СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ СБОРА СИГНАЛОВ И СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОТСЛЕЖИВАНИЯ КЛЕТОК С ПРИМЕНЕНИЕМ СВЕТОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ МИКРОСХЕМЫ Российский патент 2020 года по МПК G01N33/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области техники получения информации, в частности, к способу и устройству для сбора сигналов и способу и устройству для отслеживания клеток с применением светочувствительной микросхемы.

Предпосылки создания изобретения

Вестерн-блоттинг представляет собой гибридную методику, в которой сочетается гель-электрофорез с высокой разделяющей способностью с методикой иммунохимического анализа. Обладая преимуществами высокопроизводительного анализа, высокой чувствительности и сильной специфичности, вестерн-блоттинг представляет собой наиболее распространенный способ выявления и определения характеристик, экспрессии и распределения белка, например, качественного и количественного выявления тканевого антигена, измерения массы пептидов и антител или выявления антигенов вируса.

Существуют следующие устройство и способ сбора сигналов с помощью вестерн-блоттинга:

способ 1: плотное скрепление светочувствительной пленки и NC-мембраны (нитроцеллюлозной), их проявление и мечение после экспонирования в течение определенного периода времени с последующим получением изображения на пленке. Преимущества заключаются в высокой чувствительности и в высоком разрешении. Недостатки заключаются в следующем.

1. Большое занимаемое пространство: необходимы специальные темное помещение (комната), раковина и водопровод со сточной трубой.

2. Высокая себестоимость: необходимость в приобретении машины для проявления, кассеты и расходных материалов, таких как большое количество светочувствительной пленки, проявляющий раствор и фиксирующий раствор. В ходе промывания пленок расходуется вода.

3. Загрязнение окружающей среды: для проявления пленок требуется значительное количество проявляющего раствора и фиксирующего раствора, в то же время имеет место получение пленок, выбрасываемых из-за ненадлежащего качества, что вызывает загрязнение тяжелыми металлами и загрязнение ароматическими соединениями.

4. Нестабильное качество изображения: исследователь не может отслеживать степень экспозиции в реальном времени в темном помещении, но при этом более качественные изображения может получить лишь после ряда попыток. В основном недостатки заключаются либо в недоэкспонировании, либо в переэкспонировании и в затрате времени и энергии.

5. Затрата времени: поскольку имеющиеся данные хранят, передают и публикуют способом оцифровывания, изображения пленок будут преобразованы в цифровые изображения путем сканирования.

6. Количественная неточность: в основном изображения, определенные исследователями как надлежащего качества путем визуального осмотра, в действительности были перенасыщены по серой шкале. Таким образом, затруднительным является точное количественное измерение в ходе последующего сканирования с применением серой шкалы.

Способ 2: непосредственное фотографирование образцов путем применения светочувствительных устройств, таких как CCD (ПЗС). Преимущество заключается в том, что все недостатки способа 1 устранены. Недостаток заключается в потере преимущества сбора на пленку, то есть чувствительность значительно снижена. Причиной этого является следующее: во всех таких устройствах, имеющихся в настощее время на рынке, ПЗС-цифровая камера установлена над НЦ-пленкой на определенном расстоянии для съемки изображений. В том, что касается световой энергии, излучаемой источником света, только луч света в пределах небольшого угла может быть собран камерой. Но более 90% энергии при этом теряются. Таким образом, такие устройства часто применяют для фотографирования при сильном освещении. Лишь отдельные бренды заявляют, что их устройства могут быть использованы для фотографирования результатов вестерн-блоттинга (WB) при слабом освещении. В сравнении с пленкой время экспозиции значительно увеличено. Некоторые бренды уменьшают разрешение путем бинирования пикселей для улучшения чувствительности с тем, чтобы достигнуть чувствительности, сопоставимой с чувствительностью пленки. Однако при небольшом увеличении изображения появляется мозаика, а также все сложнее соответствовать различным требованиям.

