Под «супрессорной активностью» средства биологической борьбы с данным фитопатогеном понимают способность данного средства (агента) подавлять, ингибировать, стабилизировать, поворачивать ход болезни вспять, замедлять или задерживать развитие самого патогена или прогрессирование инфекции или болезненного состояния, вызванного данным патогеном.

[0041] Вариант: термин «вариант», используемый в данном описании по отношению к микроорганизму, означает штамм, имеющий идентифицирующие характеристики вида, к которому он принадлежит, и при этом по меньшей мере одну вариацию нуклеотидной последовательности или идентифицируемую отличительную особенность, относящуюся к родительскому штамму и являющуюся генетически (наследуемой). Например, штамм SGI-SGI-014-CQ6 вида Microbacterium, обладающий фунгицидной активностью и имеющий идентифицируемые особенности, включающие 1) способность подавлять рост гриба Fusarium graminearum и его телеоморфа Gibberella zeae, 2) способность подавлять развитие фузариоза, 3) наличие обязательных генов с идентичностью более 95%, более 96%, более 97%, более 98% или более 99% с обязательными генами SGI-014-C06 вида Microbacterium, может использоваться для подтверждения того, что анализируемый вариант является SGI-014-C06 вида Microbacterium.

[0042] В отношении нуклеиновых кислот и полипептидов термин «вариант» используется здесь для обозначения полипептидной, протеиновой или полинуклеотидной молекулы с некоторыми отличиями, созданными искусственно или природным путем, в их аминокислотных или нуклеинокислотных последовательностях от эталонных полипептидов или полинуклеотидов, соответственно. Этими отличиями могут быть, например, замены, инсерции, делеции или любые целевые комбинации таких изменений в эталонном полипептиде или полипептиде. Полипептидные и протеиновые варианты могут, кроме того, состоять из изменений в заряде и/или посттрансляционных модификаций (например, гликозилирования, метилирования, фосфорилирования и др.).

[0043] Все публикации и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены здесь посредством ссылки так, как если бы каждая из публикаций или патентных заявок была индивидуально включена посредством ссылки.

[0044] Ссылки не означают признания их известным уровнем техники или прототипом. Обсуждением ссылок констатируется, что их авторы декларируют, а заявители имеют право, оспаривать точность и релевантность цитированных документов. Вполне понятно, что, хотя здесь сделаны ссылки на множество публикаций известного уровня техники, эти ссылки не означают признания того, что любой из этих документов образует собой часть общеизвестных сведений в данной отрасли.

Методы таксономической идентификации

[0045] Микроорганизмы часто можно различать путем прямого микроскопического исследования (ведь все клетки в образце выглядят под микроскопом по-разному), по характеристикам окрашивания, путем простого молекулярного анализа (например, просто путем определения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и т.д. В дополнение к иллюстративным примерам таких методов таксономического анализа, описанных ниже, в Примерах 2-3, в таксономической идентификации того или иного микроорганизма может использоваться до нескольких различных уровней анализа, и каждый анализ может основываться на отличающихся от других характеристиках данного организма. В число таких разновидностей таксономического анализа могут входить анализ на основе нуклеиновых кислот (например, анализ индивидуальных специфических генов по уровню их присутствия или по их точной последовательности, либо по экспрессии конкретного гена или семейства генов), протеиновый анализ (например, на функциональном уровне с помощью прямого или косвенного ферментного анализа или на структурном уровне с помощью методов иммунодетектирования) и т.д.

[0046] a. Анализ посредством нуклеиновых кислот. Специалистам в данной отрасли хорошо известно, что в таксономической идентификации данного микроорганизма могут использоваться самые различные методы нуклеинокислотного анализа. Эти методы могут использоваться для идентификации клеток по нуклеотидной последовательности гена или для идентификации клетки, имеющей конкретные гены или семейства генов. Подходящими для таксономических исследований общими семействами генов могут быть семейство генов 16S, семейство актиновых генов и семейство генов рекомбиназы A (recA). В число этих методов, как правило, входят амплификация и секвенирование генов из очень малых количеств клеток, что зачастую позволяет преодолеть проблемы, связанные с концентрированием клеток и их ДНК из разбавленных суспензий. Термин «амплификация нуклеиновых кислот», в общем случае, относится к методам увеличения количества копий нуклеинокислотной молекулы в образце или препарате. Техника амплификации нуклеиновых кислот хорошо известна. Амплификацию нуклеиновых кислот можно осуществлять, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой взятый у субъекта биологический образец приводят в контакт с парой олигонуклеотидных праймеров в условиях, позволяющих осуществлять гибридизацию праймеров c нуклеинокислотной матрицей в данном образце. Праймеры в подходящих условиях удлиняются, отделяются от матрицы и затем отжигаются, удлиняются и отделяются, увеличивая число копий нуклеиновых кислот. Амплификация in vitro может проводиться также методом смещения нитей, изотермическим методом без транскрипции, методом амплификации с реакцией репарации цепей, методом лигазной цепной реакции, методом лигазной цепной реакции с заполнением разрывов, спаренным методом лигазной детекции и ПЦР; и методом амплификации без транскрипции РНК.

[0047] Кроме праймеров, приведенных в иллюстративных Примерах 2-3 и прилагаемом Перечне последовательностей, авторами в ходе лабораторных экспериментов были сконструированы также другие праймеры и, кроме того, непрерывно продолжается конструирование новых праймеров для индивидуальных биологических видов и филогенетических групп микроорганизмов. Такие узконаправленные праймеры могут находить применение в описанных здесь способах для отбора и/или специфической идентификации конкретных, целевых микроорганизмов.

[0048] Методы приготовления и использования нуклеинокислотных праймеров описаны, например, в [Sambrook et al. (In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989], Ausubel et al. (ed.) (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998]. Пары праймеров для амплификации могут быть получены из известной последовательности, например, с помощью специальной компьютерной программы «Primer», разработанной Институтом фузариоза, г. Кембридж, шт. Массачусетс, США (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Специалисту в данной отрасли хорошо известно, что специфичность зонда или праймера возрастает с его длиной. Так, например, праймер, содержащий 30 последовательных нуклеотидов его рРНК-кодирующего нуклеотидного или фланкирующего участка, будет отжигаться до целевой последовательности с более высокой специфичностью, чем соответствующий праймер, состоящий только из 15 нуклеотидов. Таким образом, для получения большей специфичности можно отбирать зонды и праймеры, содержащие по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или больше последовательных нуклеотидов целевой нуклеотидной последовательности, такие как 16S рРНК.

[0049] Нуклеиновые кислоты, подходящие для нуклеинокислотных манипуляций (например, ПЦР), можно получать с помощью таких общеизвестных технологий, как экстрагирование фенол-хлороформом, или с помощью одного из множества продажных комплектов экстрагирования ДНК. Альтернативным путем амплификации ДНК может быть присаживание клеток непосредственно в реакционную смесь для амплификации нуклеиновых кислот и проведение всех остальных манипуляций на стадии денатурации с лизисом клеток и выделением ДНК.

[0050] Полученный продукт реакций амплификации нуклеиновых кислот анализируют с помощью стандартных методов, включая электрофорез, картины расщепления рестрикционной эндонуклеазой, гибридизацию или лигирование олигонуклеотидов и/или секвенирование нуклеиновых кислот. Если методы гибридизации используются для всех целей идентификации клеток, то подходящими для этого могут быть самые различные способы мечения зондов, включая флуоресцентное мечение, радиоактивное мечение и нерадиоактивное мечение. При использовании методов секвенирования нуклеиновых кислот может проводиться исследование гомологии нуклеотидных последовательностей амплифицированных нуклеинокислотных молекул с помощью различных баз данных известных последовательностей, включая, например, базы данных DDBJ/GenBank/EMBL.

[0051] b. Протеин-опосредованный анализ. В дополнение к анализу нуклеиновых кислот, микроорганизмы могут характеризоваться с помощью таксономии и идентифицироваться непосредственно по присутствию (или отсутствию) специфических протеинов. В таком анализе за основу может приниматься активность определенного протеина, например, в ферментном анализе, или ответ совместно культивируемых организмов, или просто присутствие специфицированного протеина (которое может определяться, например, с помощью иммунологических методов, таких как иммунофлуоресцентное окрашивание антителами in situ).

[0052] Ферментный анализ. Для проведения такого анализа, в питательную среду (например, культуры на микротитровальном планшете) включают флуоресцентные или хромогенные аналоги субстрата, а затем проводят инкубацию и скрининг по продуктам реакции, идентифицируя, таким образом, культуры по их ферментативной активности.

[0053] Ответ при совместной культивации. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения активность фермента, несомого микробным изолятом, можно определять по ответу (или степени ответа) совместно культивируемого организма (например, организма-репортера).

[0054] Для идентификации микроорганизмов, выбранных и выделенных из окружающей среды-источника путем связывания по меньшей мере одного антитела или одной молекулы, полученной из антитела, с определенной молекулой, а точнее - с эпитопом молекулы, микроорганизма, также могут применяться самые различные способы.

[0055] Антитела к белкам микроорганизмов могут быть получены с помощью стандартных методик, описанных во многих литературных источниках, например, (Harlow and Lane, (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988). Определить то, связывается ли данный агент по существу только с протеином целевого микроорганизма, можно легко с помощью обычных или адаптированных методик. Одной из таких методик, подходящих для анализа in vitro, является процедура вестерн-блоттинга, описанная во многих известных работах, включая (Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988).

[0056] Более короткие фрагменты антител (молекул, полученных из антител, например, FAbs, Fvs и одноцепочечные Fvs (SCFvs)) также могут служить специфически связывающими агентами. Способы приготовления таких фрагментов широко известны.

[0057] Детекция антител, связывающихся с клетками в соответствии с изобретением, может осуществляться с помощью стандартных методов, например, иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющих получать детектируемый, например, флуоресцентный или люминесцентный, сигнал.

Выделенные культуры в соответствии с изобретением

[0058] Как более подробно описано в разделе ПРИМЕРЫ, авторами было обнаружено несколько полезных для сельского хозяйства новых микроорганизмов, способных, например, эффективно подавлять фузариоз. Указанные новые антагонистические микроорганизмы, в частности, являются эффективным средством для уменьшения тяжести заболевания фузариозом и для ингибирования роста гриба Fusarium graminearum, главного возбудителя фузариоза в пшенице. Эти микробные антагонисты были идентифицированы из пула, составляющего приблизительно 5000 микробных штаммов, полученных из образцов диких растений, собранных в нескольких местах на территории Соединенных Штатов. Начальный отбор антагонистического микроорганизма производился по способности микроорганизмов подавлять развитие патогена F. graminearum и его телеоморфа Gibberella zeae в испытаниях на антагонизм in vitro. Отобранные микробные антагонисты подвергались затем биологическим испытаниям в теплице на сеянцах пшеницы, где проводилась инокуляция сеянцев микробными штаммами, а затем - повторные инокуляции спор F. graminearum, на способность этих микробных штаммов уменьшать тяжесть инфицирования грибом и на их способность сохранять выход семян. Отобранные таким образом антагонистические микроорганизмы продемонстрировали в тепличных испытаниях свою эффективность в уменьшении тяжести фузариоза.

[0059] Кроме того, таксономический анализ показал, что каждый из описанных здесь антагонистических микроорганизмов имеет близкое родство либо с бактериальным родом Microbacterium, бактериальным родом Bacillus, бактериальным родом Variovorax, либо с родом грибов Mycosphaerella.

[0060] Род Microbacterium, типичный род семейства Microbacteriaceae, в общем случае относится к приспосабливающимся, грамположительным, неспорообразующим, палочковидным бактериям, которые изначально, на ранних стадиях исследований, были выделены на бактериях, вырабатывающих молочную кислоту. Члены рода Microbacterium поначалу широко характеризовались своей заметной теплостойкостью, присутствием в молочных продуктах и продуцированием небольших количеств L(+) молочной кислоты из глюкозы. В противоположность этим родам семейства Microbacteriaceae, виды которого отличаются когерентным пептидогликановым типом, вид Microbacterium имеет орнитин или лизин либо во межпептидном мостике, либо в позиции 3 пептидогликана B-типа. В других хемотаксономических свойствах, таких как изопреноидные хиноны (MK-11, MK-12, MK-13), полярные липиды, жирные кислоты и основной состав ДНК, члены этого семейства демонстрируют обычный диапазон разнообразия, наблюдаемый в других родах Microbacteriaceae. По результатам некоторых таксономических исследований два бактериальных рода Microbacterium и Aureo бактерия могут быть объединены. На сегодняшний день род Microbacterium включает по меньшей мере 33 вида, которые были выделены из широкого диапазона мест обитания, включая почву, молочные продукты, растительные галлы, насекомых и клинические образцы. Различные аспекты их экологии, филогении, таксономии, культивирования и условий долговременного хранения недавно были подсумированы Евтушенко и Такэути (Evtushenko и Takeuchi, 2006). Вполне понятно, что микроорганизм рода Microbacterium может быть вполне надежно идентифицирован любыми таксономическими методами, описанными выше, включая хемотаксономический анализ пептидогликанов клеточной стенки и анализ последовательностей методом выравнивания с 16S рДНК, как описано (Evtushenko и Takeuchi, 2006) и цитированных ими ссылках, а также в ссылках, цитированных в Примерах 2-3 настоящего описания. Как более подробно рассмотрено ниже, ранее сообщалось об обнаружении антагонистической активности против фузариоза у нескольких микроорганизмов природного происхождения. Однако, о том, что такой антагонистической активностью обладает микроорганизм рода Mycobacterium, до настоящего изобретения сообщений не было. Кроме того, до настоящего изобретения его авторам не были известны способы и процессы использования бактериального штамма рода Mycobacterium как агента биоборьбы для предотвращения, ингибирования или обработки против развития патогена, вызывающего фузариоз.

