Способ прогнозирования течения беременности при урогенитальной инфекции Российский патент 2020 года по МПК G01N33/487 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, гинекологии, инфекционной патологии и иммунологии и может быть использовано при прогнозировании исхода беременности при урогенитальной инфекции.

Основой формирования различных гестационных осложнений является влияние неблагоприятных факторов, среди которых наибольшее значение имеют стресс, преморбидный фон, факторы инфекционной природы, гормональные нарушения, генетическая составляющая и т.д. Однако при наличии одних и тех же факторов риска развитие патологических состояний реализуется не во всех случаях. С другой стороны, патологические состояния при беременности развиваются не только у женщин группы высокого риска (при наличии отягощенного соматического или акушерско-гинекологического анамнеза), но и у практически здоровых женщин, поскольку беременность в ряде случаев является триггером патологических процессов.

Существующие способы прогнозирования гестационных осложнений обладают рядом недостатков. Использование ряда способов прогнозирования исходов беременности предполагается только во второй половине гестации (при полностью сформировавшейся плаценте, визуализации плодово-плацентарного кровообращения, угрозе позднего выкидыша или преждевременных родов), что не всегда позволяет осуществлять превентивные меры по предотвращению формирования патологических состояний [патент РФ №2475752, патент РФ №2268466, патент РФ №2290861, патент РФ №2401069, патент РФ №2300770]. Ряд способов прогнозирования исхода беременности связан с их использованием в отношении определенного контингента женщин, что существенно сужает круг обследуемых и снижает ценность разработанных технологий. Так, известны способы прогнозирования исхода беременности у женщин с привычным невынашиванием и высоким перинатальным риском [патент РФ №2033608], способы прогноза ранних репродуктивных потерь при наличии угрозы прерывания беременности [патент РФ №2103686, патент РФ №2033607.], инфекционного фактора [патент РФ №2444734, патент РФ №2281504, патент РФ №2341799, патент РФ №2281504, патент РФ №2501017], состояния микробиоценоза слизистых открытых полостей (патент РФ №2578028), имеющегося прерывания беременности в анамнезе [патент РФ №2454669] и другие. Вышеперечисленные факторы как изолированно, так и в сочетании друг с другом могут обусловливать нарушения процессов имплантации и плацентации, а также гемодинамические сдвиги, опосредующие в итоге нарушения в системе «мать-плацента-плод». Узконаправленный подход к прогнозированию исходов беременности, ограниченный либо конкретным патологическим состоянием, либо применением способа прогноза у определенного контингента женщин, не дает возможности оценить риск реализации гестационных осложнений в целом, что является наиболее востребованным как у пациенток с отягощенным акушерским анамнезом, так и у первобеременных женщин.

В связи с этим наиболее ценными являются безопасные (неинвазивные или малоинвазивные) способы прогнозирования исходов беременности, позволяющие вне зависимости от вида патологии и на ранних сроках гестации дифференцировать физиологическое и осложненное течение беременности.

В последнее время прогнозирование преждевременных родов, способа течения урогенитальных инфекций у беременных осуществляют на основании значений уровней экспрессии генов рецепторов врожденного иммунитета - TLR (патент РФ №2334233, патент РФ №2649127, патент РФ №2651707).

Технической проблемой, решаемой изобретением, является разработка способа прогнозирования течения беременности по классификационным правилам линейного дискриминантного анализа уровней ЭГ TLRs, что позволяет прогнозировать течение урогенитальной инфекции и исход беременности на ранних сроках гестации.

Задача решена тем, что у беременных с урогенитальной инфекцией в соскобном материале со слизистых цервикального канала и/или влагалища устанавливают уровни ЭГ TLR3 и TLR8 в реакции ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией и с помощью линейного дискриминантного анализа осуществляют прогноз течения беременности.

Технический результат, получаемый в результате реализации предложенного способа, состоит в том, что заявляемый способ позволит контролировать динамику течения беременности и прогнозировать степень риска невынашивания беременности, повысить точность прогнозирования исхода беременности в 1 и 2 триместре при верифицированной урогенитальной инфекции для назначения своевременной адекватной терапии.

