СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ВНЕСЕНИЯ ГРИБНОГО БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ Российский патент 2020 года по МПК C12N15/11 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии, в частности к методам использования существующих в природе консортивных взаимоотношений высших растений и микроскопических грибов. Способ производства суспензии грибов Fusarium equiseti и Cylindrocarpon magnusianum, а также способ ее применения могут быть использованы для заражения растений в период пикировки или на стадии сеянцев растений в условиях открытого и защищенного грунта, при посеве газонных трав, в том числе на биологическом этапе рекультивации нарушенных земель, при биоремедиации загрязненных земель, при выращивании посадочного материала древесных и травянистых растений для целей зеленого строительства городов, создания защитных насаждений, при лесной рекультивации. Изобретение относится к экологически ориентированным способам повышения устойчивости растений.

Известны препараты, стимулирующие развитие и рост растений, полученные из чистых культур грибов-эндофитов, выделенных из корней пшеницы, овса, картофеля, пырея, мать-и-мачехи. Каждый препарат состоит из растворенных в 70% этиловом спирте продуктов метаболизма соответствующего ему эндофита. Обработка одним из указанных препаратов семян пшеницы, огурцов или клубней картофеля перед посевом способствует повышению урожая /Гельцер Ф.Ю. Новые продуценты стимулирующих веществ для растений. Доклады ВАСХНИЛ, №5, 1975/. Однако высокое содержание спирта в препарате затрудняет его использование с живыми растениями.

Известно сообщество микроорганизмов для получения регуляторов роста растений, состоящее из микромицета Acremonium panaxeorum UHMU F-160, дрожжей Candida muscorum UHMU Y-411, Rhodotorula glutinis UHMU Y-42 и бактерий Azomonas macrocytogenes UHMU B-28 и Xantobacter sp. UHMU B-29 /пат. РФ 2100932/. Недостатком указанного сообщества является сложность и трудоемкость его культивирования, нестабильность полученного препарата.

Известны и другие бактериальные препараты, например, бактофит на основе штамма Bacillus subtilis ИПМ-215 [Патент РФ №2019966, МПК A01N 63/00, опубл. 1994]. Недостатками бактофита являются ограниченная область применения, отсутствие в доступных источниках информации данных об оздоравливающем эффекте на растения при бактериальном поражении, эффективном защитном действии против болезней в условиях открытого грунта и способности к азотфиксации и фосфатмобилизации. Кроме того, состав препарата многокомпонентен, технология получения препарата многостадийна и сложна.

Известен препарат на основе Azotobacter chroococcum BH-1811 [Патент РФ №2289620, МПК C12N 1/20, A01N 63/00, C12R 1/065, опубл. 2006], предназначенный для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям. Недостатком препарата является низкая эффективность действия против грибных и бактериальных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и отсутствие способности к фосфатмобилизации. Предлагаются также биопрепараты на основе ассоциации микроорганизмов разной систематической принадлежности. Например, препарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней Экстрагран [Патент РФ №2302114, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, C12R 1/065, C12R 1/07, опубл. 2007], содержащий штаммы Bacillus mycoides var. B.A. ВНИИСХМ №Д138 и Azotobacter vinelandii var. НП ВНИИСХМ №Д24.

Также известен биопрепарат для осенней, весенней и летней обработок почвы, корневой и прикорневой подкормок в период вегетации растений, а также предпосевной обработки семян, представляющий собой смесь суспензий тринадцати различных штаммов [Патент РФ №2322061, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубл. 2008]: Agrobacterium tumefaciens B-4116, Agrobacterium radiobacter B-956, Azotobacter chroococcum B-2375, Bacillus thuringiensis B-2918, Bacillus subtilis B-6554, Bacillus subtilis B-4419, Bacillus megaterium B-4440, Bacillus megaterium B-200, Bradyrhizobium japonicum B-1978, Erwinia ananas B-5292, Lactobacillus casei B-3961, Pseudomonas fluorescens B-l138, Rhodopseudomonas palustris B-1620.