[0061] Bacillus является родом грамположительных вариабельных, спорообразующих палочковидных бактерий. Подобно другим родам, ассоциирующимся с ранней историей развития микробиологии, таким как Pseudomonas или Vibrio, около 266 видовых членов рода Bacillus обнаруживаются повсюду, и он широко признан как один из родов с наибольшим многообразием 16S и окружающей среды. Виды Bacillus могут быть обязательными аэробами или факультативными анаэробами, и иметь положительный тест на каталазу. Убиквист по своей природе, род Bacillus включает в себя как свободноживущие, так и патогенные виды. В тяжелых окружающих условиях эти клетки продуцируют овальные эндоспоры, которые длительное время могут пребывать в состоянии покоя. Эти характеристики изначально определяли данный род, однако не все такие виды имеют близкое родство, и многие переместились к другим родам. Фактически было предпринято несколько попыток реконструировать филогению этого рода. Bacillus-специфические исследования с наибольшим многообразием были проведены в работе (Xu and Cote, Intl. J. of Syst. Evol. Microbiol. 53 (3): 695-704; 2003) с использованием 16S и участка ITS (внутреннего транскрибированного спейсера), где авторы разделили род на 10 групп, которые включают гнездовые роды Paenibacillus, Brevibacillus, Geobacillus, Marinibacillus и Virgibacillus. Однако, согласно более поздним исследованиям род Bacillus содержит очень большое число гнездовых таксонов и особенно как в 16S, так и в 23S, он считается парафилетическим к Lactobacillales (Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus, Listeria и др.) благодаря Bacillus coahuilensis и др., например, (Yarda et al., Syst. Appl. Microbiol. 31 (4): 241-250, 2008; Yarda et al., Syst. Appl. Microbiol. 33 (6): 291-299, 2010). Одна из клад, образованная видами B. anthracis, B. cereus, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. thuringiensis и B. weihenstephanensis в соответствии с современными стандартами классификации, должна быть единичного вида (с 97% 16S идентичностью), однако по медицинским соображениям, их считают отдельными видами. В дополнение к методам таксономического анализа, описанным в Примерах 2-3, филогенетический и таксономический анализы вида Bacillus могут проводиться с помощью ряда различных методов, включая подробно описанные в (Xu and Cote, 2003; Yarda et al., 2008; Yarda et al., 2010).

[0062] Род Variovorax изначально был создан реклассификацией рода Alcaligenes paradoxus на Variovoraxparadoxus (Willems et al., 1991), который считается типичным видом этого рода. V. paradoxus был широко исследован как модель для новых биодеградационных агентов, а также взаимодействий микроб-микроб и микроб-растение. Другими видами этого рода являются V. dokdonensis, V. soli (Kim et al., 2006), и V. boronicumulans (Miwa et al., 2008). Виды Variovorax в плане катаболизма очень разнятся и вступают во взаимовыгодные взаимодействия с другими бактериальными видами во многих процессах биологического разложения и, следовательно, являются экологически значимыми и имеют высокий потенциал практического применения. Например, почвенный метанотроф, только при совместном культивировании со штамом V. paradoxus демонстрирует высокую афинность к метану (мощному тепличному газу) - особенность, которая обычно не наблюдается у лабораторных культур. Подобным образом было обнаружено, что его близкий родственник Variovorax является центральным, нефотосинтетическим партнером в рамках фототрофной консорции «Chlorochromatium aggregatum». Некоторые виды рода Variovorax обладают также способностью вмешиваться в коммуникацию других бактерий. Кроме того, некоторые виды рода Variovorax могут тесно взаимодействовать с другой биотой (например, растениями) в различных экосистемах. Более того, некоторые виды Variovorax, находясь на площади за пределами корней растения и/или внутри растения, проявляли способность активировать рост растения путем снижения уровней этилена, репрессии патогенеза, регулируемого чувством кворума, и повышения стойкости к тяжелым металлам, что очень полезно для фиторемедиации. В дополнение к методам анализа таксономии, описанным в Примерах 2-3, филогенетический и таксономический анализы вида Variovorax могут проводиться всевозможными методами, включая подробно рассмотренные в настоящем описании.

[0063] Mycosphaerella является очень большим родом грибов с более чем 2000 наименованиями видов и по меньшей мере 500 видами, ассоциированными с более чем 40 анаморфными родами (в частности, Cercospora, Pseudocercospora, Septoria, Ramularia и др.). Кроме того, несколько тысяч анаморфов не имеют телеморфов. Род Mycosphaerella включает виды, которые являются патогенами, сапробами, эндофитами или мутуалистическими ассоциациями. Разнообразные аспекты их экологии, происхождения, таксономии, методов культивирования и условий долговременного хранения недавно были описаны в (Crous et al., Persoonia, 23:119-146, 2009). Таксономическая идентификация микроорганизмов рода Mycosphaerella может производиться любым из вышеописанных соответствующих методов или их комбинацией. Наиболее общими из таких методов являются анализ последовательностей путем выравнивания с последовательностями 16S рДНК и участков внутренних транскрибированных спейсеров, как описано, например, в (Crous et al., Studies in Mycology, 55:235-253,2006; Crous et al., 2009, supra; Goodwin et al., Phytopathology 91: 648-658, 2001), а также методы, описанные в Примерах 2-3 ниже.

Депозиты биологических материалов

[0064] Очищенные культуры микробных штаммов, которые согласно их идентификации обладают супрессорной активностью против фузариоза, были депонированы в коллекцию агрокультур для исследований (Agricultural Research Service Culture Collection, размещенную по адресу 1815 N. University Street, Peoria, IL 61604, USA (NRRL)) в соответствии с «Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры» и вытекающими из него нормативными положениями (Budapest Treaty). Эти депозиты размещены под следующими номерами:

Идентификация
SGI штамма Номер депозита Предварительная таксономия видов SGI-005-G08 NRRL - Microbacterium SGI-010-H11 NRRL 50471 Mycosphaerella SGI-014-C06 NRRL B-50470 Microbacterium SGI-014-G01 NRRL B-50469 Variovorax SGI-015-F03 NRRL B-50760 Bacillus SGI-015-H06 NRRL B-50761 Bacillus

[0065] Данные микробные штаммы были депонированы с условием обеспечения доступа к этой культуре в течение нахождения данной заявки в процессе рассмотрения и принятия решения по ней руководителем Патентного ведомства США согласно 37 C.F.R. §1.14 и 35 U.S.C. §122. Эти депозиты представляют по существу чистые культуры депонированных штаммов. Доступ к депозитам обеспечивается в соответствии с патентными законодательствами стран, где зарегистрированы противоположные стороны данной заявки или их наследники. Вполне понятно, что доступ к депозитам не означает разрешения на практическое применение предмета изобретения в нарушение патентных прав, гарантированных государством.

[0066] Предпочтительные микроорганизмы в соответствии с изобретением имеют все идентификационные характеристики депонированных штаммом и, в частности, идентификационные характеристики, касающиеся способности подавлять развитие фузариоза, как указано в данном описании, и способности подавлять развитие патогена Fusarium graminearum и его телеоморфа Gibberella zeae. В частности, предпочтительные микроорганизмы в соответствии с изобретением относятся к депонированным микроорганизмам, описанным выше, и их мутантам.

Микробиологические композиции

[0067] Микробиологические композиции в соответствии с изобретением, содержащие выделенные микробные штаммы или их культуры, могут иметь самые различные формы, включая, в том числе, формы стационарной культуры, цельной культуры, сохраняемого клеточного штамма, мицелия и/или гифы (особенно, исходных глицериновых растворов), агаровых полосок, агаровые комплексы в водно-глицериновой смеси, высушенных вымораживанием маточных растворов и высушенных маточных растворов, таких как лиофилизаты или мицелии, высушенные на фильтровальной бумаге или на посевном зерне. В соответствии с определением, данным в настоящем описании, термин «выделенная культура» или используемые здесь его грамматические эквиваленты означают, что данная культура представляет собой культуральную жидкость, гранулу, соскоб, высушенный образец, лиофилат или срез (например, гифа или мицелия); или подложку, контейнер или среду, например, планшет, бумагу, фильтр, матрицу, солому, пипетку или острие пипетки, волокно, иглу, гель, тампон, пробирку, флакончик, частицу и др., которая содержит один тип организма. В настоящем изобретении выделенной культурой микробного антагониста является культуральная жидкость или соскоб, гранула, высушенный препарат, лиофилат или срез микроорганизма, или подложка, контейнер, или среда, которая содержит микроорганизм в отсутствие других организмов.

[0068] Настоящим изобретением предлагаются также композиции, содержащие по меньшей мере один выделенный микробный штамм или его культуру в соответствии с изобретением и носитель. Носителем может быть любой один носитель или множество носителей, удовлетворяющий(-щие) разнообразным свойствам, таким как повышенная стойкость, смачиваемость, диспергируемость и др. Композиция согласно изобретению может включать в себя смачивающие агенты, такие как природные или искусственные поверхностно-активные вещества, которыми могут быть неионные или ионные поверхностно-активные вещества либо их комбинации. В состав композиции могут входить также эмульсии типа вода-в-масле, которые содержат по меньшей мере один выделенный микроорганизм в соответствии с изобретением (U.S. Patent No. 7485451), включенный здесь посредством ссылки. Требуемые препараты могут быть приготовлены из смачиваемых порошков, гранул, гелей, агаровые полосок или гранул, загустителей и т.п., заключенных в микрокапсулы частиц и т.п., жидкостей, таких как водные текучие среды, водные суспензии, эмульсии типа вода-в-масле и др. Препарат может содержать зерновые или бобовые продукты (например, дробленое зерно или бобы, бульон или муку, приготовленные из зерна или бобов), крахмал, сахар или растительное масло. Носителем может быть сельскохозяйственный носитель. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения носителем является семя, а композиция может наноситься на это семя или покрывать либо пропитывать его.

[0069] В некоторых вариантах осуществления изобретения сельскохозяйственным носителем может быть почва или среда для выращивания растений. Другими подходящими сельскохозяйственными носителями являются вода, удобрения, растительные масла, увлажнители и их комбинации. В альтернативном варианте сельскохозяйственным носителем может быть твердый материал, такой как инфузорная земля, суглинок, кремнезем, альгинат, глина, бентонит, вермикулит, семенные капсулы, другие растительные и животное продукты или их комбинации, включая гранулы, окатыши и суспензии. Носителями могут служить также смеси любых вышеуказанных ингредиентов, такие как, например, песта (pesta: мука и каолиновая глина), агаровые или мучные гранулы в суглинке, песке или глине и др. Препараты могут включать в себя пищевые источники для культивированных организмов, такие как ячмень, рис или другие биологические материалы, например, семена, части растений, багасса сахарного тростника, шелуха или черешки от обработки зерна, дробленый растительный материал (например «отходы складирования») или древесина из строительных отходов, опилки или мелкие волокна от повторной переработки бумаги, тканых материалов или древесины. Специалистам в данной отрасли могут быть известны также другие подходящие материалы для этой цели.

[0070] В жидкой форме, например, растворов или суспензий, микроорганизмы могут смешиваться или суспендироваться в воде или в водных растворах. Подходящими жидкими разбавителями или носителями при этом являются вода, водные растворы, нефтяные дистилляты и другие жидкие носители.

[0071] Твердые композиции могут готовиться путем диспергирования антагонистических микроорганизмов в или на соответствующим образом разделенном твердом носителе, таком как торф, пшеница, отруби, вермикулит, глина, тальк, бентонит, инфузорная земля, сукновальная глина, пастеризованная почва и т.п. Если такие препараты используются в качестве смачиваемых порошков, то могут применяться биологически совместимые диспергаторы, такие как неионные, анионные, амфотерные или катионные диспергаторы и эмульсификаторы.

[0072] В предпочтительном варианте осуществления изобретения рассматриваемые здесь композиции предотвращают поражение фузариозом растений и, особенно, зерновых, таких как пшеница, ячмень, овес и кукуруза, а при использовании их в достаточных количествах действуют как микробные антагонисты. Подобно другим средствам биологической борьбы, эти композиции имеют высокий порог безопасности, поскольку они, как правило, не обжигают и не повреждают растение.