Иммунологическая система беременных обеспечивает одновременное развитие гестационного процесса и реакцию макроорганизма на плод и на инфекционный процесс (ИП), вызванный полиинфицированием. Мукозальный иммунитет (МИ) и рецепторы врожденного клеточного иммунитета - TLRs обеспечивают одновременно развитие беременности и ИП [1, 2]. При урогенитальной инфекции (УГИ) беременных различают стадию угнетения МИ (уровни экспрессии генов (ЭГ) TLR2 ниже 21,2 ОЕ, TLR4 ниже 23,0 ОЕ, TLR8 ниже 26,0 ОЕ), стадию физиологического состояния (TLRs - 22-23 ОЕ), стадию повышенной реакции (уровни ЭГ TLR2 - 21,2 ОЕ и выше, TLR4 - 23,0 ОЕ и выше, TLR8 - 26,0 ОЕ и выше), стадию гиперреакции (уровень ЭГ TLR8 выше 28 ОЕ) [3, 4]. Слизистые открытых полостей организма функционируют как единый орган, поэтому независимо от биотопа слизистых открытых полостей одновременно регистрируются однотипные изменения (одинаковые типы - степени) их микробиоценозов и однотипные изменения со стороны рецепторов врожденного иммунитета [5].

Наиболее близким аналогом является патент «Способ ведения беременных с инфекционной патологией урогенитального тракта» (Патент РФ №2649127), характеризующийся тем, что исследуют экспрессию генов врожденного иммунитета - TLR. При установлении уровней экспрессии генов TLR2=21,2 ОЕ и выше, TLR4=23,0 ОЕ и выше, TLR8=25,7 ОЕ и выше проводят экстренную профилактику прерывания беременности с назначением витаминотерапии, антибиотикотерапии, внутривенного иммуноглобулина и иммуномодулятора с антимикробной активностью.

Согласно способу патента -аналога было обследовано 89 беременных I, II триместра гестации, в возрасте от 18 до 35 лет (средний возраст 27,5±5,6 лет). Дизайн исследования и методология верификации возбудителей УГИ беременных представлены в ранее опубликованных материалах (Караулов А.В., Афанасьев С.С., 2017 г.) [3, 4]. Разделение пациенток по характеру течения беременности: срочные роды (наличие инфицированности) - CP (инфицированность), срочные роды (наличие инфицированности и клинических проявлений - КПР) - CP, преждевременные роды (наличие инфицированности, КПР и рецидивов КПР) - ПР, прерывание беременности (наличие инфицированности, КПР и их рецидивов) - ПРБ, по прогнозу течения беременности (физиологическое течение, иммунологическое раздражение, осложненное течение, иммунологическое отторжение плода), установление типов дисбиоза слизистых цервикального канала, а также оценку ЭГ TLR-2, TLR-4, TLR-3, TLR-8 (в относительных единицах - ОЕ) проводили согласно руководствам (Караулов А.В., Афанасьев С.С., 2017 г.; Воропаева Е.А., Караулов А.В., Афанасьев С.С., 2012 г.) [6, 7]. Клинические проявления УГИ беременных: острые респираторные инфекционно-воспалительные инфекции, лабильный герпес и другие проявления генитального герпеса рецидивирующего и нерецидивирующего характера в течении срока беременности [6, 7].

Статистический анализ. Подбор порога показателей ЭГ TLRs осуществлялся при помощи итерационных вычислений специфичности и чувствительности признака на основании доли пациентов с истинно положительными и отрицательными результатами [8]. Математическую обработку полученных данных проводили с использованием методов вариационной статистики (пакет Statistica 8.0. и MS OfficeExel 2010). По каждому признаку в сравниваемых группах определяли среднюю арифметическую величину (М) с средним квадратическим отклонением. Сравнение групп номинальных признаков проводили с помощью критерия χ2 - Пирсона с поправкой Йетса. Для оценки силы корреляционной связи (КСВ) уровней ЭГ TLRs использовали корреляционный анализ Пирсона и Спирмена, а для оценки КСВ состояния МИ, прогноза течения беременности, КПР и рецидивов КПР и прочих категориальных переменных использовали корреляционный анализ Спирмена (при r_s≥0,7 связь считали сильной; при 0,5≤r_s<0,7 связь являлась средней; при r_s<0,5 связь считали слабой. Если r_s=0 - линейная связь отсутствует) [8, 9]. Нулевую гипотезу отвергали при критическом уровне значимости р<0,05. Для оценки различия средних значений выборок использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, который является альтернативой t-критерию Стьюдента (если распределение признаков не соответствует нормальному распределению) [10, 11]. Достоверность корреляции и различий по U-критерию Манна Уитни считали при уровне р<0,05 [12]. Для оценки прогностической ценности оценивали AUC (площадь под кривой) в ROC-анализе уровня ЭГ TLRs в зависимости от состояния МИ и выраженности ИП. Учитывали значения AUC выше 0,9, что соответствует высокому уровню специфичности и чувствительности данного параметра в классификации групп [12]. Для определения граничного уровня ЭГ (CutOff), разделяющих принадлежность данной концентрации к различным группам по состоянию МИ выраженности ИП, использовали значение ROC threshold (максимум чувствительности при максимальной специфичности).