Способ 3: сканирование и сбор слабых световых сигналов с помощью светочувствительных блоков на ПЗС, которые линейно выровнены. Преимущество заключается в том, что скорость сбора оптических сигналов увеличена для повышения чувствительности. Недостатки заключаются в следующем: поскольку оптический сигнал собирают путем линейного сканирования и полное изображение не может быть получено за один раз, то при сканировании различных участков появляется разница во времени. Невозможно провести сравнение интенсивности сигналов, собранных в различные моменты времени, поскольку источник света постоянно затухает со временем. Многие контрольные испытания не являются сопоставимыми.

Таким образом, техническая проблема, которую необходимо срочно решить специалистам в данной области техники в настоящее время, заключается в предоставлении эффективного средства нового типа для решения существующей проблемы и соответствия повышенным требованиям в практических применениях.

В публикации китайского патента на изобретение № CN1708076 раскрыт способ сбора сигналов с помощью светочувствительной микросхемы. Способ включает: установку датчика на ПЗС в темном помещении, размещение микросхемы задания последовательности, несущей биологический образец с люциферазой, в темном помещении; при этом темное помещение не должно подвергаться воздействию внешнего освещения; расположение светочувствительной микросхемы в темном помещении для получения оптического сигнала; применение светочувствительной микросхемы в темном помещении для получения светового сигнала; обработку и вывод собранного оптического сигнала. Микросхема задания последовательности соединена с оптоволоконной панелью, расположенной на переднем конце датчика на ПЗС, поэтому на нее не влияет внешнее освещение.

Однако в данном патенте не раскрыто следующее содержание настоящего изобретения: светоизлучающая поверхность, несущая пленку для сбора оптического сигнала, плотно приклеивается к светочувствительной микросхеме. Также не раскрыты устройство для сбора сигналов с помощью светочувствительной микросхемы по настоящему изобретению, способ отслеживания клеток с помощью светочувствительной микросхемы и устройство для отслеживания клеток с помощью светочувствительной микросхемы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема, подлежащая решению в вариантах осуществления по настоящему изобретению, заключается в предоставлении способа и устройства для сбора сигналов и способа и устройства для отслеживания клеток с применением светочувствительной микросхемы для преобразования сигналов, подлежащих выявлению, из оптических сигналов в цифровые сигналы и быстрого осуществления количественного анализа.

Соответственно, в вариантах осуществления настоящего изобретения также предусмотрено устройство для сбора сигналов с применением светочувствительной микросхемы и устройство для отслеживания клеток для обеспечения реализации и применения описанного выше способа.

Для решения описанных выше проблем в настоящем изобретении раскрыт способ сбора сигналов с применением светочувствительной микросхемы, предусматривающий следующие стадии:

плотное совмещение светоизлучающей поверхности мембраны, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, со светочувствительной микросхемой;

размещение светочувствительной микросхемы, совмещенной с мембраной, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, в темном помещении, которое не подвержено воздействию внешнего освещения;

сбор оптических сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении;

обработка и вывод собранных оптических сигналов.

Предпочтительно способ сбора оптических сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении предусматривает следующие стадии:

сбор оптических сигналов;

отслеживание степени экспозиции с помощью экрана компьютера в реальном времени;

прекращение экспозиции в том случае, если сигналы накоплены до предварительно заданной интенсивности;

получение и сохранение изображения, полученного с помощью экспозиции.

Предпочтительно, чтобы сигнал, собранный с помощью светочувствительной микросхемы, представлял собой сигнал вестерн-блоттинга, при этом мембрану, несущую оптические сигналы, подлежащие сбору, получают с помощью следующих стадий:

проведение электрофореза белка, подлежащего испытанию;

перенос белка из геля после завершения электрофореза;

перенос белка, подлежащего испытанию, из геля на поливинилиденфторидную мембрану или нитроцеллюлозную мембрану;

блокирование поливинилиденфторидной мембраны или нитроцеллюлозной мембраны после переноса, добавление первичного антитела к белку, подлежащему испытанию, и добавление вторичного антитела, конъюгированного с HRP (пероксидазой хрена);

обработка подвергнутой реакции поливинилиденфторидной мембраны или нитроцеллюлозной мембраны хемилюминесцентным раствором.

Предпочтительно мембрана предусматривает нитроцеллюлозную мембрану и/или поливинилиденфторидную мембрану.