[0073] Как подробно показано в настоящем описании, борьба с фузариозом может осуществляться путем нанесения одной или больше микробиологических композиций в соответствии с изобретением на растение-хозяина или на его части. Эти композиции могут наноситься в количестве, эффективном для понижения уровня фузариоза по сравнению с его уровнем в необработанном контроле. Активные компоненты при этом используются в концентрации, достаточной для ингибирования развития целевого фитопатогена, когда они приложены к зерновой культуре. Для специалиста должно быть очевидно, что эффективные концентрации могут быть различными и зависеть от следующих факторов: (a) типа растения или сельскохозяйственного продукта; (b) физиологического состояния растения или сельскохозяйственного продукта; (c) концентрации патогенов, поражающих растение или сельскохозяйственный продукт; (d) типа болезни, поражающей растение или сельскохозяйственный продукт; (e) погодных условий (например, температуры, влажности); и (f) стадии развития болезни растения. Согласно изобретению, типичные величины концентрации лежат выше уровня 1×10² КОЕ/мл носителя. Предпочтительные уровни концентрации лежат в интервале приблизительно от 1×10⁴ до 1×10⁹ КОЕ/мл, а еще лучше - в интервале от 1×10⁶ до 1×10⁸ КОЕ/мл. Более предпочтительным является интервал концентрации приблизительно от 35 до 150 мг сухой микробной массы на грамм носителя (сухой препарат) или на миллилитр носителя (жидкая композиция). У твердых препаратов скорость поставки должна регулироваться так, чтобы получать число жизнеспособных клеток на единицу площади поверхности ткани растения, сравнимое с получаемым от применения вышеуказанных концентраций жидкой обработки. Как правило, агенты биологического метода борьбы в соответствии с изобретением являются биологически эффективными, когда они поставляются в концентрации выше 10⁶ КОЕ/г (колониеобразующих единиц на грамм), предпочтительно - выше 10⁷ КОЕ/г, еще предпочтительнее - в концентрации 10⁸ КОЕ/г, и наиболее предпочтительно - в концентрации 10⁹ КОЕ/г.

[0074] В некоторых вариантах осуществления изобретения количество одного или больше агентов биологической борьбы в микробной композиции в соответствии с изобретением может варьировать в зависимости от конечного препарата, а также размеров и типа растения или используемых семян. В предпочтительном варианте один или больше агентов биологической борьбы в микробной композиции находится в количестве приблизительно от 2% (мас.) до 80% (мас.) от всего количества препарата. В предпочтительном варианте один или больше агентов биологической борьбы в микробной композиции находится в количестве приблизительно от 5% (мас.) до 65% (мас.), а в наиболее предпочтительном - приблизительно от 10% (мас.) до 60% (мас.) от всего количества препарата.

[0075] Микробиологические композиции согласно изобретению могут наноситься на пшеницу или другую зерновую культуру с помощью самых различных, хорошо известных специалистам способов, таких как опыление, создание покрытия, вливание, втирание, прикатывание, протравливание погружением, распыление, обтирка щеткой и другие подходящие способы, которые не вызывают существенных повреждений у пшеницы и других зерновых культур при их обработке. Особенно приемлемым является способ распыления.

[0076] Композиции в соответствии с изобретением, как правило, являются химически инертными; поэтому они являются совместимыми по существу с любыми другими компонентами схемы распыления. Они могут использоваться также в сочетании с биологически совместимыми пестицидными активными агентами, например, с гербицидами, нематицидами, фунгицидами, инсектицидами и т.п. Они могут использоваться также в сочетании с субстанциями регуляции роста растений, такими как удобрения, регуляторы роста растений и т.п., если только такие соединения или субстанции являются биологически совместимыми.

[0077] Если пестициды или фунгициды используются в их продажных препаратах и в формах, приготовленных из этих препаратов, то активные микробные антагонисты и композиции в соответствии с настоящим изобретением могут, тем более, использоваться вместе с ними в форме синергетической смеси. Компоненты такой смеси, являясь синергистами, повышают эффективность активной композиции без необходимости добавлять в смесь специальные синергисты.

[0078] Используемые в качестве пестицидов в их продажных препаратах и в формах, приготовленных из этих препаратов, активные микробные антагонисты и композиции в соответствии с настоящим изобретением могут, тем более, использоваться вместе с ними в форме смеси с ингибиторами, которые снижают деградацию активных композиций после их применения в месте произрастания растения, на поверхности частей растения или в его тканях.

[0079] Активные микробные антагонисты и композиции согласно изобретению, в своем исходном состоянии или в препаратах, могут использоваться также в форме смеси с известными акарицидами, бактерицидами, фунгицидами, инсектицидами, микробицидами, нематицидами, пестицидами или их комбинациями, например, с целью расширения их спектра действия или для предотвращения развития стойкости этим путем. Во многих случаях, синергетика дает положительный результат, то есть активность такой смеси может превышать активность ее индивидуальных компонентов. Смесь с другими известными активными соединениями, такими как удобрения, регуляторы роста, защитные агенты и/или химикалии сигнализации также охватываются объемом изобретения.

[0080] В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиции могут содержать также по меньшей мере один химический или биологический пестицид. Количество по меньшей мере одного химического или биологического пестицида, используемого в данной композиции, может варьировать в зависимости от конечного препарата, а также размеров обрабатываемого растения и семени. В предпочтительном варианте количество по меньшей мере одного используемого химического или биологического пестицида составляет приблизительно от 0,1% (мас.) до 80% (мас.) от всего количества препарата. В более предпочтительном варианте, количество по меньшей мере одного используемого химического или биологического пестицида составляет приблизительно от 1% (мас.) до 60% (мас.), а в наиболее предпочтительном - приблизительно от 10% (мас.) до 50% (мас.).

[0081] В изобретении могут использоваться любые пестициды, известные специалистам в данной отрасли. Это могут быть, например, химические пестициды, принадлежащие к классам карбаматов, органофосфатов, хлорорганических соединений и пиретроидов. Изобретением предусмотрены также химические агенты биоборьбы, такие как, например: беномил; боракс; каптафол; каптан; хлорталонил; медьсодержащие препараты; препараты, содержащие дихлон, дихлоран, йод, цинк; фунгициды, ингибирующие биосинтез эргостерола, такие как, например, бластидидин, цимоксанил, фенаримол, флузилазол, фолпет, имазалил, ипордион, манеб, манокоцеб, металаксил, оксикарбоксин, миклобутанил, окситетрациклин, ПХНБ (пентахлорнитробензол), пентахлорфенол, прохлораз, пропиконазол, хинометионат, арсенит натрия, натрий DNOC (динитроокрезол), натрий гипохлорит, натрий фенилфенат, стрептомицин, сера, тебуконазол, тербутразол, тиабендозол, тиофанат-метил, триадимефон, трициклазол, трифорин, валидимицин, винклозолин, цинеб и цирам. В композициях согласно изобретению могут использоваться самые различные инсектицидные соединения, включая, например, указанные в заявке (U.S. Pat. Appl. No. 20110033432A1).

[0082] Микробиологические композиции в соответствии с изобретением в предпочтительном варианте содержат по меньшей мере один биологический пестицид. Типовыми биологическими пестицидами, которые являются подходящими для использования в соответствии с изобретением и могут входить в микробиологическую композицию в соответствии с изобретением для предотвращения фитопатогенной болезни, являются микробы, животные, бактерии, грибы, генетический материал, растение и природные продукты живых организмов. В этих композициях микроорганизм в соответствии с изобретением выделяется перед приготовлением препарата дополнительным организмом. В композиции с антагонистическими микроорганизмами согласно изобретению могут использоваться микробы, например, видов Ampelomyces, Aureobasidium, Bacillus, Beauveria, Candida, Chaetomium, Cordyceps, Cryptococcus, Dabaryomyces, Erwinia, Exophilia, Gliocladium, Mariannaea, Paecilomyces, Paenibacillus, Pantoea, Pichia, Pseudomonas, Sporobolomyces, Talaromyces и Trichoderma, где особенно предпочтительными являются грибные штаммы рода Muscodor. Особенно предпочтительным является также использование микробиологических композиций в соответствии с настоящим изобретением в комбинации с микробными антагонистами, описанными в (US Patent No. 7518040; US Patent No. 7601346; US Patent No. 6312940).

[0083] В качестве примеров грибов, которые могут использоваться в комбинациях с микробными антагонистами и композициями в соответствии с изобретением, можно назвать виды Muscodor, Aschersonia aleyrodis, Beauveria bassiana («белый мускарин»), Beauveria brongniartii, Chladosporium herbarum, Cordyceps clavulata, Cordyceps entomorrhiza, Cordyceps fads, Cordyceps gracilis, Cordyceps melolanthae, Cordyceps militaris, Cordyceps myrmecophila, Cordyceps ravenelii, Cordyceps sinensis, Cordycepshecocephala, Cordyceps subsessilis, Cordyceps unilateralis, Cordyceps variabilis, Cordyceps washingtonensis, Culicinomyces clavosporus, Entomophaga grylli, Entomophaga maimaiga, Entomophaga muscae, Entomophaga praxibulli, Entomophthora plutettae, Fusarium lateritium, Hirsutella citriformis, Hirsutella thompsoni, Metarhizium anisopliae («зеленый мускарин»), Metarhizium flaviride, Muscodor albus, Neozygitesfloridana, Nomuraea rileyi, Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Pandora neoaphidis, Tolypocladium cylindrosporum, Verticillium lecanii, Zoophthora radicans, и микоризные виды грибов, например, Laccaria bicolor. Подходящими могут быть также другие микопестицидные виды, известные специалистам в данной отрасли.

[0084] Настоящим изобретением предлагаются также способы лечебной обработки растения путем нанесения любого из множества обычных препаратов в эффективном количестве либо на почву (то есть, в борозды), на части растения (то есть опрыскиванием), либо на семена до их посадки (то есть нанесением покрытия или протравливанием). Обычными препаратами могут быть растворы, эмульсифицируемый концентрат, смачиваемые порошки, суспензионный концентрат, растворимые порошки, гранулы, суспензионно-эмульсионный концентрат, природные и искусственные материалы, пропитанные активным соединением, и очень мелкие полимерные капсулы с управляемым высвобождением. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции для биологической борьбы готовят в порошках, которые поступают в продажу либо в препаратах, готовых к употреблению, либо смешиваются друг с другом во время их употребления. В обоих случаях порошок может добавляться в почву перед посадкой или во время посадки. В альтернативном варианте агент биоборьбы и агент борьбы с насекомыми могут быть оба, или один из них, жидкими препаратами и смешиваться друг с другом во время лечебной обработки. Для специалиста понятно, что эффективное количество композиции согласно изобретению зависит от конечного препарата композиции, а также от размеров обрабатываемых растений или семян.

[0085] В зависимости от конечного препарата и способа его нанесения, композиция согласно изобретению может включать в себя одну или больше подходящих добавок. Такими добавками в данные композиции могут быть, например, адгезивы, такие как карбоксиметилцеллюлоза и природные либо искусственные полимеры в форме порошков, гранул или латексов, такие как гуммиарабик, хитин, поливиниловый спирт и поливинилацетат, а также природные фосфолипиды, такие как цефалины и лектицины, и искусственные фосфолипиды.

[0086] В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения микробиологические композиции готовят в едином стабильном растворе, эмульсии или суспензии. Для изготовления растворов активные химические соединения (то есть агенты биоборьбы с вредителями) перед добавлением агента биоборьбы, как правило, растворяют в растворителях. Подходящими жидкими растворителями могут быть, например, ароматические вещества из нефти, такие как ксилол, толуол или алкилнафталины, алифатические углеводороды, такие как циклогексан или парафины, например, нефтяные фракции, минеральные и растительные масла, спирты, такие как бутанол или гликоль, а также их простые и сложные эфиры, кетоны, такие как метилэтилкетон, метилизобутилкетон или циклогексанон, сильные полярные растворителями, такие как диметилформамид и диметилсульфоксид. Жидкой средой для эмульсии или суспензии является вода. В одном из вариантов осуществления изобретения агент химической борьбы и агент биологической борьбы суспендируются в жидкостях отдельно друг от друга и смешиваются во время употребления. В предпочтительном варианте приготовления суспензии агент борьбы с насекомыми и биологический агент объединяются в препарате, готовом к употреблению, имеющем срок хранения по меньшей мере два года. При употреблении жидкость может распыляться или наносится в форме пленки с помощью распылителя, либо в борозду во время посева культуры. Жидкая композиция может вводиться в почву перед прорастанием семян или непосредственно в почву в контакте с корнями с помощью разнообразных средств и методов, хорошо известных в данной отрасли, включая, например, капельное орошение, разбрызгиватели, инжекцию в почву или пропитывание почвы.

[0087] При необходимости могут добавляться стабилизаторы и буферы, включая соли щелочных и щелочноземельных металлов и органические кислоты, такие как лимонная кислота и аскорбиновая кислота, неорганические кислоты, такие как соляная кислота или серная кислота. Могут добавляться также биоциды, например, формальдегиды или формальдегид-выделяющие агенты, и производные бензойной кислоты, такие как p-гидроксибензойная кислота

Препараты для нанесения покрытий на семена

[0088] В некоторых, особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения, композиции для биоборьбы в соответствии с изобретением составляются для лечебной обработки семян. Композиция для лечебной обработки семян содержит по меньшей мере один агент борьбы с насекомыми и по меньшей мере один агент биологической борьбы. Предполагается, что семена могут по существу равномерно покрываться одним или больше слоями описанных здесь композиций для биоборьбы, используя для этого обычные методы смешивания и распыления или их комбинации и специально сконструированные и изготовленные устройства для создания покрытий, обеспечивающие требуемые точность, безопасность и эффективность нанесения на семена продуктов обработки. В таких устройствах используются различные технологии создания покрытий, например, роторного типа, барабанного типа, методы псевдоожиженного шара, фонтанирующего шара, роторного распыления или их комбинации. Жидкая обработка семян в соответствии с изобретением может осуществляться с помощью либо центрифужного дискового «распылителя», либо спрея, обеспечивающего равномерное распределение покрытия на семенах при их движении через профиль распыления. После этого семена в предпочтительном варианте перемешивают или ворошат в течение некоторого времени с целью дополнительного выравнивания распределения и сушат. Перед нанесением покрытия композицией согласно изобретению семена могут быть подвергнуты праймированию (стимуляции прорастания) для повышения равномерности прорастания и выпускания всходов. В альтернативном варианте сухой порошковый препарат может подаваться в определенных дозах на перемешиваемые семена и перемешиваться с ними до получения однородного распределения.

