СПОСОБ И СИСТЕМА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ В ЖИДКОМ ОБРАЗЦЕ С ПОМОЩЬЮ МАГНИТНЫХ ЧАСТИЦ Российский патент 2020 года по МПК C12N15/10 C12Q1/68 C12M1/02 C12M1/34 C12M3/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к области выделения компонентов, содержащихся в растворе, с использованием магнитных частиц.

Изобретение, в частности, можно использовать в области получения биологического образца, в частности, при выполнении диагностики in vitro, путем захвата анализируемых веществ биологического происхождения (нуклеиновых кислот, микроорганизмов, белков, пептидов и т.д.), присутствующих в растворе.

ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Исходно разработанная для выделения нуклеиновых кислот, присутствующих в биологическом образце, и описанная в документе США 5234809, технология «BOOM®» состоит из введения в жидкий образец магнитных частиц, способных связываться с интересующими компонентами, затем отделения магнитных частиц от образца при помощи одного или нескольких магнитов. Захваченные таким образом частицы можно затем подвергать последующей обработке, например, высвобождать их компоненты в востанавливающий раствор. В связи с эффективностью этого способа было разработано и выведено на рынок много устройств (в частности, для ДНК и РНК, и т.д.), они представляли собой как устройства с ручным управлением (например, NucliSENS-miniMAG® от автора заявки), так и автоматические устройства (NucliSENS-easyMAG® от автора заявки). Однако эти автоматические устройства имеют различные недостатки.

Первый недостаток касается их многозадачности и их громоздкости. Фактически, эти устройства, как правило, представляют собой тяжелые и громоздкие автоматические устройства, которые разработаны для проведения последовательности из обработок, которая не может быть модифицирована пользователем. Автоматическое устройство, таким образом, сконструировано для одного типа выделения, например, сконструировано для очистки нуклеиновых кислот, но не способно проводить иммуноконцентрацию на магнитных частицах.

Второй недостаток касается систем для впрыскивания и всасывания различных жидкостей, используемых во время выделения. Поскольку число жидкостей велико, это подразумевает системы, которые также являются многочисленными и/или сложными. Кроме того, из-за возможных загрязнений, эти системы впрыскивания/всасывания необходимо регулярно очищать, т.е. останавливать работу устройства.

Третий недостаток касается операций перемешивания, которые проводят, чтобы добиться гомогенности образца, содержащего магнитные частицы, перед захватом, для того чтобы максимально повысить захват указанных частиц интересующего анализируемого вещества или для того, чтобы эффективно промыть магнитные частицы. Этот тип перемешивания, как правило, требует сложных механизмов, например, на основе подвижных магнитов, которые заставляют двигаться магнитные частицы.

Четвертый недостаток касается различных жидкостей, используемых во время выделения. Как правило, этапы выделения проводят или начинают в одном контейнере. В результате, этот контейнер настроен на один объем для всех используемых жидкостей (например, образца, различных отмывающих растворов, элюирующего раствора и т.п.), что в целом ограничивает эффективность процесса выделения. Фактически, некоторые этапы обработки (например, отмывание) требуют больших объемов для полной эффективности, в то время как для остальных этапов обработки необходим только небольшой объем жидкости (например, для элюции).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей по настоящему изобретению является создание способа для выделения компонентов в жидком образце при помощи магнитных частиц, который предлагает большую свободу выбора для объемов жидкостей, используемых во время экстракции, в частности, вплоть до 10 мл.

Для достижения этого эффекта, предметом изобретения является способ для выделения компонентов, содержащихся в биологическом образце в жидкой форме, при этом указанные компоненты способны связываться с магнитными частицами, способ, включающий:

фазу смешивания образца с магнитными частицами;

фазу всасывания смеси из лунки в трубчатый конус пипетки, содержащий наконечник, предназначенный для пипетирования жидкости;

фазу захвата магнитных частиц на внутреннюю стенку конуса пипетки:

путем применения первого магнитного поля к конусу пипетки, при этом указанное магнитное поле способно притягивать и удерживать магнитные частицы в предопределенной зоне конуса пипетки, называемой зона «захвата», выше наконечника указанного конуса;

и путем выполнения, по меньшей мере, одного цикла всасывания и слива смеси, содержащейся в конусе пипетки, в лунку;

по меньшей мере, одну фазу промывания частиц, захваченных на внутренней стенке конуса пипетки при помощи:

слива смеси, содержащейся в конусе пипетки; и

выполнение, по меньшей мере, одного цикла всасывания и слива раствора для промывания в конусе пипетки из лунки, содержащей раствор для промывания;

фазу миграции магнитных частиц на внутренней стенке конуса из зоны захвата к наконечнику конуса пипетки, путем проведения относительного движения конуса пипетки относительно первого магнитного поля;

и фазу переноса указанных магнитных частиц, мигрирующих в наконечник конуса пипетки в лунку для восстановления, содержащую раствор.

Другими словами, изобретение имеет преимущество в виде конуса пипетки, в котором можно проводить циклы всасывания и слива, в то время как наконечник указанного конуса пипетки погружен в лунку. Посредством таких циклов возможно захватывать все частицы, присутствующие в образце гораздо большего объема, чем тот объем, т.е. конуса, в котором проводят выделение. Возможно даже пропускать через конус совокупный объем жидкости, гораздо больший, чем объем образца сам по себе, регулируя число циклов всасывания и слива. Аналогично, объем используемого раствора/растворов для промывания, при необходимости, во время выделения может быть гораздо больше, чем объем конуса. Фаза миграции делает возможной, со своей стороны, локализацию магнитных частиц в части конуса, наконечнике, который можно погружать в лунку очень маленького объема. Объем раствора для восстановления, таким образом, может быть небольшим, при необходимости. Объем раствора для восстановления, таким образом, не зависит от объема образца и объема конуса пипетки, в котором проводят выделение. Посредством изобретения, таким образом, возможно оптимизировать каждый объем используемой жидкости, и, таким образом, возможно оптимизировать выделение.

Кроме того, из-за геометрии трубчатых конусов и циклов всасывания/слива получают эффективное перемешивание образца в конусах, при этом указанное перемешивание проводят, например, перед захватом, а также получают эффективное промывание, что происходит без использования механизмов типа подвижного магнита. Кроме того, авторы изобретения заметили, что эффективное промывание происходит в конусе, даже если частицы захвачены на стенке конуса пипетки. Можно использовать большой объем раствора для промывания, дополнительно повышая эффективность промывания. В результате, все этапы выделения (перемешивание, захват, промывание, перенос в раствор для восстановления) можно проводить в конусе пипетки.

В соответствии с одним из вариантов осуществления движение первого магнитного поля состоит из движения конуса пипетки параллельно продольной оси указанного конуса, и из сохранения первого магнитного поля постоянным, при этом продольная ось конуса пипетки остается на одинаковом расстоянии от первого магнитного поля во время движения конуса пипетки.

Другими словами, миграцию частиц можно проводить, просто передвигая конус пипетки относительно, например, неподвижного магнита.

В соответствии с одним из вариантов осуществления фаза переноса включает:

размещение наконечника конуса пипетки в лунке для восстановления;

и применение второго магнитного поля от дна лунки для восстановления таким образом, чтобы вызвать миграцию магнитных частиц, содержащихся в наконечнике конуса пипетки в лунку для восстановления.

В частности, второе магнитное поле производится магнитом, который частично или полностью расположен под наконечником конуса пипетки. Первое магнитное поле, применяемое к конусу пипетки, деактивируют во время применения второго магнитного поля.

Другими словами, второе магнитное поле делает возможным простое притяжение частиц в лунку для восстановления, что повышает скорость восстановления магнитных частиц в лунке для восстановления, а также число восстановленных частиц. Кроме того, второе магнитное поле автоматически захватывает магнитные частицы в лунке для восстановления. Например, если раствор для восстановления является элюентом, компоненты, связанные с частицами высвобождаются, и лаборант может непосредственно пипетировать раствор, свободный от магнитных частиц.

В соответствии с одним из предпочтительных вариантов, фаза переноса включает в себя деактивацию первого магнитного поля с последующим применением циклов всасывания и слива раствора из лунки для восстановления в наконечнике конуса пипетки, при этом указанное применение состоит из:

первой фазы применения циклов с первой частотой;

с последующей второй фазой применения циклов со второй частотой, более низкой, чем первая частота.

Первая фаза делает возможным эффективное разрушение скоплений частиц, захваченных на конусе пипетки, также называемых «осадок», и, таким образом, ресуспендирование частиц в растворе для восстановления. Вторая фаза делает возможным продолжение перемешивания раствора, в то же время не препятствуя миграции частиц под воздействием магнитного поля. Это позволяет еще более повышать скорость восстановления и число восстановленных частиц в лунке для восстановления. Кроме того, если раствор является элюентом, функцией которого является высвобождение компонентов, захваченных магнитными частицами, эти циклы оказывают воздействие на перемешивание частиц в элюенте, что повышает эффективность элюента, в частности, когда элюирующий раствор применяют для отделения анализируемых веществ от магнитных частиц без этапа нагревания.