Предпочтительно светочувствительная микросхема предусматривает светочувствительную микросхему на КМОП (CMOS) и светочувствительную микросхему на ПЗС (CCD).

В настоящем изобретении также раскрыто устройство для сбора сигналов с применением светочувствительной микросхемы, содержащее:

модуль совмещения для плотного совмещения светоизлучающей поверхности мембраны, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, со светочувствительной микросхемой;

модуль укладки для размещения светочувствительной микросхемы, совмещенной с мембраной, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, в темном помещении, которое не подвержено воздействию внешнего освещения;

модуль сбора сигналов для сбора оптических сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении;

модуль обработки сигналов для обработки и вывода собранных оптических сигналов.

В настоящем изобретении также раскрыт способ отслеживания клеток с применением светочувствительной микросхемы, предусматривающий следующие стадии:

нанесение клеток, несущих люциферазу, на светочувствительную микросхему;

размещение светочувствительной микросхемы с нанесенными клетками, несущими люциферазу, в темном помещении, которое не подвержено воздействию внешнего освещения;

сбор оптических сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении;

обработка и вывод собранных оптических сигналов.

Предпочтительно перед нанесением клеток, несущих люциферазу, на светочувствительную микросхему способ дополнительно предусматривает следующие стадии: установка слоя стекла на светочувствительную микросхему и нанесение клеток, несущих люциферазу, на слой стекла светочувствительной микросхемы.

Предпочтительно способ получения клеток, несущих люциферазу, предусматривает следующие стадии:

конструирование плазмиды, несущей репортерный ген, для встраивания специфического фрагмента целевого промотора в начало последовательности экспрессии люциферазы;

совместная трансфекция регуляторной последовательностью и плазмидой, несущей ген люциферазы, клеток;

добавление люциферина в среду для культивирования клеток.

В настоящем изобретении также раскрыто устройство для отслеживания клеток с применением светочувствительной микросхемы, содержащее:

модуль нанесения для нанесения клеток, несущих люциферазу, на светочувствительную микросхему;

модуль укладки для размещения светочувствительной микросхемы с нанесенными клетками, несущими люциферазу, в темном помещении, которое не подвержено воздействию внешнего освещения;

модуль сбора сигналов для сбора оптических сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении;

модуль обработки сигналов для обработки и вывода собранных оптических сигналов.

В сравнении с предшествующим уровнем техники варианты осуществления по настоящему изобретению обладают следующими преимуществами:

согласно схеме по настоящему изобретению задача заключается в том, чтобы плотно совместить светоизлучающую поверхность мембраны, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, со светочувствительной микросхемой, разместить светочувствительную микросхему, совмещенную с мембраной, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, в темном помещении, собрать оптические сигналы с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении и обработать и вывести собранные оптические сигналы. Сбор сигналов путем непосредственного приведения в контакт со светочувствительной микросхемой обеспечивает возможность сбора полного изображение за один раз и в значительной степени избежать потери оптических сигналов с тем, чтобы улучшить чувствительность без снижения разрешения.

Это сохраняет все преимущества трех способов, описанных в уровне техники, и устраняет соответствующие недостатки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Чтобы ясно и четко описать варианты осуществления по настоящему изобретению или техническую задачу из предшествующего уровня техники, далее будут представлены варианты осуществления или чертежи, используемые в техническом описании. Очевидно, что графические материалы, описанные ниже, представляют собой некоторые варианты осуществления по настоящему изобретению. Специалисты в данной области могут получить другие графические материалы на основе этих графических материалов без осуществления творческой деятельности.

На фиг. 1 показана блок-схема способа сбора сигналов с применением светочувствительной микросхемы;

на фиг. 2 показана блок-схема устройства для сбора сигналов с применением светочувствительной микросхемы;

на фиг. 3 показана блок-схема способа отслеживания клеток с применением светочувствительной микросхемы;

на фиг. 4 показана структурная блок-схема устройства для отслеживания клеток с применением светочувствительной микросхемы.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Для более четкого определения целей, технической схемы и преимуществ вариантов осуществления по настоящему изобретению техническая схема в вариантах осуществления по настоящему изобретению будет описана четко и полностью в сочетании с графическими материалами вариантов осуществления следующим образом. Очевидно, что описанные варианты осуществления представляют собой некоторые, но не все варианты осуществления по настоящему изобретению. На основе вариантов осуществления по настоящему изобретению все другие варианты осуществления, полученные без осуществления творческой деятельности специалистами в данной области, попадают в объем защиты настоящего изобретения.