[0089] В другом аспекте согласно изобретению предлагаются семена, обработанные микробиологическими композициями в соответствии с изобретением. В одном из вариантов по меньшей мере часть поверхности семян является покрытой микробиологической композицией по изобретению. В одном из специфических вариантов осуществления обработанные микроорганизмами семена имеют концентрацию спор или микробных клеток приблизительно от 10⁶ до 10⁹ на одно семя. Семена могут иметь также большее количество спор или микробных клеток, например, 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² спор на семя. Микробные споры и/или клетки могут покрывать семена в свободном состоянии или, предпочтительно, наносится на них в предварительно приготовленной жидкой или твердой композиции. Твердая композиция, содержащая микроорганизмы, может готовиться путем перемешивания твердого носителя с суспензией спор до тех пор, пока твердые носители не будут пропитаны этой споровой или клеточной суспензией. После этого смесь просушивают, получая в результате требуемые частицы.

[0090] В некоторых других вариантах осуществления предполагается, что твердые или жидкие композиции для биоборьбы в соответствии с изобретением, кроме того, содержат функциональные агенты, способные защищать семена от вредного воздействия селективных гербицидов, такие как активированный уголь, питательные вещества (удобрения) и другие агенты, способные улучшать прорастание и качество продукции.

[0091] Известные способы и композиции для нанесения покрытий на семена могут быть особенно полезными, когда они модифицируются путем добавления одного из вариантов осуществления данного изобретения. Такие подходящие для применения способы и устройства для нанесения покрытий описаны, например, в (U.S. Pat Nos. 5918413; 5554445; 5389399; 4759945; 4465017). Всевозможные композиции для создания покрытий на семенах описаны, например, в (U.S. Pat. Appl. Nos. US20110033432, US20100154299, U.S. Pat. Nos. 5939356; 5876739, 5849320; 5791084, 5661103; 5580544, 5328942; 4735015; 4634587; 4372080, 4339456; и 4245432).

[0092] В препараты для обработки семян, содержащие композиции согласно изобретению, могут вводиться самые различные добавки. Такими добавками могут быть, например, связующие, состоящие предпочтительно адгезивного полимера, который может быть природным или искусственным и не должен оказывать фитотоксического воздействия на покрываемые семена. Связующее может выбираться среди следующих материалов: поливинилацетатов; coполимеров поливинилацетатов; coполимеров этиленвинилацетата (ЭВА); поливинилового спирта; coполимеров поливинилового спирта; целлюлоз, включая этилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу; поливинилпиролидонов; полисахаридов, включая крахмал, модифицированный крахмал, декстрины, мальтодекстрины, альгинат и хитозаны; жиров; растительных масел; протеинов, включая желатин и зеины; гуммиарабиков; шеллаков; винилиденхлорида и сополимеров винилиденхлорида; лигносульфонатов кальция; акриловых coполимеров; поливинилакрилатов; полиэтиленоксида; акриламидных полимеров и coполимеров; полигидроксиэтилакрилата, метилакриламидных мономеров; и полихлоропрена.

[0093] Могут использоваться любые красители, включая органические хромофоры, относящиеся к классу нитрозо; нитро; азо, включая моназо, бизазо и полиазо; акридин, антрахинон, азин, дифенилметан, индамин, индофенол, метин, оксазин, фталоцианин, тиазин, тиазол, триарилметан, ксантен. Среди других допустимых добавок можно назвать следовые питательные добавки, такие как соли железа, марганца, бора, меди, кобальта, молибдена и цинка. Для удержания этих веществ на поверхности семян могут добавлять полимерные или другие пылевидные средства.

[0094] В некоторых специфических вариантах осуществления изобретения нанесенные покрытия, помимо микробных клеток или спор, могут содержать также слой адгезива. Адгезив должен быть нетоксичным, биоразлагаемым и клейким. Подходящими для него материалами являются, например: поливинилацетаты; coполимеры поливинилацетатов; поливиниловые спирты; coполимеры поливиниловых спиртов; целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, гидроксиметилцеллюлоза и гидроксиметилпропилцеллюлоза; декстрины; альгинаты; сахара; меляссы; поливинилпирролидоны; полисахариды; протеины; жиры; растительные масла; гуммиарабики; желатины; сиропы; и крахмалы. Подходящими могут быть также материалы, описанные в (U.S. Pat. No. 7213367 и U.S. Pat. Appln. No. US20100189693).

[0095] В препарат для обработки семян также могут входить различные добавки, такие как адгезивы, диспергаторы, поверхностно-активные вещества, питательные и буферные ингредиенты. Обычными добавками в препарат для обработки семян являются, например, агенты для нанесения покрытия, смачивающие агенты, буферные агенты и полисахариды, а также по меньшей мере один подходящий для сельского хозяйства носитель, такой как вода, твердые тела или сухие порошки. Сухие порошки можно готовить из самых различных материалов, таких как карбонат кальция, гипс, вермикулит, тальк, гумус, активированный уголь и всевозможные соединения фосфора.

[0096] В одном из вариантов осуществления изобретения композиция для нанесение покрытия на семена может содержать по меньшей мере один наполнитель, являющийся органическим или неорганическим, природным или искусственным компонентом, с которым объединяются активные компоненты для облегчения их нанесения на семена. Желательно, чтобы наполнитель был инертным, твердым материалом, таким как глина, природный или искусственный силикат, кремнезем, смола, воск, твердое удобрение (например, соль аммония), природным почвенным минералом, таким как каолин, глина, тальк, известь, кварц, аттапульгит, монтмориллонит, бентонит или инфузорная земля, или искусственным минералом, таким как кремнезем, глинозем или силикат, из которых особенно подходящими являются силикаты алюминия или магния.

[0097] Препарат для обработки семян может содержать, кроме того, один или больше следующих ингредиентов: другие пестициды, включая соединения, действующие только под землей; фунгициды, такие как каптан, тирам, метаксил, флудиоксонил, оксадилил и изомеры каждого из этих материалов, и т.п.; гербициды, включая соединения, выбранные среди глифосфата, карбаматов, тиокарбаматов, ацетамидов, триазинов, динитроанилинов, глицериновых эфиров, пиридазинонов, урацилов, фенокси, мочевин и бензойных кислот; гербицидные защитные агенты, такие как бензоксазин, производные бензгидрила, N,N-диаллилдихлорацетамид, различные соединения дигалоацилов, оксазолидинилов и тиазолидинилов, этанон, соединения нафталевых ангидридов, и производные оксимов; удобрения; и агенты биоборьбы, такие как другие природные или рекомбинантные бактерии и грибы родов Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Trichoderma, Glomus, Gliocladium и микоризные грибы. Эти ингредиенты могут добавляться в форме отдельного слоя на семенах или, в альтернативном варианте, в качестве части композиции для покрытия семян согласно изобретению.

[0098] В предпочтительном варианте, количество новой композиции или других ингредиентов, используемых для обработки семян, не должно ингибировать прорастание семян или вызывать у них фитотоксические повреждения.

[0099] Обработанные микроорганизмами семена могут быть далее покрыты пленкой поверх нанесенного на них покрытия для защиты последнего. Такие поверхностные покрытия являются хорошо известными и могут наноситься методами псевдоожиженного слоя и во вращающемся барабане.

[0100] В принципе, любые семена растений, способные прорастать и образовывать растение, восприимчивое к воздействию нематодов и/или патогенных грибов, могут обрабатываться в соответствии с изобретением. Подходящими для этого являются семена зерновых культур, кофе, капустных культур, волокнистых культур, цветов, фруктов, бобовых, масличных культур, деревьев, клубнеплодных культур, овощей, а также других растений однодольных и двудольных видов. Предпочтительными для покрытия являются семена, например, бобовых, моркови, кукурузы, хлопка, трав, салата, арахиса, перца, картофеля, рапса, риса, ржи, сорго, сои, сахарной свеклы, подсолнуха, табака и томатов. В наиболее предпочтительными для покрытия композициями согласно изобретению являются семена ячменя или пшеницы (яровой пшеницы или озимой пшеницы).

[0101] В другом аспекте настоящего изобретения предлагается новое зерновое растение, созданное путем искусственного введения микробного эндофита по изобретению в зерновое растение, не содержащее эндофитных микроорганизмов. В некоторых вариантах осуществления данного аспекта микробным эндофитом, введенным в зерновое растение, может быть эндофитный антагонист, обладающий супрессорной активностью против фузариоза или возбудителя фузариоза. Кроме того, эндофитным антагонистом, введенным в зерновое растение, может быть грибной штамм SGI-010-H11. Известно множество способов, продемонстрировавших свою эффективность для введения микробного эндофита в зерновые травы. Примеры таких способов можно найти в (U.S. Pat. Appl. No. 20030195117A1, U.S. Pat. Appl. No. 20010032343A1, U.S. Pat. No. 7084331). Для специалиста в данной отрасли должно быть вполне понятным, что многие из вышеупомянутых способов могут использоваться в культивировании нового зернового растения согласно изобретению.

[0102] После искусственной инфикации желательно ДНК выделенного эндофитного антагониста амплифицировать с помощью ПЦР реакции, и подтвердить его антагонистичность путем проведения исследований гомологии для амплифицированной ДНК. Далее, желательно в вышеупомянутый эндофитный антагонист ввести инородный ген, экспрессирующий идентифицируемое средство, и подтвердить наличие колонизации данного эндофитного антагониста, инфицирующего растение, вышеупомянутым идентифицирующим средством с помощью этого инородного гена.

Получение композиции для биоборьбы в соответствии с настоящим изобретением

[0103] Культуры микробных антагонистов могут быть получены для использования в композициях биоборьбы согласно изобретению с помощью известных методов стандартной статической сушки и жидкой ферментации. Культивирование, как обычно, проводят в биореакторе.

[0104] Биореактором называется любое устройство, обеспечивающее условия биологически активной окружающей среды. В контексте данного описания биореактором является сосуд, в котором можно выращивать микроорганизмы, включая микробные антагонисты, согласно изобретению. Биореактор может иметь любую форму и размеры, подходящие для культивирования микроорганизмов. Биореактор может иметь размеры от 10 мл до литров и кубических метров. Он может быть изготовлен из нержавеющей стали или любого другого подходящего материала. Биореактор может быть периодического действия или непрерывного действия (например, с непрерывным перемешиванием). По своему типу биореактор может относиться к хемостатам, какие используются в микробиологии для выращивания и сбора бактерий. Среди поступающих в продажу подходящих биореакторов можно назвать, например, аппараты, выпускаемые фирмой Bioreactor System Design, Asenjo & Merchuk, CRC Press, 1995.

[0105] Для маломасштабных нужд, например, для тестирования и разработки новых процессов и процессов, которые не могут быть преобразованы в непрерывные, можно использовать биореактор периодического действия.

[0106] Микроорганизмы, культивируемые в биореакторе, могут суспендироваться или иммобилизироваться. Культивация в биореакторе в общем случае осуществляется в аэробных условиях при соответствующих температурах и pH. Для получения организмов согласно изобретению культивация клеток осуществляется при температурах в интервале 5-37°C, в котором предпочтительными являются температуры в интервалах 15-30°C, 15-28°C, 20-30°C и 15-25°C. Величина pH питательной среды может варьировать от 4,0 до 9,0, однако предпочтительным является рабочий интервал от немного кисловатого до нейтрального с pH 4,0-7,0, или 4,5-6,5, или pH 5,0-6,0. Как правило, максимальный клеточный выход получают в период 20-72 часов после инокуляция.

[0107] Вполне понятно, что оптимальные условия культивации антагонистов согласно изобретению зависят от конкретного штамма. Однако главные ингредиенты и условия питания можно будет определить, исходя из условий, применяемых в процессе селекции, и общих требований для большинства микроорганизмов. Микробные антагонисты, как правило, должны выращиваться в аэробных жидких культурах на среде, содержащей источники углерода, азота и неорганических солей, которые могут ассимилироваться микроорганизмом и содействовать эффективному росту клеток. Предпочтительными источниками углерода являются гексозы, такие как глюкоза. Однако их могут заменить другие, легкоассимилируемые источники, такие как аминокислоты. Источниками азота в процессе выращивания могут служить многие неорганические и белковые материалы. Предпочтительными источниками азота являются аминокислоты и мочевины, однако могут использоваться также газообразный аммиак, неорганические соли нитрата и аммония, витамины, чистые питательные вещества, пиримидины, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, протеоз пептона, соевая мука, гидролизаты казеина, фильтрат барды и т.п. Среди неорганических минералов, которые могут вводиться в питательную среду, можно назвать обычные соли, способные поставлять ионы кальция, цинка, железа, марганца, магния, меди, кобальта, калия, натрия, молибдата, фосфата, сульфата, хлорида, бората и др. Предпочтительной питательной средой для грибных антагонистов является жидкая картофельная декстроза, а для бактериальных штаммов - бульон премикс R2A.