Кроме того, известен биопрепарат для повышения плодородия почвы, ее оздоровления и стимуляции роста растений на основе ассоциации штаммов Bacillus subtilis K-4, Bacillus subtilis Be-12, Bacillus amyloliquefaciens 30-40 с добавлением гидролизата смеси хвойного экстракта и каротиновой пасты [Патент РФ №2314693, МПК A01N 63/02, C12N 1/20, опубл. 2008]. Существенным недостатком препаратов на основе нескольких штаммов бактерий различной таксономической принадлежности является многокомпонентность видового и родового состава микроорганизмов с различными питательными потребностями, требующих как отдельных условий культивирования, так и различных условий среды для максимального проявления свойств. Кроме того, указанные биопрепараты недостаточно эффективны в защите растений против широкого спектра возбудителей заболеваний растений.

Имеется препарат Интеграл [Патент РФ №2216173, МПК A01N 63/00, А01С 1/06, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1:065, опубл. 2003]. В состав препарата входит смесь из культуральной жидкости, содержащей штамм бактерий Bacillus subtilis 24Д (ВНИИСХМ 129) в концентрации 5×109 кл/мл, гуматы и микроэлементы при следующем соотношении компонентов, мас.%: культуральная жидкость - 70-75, гуматы - 20, микроэлементы - 5-10. Существенными недостатками препарата являются: длительный технологический процесс культивирования штамма-продуцента Bacillus subtilis 24Д (ВНИИСХМ 129) (48 ч); низкая концентрация микробных клеток в препарате (5×109 кл/мл); необходимость дополнительного внесения в состав препарата микроэлементов (5-10% от итогового веса препарата) и большого количества гуматов (20% от итогового веса), что уменьшает титр клеток штамма продуцента в составе биопрепарата и увеличивает его себестоимость; низкий уровень и недостаточный спектр фунгицидной активности.

Также следует подчеркнуть, что все препараты на основе бактерий зависимы от условий абиотической среды (рН почвенного раствора, обеспеченности элементами минерального питания, обеспеченности почвы влагой, кислородом, температурного режима) и проявляют активность в узких диапазонах рН и температуры почвы. В этом плане препараты, созданные на основе микроскопических грибов имеют преимущества как менее зависимые от условий среды, особенно это характерно для эндофитов, которые существуют и функционируют в клетках растительного организма, особенно в клетках корневой системы, обеспечивающей минеральный и водный режим растений, систему адаптации к условиям загрязнения грунтов. Это делает возможным применение препаратов на основе микроскопических симбиотических грибов в широком диапазоне почвенных условий, включая загрязнение.

Среди грибных препаратов имеется патент "Штамм Cylindrocarpon radicicola - продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих рострегуляторными свойствами". Изобретение направлено на расширение источников сырья регулятора роста из новых штаммов микроорганизмов. Новый штамм Cylindrocarpon radicicola выделен из корней женьшеня. Штамм хранится в Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, коллекционный номер ВКПМ F-861 (справка о депонировании прилагается). Штамм предназначен для получения биостимулятора роста. Недостатком препарата является его использование лишь в регуляции процессов роста, но он не используется для регуляции устойчивости растений.

Известен препарат “Симбионт-2”, стимулирующий урожайность растений, полученный из продуктов метаболизма грибов-эндофитов (авт.св. СССР №921488). В качестве сырья для его изготовления используют эндофиты, выделенные из корней облепихи. Известен препарат Симбионт-1, изготавливающийся из эндофитов, выделенных из корней женьшеня. Препарат эффективен только при хороших условиях роста растений (авт.св. СССР №370932).

Недостатком известных стимуляторов роста является невысокая активность препаратов, полученных из эндофитов растений. Общим недостатком также является невозможность идентифицировать получаемую с помощью известных штаммов продукцию.

Известен патент РФ № 2453601 об улучшенных эндофитом сеянцев с увеличенной устойчивостью к вредителям. В этом случае используется эндофит, выделенный из игл пихты. Инокулят вносится распылением. Изобретение относится к способу получения улучшенных эндофитом растений с увеличенной устойчивостью к вредителям, таким как растительноядные насекомые, посредством инокуляции растений токсикогенными эндофитными грибами. Предпосылками данного изобретения являлось то, что листья различных растений обладают бессимптомными инфекциями. Вовлеченные в это грибы обычно обозначают как эндофиты (Carroll, 1988; Clay, 1988; Petrini 1991). Токсические метаболиты, продуцируемые эндофитами трав, сильно снижают популяции растительноядных насекомых, атакующих растение. Это оказывает большое влияние на приспособленность растений (Clay, 1988; Clay & Holah, 1999). Иглы хвойных также являются инфицированными системными грибными эндофитами, которые могут исполнять несколько экологических функций (Carroll 1988; Ganley et al. 2004). Инокуляция семени хвойного растения или интактного проростка хвойного выделенным токсикогенным эндофитом в течение временного интервала чувствительности способствует повышению устойчивости растений к поражению вредителями. Недостатком является то, что препарат не влияет на устойчивость растений к абиотическим факторам среды.