Пример 1

Подробно описан способ сбора сигналов с применением светочувствительной микросхемы согласно вариантам осуществления по настоящему изобретению.

Со ссылкой на фиг. 1 показана блок-схема вариантов осуществления способа сбора сигналов с применением светочувствительной микросхемы по настоящему изобретению, в частности, предусматривающего следующие стадии:

стадия 101: плотное совмещение светоизлучающей поверхности мембраны, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, со светочувствительной микросхемой.

В практическом применении, если сигнал вестерн-блоттинга собирают с помощью светочувствительной микросхемы, то мембрану, несущую оптические сигналы, подлежащие сбору, получают с помощью следующих стадий:

проведение электрофореза белка, подлежащего испытанию;

перенос белка из геля после завершения электрофореза;

перенос белка, подлежащего испытанию, из геля на поливинилиденфторидную мембрану или нитроцеллюлозную мембрану;

блокирование поливинилиденфторидной мембраны или нитроцеллюлозной мембраны после переноса, добавление первичного антитела к белку, подлежащему испытанию, и добавление вторичного антитела, конъюгированного с HRP;

обработка подвергнутой реакции поливинилиденфторидной мембраны или нитроцеллюлозной мембраны хемилюминесцентным раствором.

В данном применении используемая мембрана главным образом предусматривает нитроцеллюлозную мембрану (НЦ-мембрану) и/или поливинилиденфторидную мембрану (ПВДФ-мембрану). Используемая светочувствительная микросхема содержит светочувствительную микросхему на КМОП и светочувствительную микросхему на ПЗС. Учитывая, что светочувствительная микросхема большого размера имеет высокую стоимость производства, матрица из светочувствительной микросхемы на КМОП и светочувствительной микросхемы на ПЗС может быть установлена для существенного снижения себестоимости, если на практике с помощью методики объединения микросхем можно достичь лучшего эффекта.

Стадия 102: размещение светочувствительной микросхемы, совмещенной с мембраной, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, в темном помещении, которое не подвержено воздействию внешнего освещения.

Чтобы избежать воздействия внешнего освещения, светочувствительную микросхему, совмещенную с мембраной, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, располагают в темном помещении. Способ осуществления может быть легко выбран, исходя из конкретных условий. Микросхема может быть закрыта светоизолирующей крышкой.

Стадия 103: сбор оптических сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении.

В практическом применении способ сбора оптических сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении предусматривает следующие стадии:

сбор оптических сигналов;

отслеживание степени экспозиции с помощью экрана компьютера в реальном времени;

прекращение экспозиции в том случае, если сигналы накоплены до предварительно заданной интенсивности;

получение и сохранение изображения, полученного с помощью экспозиции.

Стадия 104: обработка и вывод собранных оптических сигналов.

Процессоры, такие как одиночная микросхема, FPGA (программируемая пользователем вентильная матрица) и CPU (центральный процессор), могут быть применены для обработки и вывода собранных оптических сигналов. Исходя из того, что существующие в настоящее время способы обработки являются более развитыми, обработка сигнала согласно схеме может быть легко проведена, поэтому ее не будут повторно упоминать в данном документе.

Сигнал вестерн-блоттинга (сигнал WB), собранный с помощью светочувствительной микросхемы, далее подробно описан в сочетании с практическим применением.

Принцип вестерн-блоттинга:

1. Вертикальное разделение клеток или экстрактов тканей в полиакриламидном геле с применением электрического поля.

2. Горизонтальный перенос полосы белка на НЦ-мембрану с применением электрического поля, при этом данная полоса называется блот, если ее относительное положение не изменяется.

3. Блокирование. Вымачивание подвергнутой блоттингу мембраны в растворе BSA. Заполнение раствором BSA участков, не занятых полосой белка. Предупреждение адсорбции в последующем наносимых антител в этих участках и связывание антитела только с его антигеном.