В соответствии с одним из вариантов осуществления способ включает перед фазой захвата фазу перемешивания смеси, содержащейся в конусе пипетки путем применения, по меньшей мере, одного цикла всасывания и слива указанной смеси в конусе пипетки. Из-за геометрии конуса, которая является трубчатой по форме, можно получить более высокую пропускную способность по объему по отношению к поперечному сечению конуса, и таким образом, эффективное перемешивание. Кроме того, высокая турбулентность, возникающая в конусе, которая естественным путем создается потоком жидкости, повышает эффективность перемешивания. Преимуществом являются одноразовые комплектующие, предусмотренные в конусе для увеличения этого эффекта.

В соответствии с одним из вариантов осуществления способ включает перед фазой переноса, по меньшей мере, одну фазу промывания частиц, захваченных на внутренней стенке конуса пипетки, путем:

деактивации магнитного поля;

высвобождения захваченных частиц с применением, из лунки, содержащей раствор для промывания, по меньшей мере, одного цикла всасывания и слива раствора для промывания в конусе пипетки;

применение второй фазы захвата на внутреннюю стенку конуса пипетки:

путем применения первого магнитного поля к конусу пипетки,

и путем применения, по меньшей мере, одного цикла всасывания и слива смеси, содержащейся в конусе пипетки, в лунке, содержащей раствор для промывания.

В соответствии с одним из вариантов осуществления высвобождение захваченных частиц включает фазу применения циклов таким образом, чтобы проводить движения вверх и вниз мениском указанного раствора над осадком частиц, захваченных в конус пипетки; указанные движения вверх и вниз указанного мениска проводят в участке конуса, меньшем, чем общая длина конуса пипетки.

Более конкретно, высвобождение захваченных частиц включает вторую фазу применения циклов таким образом, чтобы проводить в конусе полное всасывание и слив раствора для промывания. Частота применения циклов во второй фазе ниже, чем частота применения циклов в первой фазе.

В частности, перед высвобождением захваченных частиц, способ включает, по меньшей мере, две фазы промывания, которые проводят в двух раздельных растворах для промывания.

Этот вариант осуществления в частности эффективен, когда компоненты, содержащиеся в биологическом образце, представляют собой нуклеиновые кислоты (например, ДНК, РНК).

В соответствии с другим вариантом осуществления, компоненты, содержащиеся в биологическом образце, представляют собой микроорганизмы (например, бактерии, грибы, дрожжи), и способ включает одну фазу захвата и одну фазу промывания.

В частности, смесь образца с магнитными частицами имеет объем больше чем 1 миллилитр, и предпочтительно больше чем или равный двум миллилитрам, и объем лунки для восстановления менее чем или равный 200 микролитрам, и предпочтительно менее чем или равный 100 микролитрам.

В соответствии с одним из вариантов осуществления способ включает перед фазой переноса, по меньшей мере, одну фазу промывания частиц, захваченных на внутренней стенке конуса пипетки:

путем всасывания раствора для промывания в указанный конус пипетки;

затем путем модулирования первого магнитного поля, применяемого к магнитным частицам для того чтобы захватить указанные частицы на внутреннюю стенку конуса пипетки;

затем путем слива жидкости для промывания из конуса пипетки.

Другими словами, модулирование магнитного поля вызывает реорганизацию осадка частиц, захваченных на стенку конуса. В частности, осадок может менять форму, или может распространяться, скользить или еще «катиться» по стенке конуса пипетки. Эта реорганизация осадка позволяет дополнительно повысить эффективность промывания, вдобавок эту реорганизацию можно проводить вместе с циклами всасывания и слива раствора для промывания.

В частности, модулирование первого магнитного поля проводят:

двигая конус пипетки параллельно продольной оси указанного конуса, и сохраняя первое магнитное поле неизменным;

и/или путем прохождения магнитов, пространственно отделенных друг от друга напротив захваченных частиц.

Другими словами, модулирование проводят просто, например, при помощи лаборанта, который сдвигает полоску магнитов, или при помощи автоматического устройства, которое использует простой механизм поступательного движения полоски магнитов.

В соответствии с одним из вариантов осуществления объем конуса пипетки, по меньшей мере, в десять раз больше, чем объем лунки для восстановления. В соответствии с одним из вариантов осуществления объем смеси, по меньшей мере, в три раза больше, чем объем конуса пипетки.

В соответствии с одним из вариантов осуществления компоненты относятся к группе, образованной одноцепочечными или двухцепочечными нуклеиновыми кислотами (ДНК и/или РНК), микроорганизмами, белками и пептидами. Компоненты состоят из любого другого типа молекул в зависимости от функционализации, присущей магнитным частицам.

Целью настоящего изобретения также является создание устройства для проведения только что описанного способа, которое является не слишком громоздким и которое является простым для использования лаборантом.

Для достижения этой цели, предметом по изобретению также является держатель пипетки, состоящий из:

основания;

выемки, сделанной в основании, которая может вмещать в себя съемный штатив для лунок;

штатива для пипетки, состоящего из первого гнезда в которое может быть вставлена, преимущественно съемная, пипетка, снабженная, по меньшей мере, одним трубчатым конусом пипетки, содержащим наконечник, предназначенный для пипетирования жидкостей; первое гнездо открывается наружу относительно выемки основания, штатив для пипетки поступательно перемещается относительно основания в направлении, параллельном оси конусов пипетки, и перемещается между первым положением, в котором наконечник каждого конуса пипетки введен в лунку в штативе для лунок, и, по меньшей мере, одним вторым положением, в котором указанный наконечник находится вне указанной лунки;

второго гнезда, которое может содержать в себе съемную магнитную часть, где второе гнездо обращено к каждому из конусов пипетки в положении над его наконечником, когда штатив для пипетки находится в первом положении, и второе гнездо обращено к наконечнику конуса пипетки, когда штатив для пипетки находится во втором положении.

Другими словами, в держатель пипетки вставляют пипетку, и лаборант проводит этапы способа выделения путем поднимания/опускания пипетки, в частности, для того чтобы вызвать миграцию осадка частиц в наконечник конуса/конусов пипетки, путем вставки лунок (в форме планшета, полоски, и т.д.) в основание, и путем приведения пипетки в действие.

Держатель пипетки, который является транспортабельным и не громоздким, также допускает полуавтоматический способ выделения с использованием электронной пипетки. Такая пипетка фактически содержит системы для всасывания и слива, которыми снабжен каждый конус пипетки, и микропроцессорную электронную схему. Эта электронная схема контролирует системы для всасывания и слива в зависимости от заданных значений, введенных лаборантом с помощью интерфейса, которым снабжена пипетка, и/или компьютера/планшета/смартфона, соединенных с пипеткой (например, путем беспроводного соединения типа Bluetooth), и т.д. Эти заданные значения состоят, например, например, из инструкций для цикла всасывания/слива и/или выбора конкретного протокола, предварительно записанного в пипетке.

Поскольку электронная пипетка является программируемой, большая проблема многозадачности также решается при определении способа выделения, который может быть скорректирован в виде функции желаемого конкретного магнитного захвата (например, очистка нуклеиновых кислот, магнитная иммуноконцентрация и т.д.). В частности, протокол, подходящий для предполагаемого выделения может быть записан в пипетке, причем протокол определен относительно числа циклов всасывания и слива, последовательности циклов, частоты циклов, времени между циклами, определенных объемов, и т.д. Таким образом, получают автоматическую и полуавтоматическую систему.

Наконец, конусы пипетки можно отсоединить от пипетки, и, таким образом, легко заменить без вывода пипетки из эксплуатации в течение длительного периода времени.

В соответствии с одним из вариантов осуществления первое гнездо содержит в себе отверстие для фронтальной вставки пипетки и фронтального удаления пипетки из первого гнезда штатива для пипетки. Фронтальная вставка и удаление пипетки и конусов в положении сводят к минимуму соприкосновение держателя пипетки с наконечниками конуса, и, таким образом, сводят к минимуму риск загрязнения держателя пипетки.

В соответствии с одним из вариантов осуществления второе гнездо выполнено в основании.

В частности, штатив для пипетки содержит третье гнездо, в которое вставляют съемную магнитную часть, обращенную к каждому из конусов пипетки в положении над наконечником указанного конуса, когда штатив для пипетки находится во втором положении.

Другими словами, когда магнитная часть (например, содержащая один или несколько постоянных магнитов) присутствует в третьем гнезде, она жестко связана с конусами пипетки и, таким образом, следует за их поступательным движением относительно основания. Во время таких движений, магнитная часть, таким образом, сохраняет осадки магнитных частиц, прикрепленными к конусам. Лаборант, таким образом, может, например, поднимать пипетку для того чтобы более легко двигать штатив для лунок в основании без риска сдвинуть осадки частиц в конусах.

В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления, второе и третье гнездо соединены, и штатив для пипетки содержит приспособления, способные поддерживать магнитную часть в третьем гнезде с возможностью съема. Таким образом, лаборант может отсоединять магнитную часть от штатива для пипетки, которая затем автоматически занимает место в основании за счет попадания во второе гнездо. Это отсоединение производят, в частности, для операции миграции магнитных частиц в наконечниках конусов.

В соответствии с одним из вариантов осуществления:

основание содержит, по меньшей мере, одно зубчатое колесо, которое может вращаться;

и штатив для пипетки содержит рейку, которая взаимодействует с зубчатым колесом, для того чтобы поступательно двигать штатив для пипетки относительно основания во время вращения зубчатого колеса.