Близким техническим решением к заявляемому изобретению является известный штамм Cylindrocarpon magnusianum, являющийся продуцентом регулятора роста растений /патент Украины №17558/. Штамм выделен из корневой системы облепихи. В качестве питательной среды используют, г/л: глюкозу, КН₂РО₄, К₂НРО₄, MgSО₄, К₂SО₄, MnSО₄, FeSО₄, аспарагин. Основным его недостатком является сложность его получения в промышленном масштабе и ограниченность применения, т.к. штамм проявляет эффективность только в прикорневой зоне определенного растения-хозяина.

Недостатком грибных препаратов аналогов является то, что в основном они изготавливаются в виде порошков (споры грибов, инокулированные в глину). Этот прием повышает сроки хранения грибного препарата, но значительно увеличивает сроки инокуляции растений до 3-6 месяцев, что делает невозможным их применение в условиях интенсивных культур защищенного грунта.

Предлагаемый нами способ относится к экологически ориентированным способам управления устойчивостью растений, с применением существующих в природной среде микроскопических грибов, выполняющих роль биоконтроллеров устойчивости высших растений. Существенным отличием нашего подхода является использование непосредственно процесса совместной жизнедеятельности гриба и растения, а не обработка растений веществами − продуктами жизнедеятельности грибов, так как у грибов, как правило, бывает невысокой продуктивность в выработке веществ, обладающих биологической активностью (для использования в промышленных целях), но достаточной для формирования устойчивости у инокулированного растения.

Способ производства суспензии грибов Fusarium equiseti и Cylindrocarpon magnusianum, а также оригинальный способ ее внесения могут быть использованы для заражения растений в период пикировки или на стадии сеянцев растений в условиях открытого и защищенного грунта, при посеве газонных трав, в том числе на биологическом этапе рекультивации нарушенных земель, при биоремедиации загрязненных земель, при выращивании посадочного материала древесных и травянистых растений для целей зеленого строительства городов, создания защитных насаждений, при лесной рекультивации.

Культуры Fusarium equiseti и Cylindrocarpon magnusianum выделены нами из корневой системы древесных растений (хорошего жизненного состояния), произрастающих в условиях городских почв с высоким содержанием солей тяжелых металлов, т.е в условиях длительного загрязнения. После отбора образцов корневой системы древесных растений, их стерилизации, выделены и культивируются на питательных средах изоляты грибов.

Видовая принадлежность грибов установлена методами молекулярного анализа ДНК в лаборатории Лейбницкого института овощных и декоративных культур (г. Берлин) и в 2017 г. анализ ДНК культуры проведен повторно и идентифицирован SEQ&QPCR (Прага).

Проведена экстракция ДНК, PCR-анализ (праймеры ITS1-ITS4 (57°C), ITS1F-ITS4A (57°C), ITS1F-ITS4B (57°C) FLR3-FLR4 (54°C), секвенирование продуктов амплификации (метод «Sangersequencing»). Для сравнения полученных результатов с известными последовательностями были использованы: перечень аннотированных последовательностей, представленных: на сайте Шусслера (http://schuessler.userweb.mwn.de/amphylo/), EMBL (http://www.ebi.ac.uk/), NSBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) databases.

Культуры изолятов культивируются в лабораторных условиях. Перед инокуляцией растений для формирования у них устойчивости к загрязнению почвы предварительно идет подготовка культур гриба, адаптированных к содержанию химических элементов в субстрате. Для чего перед посевом культуры гриба в агаризированную среду вносятся соли тяжелых металлов. По истечении 10-20 дней, когда происходит рост мицелия гриба, из данной культуры готовится суспензия. При использовании инокуляции грибами для выращивания сельскохозяйственных культур суспензия готовится непосредственно из культуры гриба без адаптации к действию химических элементов.