4. Инкубация с антителом. Предварительная конъюгация антитела с HRP. Инкубация НЦ-мембраны с антителом. В частности, связывание антитела с его антигеном.

5. Сбор сигналов. Вымачивание НЦ-мембраны в растворе, содержащем субстрат для HRP. Испускание флуоресцентного излучения, когда данный субстрат катализируется пероксидазой хрена. Сбор флуоресцентных сигналов с применением светочувствительной пленки или электрофотографической системы.

Стадии перед сбором оптических сигналов WB являются следующими:

(1) получение образца белка: после индуцированной бактериями экспрессии, клетки непосредственно разрушают с помощью электрофоретического буфера для нанесения образцов, добавляют гомогенизирующий буфер к эукариотическим клеткам и гомогенизируют их в течение 0,5-1 мин в гомогенизаторе или ультразвуковой камере. Затем смесь центрифугируют при 13000 g в течение 15 мин при температуре 4°C. В качестве образца берут супернатант.

(2) Электрофорез: готовят электрофорезный гель для SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия).

(3) Перенос: после электрофореза нарезают адгезивную пленку на полосы подходящего размера, уравновешивают пленку буфером для переноса три раза по 5 мин. Обработка мембраны: предварительно нарезают фильтровальную бумагу и НЦ-мембрану такого же размера, как и пленка, и вымачивают их в буфере для мембраны в течение 10 мин. Перенос на мембрану: размещение устройств для переноса на мембраны, содержащих снизу вверх: анодную углеродную пластину, 24 слоя фильтровальной бумаги, НЦ-мембрану, гель, 24 слоя фильтровальной бумаги и катодную углеродную пластину, точно выравнивают фильтровальную бумагу, гель и НЦ-мембрану, удаляя на каждой стадии пузыри, и сверху углеродной пластины устанавливают вес 500 г для впитывания избытка влаги. Включают постоянный ток 1 мА/см2 и осуществляют перенос в течение 1,5 ч. После переноса источник питания отключают для извлечения мембраны, нарезают на ленты мембрану, подлежащую испытанию, для вестерн-блоттинга. Окрашивают стандартную полосу белка, погружая ее в красящий раствор на 50 с, несколько раз ее обесцвечивают в 50% растворе метанола до тех пор, пока фон не станет прозрачным, промывают ее бидистиллированной водой, сушат на воздухе и зажимают между двумя слоями фильтровальной бумаги для хранения, а затем оставляют ее для сравнения результатов окрашивания.

(4) Иммунная реакция: мембрану промывают 0,01 M PBST три раза по 5 мин.

Добавляют блокирующий раствор при непрерывно перешивании покачиванием при комнатной температуре в течение 1 ч.

Удаляют блокирующий буфер, промывают мембрану 0,01 M PBST три раза по 5 мин.

Добавляют первичное антитело (разводят его 0,01 M PBS согласно соответствующей степени разведения и покрывают всю мембрану раствором) и оставляют мембрану в растворе на более чем 12 ч при температуре 4°C. В отрицательном контроле заменяют первичное антитело на 1% BSA и проводят другие стадии, которые являются такими же, как и в случае экспериментальной группы.

Удаляют первичное антитело и 1% раствор BSA и промывают мембрану 0,01 M PBS четыре раза по 5 мин.

Добавляют вторичное антитело, конъюгированное с HRP (разводят его 0,01 M PBS согласно соответствующей степени разведения), непрерывно встряхивая мембрану при комнатной температуре в течение 2 ч.

Удаляют вторичное антитело, промывают мембрану 0,01 M PBST четыре раза по 5 мин каждый.

Обрабатывают мембрану хемилюминесцентным раствором и осуществляют реакции с испусканием флуоресценции, когда HRP вступает в контакт с химическим субстратом в растворе.

Собирают флуоресцентные сигналы путем непосредственного совмещения мембраны с применением цифровой светочувствительной микросхемы.

Извлекают мембрану, вымоченную в хемилюминесцентном растворе, осушают избыток жидкости впитывающей бумагой и осуществляют совмещение светоизлучающей поверхности мембраны с цифровой светочувствительной микросхемой.