В частности, держатель пипетки содержит устройство для блокировки и разблокировки штатива для пипетки в первом положении. В частности, держатель пипетки содержит, по меньшей мере, одну рукоятку, которая жестко соединена с зубчатым колесом, таким образом, чтобы поворачивать указанное колесо, и которая способна присоединяться с возможностью съема к рукоятке, которая жестко соединена с зубчатым колесом другого держателя пипетки, что, таким образом, позволяет увеличить число конусов пипеток во время способа выделения.

Предметом по изобретению также является система для выделения компонентов, содержащихся в биологическом образце в жидкой форме, при этом указанные компоненты способны связываться с магнитными частицами, при этом система состоит из:

пипетки, снабженной, по меньшей мере, одним трубчатым конусом пипетки, содержащим наконечник, предназначенный для пипетирования жидкостей и с системой для всасывания и слива в каждом конусе пипетки;

по меньшей мере, одного штатива для лунок;

держателя пипетки, состоящего из:

основания;

выемки, сделанной в основании, которая может вмещать в себя каждый штатив для лунок с возможностью съема;

штатива для пипетки, состоящего из первого гнезда, в которое может быть вставлена, преимущественно съемная, пипетка, при этом первое гнездо открывается наружу относительно выемки основания, при этом штатив для пипетки поступательно перемещается относительно основания в направлении, параллельном оси конусов пипетки, и перемещается между первым положением, в котором наконечник каждого конуса пипетки введен в лунку в штативе для лунок, и, по меньшей мере, одним вторым положением, в котором указанный наконечник находится вне указанной лунки;

второго гнезда, обращенного к каждому из конусов пипетки в положении над его наконечником, когда штатив для пипетки находится в первом положении, и второго гнезда, обращенного к наконечнику конуса пипетки, когда штатив для пипетки находится во втором положении; и

магнитной части, вставленной во второе гнездо с возможностью съема.

В частности, держатель пипетки соответствует вышеописанному держателю пипетки.

Целью изобретению также является создание штатива для лунок для миграции магнитных частиц из наконечников конусов пипетки в лунки для восстановления.

Для этого воздействия, предметом по изобретению также является штатив для лунок, содержащий часть, в которой сделаны выемки для вставки лунок, и, по меньшей мере, в указанной части сделан один магнит, направленный на каждую из выемок.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Изобретение будет понятно более четко при чтении последующего описания, приведенного исключительно в качестве примера, и сделанного в соответствии с прилагаемыми чертежами, в которых одинаковые ссылки обозначают одинаковые элементы, и в которых:

фигура 1 представляет собой вид в перспективе системы для выделения по изобретению;

фигуры 2A и 2B представляют собой виды спереди в перспективе электронной пипетки и съемных конусов пипетки;

фигуры 3A и 3B представляют собой виды спереди в перспективе держателя пипетки по изобретению;

фигуры 4A и 4B представляют собой подробные виды в разрезе держателя пипетки с фигуры 3, соответственно вдоль плоскостей A-A и B-B фигуры 3B;

фигура 5 представляет собой вид в перспективе планшета «с глубокими лунками», содержащего лунки;

фигуры 6A и 6B представляют собой виды в перспективе магнитной подставки и ПЦР-пробирок для элюирования, которые можно вставлять в подставку;

фигура 7 представляет собой вид спереди магнитной части по изобретению;

фигура 8 представляет собой блок-схему способа выделения по изобретению;

фигура 9 представляет фотографию конусов пипетки из системы по изобретению с осадками магнитных частиц, размещенных приблизительно на полпути вверх в конусах;

фигура 10 представляет фотографию этих же конусов с осадками, размещенными в наконечниках указанных конусов;

фигура 11 представляет фотографию ПЦР-пробирок для элюирования, в которых восстанавливают магнитные частицы;

фигуры 12 и 13 иллюстрируют второй вариант осуществления держателя пипетки по изобретению;

фигура 14 представляет собой вид в перспективе двух систем с фигуры 1, соединенных с приспособлениями с вращающейся рукояткой;

фигура 15 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую движения мениска раствора вверх и вниз на осадке частиц для отделения указанного осадка от стенки конуса пипетки.

За исключением фигуры 15, описание дано по отношению к плоскостям и фотографиям в уменьшенном масштабе реальной системы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Со ссылкой на фигуры от 1 до 7, система 10 для выделения (фигура 1) компонентов, содержащихся в жидком образце, содержит электронную пипетку 12 (фигуры 2), держатель пипетки 14 (фигуры 3), в который вставляют пипетку 12, один или несколько штативов для лунок 18a, 18b (фигуры 5 и 6), каждый из которых можно вставлять в держатель пипетки 14, и первую магнитную часть 16 (фигура 7).

Пипетка 12, которая является переносной, содержит ряд конусов пипетки 20, и корпус 22, на котором установлены конусы 20 (фигура 2A). В этом корпусе 20 есть система для всасывания/слива жидкости в конусах 20 (например, набор поршней, приводимых в действие электрическим мотором), и электронная схема для управления контуром всасывания/слива. Электронную схему, которая включает, например, микропроцессор и один или несколько блоков памяти, можно программировать, и она имеет встроенные в нее инструкции для проведения одного или нескольких протоколов для пипетирования, при этом каждый протокол включает один или несколько этапов. Электронная схема также имеет интерфейс «пользователь-машина» 24, расположенный в ручке 26 корпуса 22, при этом интерфейс содержит набор кнопок выбора и навигации 28 и экран 30, что позволяет видеть и выбирать различные записанные протоколы для пипетирования. Пользователь, в частности, может программировать электронную пипетку 12, например, путем загрузки в указанную пипетку инструкций с компьютера, соединенного с пипеткой 12 через беспроводное соединение, например, Bluetooth. Пользователь может также выбирать, через интерфейс 24, заранее записанный протокол. Пипетка 12, кроме того, способна всасывать предопределенный объем жидкости в каждый из конусов 20, сливать предопределенный объем из каждого из конусов, и проводить автоматические циклы всасывания/слива с различными временем и частотой.

Как показано более конкретно на фигуре 2B, конусы 20, которые являются трубчатыми по форме и имеют продольную ось X, имеют возможность съема за счет установки на выступы 32, выступающие из корпуса 22, что позволяет их заменять. Конусы, кроме того, состоят из пластика, например, полипропилена, что делает их «прозрачными» для магнитного поля и позволяет захватывать магнитные частицы, что будет дальше описано подробно. Наконец, каждый конус 20 имеет сужающийся профиль 21, или «наконечник», на своем открытом конце для пипетирования. Эта часть 21 имеет уменьшенное поперечное сечение в плоскости, перпендикулярной оси X, что облегчает ее введение в контейнеры или лунки, что само по себе известно.

Электронная пипетка 12 представляет собой, например, модель «8-channel Viaflo II», которую продает компания ©Integra Biosciences AG, Швейцария, при этом элементы этой модели описаны в патентных заявках US 2009/071266, US 2009/074622, US 2011/076205 и US 2008/095671.

Держатель пипетки 14 со своей стороны включает (фигуры 3A и 3B) основание 34, предназначенное для установки на рабочем месте (например, лабораторном столе или рабочем месте), и также подвижную часть 36, которая движется относительно основания 34. Мобильная часть 36, также называемая «штатив для пипетки», состоит из гнезда 38, в которое можно вставлять пипетку 12 с возможностью съема и сохранять неподвижной, как показано на фигуре 1. Для поступательного движения штатива для пипетки 36 относительно основания 34, штатив 36 содержит одну или несколько реек 40, например, две, которые взаимодействуют с зубчатыми колесами 42, установленными на оси 44, которая вращается и которая вставлена в основание 34. Один или несколько стержней 46 также присоединены к штативу 36 (соответственно, в основание 34) и скользят в отверстиях основания 34 (соответственно, в штативе 36) для того чтобы направлять штатив 36 в его поступательном движении. К концу оси 44 также присоединены одна или две вращающихся рукоятки 50 для того чтобы позволить пользователю легко поворачивать ось в направлении стрелок 52 (фигура 1) и, таким образом, заставлять штатив для пипетки 36 подниматься и опускаться, как показано стрелками 54 (фигура 1). Поступательное движение штатива для пипетки 36 относительно основания 34, таким образом, параллельно оси X конусов 20, когда пипетка 12 помещена в гнездо 38 штатива 36, и, таким образом, параллельно направлению силы тяжести, когда основание 34 помещают на горизонтальное рабочее место, таким образом, что штатив 36 «поднимается» или «опускается».

Основание 34 открыто с передней стороны 56 таким образом, чтобы было возможно вставлять и удалять штатив для лунок 18a, 18b, таким образом, определяя нишу для штатива. Этот корпус открыт на верхней части таким образом, чтобы позволять конусам 20 пипетки 12 доставать до указанного штатива для лунок, когда пипетка опущена. Таким образом, как описано более подробно ниже, пипетка 12 может занимать несколько положений относительно основания 34, и, таким образом, относительно штатива для лунок 18a, 18b, вставленного в основание. В частности, пипетка 12 может принимать положение, при котором наконечники 21 конусов 20 погружаются в лунки штатива 18a, 18b, и, по меньшей мере, одно положение, при котором наконечники 21 не погружаются в лунки, и находятся на расстоянии от лунок, что позволяет пользователю манипулировать штативом для лунок и магнитным частицам быть захваченными в центральном положении конусов 20.