Таблица. Характеристика урогенитальной инфекции беременных.

Примечания: срочные роды (наличие инфицированности) - CP (инфицированность); срочные роды (наличие инфицированности и клинических проявлений- КПР) - CP; преждевременные роды (наличие инфицированности, КПР и рецидивов КПР) - ПР; прерывание беременности (наличие инфицированности, КПР и рецидивов КПР) - ПРБ; экспрессия генов- ЭГ; сравнение групп номинальных признаков проводили с помощью критерия χ2 - Пирсона с поправкой Йетса; для оценки взаимосвязи использовали корреляцию Спирмена (при r_s≥0,7 связь считали сильной; при 0,5≤r_s<0,7 связь являлась средней; при r_s<0,5 связь считали слабой. Если r_s=0 - линейная связь отсутствует) и χ2 - Пирсона; нулевую гипотезу отвергли при критическом уровне значимости р<0,05.

Основным недостатком патента-аналога является то, что для оценки состояния мукозального иммунитета используется большое количество параметров, а решающие правила не формализованы для однозначного трактования результата.

Сущность изобретения заключается в том, что с использованием канонического линейного дискриминантного анализа рассчитана математическая модель для осуществления прогноза течения беременности при урогенитальной инфекции с включением показателей экспрессии генов TLR-3,TLR-8(12).

Для количественного определения уровней ЭГ TLR3 и TLR8 используют метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР РВ) с обратной транскрипцией (OT-Real-Time PCR), выполняемый с помощью амплификатора iCycler IQ5 («Bio-Rad», США). Уровни ЭГ TLRs стандартизируют по гену GAPDH. Полученный материал суспендируют в растворе EverFresh RNA (ЗАО "Силекс" г. Санкт-Петербург) в соотношении 1:5 относительно объема клеточной суспензии. Конструирование олигонуклеотидных праймеров к генам TLR3 и TLR8 проводят с применением биоинформационного анализа комплексом компьютерных программ: Vector NTI Advance 9.0 (PC) (http://wwwinvitrogen.com/site/us/en/home.html), DNASTAR, BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/). Уровень экспрессии mRNA генов TLRs определяют с использованием специфических праймеров. Праймеры синтезированы на базе ЗАО «Синтол» (Москва). Уровни экспрессии mRNA TLRs контролируют (стандартизируют) по гену GAPTAH-F за счет сходной экспрессии этого гена среди человеческих тканей. Из исследуемого материала выделяют тотальную RNA согласно протоколу к наборам для выделения тотальной RNA на магнитных частицах SiO2 - бесфенольное выделение для микроанализа (ЗАО "Силекс", г. Санкт-Петербург). Синтез первой цепи cDNA проводят, согласно указаниям инструкции набора для синтеза первой цепи cDNA mRNA (базовый) (ЗАО "Силекс" г. Санкт-Петербург). Амплификацию с последующим определением уровней ЭГ TLRs проводят методом PCR с детекцией накопления продуктов реакции "в режиме реального времени" (Real-Time PCR, USA) с помощью детектирующего амплификатора АНК-32 («Синтол», Россия) и специфических праймеров к TLR-3 и TLR-8. Количество исследуемых cDNA в образцах рассчитывают путем определения пороговых циклов PCR в РВ на образцах серийных разведений очищенного PCR-продукта в качестве матрицы. Нормализация количества изучаемых транскриптов к общему количеству cDNA в пробе проводится с помощью отношений TLR3/GAPDH, TLR8/GAPDH. Для определения уровня экспрессии мРНК TLRs возможно использовать сравнительный СТ-метод (уровень СТ-номер цикла, при котором флуоресцентный сигнала превышает пороговое значение термоциклера). В сравнительном СТ-методе для относительного определения уровня экспрессии mRNA TLRs используют следующую арифметическую формулу: 2- ΔΔСт. Для расчета величины ΔΔСТ: - определяют величину ΔCT путем вычитания средней величины СТ эндогенного контроля (GAPDH) из средней величины СТ мишени: mRNA TLRs; - определяют величину ΔΔСТ путем вычитания величины ΔCT калибратора (TLRs здоровых пациентов) из величины ΔCT исследуемого образца (TLRs пациентов с патологией) [4]. ЭГ TLRs оценивают в относительных единицах (ОЕ).