[0108] В настоящем описании указаны и включены посредством ссылок различные источники информации, среди которых, например, статьи из научных журналов, патентные документы, учебные пособия и адреса интернет-страниц. Ссылки на эти источники служат исключительно для целей показать общее состояние уровня техники на время подачи заявки. В то время как содержание и идеи, изложенные во всех и каждом из этих источников, могут послужить основой и использоваться для реализации и применения вариантов осуществления изобретения на практике, ни одно из обсуждений и ни один из комментариев в конкретном источнике информации не может считаться признанием того, что такой комментарий был в широком смысле принят в качестве общего мнения в данной отрасли.

[0109] Приведенное здесь описание общих способов имеет исключительно иллюстративные цели. Вполне очевидными могут быть вытекающие из этого описания другие альтернативные способы и варианты осуществления изобретения, которые также лежат в рамках идеи и сферы применения настоящей заявки.

[0110] Ниже приведены примеры, которые служат также исключительно для иллюстрации данного изобретения и не предполагают каких бы то ни было его ограничений.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Описание антагонистических микроорганизмов, способных подавлять развитие Fusarium graminaerum и Gibberella zeae, являющихся возбудителями фузариоза

[0111] В данном примере описан высокопроизводительный процесс сбора и скрининга микроорганизмов-кандидатов, разработанный фирмой Synthetic Genomics, Inc. для выделения штаммов микроорганизмов, обладающих супрессорной активностью против возбудителей фузариоза и, в частности, против Fusarium graminearum. Новые микробные антагонистические штаммы были выделены из образцов растительной ткани, собранных в нескольких местах на территории Соединенных Штатов. Из тканей корней растений, собранных в заповеднике Eagle Peak Preserve вблизи Julian, CA, были выделены бактериальные штаммы SGI-014-C06, SGI-014-G01, SGI-015-F03 и SGI-015-H06. Из тканей стеблей двух образцов различных растений, собранных в San Elijo Lagoon, Encinitas, CA, были выделены грибной штамм SGI-010-H11 и бактериальный штамм SGI-005-G08.

[0112] Выделение этих микроорганизмов производили следующим образом. Для выделения бактериального штамма ткани корней растений облучали ультразвуком и последовательно разбавляли на планшетах с 2xYT (дрожжевым экстрактом с триптоном) и с безазотистой агаровой средой. После этого по морфологическим характеристикам были отобраны индивидуальные колонии, которые индивидуально культивировали в жидкой бульонной среде. Для выделения грибов растительную ткань сначала подвергали поверхностной стерилизации погружением в 70% этанол и кратковременной обработкой в пламени. Затем ткань рассекали и помещали на картофельно-декстрозный агар (ПДА), после чего ее инкубировали при комнатной температуре. Когда начинал наблюдаться рост мицелия, сегмент мицелиальной культуры переносили на другой ПДА планшет. Штаммы микроорганизмов выделяли, очищали и хранили при -80°C в 15% глицероле для бактериальных штаммов и на высушенных семенах ячменя для грибных штаммов.

[0113] У выделенных штаммов микроорганизмов определяли способность подавлять рост мицелия F. graminearum в испытаниях на антагонизм in vitro, которые проводили на агаровых планшетах с картофельно-декстрозной агаровой (ПДА) питательной средой в соответствии с методикой высокоэффективного скрининга с небольшими модификациями, описанной в заявке (U.S. Pat. Appl. No. US20120107915A1), включенной здесь посредством ссылки. Вкратце, выделенные штаммы микроорганизмов выращивали на трипсин-соевом бульоновом агаре (ТСБА/5) с одной пятой нормальной концентрации в течение 24 ч перед употреблением. Конидиальный инокулят F. graminearum NRRL-5883 продуцировали путем гифального прищипывания активно растущей колонии гриба и переноса гифальных нитей в ПДА агаровую среду. После инкубирования планшетов в течение 7 дней при 25°C с 12 ч/день фотопериодом, конидии отмывали от ПДА планшетов с помощью слабого фосфатного буфера (0,004% фосфатный буфер, pH 7,2 с 0,019% MgCl₂). Затем суспензию конидий F. graminearum в слабом фосфатном буфере (1×10⁵ конидий/мл) сразу же распределяли по поверхности агара, и затем планшеты инкубировали при 25°C в течение 48-72 ч. Для инициации теста на антагонизм, клетки выделенных микробных штаммов точечно инокулировали на равных расстояниях внутри периметра планшета. Через пять дней штаммы отмечали как антибиоз-положительные, когда по периметру микробных колоний визуально наблюдалась светлая площадь, на которой отсутствовал мицелиальный рост.

[0114] По вышеописанной методике было выделено и проанализировано более 4000 микробных штаммов. Среди них шесть штаммов проявляли способность существенно подавлять мицелиальный рост F. graminearum NRRL-5883 на ПДА среде. Эти новые микробные антагонисты получили следующие наименования: SGI-005-G08, SGI-010-H11, SGI-014-C06, SGI-014-G01, SGI-015-F03 и SGI-015-H06.

[0115] Вышеуказанные новые микробные антагонисты подвергались также тестированию на антагонизм по их способности подавлять рост грибного патогена Gibberella zeae, который является телеоморфным видом гриба Fusarium graminearum. Все используемые при этом методики были идентичными вышеописанным, за исключением того, что тестированным таким способом патогенным штаммом был патогенный штамм гриба Gibberella zeae. Среди этих шести микробных антагонистов четыре штамма SGI-010-H11, SGI-014-C06, SGI-015-F03 и SGI-015-H06 продемонстрировали способность существенно подавлять мицелиальный рост гриба Gibberella zeae.

ПРИМЕР 2. Экстрагирование ДНК. Секвенирование и таксономия

Лизис грибных клеток и получение информации о последовательности ITS-5.8S рДНК

[0116] Грибную биомассу переносили на 96-луночный ПЦР микропланшет, содержащий 50 мкл 2× буфера для лизиса (100 мM Tris HCL, pH 8,0, 2 мM EDTA, pH 8,0, 1% SDS, 400 мкг/мл протеиназы K). Лизис проводили в следующих условиях: 55°C в течение 60 минут, 94°C в течение 4 минут. Аликвоту лизисного продукта использовали в качестве источника матричной ДНК для ПЦР амплификации. Последовательность ITS-5.8S рДНК амплифицировали с помощью ПЦР реакции с двумя праймерами M13-ITS1 (SEQ ID NO: 15) и ITS4 M13-хвост (SEQ ID NO: 16).

[0117] Для амплификации участка ITS-5.8S рДНК каждую ПЦР смесь готовили в реакционной смеси с конечным объемом 20 мкл, содержащей 4 мкл из реакционной смеси грибного лизиса, 0,2 мкM каждого праймера (ITS1/ITS4), 6% Tween-20 и 10 мкл 2× ImmoMix (Bioline USA Inc, Taunton, MA). ПЦР проводили в следующих условиях: 94°C в течение 10 минут; 94°C в течение 30 секунд, 52°C в течение 30 секунд, 72°C в течение 75 секунд в течение 30 циклов; 72°C в течение 10 минут. 2-мкл аликвоту ПЦР продукта помещали на 1,0% агарозный гель для подтверждения одинарной полосы ожидаемого размера. Положительные полосы направляли на секвенирование по Сэнгеру в прямом и обратном направлениях с помощью M13 праймеров. Последовательность 5.8S межгенного участка (ITS) грибного штамма SGI-010-H11 представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 11. Исследование гомологии для определенной нуклеотидной последовательности 5.8 S межгенного участка (ITS) проводили с помощью базы данных DDBJ/GenBank/EMBL. После этого была проанализирована филогенетическая взаимосвязь нуклеотидной последовательности 5.8S межгенного участка (ITS) среди описанного здесь выделенного грибного антагониста SGI-010-H11, микроорганизмов родов и видов, демонстрирующих высокие гомологии последовательностей с выделенным грибным антагонистом SGI-010-H11, и другими разнообразными родами и видами микроорганизмов с помощью программы ClustalW строительства филогенетического дерева. Грибной штамм SGI-010-H11 считается родственным семейству Mycosphaerellaceae, если судить по ~97% сходству его последовательности ITS-5.8S рДНК с таковой у Mycosphaerellapunctiformis (GenBank EU343182) и Ramulariapratensis (GenBank EUO19284), 5.8S ITS последовательности которых демонстрируют явное родство с Mycosphaerellaceae.

Лизис бактериальных клеток и получение информации о последовательности 16S рРНК

[0118] 20 мкл аликвоту клеточной суспензия перенесли на 96-луночный ПЦР планшет, содержащей 20 мкл 2х буфера для лизиса (100 мM Tris HCL, pH 8,0,2 мM EDTA, pH 8,0,1% SDS, 400 мкг/мл Протеиназы K). Лизис проводили в следующих условиях: 55°C в течение 30 минут, 94°C в течение 4 минут. Аликвоту лизисного продукта использовали в качестве источника матричной ДНК для ПЦР амплификации. Последовательность 16S рРНК амплифицировали с помощью ПЦР реакции с праймерами M13-27F (SEQ ID NO: 17) и 1492R M13-хвост (SEQ ID NO: 18).

[0119] Для амплификации участка 16S рРНК каждую ПЦР смесь готовили в реакционной смеси с конечным объемом 20 мкл, содержащей 4 мкл из реакционной смеси бактериального лизиса, 2 мкM каждого праймера (27F/1492R), 6% Tween-20 и 10 мкл 2x ImmoMix (Bioline USA Inc, Taunton, MA). ПЦР реакцию проводили в следующих условиях: 94°C в течение 10 минут; 94°C в течение 30 секунд, 52°C в течение 30 секунд, 72°C в течение 75 секунд в течение 30 циклов; 72°C в течение 10 минут. 2-мкл аликвоту ПЦР продукта поместили на 1,0% агарозный гель для подтверждения одиночной полосы ожидаемого размера. Положительные полосы направляли на секвенирование по Сэнгеру в прямом и обратном направлениях с Ml3 праймерами. Последовательности 16S рРНК бактериальных штаммов SGI-014-C06, SG1-005-G08, SGI-014-G01, SGI-015-F03 и SGI-015-H06 имели длину приблизительно 1,4 Kb и представлены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO: 1, 10, 12, 13 и 14, соответственно. Исследование гомологии для определенных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью базы данных DDBJ/GenBank/EMBL. После этого анализировали филогенетическую взаимосвязь нуклеотидной последовательности 16 рРНК генов среди описанных здесь выделенных бактериальных антагонистов, бактерий родов и видов, проявляющих высокие гомологии последовательностей с выделенными бактериальными антагонистами, и других разнообразных бактериальных родов и видов с помощью программы ClustalW строительства филогенетического дерева. Идентичность последовательностей и сходство определяли также с помощью программы GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. USA). Результаты анализа последовательностей показали, что бактериальный изолят SGI-014-G01 может считаться родственным роду Variovorax на основании ~99% сходства его 16S рРНК последовательности с таковыми у нескольких видов Variovorax, включая Variovorax. R-21938 (GenBank AJ786799) и Variovoraxparadoxus (GenBank GUI 86109), 16S рРНК последовательности которых демонстрируют явную родственность с видом Variovorax. Кроме того, результаты анализа последовательностей показали, что два бактериальных изолята SGI-015-F03 и SGI-015-H06 могут считаться родственными семейству Bacillaceae на основании >99% сходства их соответствующих 16S последовательностей таковым у нескольких видов Bacillus.

[0120] Результаты анализа последовательностей показали, что два бактериальных изолята SGI-014-C06 и SGI-055-G08 могут считаться родственными семейству Microbacteriaceae на основании >99% сходства их соответствующих 16S последовательностей таковым у нескольких видов Microbacterium. А именно, 1430 нт последовательность 16S рРНК гена SGI-014-C06 (SEQ ID NO: 1) является идентичной 16S рРНК гена штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans и нескольких других штаммов Microbacterium (например, последовательностям Y17227.1, FJ200406, EU086800 и EU714335 из GenBank) на всей 1430 нт длине.

[0121] В частности, среди тысяч микробных штаммов, которые были выделены и протестированы на способность подавлять развитие Fusarium в анализе на антагонизм, как описано в Примере 1, восемьдесят восемь штаммов были вслед за этим идентифицированы как вид Microbacterium на основании подобия их 16S последовательностей таковым у известных видов Microbacterium. Однако авторами было установлено, что супрессорной активностью против Fusarium graminearum обладали только два штамма - SGI-014-C06 и SGI-055-G08 Microbacterium. Как указывалось выше, на сегодняшний день сообщалось о нескольких микробах природного происхождения, обладающих антагонистической активностью против фузариоза. Однако до настоящего изобретения не было сообщений о микроорганизме рода Mycobacterium, обладающем антагонистической активностью. Кроме того, до настоящего изобретения его авторам не были известны способы или процессы, в которых бы использовался бактериальный штамм рода Mycobacterium в качестве агента биоборьбы по предотвращению, ингибированию или лечебной обработке по отношению к развитию патогена, являющегося возбудителем фузариоза.