Со ссылкой на фигуры 5 и 6, штатив для лунок может иметь несколько форм в зависимости от желаемого выделения. В частности, штатив для лунок представляет собой разделенный на отсеки планшет 18a (фигура 5), как правило, называемый «микропланшет» с лунками «глубокого типа». Этот тип планшета содержит ряды 60 лунок 52, в которые может погружаться ряд конусов пипетки 20. Каждый ряд 60 может, таким образом, получить конкретную жидкость, применяемую на этапе выделения, проводимом при помощи системы 10. Переход от одного ряда 60 к другому затем просто выполняется пользователем, который помещает на уровне конусов пипетки 20 конкретный ряд 60, который содержит жидкость, необходимую для этапа, который будут проводить.

Другой штатив для лунок, описанный на фигуре 6A, является магнитным и специально разработан для миграции магнитных частиц из наконечников 21 конусов пипетки 20 в лунки. Штатив 18b состоит для этой цели из корпуса 64, в котором сделан ряд гнезд 66, которые могут принимать ряд конусов пипетки 20, и в который вставлена вторая магнитная часть 68, содержащая один или несколько постоянных магнитов, например, постоянный магнит в непосредственной близости от каждой из лунок 66. Магнитную часть 68 помещают под лунками 66 или обращают к их нижним частям, как показано. Таким образом, наконечники 21 конусов пипетки 20 помещают над магнитной частью 68, когда указанные наконечники погружены в лунки 66. Наконец, штатив 18b служит в качестве магнитной подставки, в которую помещают пробирки 69 в гнезда 66, например ПЦР-пробирки для элюирования, как показано на фигуре 6B, с возможностью съема, например, с целью последующего переноса продукта выделения, восстановленного в пробирке.

Первая магнитная часть 16, функция которой заключается в захвате магнитных частиц в конусах 20 способом, который будет затем описан более подробно, содержит, со своей стороны, один или несколько постоянных магнитов 72, предпочтительно ряд постоянных магнитов, отделенных друг от друга пространствами 74, и даже более предпочтительно постоянный магнит, обращенный к каждому конусу пипетки 20, когда часть 16 полностью вставлена в основание 34. Часть 16 также содержит рукоятку 76 для лучшего захвата пользователем.

Гнездо 78 для приема магнитной части 16 расположено в основании 34, при этом гнездо 78 размещено таким образом, что часть 16 обращена к конусам пипетки 20 выше их наконечника 21, и предпочтительно обращена к центральной зоне 80 на высоте, большей чем лунка, когда наконечники 21 погружены в лунки, закрепленные в штативе для лунок. Таким образом, частицы захватываются в объеме конуса, который достаточно велик, для того, чтобы в конусах не образовывались пробки.

Держатель пипетки 14 также содержит приспособления для управления скоростью, с которой поднимается штатив 36. В частности, рейка и зубчатое колесо разработаны таким образом, что пол-оборота (180°) колеса 50 позволяет движение вдоль всей рейки, а противовесу 58, вставленному в каждую из рукояток 50, внеосевым образом относительно оси 44. Эти противовесы, под своей массой и связанным с этим эффектом рычага, создают вращательную пару сил, которая вращает ось 44, в то же время ограничивая момент силы, переданный пользователем вручную. Предпочтительно, как показано на фигуре 4A, существенная часть оси 44 также образована полуцилиндрическим противовесом для той же цели. Эта механическая помощь помогает поднять штатив для пипетки, и, таким образом, ограничивает проблемы опорно-двигательного аппарата, и осуществляет торможение, которое позволяет пользователю более точно управлять скоростью, с которой поднимается и опускается штатив 36.

Могут быть предложены другие механизмы для контроля скорости штатива 36, в частности, магнитный тормоз. Например, со ссылкой на фигуру 4A, противовес 59 содержит намагничиваемый материал (например, сталь или эквивалент), и третья магнитная часть 80 (в форме параллелепипеда или в форме дуги окружности, концентрической по отношению к оси 44) помещена в основание 34, предпочтительно, при этом обращать магнитную часть 16 в отношении оси 44, так чтобы не мешать выделению. Когда противовес 59 оси проходит напротив магнитной части 80, вращательный момент оси 44 замедляется, поскольку создается тормозящий момент. Это делает возможным, с одной стороны, компенсировать усилия по подъему пипетки во время подъема (действуя в качестве помощи для пользователя) и, с другой стороны, контролировать скорость, с которой пипетка поднимается, когда требуется заставить магнитные частицы опуститься на дно конусов пипетки, как будет описано далее.

Также предпочтительно предлагается тормозное устройство, как показано на фигуре 4B. В этом варианте, колесо 84, сделанное из деформируемого материала (например, из эластомера), крепится на оси 44 и имеет два зубца 86, 88. Выступ 82, например, полусферический выступ, кроме того, выступает из основания 84 и обращен к колесу 84. Когда пользователь поднимает пипетку 12, приводя в действие колесо 50, первый зубец 86 сталкивается с выступом 82. Когда борозда, нанесенная на колесо 50, увеличивается, зубец 86 изгибается, проходит выступ 82, и возвращается к своей форме. В этом положении, зубец 86 может затем опираться на выступ 82, жесткость этого зубца выбирается таким образом, чтобы он не сгибался под действием массы пипетки 12 и держателя пипетки 36. Пипетка, таким образом, блокируется в верхнем положении, пользователь, таким образом, способен высвободить колесо 50. Второй зубец 88, который больше по размеру (например, по длине и/или ширине) требует значительно большей пары сил для того чтобы пройти, и, таким образом, определяет остановку для предотвращения отсоединения держателя пипетки 36 от основания 34, до тех пор пока пользователь не применяет силу, способную сломать этот зубец. В качестве варианта, выступ 82 заменяется упором, содержащим шар, который крепится на пружине в гнезде основания. Колесо 84, таким образом, может быть сделано из твердого материала. Действие первого зубца 86 затем толкает шар в его гнездо, таким образом, позволяя зубцу 86 пройти.

В настоящем изобретении описан способ для выделения компонентов, содержащихся в жидком образце, с помощью магнитных частиц, этот способ проводят при помощи системы, которая только что была описана. Способ основан на комбинации держателя пипетки, программируемой электронной пипетки и конусов пипетки (например, с объемом 1250 мкл) для того чтобы проводить различные этапы захвата, промывания и элюирования магнитных частиц для обработки объема образца в расчете на конус пипетки от 1 мл до 5 мл. Захват магнитных частиц проводят последовательно в конусах пипетки во время циклов всасывания/слива на всем объеме обрабатываемого образца. В качестве примера, способ для очистки вирусных нуклеиновых кислот с использованием химии NucliSENS©, а именно, выделение нуклеиновых кислот при помощи магнитных частиц диоксида кремния, описан на блок-схеме фигуры 8.

Способ начинается с этапа подготовки 100 различных образцов и реагентов, необходимых для очистки, с последующей указанной очисткой в 102.

В частности, подготовка 100 в 104 состоит из смешивания биологического образца, содержащего вирусы, из которых необходимо выделить нуклеиновые кислоты, с реагентом для химического лизиса вирусов (например, реагентом для лизиса «Nuclisens miniMAG» от bioMérieux, каталожный номер 200292, или реагентом для лизиса «Nuclisens easyMAG» от bioMérieux, каталожный номер 280130), в пропорции два объема реагента для лизиса на один объем образца. Смесь затем нагревают в течение 30 минут при 56°C, таким образом, высвобождая нуклеиновые кислоты из вирусов известным способом. Магнитные частицы диоксида кремния (например, частицы с парамагнитной, ферромагнитной или ферримагнитной сердцевиной, которые могут проявлять или не проявлять остаточный магнетизм, при этом указанная сердцевина покрыта оболочкой из диоксида кремния), которые имеют свойства связываться с нуклеиновыми кислотами, затем вводят, в 106, в лизированный образец.

Подготовка 100 продолжается в 108 заполнением микропланшета 18a с лунками 62 по 5 мл, и ПЦР-пробирок для элюирования 69 по 0,2 мл из магнитной подставки 18b, таким образом что:

каждую лунку 66 первого ряда микропланшета 18a заполняют лизированным образцом, содержащим частицы диоксида кремния, далее в настоящем документе «лизированный образец». Общий объем в каждой лунке первого ряда предпочтительно больше чем 1,5 мл, из-за использования микропланшета с глубокими лунками по 5 мл и объемов, которые обрабатываются электронной пипеткой;

каждую лунку 66 второго ряда микропланшета 18a заполняют 1250 мкл буфера для промывания (например, «NucliSENS easyMAG Extraction Buffer No.2» от bioMérieux, каталожный номер bMx 280131);

каждую лунку 66 третьего ряда микропланшета 18a заполняют 1250 мкл буфера для промывания (например, «NucliSENS easyMAG Extraction Buffer No.2» от bioMérieux, каталожный номер bMx 280131);

каждую ПЦР-пробирку для элюирования 69, вставленную в магнитную подставку 18b заполняют 100 мкл буфера для элюирования (например, «NucliSENS easyMAG Extraction Buffer No.3» от bioMérieux, каталожный номер 280132).