Сдавливают мембрану плоским предметом и осуществляют непосредственное и плотное совмещение с цифровой светочувствительной микросхемой.

Закрывают крышкой и размещают цифровую светочувствительную микросхему и мембрану в темных условиях во избежание воздействия внешним освещением.

Управление светочувствительной микросхемой осуществляют с помощью компьютера и собирают хемилюминесцентные сигналы. Отслеживание экспозиции осуществляют с помощью экрана компьютера в реальном времени и прекращают экспозицию в том случае, если сигналы накоплены до соответствующей интенсивности.

Получают и сохраняют изображение, полученное при экспозиции, для количественного и качественного анализа.

В одном варианте осуществления количественный анализ может быть осуществлен путем применения светочувствительной микросхемы контактного типа для сбора сигналов и преобразования оптических сигналов в цифровые сигналы.

Пример 2

Подробно описано устройство для сбора сигналов с применением светочувствительной микросхемы согласно вариантам осуществления по настоящему изобретению.

Со ссылкой на фиг. 2 показана блок-схема устройства для сбора сигналов с помощью светочувствительной микросхемы, в частности, содержащего:

модуль 201 совмещения для плотного совмещения светоизлучающей поверхности мембраны, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, со светочувствительной микросхемой;

модуль 202 укладки для размещения светочувствительной микросхемы, совмещенной с мембраной, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, в темном помещении, которое не подвержено воздействию внешнего освещения;

модуль 203 сбора сигналов для сбора оптических сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении;

модуль 204 обработки сигналов для обработки и вывода собранных оптических сигналов.

Поскольку варианты осуществления устройства аналогичны вариантам осуществления способа, они описаны упрощенно. Смотрите описание вариантов осуществления способа, относящееся к содержанию.

Пример 3

Подробно описан способ отслеживания клеток с применением светочувствительной микросхемы согласно вариантам осуществления по настоящему изобретению.

Со ссылкой на фиг. 3 показан способ отслеживания клеток с применением светочувствительной микросхемы согласно настоящему изобретению, в частности, включающий следующие стадии:

стадия 301: нанесение клеток, несущих люциферазу, на светочувствительную микросхему.

В целом прозрачный защитный слой, или слой стекла, или слой смолы, или слой, изготовленный из других материалов, будет закрывать светочувствительную микросхему, при этом толщина защитного слоя составляет менее 0,5 мм.

Учитывая эффект отслеживания и вторичное использование светочувствительной микросхемы на практике, слой стекла может быть установлен на светочувствительную микросхему перед нанесением клеток, несущих люциферазу, на светочувствительную микросхему, таким образом, нанесение клеток, несущих люциферазу, осуществляют на слой стекла светочувствительной микросхемы, что делает ее более удобной для последующей очистки.

Для оборудования, в котором используется светочувствительная микросхема, но отсутствует модуль освещения, необходимо принять меры, обеспечивающие клеткам способность к самостоятельному свечению. В частности, общепринятым способом является перенос гена люциферазы для обеспечения клеткам способности к самостоятельному свечению.

Люцифераза представляет собой белок, получаемый из хвоста светляка, который может катализировать реакцию люциферина с кислородом в присутствии АТФ для испускания флуоресценции. Ген люциферазы и последовательность ДНК для контроля транскрипции переносят в клетки, и интегрируют в хромосому хозяина с применением методик биоинженерии. Некоторые экспрессируемые хозяином молекулы белка, имеющие особую структуру и функцию контроля экспрессии гена, используются для того, чтобы специфично связывать последовательность ДНК для контроля транскрипции с тем, чтобы повышать экспрессию гена люциферазы.

Способ получения клеток, несущих люциферазу, предусматривает следующие стадии:

конструирование плазмиды, несущей репортерный ген, для встраивания специфического фрагмента целевого промотора в начало последовательности экспрессии люциферазы; в частности, например, pGL3-basic;

совместная трансфекция регуляторной последовательностью и плазмидой, несущей ген люциферазы, клеток;

добавление люциферина в среду для культивирования клеток, обеспечивающего энергией для катализа реакции люциферина с кислородом за счет того, что люцифераза использует АТФ для испускания флуоресценции. Таким образом, с помощью оборудования можно отслеживать путь миграции клеток. Такой способ может быть применен в экспериментах по изучению поведения животных.