ПРИМЕР 3. Анализ последовательностей обязательных генов из изолята SGI-014-C06

[0122] Недавно в работе (Richert et al. Syst. Appl. Microbiol. 30:102-108, 2007) сообщалось о филогенетических исследованиях нескольких обязательных генов из 27 видов рода Microbacterium. В этих исследованиях было сделано заключение, что хотя достоинства анализа 16S рРНК последовательностей для систематической таксономии являются непревзойденными, фокусирование внимания только на единственном таксономическом параметре не приведет к систематическим выводам. Как указывалось выше, нуклеотидная последовательность 16S рРНК гена штамма SGI-014-C06 (SEQ ID NO: 1) является идентичной 16S рРНК гена нескольких штаммов Microbacterium, включая нуклеотидную последовательность 16S рРНК гена штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans, который был включен в исследования (Richert et al. (2007) (GenBank Accession Y17227.1)). Авторы изобретения распространили далее филогенетический анализ на четыре обязательные гена изолята SGI-014-C06, которыми являются субъединица B ДНК-гиразы (gyrB), субъединица B РНК-полимеразы (rpoE), рекомбиназа A (recA), и полифосфат-киназа (ppk). В направлении этого конца весь геном изолята SGI-014-C06 был секвенирован методом «шотган», собран и аннотирован в соответствии с методиками, описанными в (PCT Patent Application No. WO2010115156A2). Геномная ДНК была приготовлена из свежей культуры SGI-014-C06. Для экстрагирования высокомолекулярной ДНК использовались клеточная гранула и комплект для выделения ДНК UltraClean® Mega Soil DNA Isolation Kit (Cat. No 12900-10), выпускаемый MO BIO Laboratories, Inc., согласно протоколу, рекомендованному изготовителем. После этого была приготовлена геномная ДНК из SGI-014-C06 для «шотган» 454-пиросеквенирования. Геномная ДНК (7,5 мкг) использовалась для конструирования библиотеки в соответствии с рекомендованным протоколом (454 Life Sciences) для одиночных длинных рядов. Последовательности были генерированы двумя последовательными проходами секвенирования GS FLX Titanium.

[0123] Получены последовательности четырех обязательных генов gyrB, rpoB, recA, andppk изолята SGI-014-C06, приведенные в Перечне последовательностей. Исследования гомологии для определенных нуклеотидных последовательностей проводились с помощью базы данных DDBJ/GenBank/EMBL. Идентичность последовательностей и сходство также определялись с помощью программы GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. USA). Ниже более подробно показано, что результат секвенирования обязательных генов выявил новизну описанного здесь изолята SGI-014-C06, который является новым бактериальным штаммом и может считаться родственным семейству Microbacteriaceae.

[0124] Полинуклеотидная последовательность гена gyrB штамма SGI-014-C06 имеет наибольшую идентичность с последовательностью гена gyrB штамма Microbacterium testaceum с номером доступа AP012052 в GenBank (82,69% по выравниванию 936/2172 нуклеотидов). По сравнению с геном gyrB штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans (GenBank AMI 81493; Richert et al., 2007), гомологии последовательностей между этими двумя генами были на ~62% идентичными на нуклеотидном уровне и на ~37% идентичными на аминокислотном уровне.

[0125] Полинуклеотидная последовательность гена rpoB штамма SGI-014-C06 имеет наибольшую идентичность с последовательностью гена rpoB штамма Microbacterium maritypicum с номером доступа AM181582 в GeneBank (96,98% по выравниванию 1093/3504 нуклеотидов). По сравнению с геном rpoB штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans (GenBank AM181583; Richert et al., 2007), гомологии последовательностей между этими двумя генами были на ~96% идентичными на нуклеотидном уровне и на 99% идентичными на аминокислотном уровне.

[0126] Полинуклеотидная последовательность гена recA штамма SGI-014-C06 имеет наибольшую идентичность с последовательностью гена recA штамма Microbacterium testaceum с номером доступа AP012052 в GeneBank (85,45% по выравниванию 962/1188 нуклеотидов). По сравнению с геном recA штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans (GenBank AMI 81527; Richert et al., 2007), гомологии последовательностей между этими двумя генами были на ~92% идентичными на нуклеотидном уровне и на 100% идентичными на аминокислотном уровне.

[0127] Полинуклеотидная последовательность гена ppk штамма SGI-014-C06 имеет наибольшую идентичность с последовательностью гена ppk штамма Microbacterium luteolum с номером доступа AM181554 в GenBank (91,38% по выравниванию 1380/2175 нуклеотидов). По сравнению с геном ppk штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans (GenBank AMI 81556; Richert et al., 2007), гомологии последовательностей между этими двумя генами были на ~91% идентичными на нуклеотидном уровне и на ~98% идентичными на аминокислотном уровне.

ПРИМЕР 4. Защита пшеницы от инфекции Fusarium graminearum с помощью микробных антагонистов Microbacterium. (NRRL B-50470) Mycophaerella. fNRRL 50471) и Variovorax. (NRRL B-50469)

[0128] Описанные в Примере 1 микробные штаммы, продемонстрировавшие положительную пробу на антибиоз в скрининге по антагонизму, далее были подвергнуты биоиспытаниям на растениях, в которых клетки микробных штаммов наносились непосредственно на семена восприимчивого зернового культивара с последующей инокуляцией конидиальными спорами гриба F. graminearum. Микробные штаммы выращивались до достаточной мутности и разбавлялись в воде. Два грамма семян пшеницы восприимчивого сорта (Hank; WestBred LLC, Bozeman, MT) высеивали в однолитровые горшки с пастеризованной почвенной средой. После высеивания, поверх семян распределяли 20 мл раствора микробной культуры. Семена пшеницы выдерживали в тепличных условиях для проращивания под флуоресцентным освещением в течение 14 ч фотопериода. В начале цветения колос пшеницы подвергали заражению путем распыления конидиальных спор NRRL 5883 F. graminearum. Конидиальные споры собирали с ПДА планшетов пятидневного возраста путем выливания на планшеты воды с 0,01% Tween 20 и соскабливания спор в суспензию. После распыления спор пшеничные растения переносили в туманную камеру с 100% влажностью и выдерживали в ней в течение трех дней для инфицирования. Таким образом готовили следующие образцы:

[0129] 1. Необработанные образцы: без обработки микробным или химическим фунгицидом + заражение Fusarium.

[0130] 2. Неинфицированные образцы: без обработки микробным или химическим фунгицидом, без заражения Fusarium.

[0131] 3. SGI-010-H11: грибная обработка + заражение Fusarium.

[0132] 4. SGI-014-GO1: бактериальная обработка + заражение Fusarium.

[0133] 5. SGI-014-C06: бактериальная обработка + заражение Fusarium.

[0134] Через двадцать дней после инфицирования орошение прекращали, и пшеничным растениям давали высохнуть в течение трех недель перед сбором урожая. Затем каждый колос пшеницы срезали и собирали индивидуально. Тяжесть болезни определяли для каждого колоса, имевшего симптомы фузариоза. Численно тяжесть болезни определяли путем деления числа пораженных колосков на общее число колосков, приходившееся на один колос. Полученные результаты (таблица 2) показали, что пшеница, обработанная любым из трех микробных антагонистов SGI-014-C06 (NRRL B-50470), SGI-010-H11 (NRRL 50471) и SGI-014-G01 (NRRL B-50469), имела значительно меньшие тяжесть болезни и количество заражений Fusarium graminearum, чем «необработанный» контроль, выращиваемый в тех же самых условиях (P<0,05).

[0135] Семена с каждого колоса собирали вручную и взвешивали. Определяли средний вес семян на горшок и в каждом режиме обработки. Как показано в таблице 3, все микробные антагонисты дали значительное снижение потерь урожая, обусловленных инфицированием фузариозом.

Таблица 2
Эффективность микробных антагонистов в снижении количества заболеваний пшеницы фузариозом Обработка Тяжесть заболевания, % Стандартное отклонение Величина P Неинфицированный 1,30 0,0025 <0,0001 Необработанный 15,46 0,0364 Не определена SGI-010-H11 7,42 0,0219 0,0005 SGI-014-G01 6,59 0,0315 0,0001 SGI-014-C06 7,21 0,0225 0,0004

Таблица 3
Эффективность микробных антагонистов в сохранении выхода семян в пшенице, зараженной фузариозом Обработка Масса семени, г Величина P Неинфицированный 0,8438±0,1633 0,0191 Необработанный 0,4669±0,1209 Не определена SGI-010-H11 0,6200±0,1 844 0,7025 SGI-014-G01 0,7963±0,2032 0,5277 SGI-014-C06 0,6744±0,0948 0,0551

ПРИМЕР 5. Ингибирование роста Fusarium graminearum микробными антагонистами на сеянцах пшеницы

[0136] Микробные штаммы, продемонстрировавшие супрессорную активность против F. graminearum в лабораторном тесте на антагонизм, были исследованы также на их способность снижать заболеваемость фузариозом семян пшеницы. Семена восприимчивого сорта пшеницы (Hank; WestBred LLC, Bozeman, MT) высеивали в 1-литровые пластмассовые горшки диметром 20 см с пастеризованной почвенной средой. Микробные клеточные суспензии готовили следующим образом. 2YT или другую подобную питательную среду инокулировали бульонными культурами из матричных глицериновых растворов изолятов или штриховых планшетов. Как правило, культуры инициировались за 48-72 ч до помещения их в камеру для культивирования, теплицу или на поле, где они достигали поздней экспоненциальной фазы роста. Изоляты с более длительным временем удвоения инициировались, кроме того, заранее. Культуры инкубировали при 30°C на роторном шейкере при 200 об/мин. После культивирования клетки формировались в гранулы 10000×г в течение 15 мин при 4°C и ресуспендировались в 10 мM MgSO₄ буфере (pH 7,0). Плотность клеток нормировали для каждого изолята в единицах КОЕ/мл (клеткообразующих единицах на миллилитр). Как правило, готовили ~10⁹ КОЕ/мл суспензии для каждого изолята, которую доставляли к месту инокуляция на льду. Инокуляцию проводили путем разбавления этих клеточных суспензий в отношении 1/20 в ирригационной воде до конечной плотности 5×10⁷ КОЕ/мл. Для опытов в 1 литровых горшках 20 мл этой разбавленной клеточной суспензии равномерно распределяли по культивационной поверхности каждого горшка. Для экспериментов в микрогоршках клеточные суспензии не разбавлялись, и 1 мл каждой 10⁹ КОЕ/мл суспензии помещали пипеткой на культивационную поверхность каждого горшка подобно опрыскиванию по верху погруженных семян. Семена и растения выдерживались в теплице при комнатной температуре с 14-ти часовым фотопериодом освещения.

[0137] Мицелий штамма NRRL-5883 вида Fusarium graminearum выращивали на ПДА планшетах в течение 5 дней при непрерывном освещении. Гифы и конидии собирали путем выливания нескольких миллилитров стерильной воды (0,01% Tween 20) на планшеты и соскабливания поверхности агара стерильным шпателем. Концентрация спор в инокуляте составляла приблизительно 2×10⁵ спор/мл, однако концентрация гифального фрагмента не определялась.

[0138] Инокуляцию видом F. graminearum начинали после выхода коротких ростков из семян и повторяли каждый второй вечер на протяжении 10 дней. Инокулят F. graminearum наносили путем разбрызгивания в количестве приблизительно 30 мл на горшок. Сразу после инокуляции, всякий раз растения опрыскивали сверху с помощью туманообразователя. При использовании химического фунгицида его готовили путем разбавления 2 мл фунгицидного исходного раствора (Banner Maxx, Syngenta) в 1 л дистиллированной воды и наносили с помощью разбрызгивателя в количестве приблизительно 30 мл на горшок.

[0139] Фузариозное поражение оценивали по степени Fusarium инфицирования, определяя ее числом Fusarium колониеобразующих единиц на грамм (КОЕ/г) растительных тканей. Все операции обработки выполнялись в четырех блоках по четыре горшка в каждом. Проводились следующие виды обработки:

[0140] 1. Необработанный: без обработки микробным или химическим фунгицидом + заражение Fusarium.

[0141] 2. Неинфицированный: без обработки микробным или химическим фунгицидом и без заражения Fusarium.

[0142] 3. Фунгицид: обработка химическим фунгицидом + заражение Fusarium.

[0143] 4. SGI-010-H11: грибная обработка + заражение Fusarium.

[0144] 5. SGI-014-G01: бактериальная обработка + заражение Fusarium.

[0145] 6. SGI-014-C06: бактериальная обработка + заражение Fusarium.

[0146] Полученные результаты, которые приведены в таблице 4, показали, что все три микробные обработки дали значительное снижение тяжести фузариоза по сравнению с неинфицированным контролем. В частности, два микробных антагониста, SGI-014-C06 и SGI-010-H11, значительно снизили инфицирование пшеницы видом Fusarium graminearum по сравнению с необработанным контролем, выращиваемым в таких же самых условиях. Защита пшеницы от Fusarium-инфицирования, осуществляемая любым из двух микроорганизмов - SGI-014-C06 или SGI-010-H11, была статистически сравнимой с защитой продажным химическим фунгицидом. При использовании микроорганизма SGI-014-G01 наблюдаемая защита пшеницы от Fusarium-инфицирования была намного менее заметной, а ее эффективность существенно изменялась от одного культивационного горшка к другому.