Пользователь затем помещает:

электронную пипетку 12 с рядом конусов 20 в гнездо 38 держателя пипетки 14 в поднятом положении, таким образом, чтобы позволить вставку планшета 18a; и

планшет 18a в гнездо 56 основания 34 с первым рядом лунок, содержащих лизированный образец напротив конусов 20.

Выделение 102 начинается с гомогенизации лизированного образца. Для этого магнитную часть 16 не помещают в основание 34 и она, таким образом, не мешает конусам 20. Пользователь поворачивает одно из колес 50 таким образом, чтобы погрузить наконечники 21 конусов 20 в ряд лунок планшета 18a, содержащих лизированный образец. Пользователь затем выбирает при помощи интерфейса 24 пипетки 12 первый протокол для пипетирования, содержащий, по меньшей мере, один фазу всасывания/слива лизированного образца в конусах 20, и запускает выбранный протокол. Каждая из этих фаз (например, две из них) включает, по меньшей мере, один цикл всасывания/слива (например, пять циклов), с последующим периодом ожидания в несколько минут, например, 5 минут. Для целей изобретения цикл всасывания и слива состоит из заполнения, по меньшей мере, три четвертей, например, полного заполнения, конусов, а затем их полного опустошения, если не указано иначе в программе.

После завершения гомогенизации конусы 20 пустые, и их наконечники 21 погружены в лунки, содержащие лизированный образец. Очистка 102 продолжается захватом, в 112, частиц диоксида кремния из лизированного образца на внутренней стенке конусов 20. Для этого пользователь помещает магнитную часть 16 в гнездо 78 основания 34, выбирает при помощи интерфейса 24 пипетки 12 второй протокол для пипетирования, а затем запускает выбранный протокол. Второй протокол включает множество циклов всасывания/ожидания/слива, например, приблизительно десять циклов, при этом операцию всасывания отделяют от операции слива несколько секунд, например, приблизительно, десять секунд. При каждой операции всасывания и каждой операции слива часть частиц, содержащихся в лизированном образце, захватывается на стенку конусов пипетки посредством магнитного поля, производимого магнитной частью 16. Магнитные частицы, и, таким образом, также связанные с ними нуклеиновые кислоты, захватываются в форме осадков частиц 100, обращенных к магнитной части 16, и предпочтительно в центральной зоне на пол-пути вверх в конусах 20, как показано на фигуре 9.

Как только захват завершен, лизированный образец полностью удален из конусов 20, а магнитная часть 16 все еще находится в положении, очистка 102 продолжается первым этапом промывания 114. С этой целью, пользователь поднимает держатель пипетки 14 (соответственно, поднимает пипетку 12) таким образом, чтобы высвободить планшет 18a из конусов 20, выравнивает второй ряд планшета 18a с рядом конусов 20, затем возвращает на место держатель пипетки (соответственно, опускает пипетку) таким образом, что наконечники 21 конусов погружаются в лунки планшета 18a. Пользователь затем выбирает при помощи интерфейса 24 третий протокол для пипетирования, содержащий, по меньшей мере, одну фазу всасывания/слива лизированного образца в конусах 20, затем запускает выбранный протокол. Третий протокол, например, идентичен первому протоколу. Повторное прохождение буфера для промывания через осадки частиц, таким образом, позволяет промывать указанные частицы. Этот этап промывания преимущественно завершается, или проводится вместе с модулированием магнитного поля, захватывающего частицы на конусах. Например, пользователь поднимает и опускает пипетку 12, что воздействует на движение осадков частиц в конусах, или альтернативно магнитная часть 16 содержит набор постоянных магнитов, и пользователь сдвигает магнитную часть 16, движениями вверх и вниз, от ее гнезда 78, таким образом, что интенсивность и линии магнитного поля, захватывающего осадки, варьируют, с одновременным сохранением частиц, захваченных на конусах. Модулирование магнитного поля, таким образом, оказывает воздействие на реорганизацию осадков во время промывания, и повышает его эффективность.

Затем проводят операцию второго промывания в 116 при помощи буфера для промывания из третьего ряда планшета 18a. Например, первый буфер для промывания полностью удаляют из конусов, затем проводят операцию второго промывания, идентичную операции первого промывания.

После операции второго промывания проводят этап миграции 118 осадков частиц 200 в наконечниках 21 конусов 20. Для этого конусы 20 предпочтительно оставляют заполненными вторым буфером для промывания для того чтобы облегчить скольжение осадков 200, и оставляют выровненными со вторым рядом планшета 18a. Пользователь затем поворачивает одно из колес 50 таким образом, чтобы поднять пипетку 12. Поскольку магнитная часть 16 жестко соединена с основанием 34, осадки, таким образом, остаются неподвижными относительно указанной части и мигрируют в направлении наконечников 21, скользя вдоль стенок конусов 20, поскольку пипетка поднята. Пользователь останавливает подъем пипетки 12 после того как осадки 200 окажутся в наконечниках 21, как показано на фигуре 10, на среднем расстоянии, например, 8 мм, от открытых концов конусов. В этом положении, пользователь выбирает, а затем запускает при помощи интерфейса 24, слив буфера для промывания, содержащегося в конусах 20 в лунки планшета 18a. Необязательно, одна из фаз промывания, или дополнительная фаза промывания, состоит из удаления магнитной части для того чтобы высвободить магнитные частицы и для проведения операции промывания с одновременным перемешиванием частиц в растворе для промывания при помощи циклов всасывания и слива. Частицы затем захватываются еще раз путем возвращения на место магнитной части и проведения циклов всасывания и слива, как описано ранее.

Очистка 102 заканчивается этапом 120 переноса магнитных частиц, присутствующих в наконечниках 21 конусов 20, в ПЦР-пробирки для элюирования 69. Для этого пользователь поднимает держатель пипетки 14, убирает планшет 18a, помещает магнитную подставку 18b в гнездо 56, таким образом, выравнивая ПЦР-пробирки 69 с рядом конусов 20, останавливает держатель пипетки 14 и удаляет магнитную часть 16 из основания 14 для того чтобы высвободить захваченные магнитные частицы из конусов. После того как наконечники 21 будут погружены в пробирки 69, пользователь выбирает при помощи интерфейса 24 четвертый протокол для пипетирования, затем запускает выбранный протокол. Первый вариант этого протокола состоит из циклов всасывания и слива буфера для элюирования в наконечниках 21 конусов 20, что позволяет ресуспендировать магнитные частицы для того чтобы разбить осадок частиц. Кроме того, частота, выбранная для циклов, позволяет при каждом сбросе в пробирки 69 захватывать некоторые магнитные частицы в пробирках 69 посредством магнитного поля от магнитной части 68, вставленной в подставку 64. Кроме того, эти циклы позволяют «смачивать» наконечники 21 для того чтобы восстанавливать частицы, прикрепленные к стенкам конусов. Во втором варианте протокола, циклы всасывания и слива прежде всего проводят с более высокой частотой, чтобы перемешивать буфер и частицы более интенсивно, и, таким образом, получать ускоренную гомогенизацию, облегчая перенос в пробирки для элюирования 69. Этап переноса заканчивается полным сливом буфера для элюирования в пробирки 69. Под воздействием магнитного поля подставки 64, магнитные частицы затем отделяются от буфера для элюирования, как показано на фигуре 11. Пользователь может, таким образом, восстанавливать пробирки 69 для последующей обработки, в частности, элюирования нуклеиновых кислот путем нагревания общеизвестным способом.

В ранее описанном варианте осуществления держателя пипетки магнитная часть 16 вставлена в основание 34. Таким образом, когда пользователь желает сдвинуть планшет 18a вперед, он может поднять пипетку достаточно высоко для проведения этой операции. Это вызывает, относительно миграции частиц к наконечникам, движение осадков 200 по стенкам конусов 20, что имеет преимущество «реорганизации» осадков, которые могут катиться сами по себе. Эффективность промывания, таким образом, усиливается. С другой стороны, это означает, что пользователь заботится о том, чтобы никогда не поднимать пипетку слишком высоко, чтобы осадки не покинули конусы. Для этого пользователь может, например, поднимать или наклонять держатель пипетки, чтобы сохранять осадки на расстоянии от отверстий конусов. Этот вариант, требующий повторного поднимания устройства, масса которого может быть значительной, может, однако, привести в долгосрочной перспективе к проблемам опорно-двигательного аппарата. Кроме того, пользователь должен также позаботиться о том, чтобы не поднимать держатель пипетки слишком высоко, чтобы осадки не вышли из конусов.

Второй вариант осуществления держателя пипетки по изобретению позволяет манипулировать планшетами 18a, 18b, поднимая только пипетку, и, таким образом, избегая подъема держателя пипетки 14, с одновременной гарантией того, что осадки частиц останутся на расстоянии от наконечников 21 конусов. Этот второй вариант осуществления, и также изменения относительно только что описанного способа, показаны на фигурах 12 и 13.