Примерный протокол ведения исследования.

1. Сбор материала.

Материал необходимо собирать в фиксатор для стабилизации RNA такие как, EverFresh RNA(Силекс) или Фиксатор IntactRNA (Евроген). Полученный материал суспендировали в растворе EverFresh RNA (ЗАО "Силекс" г. Санкт-Петербург) в соотношении 1:5 относительно объема клеточной суспензии. До выделения RNA, образец в фиксаторе необходимо хранить при -20°С.

2. Выделение RNA.

Выделение RNA проводится с использованием коммерческих наборов таких как, «АмплиПрайм РИБО-сорб» AmpliSens (ПНИИЭ, Россия), «РИБО-преп» AmpliSens (ЦНИИЭ, Россия), ExtractRNA (Евроген, Россия) или других, согласно протоколу производителя.

Протокол для выделения RNA с использованием коммерческого набора «РИБО-преп» AmpliSens (ЦНИИЭ, Россия).

Раствор для лизиса (если он хранился при температуре от 2 до 8°С) прогреть при температуре 65°С до полного растворения кристаллов.

Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл с плотно закрывающимися крышкам. Добавить в пробирки по 300 мкл раствора для лизиса. Промаркировать пробирки.

В пробирки с раствором для лизиса, внести по 100 мкл подготовленных проб, используя наконечники с аэрозольным барьером.

Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе, процентрифугировать в течение 5 с на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней поверхности крышки и прогреть 5 мин при 65°С в термостате.

Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, перемешать на вортексе.

Процентрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 5 мин при 13 тыс об/мин.

Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 200 мкл для каждой пробы.

Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрыть крышки, осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Можно провести процедуру одновременно для всех пробирок, для этого необходимо накрыть пробирки в штативе сверху крышкой или другим штативом, прижать их и переворачивать штатив.

Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге.

Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы.

Добавить в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрыть крышки и осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз.

Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге.

Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы.

Поместить пробирки в термостат при температуре 65°С на 5 мин для подсушивания осадка (при этом крышки пробирок должны быть открыты).

Добавить в пробирки по 50 мкл RNA-буфера. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 65°С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе. Допускается при необходимости увеличение объема элюции до 90 мкл.

Процентрифугировать пробирки при 13 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге.

Надосадочная жидкость содержит очищенные RNA и DNA. Пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции и PCR. После выделения RNA, рекомендуется сразу произвести обратную транскрипцию. Выделенную RNA хранить при -20°.

3. Обратная транскрипция.

Для получения cDNA на матрице, выделенной RNA, используются коммерческие наборы для обратной транскрипции такие как «PEBEPTA-L» (AmpliSens, ЦНИИЭ, Россия), набор реактивов MMLV RT kit (Евроген, Россия), согласно протоколу производителя.

Протокол проведения обратной транскрипции с использованием коммерческого набора «PEBEPTA-L» AmpliSens (ЦНИИЭ, Россия).

Отобрать необходимое количество микропробирок объемом 0,2 мл.

Приготовить реакционную смесь на 12 реакций. Для этого в пробирку с RT-mix внести 5 мкл RT-G-mix-1 (RT-G-mix-2), тщательно перемешать на вортексе, осадить капли с крышки пробирки кратковременным центрифугированием.