Суспензия гриба производится на основе стерильного картофельного бульона с декстрозой (Potato Dextrose Broth) с внесением антибиотика стрептомицина. В бульон вносятся высечки культуры гриба Fusarium equiseti и Cylindrocarpon magnusianum. Высечки готовятся стерильным металлическим сверлом заданного диаметра. Суспензия готовится в течение 1-2 недель в термо-шейкере-инкубаторе при температуре +20-35 °С. Готовая суспензия содержит: споры – 1-10 млн. шт./мл; фрагменты мицелия – 100-200 шт./мл. Суспензия вносится в грунт в лунку в момент пикировки растений. Для усиления контакта с корневой системой растений в лунку вставляется воронка из фильтрованной бумаги и в нее заливается 10-50 мл (в зависимости от инокулируемого растения и условий дальнейшего выращивания) суспензии. Возможно разбавление суспензии дистиллированной водой до 3÷10 раз. Либо суспензией поливаются растения в момент формирования корневых всасывающих корней (у трав в стадии проростков, у древесных растений в стадии сеянцев, либо саженцев (в последнем случае в апреле или сентябре в период формирования молодых корней)).

Описанные способы приготовления суспензии гриба и ее внесения в грунт под корневую систему растений сокращает сроки инокуляции растений до 20-30 дней, при 1-3 классе развития микоризной инфекции.

Примеры, показывающие пределы устойчивости исследуемых грибов к условиям высокого содержания солей в субстратах (предпосылки изобретения).

Пример 1. Для лабораторных экспериментов по изучению особенностей роста и пределов устойчивости изолятов микроскопических грибов Fusarium equiseti и Cylindrocarpon magnusianum использовалась стерильная питательная среда, состоящая из декстрозного бульона, агара-агара и дистиллированной воды. В питательную среду вносили соли: NaCl, соли тяжелых металлов (согласно схеме эксперимента). После затвердевания среды проводился посев культуры гриба. Через каждые трое суток после посева грибов проводили наблюдения за ростом мицелия гриба путем измерения диаметра мицелия.

Таблица 1 - Схема эксперимента по изучения особенностей роста и пределов устойчивости изолята микроскопического гриба Fusarium equiseti

NaCl, моль/л Zn, мг/л Сu, мг/л 0,5 100 50 1 200 100 1,5 300 150

Таблица 2 - Схема эксперимента по изучения особенностей роста и пределов устойчивости изолята микроскопического гриба Cylindrocarpon magnusianum

NaCl, моль/л Zn, мг/л Сu, мг/л Сr, мг/л Pb, мг/л 0,5 100 50 2,5 20 1 200 100 5 50 1,5 300 150 10 100

Также имелся контрольный вариант (К) (без добавления солей). Опыт проводили в пятикратной повторности. При выборе вносимых концентраций ориентировались на токсичность элемента и значения ПДК для почв, внося дозы менее, равные и превышающие значения ПДК. Результаты представлены на рисунках 1-3.

Результаты эксперимента показали, что при внесении в субстрат солей цинка (100, 200 и 300 мг/л) достоверно снижается скорость роста культуры гриба Fusarium equiseti, и через 15 дней после посева культуры гриба все варианты имели достоверно меньшие размеры мицелия по сравнению с контролем. При этом в контроле максимальный суточный рост мицелия наблюдался на шестые сутки после посева, а в вариантах с разными концентрациями солей цинка скорость роста возрастала на 9-е сутки. Это же наблюдалось и при внесении меди (50, 100 и 150 мг/л). Но медь оказалась более токсичным элементом для гриба. NaCl существенно повлиял на рост изолята в концентрации 1,5 моль/л, вызвав его ингибирование. Культура гриба с 0,5 молярной концентрацией через две недели после посева не отличалась от контрольного варианта. Диаметр гриба при концентрации 1 моль/л имел немного меньшие размеры.

Cylindrocarpon magnusianum показал более высокую металлрезистентность в отношении содержания меди и цинка (рисунки 4-8). Хотя более существенное ингибирование роста вызвали соли цинка. Соли хрома в концентрации 2,5 и 5,0 и 10 мг/л не оказали достоверного снижения роста культуры гриба, а внесение солей свинца в концентрации 25 мг/л даже стимулировало рост гриба.

Как и в опытах с Fusarium equiseti в контроле максимальный суточный рост мицелия наблюдался на шестые сутки после посева, а в вариантах с разными концентрациями солей тяжелых металлов скорость роста мицелия Cylindrocarpon magnusianum возрастала на 9-е сутки после посева.

Таким образом, проведенные эксперименты с микроскопическими грибами показали, что изоляты обладают высокой устойчивостью к действию NaCl и солей тяжелых металлов. И так как изоляты грибов являются эндотрофными и симбиотическими для растений, были сформулированы предпосылки идеи о том, что данные грибы могут передать свойство устойчивости инокулированным растениям.