Более конкретно, второй вариант осуществления отличается от первого варианта осуществления способами вхождения магнитной части 16 в держатель пипетки 14. В частности, основание 34 содержит гнездо 78 для вставки и удаления магнитной части 16, как описано ранее, и гнездо 78 открыто в своей верхней части 130 для того чтобы также было возможно вставлять и удалять часть 16 вертикально в гнездо 78. Штатив для пипетки 36 также содержит приспособления для присоединения магнитной части 16 в одну линию с открытым гнездом 78, в частности одного или нескольких блоков 132, сделанных из намагниченного материала (например, сделанных из стали), присоединенных к задней стенке 134 мобильного штатива для пипетки 36 (фигура 12C). Таким образом, магнитная часть 16 жестко соединена с мобильным штативом 36 и остается обращенной к конусам 20, когда пользователь поднимает и опускает пипетку (в частности, во время фаз промывания), как показано на фигурах с 12B до 13A.

Для того чтобы проводить миграцию осадков 200 в наконечники конусов 20, пользователь отсоединяет магнитную часть 16 от штатива для пипетки 36, прилагая простое нажатие вниз на рукоятку 78 части 16, и поднимает пипетку 12. Магнитная часть 16 отсоединяется от блоков 134, таким образом, остается в гнезде 78 основания и, таким образом, жестко соединена с основанием 34, индуцируя движение осадков 200 в наконечники 21 конусов, как описано ранее (фигуры 13A и 13B). После того как пипетка поднята, пользователь заменяет планшет 18a подставкой 18b, снабженной ПЦР-пробирками для элюирования, удаляет магнитную часть 16 и опускает пипетку (фигура 13C, пробирки 69 не представлены). В качестве варианта, штатив для пипетки 36 может содержать гнездо, аналогичн гнезду 78 основания, в которое пользователь задвигает магнитную часть, в частности, для фаз промывания.

Был описан конкретный способ выделения. Однако, настоящее изобретение применимо к любому типу захвата магнитных частиц и к любому типу последовательностей пипетирования. Аналогично, была описана восьмиканальная пипетка с конкретным объемом. Пипетка может иметь любое число каналов любого объема в зависимости от предполагаемого применения.

Для того чтобы увеличить число обрабатываемых образцов, можно соединять две системы для выделения по изобретению, как показано на фигуре 14. Например, рукоятки для вращения 50 можно соединить вместе таким образом, что два выделения можно проводить одновременно, при этом пользователь поднимает и опускает пипетки 12 одновременно. С этой целью, пипетки можно также синхронизировать, при этом одна пипетка контролирует, например, другую пипетку.

Аналогичным образом была описана переносная и полуавтоматическая система выделения, в частности, подходящая для испытательных лабораторий, с ограниченным количеством выделений, которые должны выполняться ежедневно. Однако, изобретение может быть автоматизировано. Например, пипетка интегрирована в автоматизированное устройство, которое содержит программируемые механизмы для подъема и опускания пипетки и для перемещения магнита (или для активации/дезактивации электромагнитов).

Были описаны две операции промывания в лунках второго ряда и третьего ряда микропланшета 18a. Однако число операций промывания может быть любым. Аналогично, описан один этап захвата частиц в конусах. Могут также быть предусмотрены один или несколько этапов высвобождения частиц, каждый с последующим дополнительным этапом захвата.

Для высвобождения частиц, магнитное поле для захвата частиц деактивируется удалением магнитной части 16 из его гнезда, затем циклы всасывания/слива буфера выполняются в конусах пипетки, чтобы отсоединить осадки частиц от стенок конусов и дезагрегировать их. Такая процедура занимает более 10 минут, чтобы полностью отсоединить осадки со стенок конусов, с частотой всасывания/слива (полного всасывания и слива в конусах) 5 циклов за минуту. Со ссылкой на фигуру 15, более быстрое высвобождение осадка 200 получается путем проведения на осадке 200 движения мениска 300 вверх и вниз, который буфер 302 образует в конусе 20. В частности, цикл всасывания/слива регулируется таким образом, что мениск 300 перемещается по ограниченному пути 304 по обе стороны от осадка 200, чтобы увеличить частоту, с которой мениск проходит над осадком. Аналогично, частота циклов всасывания/слива увеличивается, чтобы дополнительно повысить указанную частоту прохождения, в частности, частота цикла более двух циклов в секунду в зоне, где присутствует осадок магнитных частиц. Когда используется эта процедура, осадки отсоединяются от конуса менее чем за одну минуту. Авторы изобретения отметили, что это прохождение мениска над осадком помогает его отделить. Фактически, тесты были проведены путем быстрого перемешивания буфера в конусах без прохождения менисков над осадками (т.е. «простого» движения жидкости перед осадками) без какой-либо заметной экономии времени. После того, как была проведена фаза высвобождения осадка, при этом указанная фаза также имеет эффект дезагрегации осадков, в конусах проводят фазу перемешивания путем полного всасывания/слива (например, 8 циклов всасывания/слива за минуту), чтобы закончить дезагрегацию осадков и гомогенизировать буфер, содержащий частицы. Эти полные циклы всасывания/слива в лунки микропланшета перемешивают больший объем на более длинном пути, тем самым облегчая гомогенизацию буфера.

Теперь будет дано описание предпочтительного способа выделения нуклеиновых кислот (например, ДНК и РНК), в частности вирусного происхождения, например при помощи магнитных частиц диоксида кремния. Этот способ включает фазу высвобождения частиц, например, как описано ранее, с последующей фазой промывания в буфере и повторного захвата частиц. За счет улучшенного выделения происходит заметная экономия времени. В частности, этот способ включает, после проведения этапа лизиса вируса:

1. Первый этап захвата магнитных частиц в конусах пипетки, например, ранее описанным способом;

2. Последующий этап первого промывания, и предпочтительно, по меньшей мере, один этап второго промывания, в различных рядах микропланшета, которые заполнены буфером для промывания (например, «NucliSENS easyMAG Extraction Buffer No. 1» от bioMérieux, каталожный номер 280130). Каждая операция промывания включает циклы всасывания/слива буфера для промывания с частицами, захваченными на конусах пипетки, и длится, по меньшей мере, 15 секунд, предпочтительно, от 25 секунд до 35 секунд, например, 30 секунд, и предпочтительно, менее чем одну минуту;

3. По меньшей мере, один этап третьего промывания в третьем ряду микропланшета 18a, заполненного буфером для промывания (например, «NucliSENS easyMAG Extraction Buffer No. 2» от bioMérieux, каталожный номер bMx 280131). Во время этого этапа третьего промывания, частицы освобождают путем удаления магнита, для того чтобы ресуспендировать частицы, при этом буфер с частицами в суспензии всасывают/сливают в соответствующие лунки микропланшета 18a. Этап третьего промывания, предпочтительно содержащий фазу прохождения менисков над осадками, как описано ранее, длится несколько минут, в частности 5 минут;

4. Второй этап захвата частиц на конусах пипетки, например, как описано ранее;

5. Необязательно, этап четвертого промывания, при этом частицы захвачены в третьем ряду микропланшета 18a, заполненный буфером для промывания (например, «NucliSENS easyMAG Extraction Buffer No. 2» от bioMérieux, каталожный номер bMx 280131);

6. Этап миграции осадков частиц в наконечники, с последующим этапом переноса в пробирки (например, содержащие буфер для элюирования, например «NucliSENS easyMAG Extraction Buffer No. 3» от bioMérieux, каталожный номер 280132), например, как описано ранее.

Был описаны буферы для промывания линейки NucliSens, в частности, буферы для выделения № 1, № 2 и № 3. В более общем смысле:

буфер для выделения № 1 представляет собой буфер, который способствует захвату нуклеиновых кислот на диоксид кремния за счет создания мостиков между силанольными группами диоксида кремния и фосфатными группами нуклеиновых кислот. Он состоит, например, из гуанидин изотиоцианата, а именно, из разобщающего агента, как описано в документе от R. Boom et al. «Rapid and simple method for purification of nucleic acids» Journal of Clinical Microbiology. 1989; 28 (3): 495-503;

операции первого и второго промывания позволяют удалить остатки матрицы или остатки микроорганизмов,

операции третьего и четвертого промывания позволяют удалить следы GuSCN и ингибиторов амплификации ПЦР-типа, которую обычно затем проводят на ДНК/РНК, захваченных магнитными частицами,

буфер для элюирования, содержащийся в ПЦР-пробирках позволяет удалить любой след буфера для промывания и создать оптимальные условия для этапа элюирования.

Следующая таблица сравнивает результаты, полученные с устройством по изобретению с применением протокола, который только что был описан (2 операции первого промывания с последующей операцией третьего промывания с высвобождением частиц), по сравнению с результатами, полученными с устройством известного уровня техники, а именно, MiniMag®, которое продается компанией bioMérieux и считается референсным устройством для выделения вирусной РНК. Протокол для MiniMag® включает четыре этапа промывания буферами для промывания (два с «NucliSENS easyMAG Extraction Buffer No. 1» и два с «NucliSENS easyMAG Extraction Buffer No. 2»). Для того чтобы определить эффективность выделения, проводят амплификацию выделенного лизата путем ПЦР в реальном времени (или «РВ-ПЦР») и измеряют Ct каждого образца («пороговый цикл», который количественно измеряет порог детекции нуклеиновой кислоты в образце). Образцы, которые тестируют в двух повторениях, представляют собой образцы малины и зеленого лука весом 25 грамм, к которым добавляют раствор вируса Менго, который или чистый (соответствует 500 копиям генома на 25 грамм), или растворен 1/10.