К полученному раствору добавить 6 мкл ревертазы (MMlv), пипетировать 5 раз, перемешать на вортексе. Осадить капли с крышки пробирки кратковременным центрифугированием.

Внести в микропробирки по 10 мкл готовой реакционной смеси.

Используя наконечники с аэрозольным барьером, добавить по 10 мкл RNA-пробы в пробирки с реакционной смесью. Осторожно перемешать пипетированием.

Поставить пробирки в амплификатор (термостат) с температурой 37°С на 30 мин.

Полученную в реакции обратной транскрипции cDNA для последующей постановки PCR развести в 2 раза DNA-буфером (к 20 мкл cDNA отдельным наконечником с аэрозольным барьером добавить 20 мкл DNA-буфера, аккуратно перемешать пипетированием 10 раз). Полученную cDNA хранить при -20°С.

4. Проведение ОТ-ПЦР.

ОТ ПЦР проводится в готовых 2,5-кратных реакционных смесях, содержащих краситель SYBR Green (НПО "Синтол").

Последовательность используемых праймеров:

Для каждой пары праймеров готовится реакционная смесь в отдельных пробирках, расчет на один образец следующий:

2,5 кратная реакционная смесь - 10 мкл;

25 mM MgCl₂ - 1 мкл;

прямой праймер (10 mM) - 0,5 мкл;

обратный праймер (10 mM) - 0,5 мкл;

вода - 9 мкл;

матрица cDNA- 1 мкл.

Каждый клинический образец ставится в трех повторах.

Параметры циклов амплификации:

1) 95°С-10 мин;

2) 50 циклов: 94°С 20 сек, 58°С 20 сек, 72°С 20 сек.

5. Обсчет результатов.

Детекция проводится на светофильтре FAM, оценивается уровень СТ-номера цикла, при котором флуоресцентный сигнала превышает пороговое значение. Для определения уровня экспрессии mRNA TLRs используется сравнительный СТ-метод. В сравнительном СТ-методе для относительного определения количества используют арифметические формулы, а не стандартную кривую. Количество мишени, нормированное на количество эндогенного контроля и по отношению к калибратору, определяют по формуле 2^-ΔΔСт

Чтобы выполнить расчет величины ΔΔСТ:

- определяют величину ΔCT путем вычитания средней величины СТ эндогенного контроля (GAPDH) из средней величины СТ мишени: mRNA TLRs; - определяют величину ΔΔСТ путем вычитания величины ΔCT калибратора (TLRs здоровых пациентов) из величины ΔCT исследуемого образца (TLRs пациентов с патологией). ЭГ TLRs оценивают в относительных единицах (ОЕ).

Для расчета прогностических коэффициентов, определяющих характер течения беременности, был использован метод линейного дискриминантного анализа, анализом сопряженности с прямой пошаговой процедурой включения показателей экспрессии генов TLR 3 и TLR 8. Значения полученных прогностических коэффициентов сравниваются между собой.

Прогноз течения беременности определяют по максимальному значению соответствующей функции.

Прогноз течения беременности (ПТБ). Расчет математической модели прогноза течения беременности был проведен на основании ретроспективных данных экспрессии генов TL рецепторов пациенток с исходом срочных родов при инфицировании без клинических проявлений (CP Инф), исходом срочных или преждевременных родов с инфицированием и клиническими проявлениями (CP ИнфКП) и прерыванием беременности при инфицировании и клиническими проявлениями (ПБ ИнфКП). При проведении дискриминантного анализа прогноза течения беременности в результате анализа толерантности в пошаговой процедуре исключения показателей были исключены показатели TLR2 и TLR4.

Статистическая значимость дискриминации групп подтверждается достоверными значениями квадратов расстояний Махалонобиса между всеми центроидами: «СР ИнфКП - CP Инф» = 0,42 (р=0,019); «СР ИнфКП - ПБ ИнфКП» = 2,01 (р=0,00033); «СР Инф - ПБ ИнфКП» = 3,93 (р=3,0⋅10^-5).