Таблица 4
Действие микробных антагонистов на инфицирование грибом Fusarium Обработка КОЕ/г Величина P Необработанный 1487±600 Не определена Неинфицированный 0±0 <0,0001 Химический фунгицид 290±146 <0,0001 SGI-010-H11 671±450 0,0077 SGI-014-G01 1246±465 0,8387 SGI-014-C06 367±234 0,0001

ПРИМЕР 6. Культивирование и хранение микробных антагонистов

[0147] Вид Mycosphaerella. Для хранения выделенного гриба в качестве чистой культуры использовали несколько способов, в одном из которых применяли фильтровальную бумагу. В другом случае, после культивирования гриба на ПДА его разрезали на маленькие квадраты, которые помещали во флакончики с 15% раствором глицерола и сохраняли в них при -70°C. В аналогичном опыте этот гриб хранили при 4°C, но не в глицероле, а в дистиллированной воде. Однако одним из предпочтительных способов было хранение на инфицированных стерильных семенах ячменя при -80°C.

[0148] Виды Bacillus, Microbacterium и Variovorax. Выделенные бактерии сохранялись как чистая культура. Бактериальную колонию переносили в флакончик с жидкой бульонной средой R2A (Tecknova) и культивировали в нем при 30°C на шейкере при скорости 250 об/мин в течение двух дней. После этого культуру переносили во флакончики с 15% раствором глицерола и сохраняли в них при -80°C.

ПРИМЕР 7. Обработка для продуцирования спор и нанесения покрытия на семена

[0149] Продуцирование спор. В соответствии с типовой методикой продуцирования спор, один литр питательной среды 2xYT (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl) инокулировали стартерной культурой в количестве 5 мл или соскобом чашки Петри и инкубировали в течение ночи при 30°C в ротационном шейкере со скоростью 225 об/мин. Бактериальные клетки гранулировали путем центрифугирования и промывали 1x ЗФР буфером (8 г/л NaCl; 0,2 г/л KC1; 1,44 г/л Na₂HPO₄; 0,24 г KH₂PO₄; pH 7,4). Клетки ресуспендировали в среде CDSM (Hageman et al, J. Bacterial., 438-441, 1984), и культивировали еще в течение четырех ночей при 30°C в ротационном шейкере. Споруляцию в бактериальной культуре контролировали ежедневно с помощью фазоконтрастного микроскопа до тех пор, пока не образовалась вся культура из свободно плавающих спор. Продолжительность такого инкубирования, как правило, не превышает четырех дней или же длится более шести дней, в зависимости от культивируемого вида. Под фазоконтрастным микроскопом эндоспоры видны внутри клеток в виде ярко-белых сплющенных сфероидов. Бактериальные споры гранулировали путем центрифугирования в режиме 10000 X г в течение 15 минут, дважды промывали стерильной dH₂О и, при необходимости, концентрировали до 50 мл, и могли либо сразу использоваться, либо охлаждаться для использования в будущем. Концентрацию спор измеряли по методике OD₆₀₀. Эта методика, как правило, давала по меньшей мере 2000 OD бактериальных спор.

[0150] В частности, несколько бактериальных штаммов в соответствии с изобретением, например, SGI-015-F03 вида Bacillus, могут продуцировать большие количества спор после 4 дней инкубации с простой инокуляцией большой, росшей в течение ночи стартерной культурой (~15 мл) в 1 л 2хSG питательной среды с последующей 4-дневной инкубацией при соответствующей температуре в ротационном шейкере в режиме 225 об/мин. Использовалась питательная среда 2хSG следующего состава: 16 г/л питательный бульон; 0,25 г/л MgSO₄; 2,0 г/л KCl; 0,15 г/л CaCl₂.2H₂O; 0,025 г/л MnCl₂.2H₂O; 0,28 мг/л FeSO₄-7H₂O; 1,0 г/л декстрозы.

[0151] Нанесение покрытия на семена пшеницы и кукурузы. Проводили маломасштабный эксперимент по обработке семян в соответствии с минимально модифицированной методикой, описанной в (Sudisha et al., 2009). Как правило, готовили маточный раствор биополимера путем добавления 6 г порошка гуммиарабика (MP Biomedical) в 36 мл воды в 50 мл пробирке Falcon и последующего перемешивания до гомогенности с помощью колесного миксера. Для перемешивания больших количеств покрываемых семян, где необходимо, использовали смесительную плиту.

[0152] Если использовали растительные клетки, то мутные культуры активно растущих микробных клеток промывали ЗФР (забуференным фосфатом физиологическим раствором) и доводили до OD₆₀₀~5,0. В альтернативном варианте микробные споровые суспензии готовили так, как описано выше. Бактериальные споры и/или растительные клетки тщательно ресуспендировали в ~32 мл гуммиарабик-биoполимерного маточного раствора, приготовленного так, как описано выше, и полученную суспензию тщательно перемешивали в 1 л бутыли. В бутыль добавляли приблизительно 400 г семян (пшеницы или кукурузы) и интенсивно перемешивали на шейкере или вихревом встряхивателе до достижения равномерного распределения гумми/клеточной суспензии. Затем покрытые семена распределяли по пластмассовым блюдцам для сушки в ламинарном потоке до устранения липкости, в общем случае в течение 3-6 ч с периодическим перемешиванием. В некоторых случаях, покрытые спорами семена можно сушить в течение ночи. Однако, семена, покрытые растительными культурами, как правило, отправлялись на хранение до того, как они полностью обезвоживались. Тест на жизнеспособность, которому периодически подвергались микробы, используемые в препаратах покрытий на семенах, показал, что эти микробы сохраняли жизнеспособность в течение по меньшей мере трех месяцев. Скорость прорастания покрытых семян была практически идентичной таковой у непокрытых контрольных семян.

ПРИМЕР 8. Влияние микробной обработки семян на развитие фузариоза в пшенице

[0153] Семена восприимчивого к фузариозу сорта (RB07) пшеницы покрывались микроорганизмами SGI-014-C06 или SGI-015-F03, или SGI-015-H06 в соответствии с методикой, описанной в Примере 8. Покрытые семена высевали в 1 л горшки с пастеризованной почвенной средой [(Metromix-Mix 200; Scotts-Sierra Horticultural Products, Marysville, OH; и 3 грамма удобрения 14-14-14 (N-P-K)]. Горшки засеменялись по 7-8 растений в каждом, после чего, в фазу роста 3-го листа, их засеменение уменьшали до 5 растений на горшок. Горшки объединяли в рандомизированные блоки по 5 горшков на обработку. Далее, покрытые семена ставили для прорастания в тепличные условия с флуоресцентным освещением в течение 16 ч в сутки. Когда началось цветение пшеницы, ее путем разбрызгивания на колос заражали макроконидиальными спорами штамма NRRL 5883 вида F. graminearum в концентрации 100000 спор/мл. После разбрызгивания спор пшеницу помещали в климатическую камеру с 100% влажностью и образованием росы, и выдерживали в этих благоприятных для инфицирования условиях в течение трех дней. Проводили такие виды обработки образцов:

[0154] 1. Необработанный: без микробной или химической фунгицидной обработки + заражение Fusarium.

[0155] 2. SGI-014-C06: бактериальная обработка семян + заражение Fusarium.

[0156] 3. SGI-015-F03: бактериальная обработка семян + заражение Fusarium.

[0157] 4. SGI-015-H06: бактериальная обработка семян + заражение Fusarium.

[0158] Тяжесть фузариоза оценивали визуально на десятый день и двадцать первый день после инфицирования. Степень инфицирования определяли для каждого колоска, проявляющего симптомы фузариоза, и вычисляли процент симптоматических колосков, то есть умноженное на 100 число колосков, демонстрирующих симптомы фузариоза, делили на общее число колосков. Полученные результаты (таблица 5) показали, что семена пшеницы, покрытые любым из трех тестируемых микробных антагонистов - SGI-014-C06, SGI-015-F03, SGI-015-H06, имели значительно пониженную степень инфицирования грибом Fusarium graminearum по сравнению с «необработанным» контролем, выращиваемым в таких же самых условиях (P<0,05).

Таблица 5
Развитие симптомов фузариоза в пшенице после обработки семян антагонистическими микроорганизмами Обработка Степень инфицирования, % На 10 день после инфицирования На 21 день после инфицирования Необработанный контроль 49,31 66,10 SGI-014-C06 2,08 7,74 SGI-015-F03 23,12 31,53 SGI-015-H06 9,42 19,81

ПРИМЕР 9. Биоборьба с фузариозом пшеницы в тепличных испытаниях

[0159] Каждый из микроорганизмов SGI-014-C06, SGI-015-F03 и SGI-015-H06 тестировали в тепличных испытаниях большего масштаба. Испытания проводили в «теплице для культивирования растений» (PGCR: plant growth containment room) при фирме Synthetic Genomics, Inc., и включали такие виды лечебной обработки: инфицированный контроль, неинфицированный контроль, а также обработку промышленными фунгицидами четырех марок. Среди них были: химические фунгициды марок Banner MAXX® (Syngenta) с концентрацией 2 мл/л и Prosaro® (Bayer CropScience) с концентрацией 3 мл/л, которые наносились путем распыления на листья в соответствии с рекомендациями изготовителя, и биологические фунгициды марок Actinovate® (Natural Industries) и RhizoVital® (ABiTEP GmbH), которые наносились путем опрыскивания почвы также в соответствии с рекомендациями изготовителя.

[0160] Препарат для микробной обработки наносили либо путем опрыскивания почвы, либо путем покрытия семени. Когда микробную обработку проводили путем опрыскивания почвы, клеточные суспензии каждого микроорганизма индивидуально наносили на семена перед покрытием их большим количеством питательной среды. Для этого, свежеприготовленные культуры гранулировали, удаляя с них питательные вещества, и повторно суспендировали в 10 мM сульфат-магниевого (MgSO₄) буфера. После этого клеточные суспензии добавляли путем пипетирования и равномерного распределения 20 миллилитров суспензии по семенам при общем количестве ~10⁹ клеток на горшок. В случае микробной обработки путем нанесения покрытий на семена, микроорганизмы (клетки/споры) готовили по существу так, как описано выше, в Примере 8. Покрытые семена получали путем введения в клеточную суспензию раствора гуммиарабика и, таким образом, создания липкой смеси для последующего нанесения ее на семена. После этого микробное покрытие семян просушивали, в результате чего образовывался твердый, но водорастворимый, биополимер захватывающий микроорганизмы (клетки/споры). Цель этих манипуляций состояла в том чтобы обеспечить титр клеток по меньшей мере 10⁶-10⁷ жизнеспособных клеток/семя. В этом тепличном эксперименте покрытие на семена наносили за день до посева.

[0161] Для каждого вида обработки было предусмотрено четыре одинаковых комплекта образцов, размещенных по рандомизированной полнооблочной схеме проведения эксперимента (RCBD: Randomized Complete Block Design) на трехуровневых полках, расположенных в два ряда вдоль боковых сторон теплицы. Полки были оборудованы флуоресцентной системой освещения (Agrosun, 5850K), которая обеспечивала освещенность в среднем 800 мкмоль, измеренную на поверхности горшка. Каждый комплект образцов состоял из четырех неподвижно установленных 1 л горшков. Горшки наполняли искусственной питательной средой, состоящей из питательной среды на основе резуховидки Arabidopsis Growth Medium AIS (от фирмы Lehle Seeds) и крупного промытого песка в объемном соотношении 3:1. Во всех горшках по поверхности питательной среды распределяли по два грамма семян яровой пшеницы (Hank, WestBred). Горшки имели донную подачу воды с поддержанием ~2 см уровня воды и визуально контролировались на прорастание и рост.

[0162] В фазу цветения (по системе идентификации роста и развития зерновых культур Feekes 10.5.1) колос пшеницы инфицировали распылением суспензии конидиальных спор Fusarium graminearum. Для этого тепличного эксперимента споры грибов готовили путем посадки гомогенизированного мицелия штамма NRRL 5883 F. graminearum на большие ПДА планшеты и последующей пятидневной инкубации в условиях непрерывного освещения при комнатной температуре. После этого грибные споры собирали путем заливки планшетов магний-сульфатным буфером (10 мM MgSО₄; 0,01% Tween 20) и соскабливания поверхности агара стерильным шпателем. После регулирования концентрации спор, их в количестве приблизительно 50000 конидиальных спор на один колос наносили на растения с помощью ручного распылителя. Относительную влажность в теплице повышали до 90% и выдерживали в течение трех дней для инфицирования, а затем возвращали на нормальный уровень. После того как семена пшеницы завязались, подачу воды прекратили и колоскам дали возможность полностью высохнуть. Затем колосья пшеницы собирали каждый индивидуально. Тяжесть заболевания определяли для каждого колоса, имевшего симптомы фузариоза, путем подсчета числа пораженных колосков и деления его на общее число колосков, приходящееся на один колос. Полученные результаты (таблица 6) показали, что пшеница, обработанная любым из трех тестируемых микробных антагонистов, SGI-014-C06, SGI-015-F03, SGI-015-H06, имела значительно меньшую тяжесть и количество инфикаций Fusarium graminearum по сравнению с «необработанным» контролем, выращиваемым в таких же самых условиях (P<0,05).