Изобретение (величина Ct) MiniMag® (величина Ct) Образец Малина Зеленый лук Малина Зеленый лук Менго чистый 25,72 26,29 25,87 25,55 24,86 25,06 1/10 27,87 28,61 28,06 27,95 28,01 27,81 Менго чистый 26,05 26,11 25,82 25,87 24,93 24,99 1/10 28,23 28,44 27,59 28,13 28,06 27,76

Как можно видеть, выделение вирусной РНК по изобретению дает результаты, сходные с результатами, полученными с использованием MiniMag®. Кроме того, проводили тесты с различными партиями магнитных частиц диоксида кремния различного качества. Было отмечено, что выделение по изобретению оказалось неожиданно очень надежным в отношении качества указанных частиц. В частности, тесты проводили на одинаковых образцах с партией частиц с более низкой производительностью, при этом выделение не включало этап высвобождения/промывания/повторного захвата, как описано ранее. В этом случае, степень выделения была ниже. При использовании ранее описанного предпочтительного способа с дефектными частицами, получали результаты, аналогичные результатам в предшествующей таблице.

Было описано применение по изобретению для захвата нуклеиновых кислот, например, РНК и/или ДНК, полученных из лизиса, проведенного перед фазами захвата/промывания/миграции и переноса. Изобретение также применимо для захвата микроорганизмов (например, бактерий, грибов, дрожжей) при помощи магнитных частиц, поверхность которых функционализирована для захвата микроорганизмов (например, покрыта фаговыми белками или поликатионами, подходящими для такого захвата известным образом). Магнитные частицы с захваченными микроорганизмами переносят в пробирки для того, чтобы подвергнуть лизису, например механическому лизису. Полученный лизат может непосредственно быть объектом обработки, например, для амплификации путем полимеразной цепной реакции (например, количественной ПЦР типа кПЦР), или его можно очищать в соответствии с вышеописанным способом выделения нуклеиновых кислот.

Изобретение особенно подходит для получения микробного образца для целей ПЦР. Фактически, образец, на котором проводят захват частиц в конусы пипетки, может иметь очень большой объем (например, несколько миллилитров), в то время как конечный объем пробирок, в которые переносят частицы, может быть очень маленьким (например, менее чем или равный 200 микролитров, или даже менее чем или равный 100 микролитрам). Из-за большого объема образца захватывается большое количество микроорганизмов. Переход к очень маленькому конечному объему приводит к концентрированию микроорганизмов. Таким образом, авторы изобретения заметили, что одной фазы захвата из образца в несколько миллилитров, с последующим одним этапом промывания, достаточно для получения результатов путем кПЦР из лизиса, который проводят в объеме 5 микролитров.

В частности, обогащение пищевой матрицы (куриное плечо) питательным бульоном проводили в течение пяти часов при 41,5°C. Последующее заражение штаммом Salmonella Derby проводят с концентрацией от 10² до 10⁴ КОЕ/мл, которая соответствует концентрациям, которые достигаются при обогащении в присутствии патогена в пищевой матрице (т.е. концентрации, при которых партию еды определяют как непригодную для потребления). Проводили две процедуры, в двух повторениях, на каждом зараженном образце, одну в соответствии со стандартным протоколом захвата с системой Gene-up® от bioMérieux, Франция, и одну - по изобретению.

Протокол Gene-up® состоит из этапа «разбивания гранулами» образца (т.е. механического разрушения стенки бактерий), при этом берут 20 мкл указанного образца и помещают в пробирку для разьивания гранулами, содержащую 180 мкл буфера для промывания, с последующим встряхиванием в течение 5 минут на шейкере для микропланшетов для разбивания гранулами. Берут 5 микролитров конечного раствора и проводят кПЦР.

Способ по изобретению, со своей стороны, состоит из:

1. этапа специфического захвата посредством контакта 2 мл образца с раствором биотинилированного фагового белка (конечная концентрация 2 мкг/мл) путем:

a. перемешивания за счет всасывания/сброса в конусах пипетки в течение 10 минут;

b. добавления магнитных частиц «Hyglos Streptavidin» (50 мкл) и перемешивания за счет всасывания/слива в течение 15 минут (комплексы бактерии-биотинилированный фаговый белок связываются с магнитными частицами);

c. установки на место магнита для фазы сбора магнитных частиц в конусах;

d. запуска цикла захвата магнитных частиц;

2. этапа промывания в лунках, содержащих раствор для промывания TST (Трис-физиологический раствор-Твин) с пятью циклами всасывания/слива;

3. этапа сбора магнитных частиц в пробирки на 5 микролитров, которые подвергают обработке разбивания гранулами, на конечном растворе объемом 5 микролитров затем проводят кПЦР.

Результаты, полученные согласно протоколу Ген-up® и по изобретению, обобщены в таблице ниже:

Концентрация Изобретение (величина Ct) Gene-up® (величина Ct) 10² КОЕ/мл 35,2 Ct отсутствует 35 Ct отсутствует 10³ КОЕ/мл 33,8 Ct отсутствует 33,8 Ct отсутствует 10⁴ КОЕ/мл 29,5 34,9 29,7 Ct отсутствует

Расчетное усиление чувствительности составляет 2 log по сравнению со стандартным протоколом Ген-up.

Настоящее изобретение отвечает на проблему многозадачности для использования различных способов магнитного захвата (очистка нуклеиновых кислот, магнитная иммуноконцентрация, и т.д.). Система по изобретению, которая является развивающейся и регулируемой, позволяет:

проводить этапы захвата/промывания/элюирования магнитных частиц с использованием автономной системы, состоящей из комбинации программируемой электронной пипетки и штатива, позволяющей проводить различные вышеупомянутые этапы;

обрабатывать ряд образцов от 1 до 8 как функцию конфигурации используемой электронной пипетки;

обрабатывать образцы параллельно, в контексте, определенном выше, с помощью полуавтоматической системы;

комбинировать две системы при необходимости увеличения числа образцов для обработки;

позволяет проводить этапы элюирования в различных типах пробирок: ПЦР-пробирках на 0,2 мл для восстановления магнитных частиц диоксида кремния, когда включен захват нуклеиновых кислот (например, химия NucliSENS©) или дажe пробирок для разбивания гранулами в случае восстановления магнитных частиц, использованных для восстановления патогенов (магнитная иммуноконцентрация). С этой целью, система позволяет проводить этапы захвата/концентрации патогенов на магнитных частицах и их лизис in situ при помощи керамических/стеклянных гранул (например, способ типа CapLyse©).

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ выделения содержащихся в биологическом образце в жидкой форме компонентов, держатель пипетки и система для выделения компонентов. Способ включает смешивание образца с магнитными частицами, всасывание смеси из лунки в содержащий наконечник трубчатый конус пипетки, захват магнитных частиц на внутреннюю стенку конуса пипетки, промывание захваченных частиц, миграцию магнитных частиц из зоны захвата к наконечнику конуса пипетки и перенос мигрировавших магнитных частиц в лунку для восстановления. Система содержит пипетку, штатив для лунок и держатель пипетки и магнитную часть. Держатель пипетки содержит основание, выемку в основании для съемного вмещения штатива для лунок, штатив для пипетки, имеющий первое гнездо для вставки пипетки, и второе гнездо для съемного удержания магнитной части. Изобретения обеспечивают использование жидких образцов при выделении компонентов с объемом до 10 мл. 3 н. и 27 з.п. ф-лы, 15 ил., 2 табл.

1. Способ выделения компонентов, содержащихся в биологическом образце в жидкой форме, при этом компоненты способны связываться с магнитными частицами, при этом способ включает:

стадию (106) смешивания образца с магнитными частицами;

стадию (110) всасывания полученной смеси из лунки в трубчатый конус пипетки (20), содержащий наконечник (21), предназначенный для пипетирования жидкости;

стадию захвата (112) магнитных частиц на внутреннюю стенку конуса пипетки (20):

путем приложения первого магнитного поля (16) к конусу пипетки (20), при этом магнитное поле приводит к притягиванию и удерживанию магнитных частиц в заданной зоне конуса пипетки (20), называемой зона «захвата», выше наконечника конуса;

и путем выполнения по меньшей мере одного цикла всасывания и слива смеси, содержащейся в конусе пипетки (20), в лунку (62);

по меньшей мере одну стадию (114, 116) промывания частиц, захваченных на внутренней стенке конуса пипетки (20) при помощи:

слива смеси, содержащейся в конусе пипетки (20); и

выполнения по меньшей мере одного цикла всасывания и слива раствора для промывания в конусе пипетки (20) из лунки (62), содержащей раствор для промывания;

стадию (118) миграции магнитных частиц на внутренней стенке конуса пипетки (20) из зоны захвата к наконечнику (21) конуса пипетки (20), путем осуществления относительного перемещения конуса пипетки (20) относительно первого магнитного поля (16);

и стадию (120) переноса магнитных частиц, мигрировавших в наконечник (21) конуса пипетки (20) в лунку для восстановления (69), содержащую элюирующий раствор.

2. Способ по п.1, где перемещение первого магнитного поля (16) состоит из перемещения конуса пипетки (20) параллельно продольной оси (Х) конуса (20) и из сохранения первого магнитного поля (16) постоянным, при этом продольная ось (Х) конуса пипетки (20) остается на одинаковом расстоянии от первого магнитного поля (16) во время движения конуса пипетки (20).