Решающие правила, используемые для оценки характера течения беременности, имеют вид классификационных функций:

F1=0,74512×TLR3+0,01123×TLR8-8,69941

F2=0,78193×TLR3-0,07797×TLR8-8,59924

F3=0,4849×TLR3+0,2247×TLR8-10,7347

где:

F1 - значение классификационной линейной функции дискриминантного анализа, указывающее на развитие срочных и преждевременных родов с инфицированием и клиническими проявлениями,

F2 - значение классификационной линейной функции дискриминантного анализа, указывающее на развитие срочных родов с инфицированием,

F3 - значение классификационной линейной функции дискриминантного анализа, указывающее на развитие прерывания беременности с инфицированием и клиническими проявлениями

Максимальное значение классификационной функции среди указанных 3х функций указывает на принадлежность исследуемого образца к соответствующей группе.

TLR3 - экспрессия генов TLR3, ОЕ,

TLR8 - экспрессия генов TLR8, ОЕ.

При максимальном значении F1 прогнозируют срочные и преждевременные роды с инфицированием и клиническими проявлениями, при максимальном значении F2 прогнозируют срочные роды с инфицированием, при максимальном значении F3 прогнозируют прерывание беременности с инфицированием и клиническими проявлениями.

В результате проведенных нами исследований впервые были получены решающие правила, позволяющие спрогнозировать характер течения беременности при наличии урогенитальной инфекции у беременных на ранних сроках гестации.

Заявленный способ прогнозирования течения беременности является новым и в литературе не описан.

В основу заявляемого изобретения положена, обеспечивающая решение поставленной задачи, новая совокупность оригинальных отличительных признаков.

Впервые прогнозирование течения беременности выполняется при одновременном использовании уровней ЭГ TLR3 и TLR8 в сочетании с определением значения классификационной линейной функции дискриминантного анализа, указывающего на вероятность срочных родов при инфицировании, инфицировании и клинических проявлениях, значения классификационной линейной функции дискриминантного анализа, указывающего на вероятность прерывания беременности у беременных с УГИ с высокой достоверностью (прогностическая точность = 71,7%).

Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - обеспечения раннего информативного прогноза течения беременности.

Заявляемое изобретение апробировано при обследовании 89 беременных с УГИ. Ниже приводятся результаты этой апробации.

Пример 1. Пациентка Б. Клиника невынашивания: угроза прерывания беременности; жалобы на тянущие боли внизу живота; бели. Клинические проявления генитального герпеса и ОРВИ во время беременности.

Уровни экспрессии генов TLR:

TLR3 - 12,1 ОЕ;

TLR8 - 9,3 ОЕ;

Рассчитали значения классификационных функций дискриминантного уравнения математической модели характера течения беременности по формулам:

F1=0,74512×TLR3+0,01123×TLR8-8,69941

F2=0,78193×TLR3-0,07797×TLR8-8,59924

F3=0,4849×TLR3+0,2247×TLR8-10,7347

Максимальное значение классификационной функции среди указанных 3х функций указывает на принадлежность исследуемого образца к соответствующей группе.

TLR3 - экспрессия генов TLR3, ОЕ,

TLR8 - экспрессия генов TLR8, ОЕ.

Полученные по формулам значения F1, F2 и F3 округляют до второго знака после запятой (до сотых долей) и устанавливают максимальное значение функции. Данные округленные значения составили: для F1 (Срочные и преждевременные роды с инфицированием и клиническими проявлениями) = 0,421, для F2 (Срочные роды с инфицированием) = 0,137, для F3 (Прерывание беременности с инфицированием и клиническими проявлениями) = -2,778

В связи с тем, что округленное значение F1 было больше округленного значения F2 и F3, прогнозируются срочные или преждевременные роды с инфицированием и клиническими проявлениями.

Пример 2. Пациентка К. Клиника невынашивания: угроза прерывания беременности; жалобы на тянущие боли внизу живота; бели. Клинические проявления генитального герпеса и ОРВИ во время беременности.

Уровни экспрессии генов TLRs:

TLR3 - 24,0 ОЕ;

TLR8 - 26,8 ОЕ;

Рассчитали значения классификационных функций дискриминантного уравнения математической модели характера течения беременности по формулам:

F1=0,74512×TLR3+0,01123×TLR8-8,69941

F2=0,78193×TLR3-0,07797×TLR8-8,59924

F3=0,4849×TLR3+0,2247×TLR8-10,7347

Максимальное значение классификационной функции среди указанных 3х функций указывает на принадлежность исследуемого образца к соответствующей группе.