Стадия 302: размещение светочувствительной микросхемы с нанесенными клетками, несущими люциферазу, в темном помещении, которое не подвержено воздействию внешнего освещения;

Стадия 303: сбор оптических сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении.

Стадия 304: обработка и вывод собранных оптических сигналов.

Пример 4

Подробно описано устройство для отслеживания клеток с применением светочувствительной микросхемы согласно вариантам осуществления по настоящему изобретению.

Со ссылкой на фиг. 4 показана блок-схема устройства для отслеживания клеток c помощью светочувствительной микросхемы, в частности, содержащего:

модуль 401 нанесения для нанесения клеток, несущих люциферазу, на светочувствительную микросхему;

модуль 402 укладки для размещения светочувствительной микросхемы с нанесенными клетками, несущими люциферазу, в темном помещении, которое не подвержено воздействию внешнего освещения;

модуль 403 сбора сигналов для сбора оптических сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении;

модуль 404 обработки сигналов для обработки и вывода собранных оптических сигналов.

Замысел настоящего изобретения может широко применяться в сборе сигналов вестерн-блоттинга, отслеживании и сравнении свечения низкой интенсивности в анализе с использованием массива в формате капель и нанесении клеток на светочувствительную микросхему для наблюдения за миграцией и делением клеток или динамическим процессом экспрессии некоторых молекул.

Следует отметить, что для простого описания вариантов осуществления способа, последовательности действий объединены в описании. Специалистам в данной области следует знать, что варианты осуществления изобретения не ограничены последовательностью описанных действий, поскольку некоторые стадии могут быть выполнены в других последовательностях или в одно и то же время в соответствии с вариантами осуществления по настоящему изобретению. Специалистам в данной области также должно быть известно, что варианты осуществления, описанные в данном описании, являются предпочтительными вариантами осуществления по настоящему изобретению, при этом предусмотренные действия необязательно требуются в вариантах осуществления по настоящему изобретению.

Поскольку варианты осуществления устройства аналогичны вариантам осуществления способа, они описаны упрощенно. Смотрите описание вариантов осуществления способа, относящееся к содержанию.

Все варианты осуществления в описании описаны поэтапным образом, и каждый вариант осуществления сосредоточен на отличии от других вариантов осуществления, и одинаковые или похожие части в вариантах осуществления могут перекрестно ссылаться друг на друга.

Согласно настоящему изобретению подробно описаны способ и устройство для сбора сигналов с применением светочувствительной микросхемы и способ и устройство для отслеживания клеток. В данном документе конкретные примеры используются для описания принципов и вариантов осуществления по настоящему изобретению, и вышеупомянутые варианты осуществления описаны только для того, чтобы способствовать пониманию способа и основной сути настоящего изобретения. Одновременно для специалистов в данной области предпочтительные варианты осуществления и область применения могут иметь изменения, основанные на сути настоящего изобретения. И в заключение, содержимое данного описания не должно истолковываться как ограничение настоящего изобретения.

Группа изобретений относится к биологии и может быть использована для отслеживания миграции клеток при изучении поведения животных. Для этого в среду для культивирования эукариотических клеток добавляют люциферин. Затем клетки, несущие люциферазу, отделяют и наносят на слой стекла в темном помещении, при этом плотно совмещают светоизлучающую поверхность со светочувствительной микросхемой. Полное изображение получают за один раз. Устройство для отслеживания клеток содержит модуль укладки для размещения светочувствительной микросхемы в темном помещении, модуль сбора сигналов для сбора хемилюминесцентных сигналов и модуль обработки сигналов для обработки и вывода собранных хемилюминесцентных сигналов с помощью компьютера в реальном времени для преобразования оптических сигналов в цифровые. Группа изобретений обеспечивает количественный анализ отслеживания миграции клеток. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

1. Способ сбора хемилюминесцентных сигналов с применением светочувствительной микросхемы для получения изображения, предусматривающий следующие стадии:

плотное совмещение светоизлучающей поверхности мембраны, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, со светочувствительной микросхемой, указанная мембрана представляет собой мембрану образца, полученную в экспериментах с применением метода вестерн-блоттинга, и указанную мембрану образца обрабатывают хемилюминесцентным раствором с испусканием хемилюминесцентного сигнала;

размещение светочувствительной микросхемы, совмещенной с мембраной, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, в темном помещении, которое не подвержено воздействию внешнего освещения;

сбор хемилюминесцентных сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении и получение изображения с осуществлением полного изображения за один раз;

обработка и вывод собранных хемилюминесцентных сигналов.