3. Способ по п.1 или 2, где стадия переноса (120) включает:

размещение наконечника (21) конуса пипетки (20) в лунке для восстановления (69);

и приложение второго магнитного поля (68) от дна лунки для восстановления (69) таким образом, чтобы вызвать миграцию магнитных частиц, содержащихся в наконечнике (21) конуса пипетки (20), в лунку для восстановления (69).

4. Способ по п.3, где второе магнитное поле (68) производится магнитом, который частично или полностью расположен под наконечником конуса пипетки.

5. Способ по п.3 или 4, где первое магнитное поле, прилагаемое к конусу пипетки, деактивируют во время приложения второго магнитного поля.

6. Способ по любому из пп. 3-5, где стадия переноса (120) включает в себя деактивацию первого магнитного поля (16) с последующим применением циклов всасывания и слива раствора из лунки для восстановления (69) в наконечнике (21) конуса пипетки, при этом указанное применение состоит из:

первой стадии применения циклов с первой частотой;

с последующей второй стадией применения циклов со второй частотой, более низкой, чем первая частота.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, включающий перед фазой захвата (112) стадию перемешивания смеси, содержащейся в конусе пипетки, путем применения по меньшей мере одного цикла всасывания и слива смеси в конусе пипетки.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, включающий перед стадией переноса (120) по меньшей мере одну стадию промывания частиц, захваченных на внутренней стенке конуса пипетки, путем:

a) деактивации магнитного поля;

b) высвобождения захваченных частиц с применением из лунки, содержащей раствор для промывания, по меньшей мере одного цикла всасывания и слива раствора для промывания в конусе пипетки;

c) применения второй стадии захвата на внутреннюю стенку конуса пипетки:

путем приложения первого магнитного поля к конусу пипетки

и путем применения по меньшей мере одного цикла всасывания и слива смеси, содержащейся в конусе пипетки, в лунке, содержащей раствор для промывания.

9. Способ по п.8, где высвобождение захваченных частиц включает стадию применения циклов таким образом, чтобы проводить перемещение вверх и вниз мениском раствора над осадком частиц, захваченных в конус пипетки; указанные перемещения вверх и вниз мениска проводят в участке конуса, меньшем, чем общая длина конуса пипетки.

10. Способ по п.9, где высвобождение захваченных частиц включает вторую стадию применения циклов таким образом, чтобы проводить в конусе полное всасывание и слив раствора для промывания.

11. Способ по п.10, где частота применения циклов второй стадии ниже, чем частота применения циклов первой стадии.

12. Способ по любому из пп. 8-11, где перед высвобождением захваченных частиц способ включает по меньшей мере две стадии промывания, которые проводят в двух отдельных растворах для промывания.

13. Способ по любому из пп. 8-12, где компоненты, содержащиеся в биологическом образце, представляют собой нуклеиновые кислоты.

14. Способ по любому из пп. 1-7, где компоненты, содержащиеся в биологическом образце, представляют собой микроорганизмы, и где способ включает одну стадию захвата и одну стадию промывания.

15. Способ по п.14, в котором смесь образца с магнитными частицами имеет объем больше чем один миллилитр, и предпочтительно больше чем или равный двум миллилитрам, и объем лунки для восстановления менее чем или равный 200 микролитрам и предпочтительно менее чем или равный 100 микролитрам.

16. Способ по любому из предшествующих пунктов, включающий перед стадией переноса (120) по меньшей мере одну стадию промывания частиц, захваченных на внутренней стенке конуса пипетки:

путем всасывания раствора для промывания в указанный конус пипетки;

затем путем изменения первого магнитного поля, применяемого к магнитным частицам для того, чтобы захватить указанные частицы на внутреннюю стенку конуса пипетки;

затем путем слива жидкости для промывания из конуса пипетки.

17. Способ по п.16, где изменение первого магнитного поля проводят:

перемещая конус пипетки параллельно продольной оси указанного конуса и сохраняя первое магнитное поле неизменным;

и/или путем прохождения магнитов, пространственно отделенных друг от друга напротив захваченных частиц.

18. Способ по любому из предшествующих пунктов, где объем конуса пипетки по меньшей мере в десять раз больше, чем объем лунки для восстановления.

19. Способ по любому из предшествующих пунктов, где объем смеси по меньшей мере в три раза больше, чем объем конуса пипетки.

20. Способ по любому из предшествующих пунктов, где компоненты относятся к группе, образованной нуклеиновыми кислотами, микроорганизмами, белками и пептидами.

21. Держатель пипетки (14), используемый в способе выделения по пп.1-20, причем указанный держатель содержит:

основание (34);

выемку (56), обеспеченную в основании (34), выполненную с возможностью съемного вмещения штатива для лунок (18a, 18b);

штатив для пипетки (36), содержащий первое гнездо (38), при этом пипетка (12) выполнена с возможностью вставки в гнездо (38), причем пипетка (12) снабжена по меньшей мере одним трубчатым конусом пипетки (20), содержащим наконечник (21), предназначенный для пипетирования жидкостей; при этом первое гнездо (38) открыто наружу относительно выемки (56) основания, причем штатив для пипетки (36) выполнен с возможностью поступательного перемещения относительно основания (34) в направлении, параллельном оси (X) конусов пипетки (20), и перемещения между первым положением, в котором наконечник (21) каждого конуса пипетки (20) введен в лунку (62, 69) в штативе для лунок (18a, 18b), и по меньшей мере одним вторым положением, в котором наконечник (21) находится вне лунки (62, 69);

второе гнездо (78), выполненное с возможностью съемного удержания магнитной части (16), причем второе гнездо (78) обращено к каждому из конусов пипетки (20) в положении над его наконечником, когда штатив для пипетки (36) находится в первом положении, причем второе гнездо (78) обращено к наконечнику конуса пипетки (20), когда штатив для пипетки (36) находится во втором положении.

22. Держатель пипетки по п.21, в котором первое гнездо (38) содержит отверстие для фронтальной вставки пипетки (12) и фронтального удаления пипетки (12) из первого гнезда (38).

23. Держатель пипетки по п. 21 или 22, в котором второе гнездо (78) выполнено в основании (36).

24. Держатель пипетки по любому из пп. 21-23, содержащий третье гнездо в штативе для пипетки (36), в котором выполнена с возможностью вставки удаляемым образом магнитная часть (16) с тем, чтобы быть обращенной к каждому из конусов пипетки (20) в положении над наконечником (21) конуса, когда штатив для пипетки (36) находится во втором положении.

25. Держатель пипетки по п.24, в котором второе и третье гнезда находятся в связи друг с другом, причем штатив для пипетки содержит средство, выполненное с возможностью поддержания удаляемым образом магнитной части в третьем гнезде с возможностью съема.

26. Держатель пипетки по любому из пп. 21-25, в котором:

основание (34) содержит по меньшей мере одно выполненное с возможностью вращения зубчатое колесо (42);

при этом штатив для пипетки содержит рейку (40) в зацеплении с зубчатым колесом (42) для поступательного перемещения штатива для пипетки (36) относительно основания (34) во время вращения зубчатого колеса.

27. Держатель пипетки по п.26, содержащий устройство для блокировки и разблокировки штатива для пипетки (82) по меньшей мере в первом положении.

28. Держатель пипетки по любому из пп.26 и 27, содержащий по меньшей мере одну рукоятку (50), которая жестко соединена с зубчатым колесом для поворота колеса и выполнена с возможностью присоединения с возможностью съема к рукоятке (50), которая жестко соединена с зубчатым колесом другого держателя пипетки.

29. Система для выделения компонентов, содержащихся в биологическом образце в жидкой форме, при этом компоненты способны связываться с магнитными частицами, причем система выполнена с возможностью использования в способе выделения по пп.1-20, причем система содержит:

пипетку (12), снабженную по меньшей мере одним трубчатым конусом пипетки (20), содержащим наконечник (21), предназначенный для пипетирования жидкостей и с системой для всасывания и слива в каждом конусе пипетки (20);

по меньшей мере один штатив для лунок (18a, 18b);

держатель пипетки (14), содержащий:

основание (34);

выемку (56), обеспеченную в основании (34), выполненную с возможностью вмещения с возможностью удаления каждого штатива для лунок;

штатив для пипетки (36), содержащий первое гнездо (38), в которое вставлена пипетка (12), при этом первое гнездо (38) открыто наружу относительно выемки (56) основания (34), при этом штатив для пипетки (36) выполнен с возможностью поступательного перемещения относительно основания (34) в направлении, параллельном оси (Х) конусов пипетки (12), и с возможностью перемещения между первым положением, в котором наконечник (21) каждого конуса пипетки (36) введен в лунку (62, 69) в штативе для лунок (18a, 18b), и по меньшей мере одним вторым положением, в котором указанный наконечник (21) находится вне указанной лунки (62, 69);

второе гнездо (78), обращенное к каждому из конусов пипетки (20) в положении над его наконечником (21), когда штатив для пипетки находится в первом положении, при этом второе гнездо обращено к наконечнику конуса пипетки, когда штатив для пипетки находится во втором положении; и

магнитную часть (16), вставленную удаляемым образом во второе гнездо (78).

30. Система по п.29, в которой держатель пипетки соответствует держателю пипетки по любому из пп. 21-28.