TLR3 - экспрессия генов TLR3, ОЕ,

TLR8 - экспрессия генов TLR8, ОЕ.

Полученные по формулам значения F1, F2 и F3 округляют до второго знака после запятой (до сотых долей) и устанавливают максимальное значение функции. Данные округленные значения составили: для F1 (Срочные и преждевременные роды с инфицированием и клиническими проявлениями) = 9,48, для F2 (Срочные роды с инфицированием) = 8,08, для F3 (Прерывание беременности с инфицированием и клиническими проявлениями) = 6,93

В связи с тем, что округленное значение F1 было больше округленного значения F2 и F3, прогнозируются срочные или преждевременные роды с инфицированием и клиническими проявлениями.

Пример 3. Пациентка О. Клиника невынашивания: неразвивающаяся беременность, самопроизвольный аборт.

Уровни экспрессии генов TLR:

TLR3 - 12,1 ОЕ;

TLR8 - 29,8 ОЕ;

Рассчитали значения классификационных функций дискриминантного уравнения математической модели характера течения беременности по формулам:

F1=0,74512×TLR3+0,01123×TLR8-8,69941

F2=0,78193×TLR3-0,07797×TLR8-8,59924

F3=0,4849×TLR3+0,2247×TLR8-10,7347

Максимальное значение классификационной функции среди указанных 3х функций указывает на принадлежность исследуемого образца к соответствующей группе.

TLR3 - экспрессия генов TLR3, ОЕ,

TLR8 - экспрессия генов TLR8, ОЕ.

Полученные по формулам значения F1, F2 и F3 округляют до второго знака после запятой (до сотых долей) и устанавливают максимальное значение функции. Данные округленные значения составили: для F1 (Срочные и преждевременные роды с инфицированием и клиническими проявлениями) = 0,65, для F2 (Срочные роды с инфицированием) = -1,46, для F3 (Прерывание беременности с инфицированием и клиническими проявлениями) = 1,82

В связи с тем, что округленное значение F3 было больше округленного значения F1 и F2, прогнозируется прерывание беременности с инфицированием и клиническими проявлениями.

Пример 4. Пациентка О.В. Клиника невынашивания: угроза прерывания беременности; жалобы на тянущие боли внизу живот; бели. Клинические рецидивы вирусной инфекции во время беременности.

Уровни экспрессии генов TLR:

TLR3 - 18,3 ОЕ;

TLR8 - 8,4 ОЕ;

Рассчитали значения классификационных функций дискриминантного уравнения математической модели характера течения беременности по формулам:

F1=0,74512×TLR3+0,01123×TLR8-8,69941

F2=0,78193×TLR3-0,07797×TLR8-8,59924

F3=0,4849×TLR3+0,2247×TLR8-10,7347

Максимальное значение классификационной функции среди указанных 3х функций указывает на принадлежность исследуемого образца к соответствующей группе.

TLR3 - экспрессия генов TLR3, ОЕ,

TLR8 - экспрессия генов TLR8, ОЕ.

Полученные по формулам значения F1, F2 и F3 округляют до второго знака после запятой (до сотых долей) и устанавливают максимальное значение функции. Данные округленные значения составили: для F1 (Срочные и преждевременные роды с инфицированием и клиническими проявлениями) = 5,03, для F2 (Срочные роды с инфицированием) = 5,06, для F3 (Прерывание беременности с инфицированием и клиническими проявлениями) = 0,03

В связи с тем, что округленное значение F2 было больше округленного значения F1 и F3, прогнозируются срочные роды с инфицированием без клинических проявлений.

Список литературы

1. Караулов А.В., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Бондаренко Н.Л., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С.и др. Роль возбудителей и факторов врожденного иммунитета в патогенезе урогенитальной инфекции беременных. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2018; 17(2): 77-88. doi: 10.20953/1726-1678-2018-2-77-88

2. Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Несвижский Ю.В., Караулов А.В., Кафарская Л.И. и др. Роль и биологическое значение толл-подобных рецепторов в антиинфекционной резистентности организма. Вестник Российской академии медицинских наук. 2008; (1): 45-55.