Таблица 6
Эффективность микробных антагонистов в уменьшении заболеваемости пшеницы фузариозом Обработка Степень инфицирования, % Защита от инфекции, % Неинфицированный 2,1±2,9 Не определена Инфицированный 37,2±9,8 0,00 Prosario® 4,6±2,8 93,00 Banner-MAXX® 12,5±5,8 70,00 Actinovate® 38,9±12,1 -5,00 Rhizo Vital® 28,0±5,4 26,00 SGI-014-C06 18,4±9,1 30,00 SGI-015-F03 25,4±6,9 54,00 SGI-015-H06 26,6±7,4 34,00

[0163] Для определения выхода семян, каждый колос пшеницы срезали вручную, семена собирали и очищали от шелухи и других детритов, посчитывали и взвешивали. Общий выход семян определяли как общую массу семян, полученных от растений в 16 горшках для каждого вида обработки. Как показано в таблице 7, все три тестированных микробных антагониста продемонстрировали существенное сохранение выхода семян, то есть потери семян, обусловленные фузариозной инфикацией, были значительно снижены.

Таблица 7
Эффективность микробных антагонистов в сохранении выхода семян пшеницы, пораженной фузариозом Обработка Общий выход семян, г Защита выхода семян, % Неинфицированный 14,36 Не определено Необработанный 11,05 0,00 Prosario® 13,44 72,00 Banner-MAXX® 14,41 102,00 Actinovate® 11,99 28,00 RhizoVital® 12,65 48,00 SGI-014-C06 14,70 110,00 SGI-015-F03 15,03 120,00 SGI-015-H06 14,14 93,00

[0164] Таким образом, обработка пшеницы любым из рассмотренных микроорганизмов позволила заметно предохранить выход семян от потерь, вызываемых Fusarium инфицированием. В частности, пшеница, обработанная любым из штаммов SGI-014-C06 или SGI-015-F03, продемонстрировала существенное улучшение общего выхода семян, то есть 110% и 120%, соответственно, по сравнению с неинфицированным контролем. В противоположность этому, продажные фунгициды марок Actinovate®, RhizoVital® и Prosario® не продемонстрировали существенной защиты урожая обработанной ими пшеницы от потерь, вызываемых инфикацией Fusarium.

ПРИМЕР 10. Биоборьба с фузариозом пшеницы в полевых условиях

[0165] Антагонистические микроорганизмы, проявившие свою супрессорную активность против патогена F. graminearum и фузариоза в анализе на антагонизм in vitro и в тепличных исследованиях, описанных в Примерах 4-9, продолжают исследоваться далее, в серии полевых испытаний в различных географических ареалах на территории Соединенных Штатов. Некоторые эксперименты проводятся на сельскохозяйственных площадях, которые используются для микробиологической борьбы с фузариозом пшеницы, где происходит природное инфицирование этим заболеванием. В этих испытаниях используются сорта пшеницы, чувствительные к заражению грибом F. graminearum. В этих испытаниях, пшеницу, обработанную различными методами, высевают на небольших участках из 12 рядов, длиной около 3 метров. Промежуток между рядами равен приблизительно 20 см. Обработанные участки в каждом эксперименте вносятся в рандомизированную блочную схему. Оценивается также эффективность различных композиций из смачиваемых порошков, содержащих микробные антагонисты в соответствии с изобретением, в снижении тяжести и количества случаев инфицирования фузариозом. В этих экспериментах, микробные антагонисты оцениваются как индивидуально, так и в комбинациях.

[0166] В этих испытаниях антагонистические микроорганизмы оцениваются в различных покрытиях на семенах и/или в полевых условиях, где микробные суспензии наносят непосредственно на цветущие пшеничные колосья. В каждом из этих экспериментов микроорганизмы оцениваются на идентичных участках. В экспериментах могут использоваться антагонисты, патогены и методы аграрного производства, описанные в Примерах 4-9.

[0167] Нанесение покрытия на семена. Помимо способов нанесения покрытий на семена, описанных выше, в Примере 7, могут приспосабливаться самые различные известные технологии и препараты для обработки семян пшеницы микробными антагонистами, например, описанные в работах (Fernando et al, 2002; Bello et al., 2002; Kim et al., 1997). В общем случае, семена пшеницы вначале увлажняют и выдерживают при комнатной температуре для инициации прорастания. Перед высеванием проросшие семена можно погружать в микробные суспензии. Патогенные споры можно инокулировать либо до бактериальной инокуляции либо после нее. Способы приготовления антагонистов, патогенов и растений для такой обработки семян могут быть такими, как описано в Примерах 4 и 5.

[0168] Оценка тяжести заболевания и выхода семян.

Антагонисты поддаются дальнейшим оценкам в тепличных условиях на их супрессорную активность против фузариоза на пшенице и ячмене в фазе цветения с помощью самых различных способов и методик, включая описанные, например, в (Schisler, Plant Disease, Vol 86(12), 1350-1356, 2002; Schisler et al. Biological Control, 39:497-506,2006; and Khan and Doohan, Biological Control, 48:42-47,2009). В одном из таких экспериментов инокуляты штамма G. zeae готовят на стерильной, желтозерновой кукурузе, как описано в (Khan et al. Biological Control, 29:245-255, 2004). Полностью колонизированные липидные культуры (48-часовая культивация) микробных штаммов разбавляют до одной четвертой концентрации фосфатным буфером. Конечное число КОЕ на мл для антагонистической обработки составляет от 1×10⁹ КОЕ/мл до 6×10⁹ КОЕ/мл. После этого к колосьям цветущей пшеницы применяется обработка суспензиями с помощью CO₂ ручного распылителя. Обработку, как правило, производят после захода солнца для снижения до минимума возможную УФ деградацию антагонистических клеток. Готовят 5 репликатов (групп образцов-копий) на одну обработку, вносимых в рандомизированную блок-схему. Первым контролем обработки являются растения, обработанные буферным раствором. Вторым контролем обработки являются необработанные растения. Оценка тяжести инфицирования и заболеваемости фузариозом в полевых условиях производится путем подсчета 60 колосьев на репликат (то есть 300 колосьев/обработку), где развитие растения происходит от фазы средней молочной спелости и до фазы мягкой восковой спелости. Когда зерна достигают полной зрелости, колосья пшеницы собирают вручную и обмолачивают с помощью молотилки марки Almaco для единичных растений и колосьев (Almaco, IA). Образцы зерен, полученные из каждого ряда репликатов, оцениваются по весу 100 зерновок. Данные по тяжести заболевания, заболеваемости и весу 100 зерновок анализируют методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA).

[0169] Композиции, содержащие микробные антагонисты согласно изобретению, индивидуально или в комбинации, демонстрируют значительное снижение заболеваемости. Эти результаты являются свидетельством того, что биологический метод борьбы с помощью данных активных микробных агентов может играть важную роль в борьбе с паршой зерновых растений, таких как пшеница.

ПРИМЕР 11. Разработка культиваров неприродного происхождения и программ по их селекционированию

[0170] Эндофитные микроорганизмы в соответствии с изобретением вводятся в культурные растения, включая зерновые культуры, различных генотипов и географического происхождения. Однако подобные им эндофитные микроорганизмы, с которыми бы можно было создавать растение-эндофитных комбинации с улучшенными агрономическими характеристиками с помощью методик, аналогичных известным в данной отрасли методикам, включая, среди прочих, методики, описанные в (U.S. Pat Appl. No. 20030195117A1; U.S. Pat. Appl. No. 20010032343A1; и U.S. Pat. No. 7084331), отсутствуют. Таким образом, требуемые искусственные растение-эндофитные комбинации могут создаваться и селектироваться по программе селекции и разработке культиваров на базе их способности образовывать и поддерживать мутуалистическую комбинацию, дающую в итоге агрономический эффект. В такой селекционной программе может использоваться также рейтинг агрономических характеристик данной комбинации. В число этих характеристик могут входить, например, засухоустойчивость, аккумулирование биомассы, стойкость к инфицированию насекомыми, поедаемость скотом (например, травоядными), легкость репродукции, выход семян и др. Такие комбинации могут различаться по уровню аккумулирования микробных метаболитов, являющихся токсичными к сельскохозяйственным вредителям и сорнякам, включая уровни эргот-алкалоидов, уровни лолина, уровни перамина или уровни лолитрема, и демонстрировать при этом требуемые агрономические характеристики возделываемых растений, включая стойкость к инфицированию или поеданию насекомыми, стойкость к абиотическому стрессу, поедаемость скотом, аккумулирование биомассы, легкость размножения и выход семян и др.

[0171] Здесь дано описание множества вариантов осуществления изобретения. Тем не менее, вполне понятно, что элементы описанных здесь вариантов осуществления изобретения могут объединяться в комбинации, образовывая новые варианты осуществления изобретения и его различные модификации, которые не выходят за рамки идеи и объема настоящего изобретения. Следовательно, все другие варианты осуществления изобретения, альтернативы и эквиваленты охватываются объемом изобретения в соответствии с данным описанием изобретения и его формулой.

[0172] Заглавие в настоящей заявке дано исключительно для облегчения восприятия читателем и никоим образом не ограничивает объема изобретения или вариантов его осуществления.

[0173] Все публикации и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, включены здесь посредством ссылки в такой же мере, как если бы каждая публикация или патентная заявка индивидуально указывалась как включенная посредством ссылки.

Группа изобретений относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Предложены выделенный штамм вида Variovorax sp. NRRL В-50469, обладающий подавляющей активностью в отношении фузариоза, композиции и способы с использованием указанного штамма. Способ предотвращения развития фузариоза включает выращивание микробного штамма или его культуры в среде для роста или почве растения. Способ обработки против развития фузариоза включает нанесение на растение или на окружающую его среду эффективного количества микробного штамма или его культуры. Также предложены композиции для подавления фузариоза, содержащие микробный штамм или его культуру, семя, резистентное к инфекции грибка Fusarium, покрытое составом для покрытия семян, содержащим композицию. Изобретения эффективны в борьбе с фузариозом злаковых растений, таких как пшеница и ячмень. 8 н. и 10 з.п. ф-лы, 7 табл., 11 пр.

1. Выделенный микробный штамм, представляющий собой штамм вида Variovorax sp., репрезентативный образец которого депонирован как NRRL B-50469, причем выделенный микробный штамм имеет подавляющую активность в отношении фузариоза.

2. Выделенный микробный штамм по п.1, где указанный микробный штамм содержит последовательность ДНК, демонстрирующую по меньшей мере 85% идентичность по отношению к SEQ ID NO: 12.

3. Обогащенная культура микробного штамма по п.1 для подавления фузариоза, включающая по меньшей мере 50% выделенного штамма.

4. Композиция для подавления фузариоза, содержащая микробный штамм или его культуру по любому из пп. 1-3 и эффективное для сельскохозяйственного производства количество соединения или композиции, выбранных из группы, состоящей из акарицида, бактерицида, фунгицида, инсектицида, микробицида, нематицида, пестицида и удобрения.

5. Композиция для подавления фузариоза, содержащая микробный штамм или его культуру по любому из пп. 1-3 и носитель.

6. Композиция по п.5, где указанным носителем является носитель, приемлемый для сельского хозяйства.

7. Композиция по п.5, где указанным носителем является семя растения.

8. Композиция по п.5, где указанную композицию получают в форме состава, выбранного из группы, состоящей из эмульсии, коллоида, пылевидного препарата, гранулы, шарика, порошка, спрея, эмульсии и раствора.

9. Композиция по п.5, где указанная композиция представляет собой состав, покрывающий семя.

10. Семя, резистентное к инфекции грибка Fusarium, покрытое составом для покрытия семян, содержащим композицию по п.5.

11. Способ предотвращения развития фузариоза, включающий выращивание микробного штамма или его культуры по любому из пп. 1-3 в среде для роста или почве растения-хозяина перед выращиванием или одновременно с выращиванием растения-хозяина в указанной среде для роста или почве.

12. Способ по п.11, где возбудителем фузариоза является Fusarium graminearum.

13. Способ обработки против развития фузариоза растения, включающий нанесение на растение или на окружающую среду растения эффективного количества микробного штамма или его культуры по любому из пп. 1-3.

14. Способ по п.13, где указанный микробный штамм или его культуру наносят на почву, семя, корни, цветок, лист, часть растения или все растение.

15. Способ по п.13, где указанное растение является восприимчивым к Fusarium graminearum.

16. Способ по п.13, где указанным растением является пшеница, кукуруза, ячмень или овес.

17. Способ по п.13, где указанный микробный штамм или его культура является установленным(-ой) как эндофит к указанному растению.

18. Способ получения сельскохозяйственной композиции для подавления фузариоза, включающий инокуляцию микробного штамма или его культуры согласно любому из пп. 1-3 в или на субстрат и позволяющий указанному микробному штамму или его культуре расти при температуре 1-37°C до получения клеток или спор в количестве по меньшей мере 10²-10³ на миллилитр или на грамм.