2. Способ по п. 1, где способ сбора хемилюминесцентных сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении предусматривает следующие стадии:

сбор хемилюминесцентных сигналов на мембране;

отслеживание степени экспозиции с помощью экрана компьютера в реальном времени;

прекращение экспозиции в том случае, если хемилюминесцентные сигналы накоплены для четкой идентификации путем визуального осмотра;

получение и сохранение изображения, полученного с помощью экспозиции.

3. Способ по п. 1, где мембрана предусматривает нитроцеллюлозную мембрану и/или поливинилиденфторидную мембрану.

4. Способ по п. 1, где светочувствительная микросхема содержит светочувствительную микросхему на КМОП и светочувствительную микросхему на ПЗС.

5. Устройство для сбора хемилюминесцентных сигналов с применением светочувствительной микросхемы для получения изображения, содержащее:

модуль совмещения для плотного совмещения светоизлучающей поверхности мембраны, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, со светочувствительной микросхемой, указанная мембрана представляет собой мембрану образца, полученную в экспериментах с применением метода вестерн-блоттинга, и указанную мембрану образца обрабатывают хемилюминесцентным раствором с испусканием хемилюминесцентного сигнала;

модуль укладки для размещения светочувствительной микросхемы, совмещенной с мембраной, несущей оптические сигналы, подлежащие сбору, в темном помещении, которое не подвержено воздействию внешнего освещения;

модуль сбора сигналов для сбора хемилюминесцентных сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении и получения изображения с осуществлением полного изображения за один раз;

модуль обработки сигналов для обработки и вывода собранных хемилюминесцентных сигналов.

6. Способ отслеживания клеток с применением светочувствительной микросхемы, предусматривающий следующие стадии:

добавление люциферина в среду для культивирования клеток для получения хемилюминесцентных сигналов;

нанесение клеток, несущих люциферазу, на слой стекла и плотное совмещение слоя стекла со светочувствительной микросхемой;

размещение светочувствительной микросхемы с нанесенными клетками, несущими люциферазу, в темном помещении, которое не подвержено воздействию внешнего освещения;

сбор хемилюминесцентных сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении и получение изображения с осуществлением полного изображения за один раз;

обработка и вывод собранных хемилюминесцентных сигналов.

7. Способ по п. 6, где способ дополнительно предусматривает следующие стадии перед нанесением клеток, несущих люциферазу, на светочувствительную микросхему:

установка слоя стекла на светочувствительную микросхему и нанесение клеток, несущих люциферазу, на слой стекла.

8. Способ по п. 6 или 7, где способ подготовки и продуцирования хемилюминесцентных сигналов клетками, несущими люциферазу, предусматривает следующие стадии:

конструирование плазмиды, несущей репортерный ген, для встраивания специфического фрагмента целевого промотора в начало последовательности экспрессии люциферазы;

совместная трансфекция регуляторной последовательностью и плазмидой, несущей ген люциферазы, клеток;

добавление люциферина в среду для культивирования клеток.

9. Устройство для отслеживания клеток с применением светочувствительной микросхемы, содержащее:

модуль нанесения для нанесения клеток, несущих люциферазу, на слой стекла и плотное совмещение слоя стекла со светочувствительной микросхемой;

модуль укладки для размещения светочувствительной микросхемы с нанесенными клетками, несущими люциферазу, в темном помещении, которое не подвержено воздействию внешнего освещения;

модуль сбора сигналов для сбора хемилюминесцентных сигналов с помощью светочувствительной микросхемы в темном помещении, получения изображения светочувствительной микросхемой с осуществлением полного изображения за один раз;

модуль обработки сигналов для обработки и вывода собранных хемилюминесцентных сигналов.