3. Караулов А.В., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Бондаренко Н.Л., Агаева М.И., Воропаева Е.А. и др. Роль TLR и факторов мукозального иммунитета в патогенезе и предупреждении прерывания беременности при урогенитальной инфекции. Инфекционные болезни. 2017; 15(4): 82-90. doi: 10.20953/1729-9225-2017-4-82-90

4. Караулов А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Бондаренко Н.Л., Агаева М., Воропаева Е.А. и др. Роль TLR в патогенезе и диагностике урогенитальных инфекций женщин. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2017; 16(4): 32-38. doi: 10.20953/1726-1678-2017-4-32-38

5. Микробиоценозы и здоровье человека / Под ред. В.А. Алешкина, С.С. Афанасьева, А.В. Караулова. М.: Династия, 2015.

6. Караулов А.В., С.С. Афанасьев, Ю.В. Несвижский, В.А. Алёшкин, М.С. Афанасьев, Е.А. Воропаева и др. Мукозальный иммунитет и колонизационная резистентность слизистых открытых полостей человека в норме и при патологических состояниях. Учебное пособие для системы послевузовского профессионального образования врачей. Регистрационный номер рецензии Координационного совета по области образования «Здравоохранение и медицинские науки»: №048 ЭКУ от 15 декабря 2016 г. М.: Издательство Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова; 2017.

7. Воропаева Е.А., Караулов А.В., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Макаров О.В., Несвижский Ю.В. и др. Оценка микробиоценоза влагалища при акушерской и гинекологической патологии (новая медицинская технология). ФС №2009/187 от 17. 07. 2009. Москва-Астрахань: Изд-во Астраханской государственной медицинской академии; 2012.

8. Гринхальд Т. Основы доказательной медицины. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2008.

9. Гржибовский A.M. Корреляционный анализ в медицинских исследованиях. Бюллетень Саратовского государственного медицинского университета. 2000; (2): 22-23.

10. Зайцев В.М., Лифляндский В.Г., Маринкин В.И. Прикладная медицинская статистика. СПб.: Фолиант; 2008.

11. Крамер Г. Математические методы статистики. М.: Мир; 1975.

12. Боровиков В.П. STATISTICA, искусство анализа данных на компьютере. СПб.: Издательство «Питер»; 2003.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, гинекологии, инфекционным болезням и иммунологии, и может быть использовано для прогнозирования течения беременности при урогенитальной инфекции (УГИ). Для этого у беременных с УГИ в соскобе со слизистых цервикального канала и/или влагалища определяют уровни экспрессии генов TLR3 и TLR8 методом ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией. Для прогноза течения беременности рассчитывают значения классификационных функций по формулам и устанавливают максимальное значение функции, по которым прогнозируют срочные и преждевременные роды с инфицированием и клиническими проявлениями, срочные роды с инфицированием, прерывание беременности с инфицированием и клиническими проявлениями. Способ позволяет прогнозировать исход беременности на ранних сроках гестации при его малоинвазивности. 1 табл., 4 пр.

Способ прогнозирования течения беременности при урогенитальной инфекции, характеризующийся тем, что у беременных с урогенитальной инфекцией определяют уровни экспрессии генов TLR3 и TLR8 в соскобе со слизистых цервикального канала и/или влагалища с помощью ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией, затем с использованием линейного дискриминантного анализа рассчитывают прогностические коэффициенты, оценивающие характер течения беременности по формулам

F₁=0,74512*TLR3+0,01123*TLR8-8,69941

F₂=0,78193*TLR3-0,07797*TLR8-8,59924

F₃=0,4849*TLR3+0,2247*TLR8-10,7347

где

F1 - значение классификационной линейной функции дискриминантного анализа, указывающее на развитие срочных и преждевременных родов с инфицированием и клиническими проявлениями,

F2 - значение классификационной линейной функции дискриминантного анализа, указывающее на развитие срочных родов с инфицированием,

F3 - значение классификационной линейной функции дискриминантного анализа, указывающее на развитие прерывания беременности с инфицированием и клиническими проявлениями;

при максимальном значении F1 прогнозируют срочные и преждевременные роды с инфицированием и клиническими проявлениями, при максимальном значении F2 прогнозируют срочные роды с инфицированием без клинических проявлений, при максимальном значении F3 прогнозируют прерывание беременности с инфицированием и клиническими проявлениями.