Пример 2. Формирование солеустойчивости растений с использованием суспензии гриба.

Для оценки возможности использования свойств эндотрофных грибов в формировании устойчивости высших растений к условиям засоления почв проведен опыт с использованием популяций гриба Cylindrocarpon magnusianum, выращенных на средах с внесением хлорида натрия в концентрациях 0,5 и 1,0 моль/л. Эти популяции грибов были использованы в проведении опыта по инокуляции тестовых культур (томат). Схемой опыта было предусмотрено выращивание растений, инокулированных популяциями гриба (без гриба А0 (абсолютный контроль), контрольная популяция А1; популяции, выращенные в условиях содержания хлорида натрия 0,5 (А2) и 1,0 моль/л (А3)), выращенные на контрольном субстрате В0 (без внесения хлорида натрия) и на субстратах, содержащих хлорид натрия (в концентрациях 0,5 (В1) и 1,0 (В2) моль/л). Всего имелось 12 вариантов в четырехкратной повторности.

Растения выращивались в минигидропонных установках.

Оценка развития грибов эндофитов в корнях была проведена с использованием препаратов окрашенных корней (trypanblue 1%) с их предварительной мацерацией согласно стандартным методикам и использованием метода световой микроскопии.

Оценка устойчивости растений проведена на основе: анализа морфометрических показателей растений; содержания фотосинтетических пигментов (хлорофиллы а и в, каротиноиды); биомассы надземной части и корневой системы растений. Содержание фотосинтетических пигментов (хлорофиллов а и в, каротиноидов) определяли спектрофотометрическим методом (спектрофотометр ПЭ-5400 ВИ) в ацетоновых экстрактах (поглощение 662, 644 и 440,5 нм, соответственно), расчет концентрации пигментов проведен по уравнениям Холма-Веттштейна. Математическую обработку материалов осуществляли с применением статистического пакета программы “Statistica 6,0”. Для интерпретации полученных данных использовали методы описательной статистики. В процессе сравнения и анализа полученных результатов использовали достоверные различия между признаками (при p < 0,05).

Результаты показали, что растения, не инокулированные грибами (варианты А0В1 и А0В2), в субстратах с содержанием хлорида натрия погибли через 3 недели от начала эксперимента. В то время как растения, инокулированные грибами (А1, А2, А3), при выращивании на субстрате с содержанием хлорида натрия 1,0 моль/л (В2), не смотря на признаки сильного угнетения, выжили.

Растения, инокулированных популяции А1, А2 и А3 показали очень хорошие результаты при выращивании на субстрате с содержанием хлорида натрия 0,5 моль/л (В1). Показатели биомассы наземной части и корней растений, содержания хлорофиллов в листьях растений в этих вариантах не имели достоверных различий с абсолютным контролем (А0В0) (таблица 3).

Таблица 3 – Физиолого-биохимические показатели растений томата в опытах

Варианты Биомасса надземной части,
г сух. в-ва Биомасса корней,
г сух. в-ва Содержание пигментов, мг/л хлорофилла а хлорофилл b каротиноиды А0В0 29,14 ± 2,69 22,46…35,82 4,38 ± 0,15 4,01…4,75 0,095 ± 0,009 0,073…0,117 0,032 ± 0,002 0,028…0,035 0,230 ± 0,014
0,195…0,265 А1В1 27,34 ± 8,01 7,44…47,24 329 ± 0,77 11,28…25,93 0,062 ± 0,013 0,031…0,093 0,022 ± 0,004 0,012…0,032 0,144 ± 0,040 0,045…0,243 А2В1 34,75 ± 3,78
22,52…40,98 4,48 ± 1,70 0,25…8,71 0,101 ± 0,005 0,089…0,113 0,36 ± 0,000 0,036…0,036 0,270 ± 0,047 0,153…0,387 А3В1 25,76 ± 4,92 13,52…37,99 2,70 ± 0,42 1,65…3,74 0,080 ± 0,007
0,064…0,096 0,029± 0,003
0,022…0,036 0,181 ± 0,015
0,145…0,217

Анализы корневой системы на наличие микоризной инфекции (через три недели после инокуляции растений) показали: частота встречаемости микоризной инфекции равна 92,5 %; интенсивность развития микоризной инфекции равна 3,9 %.

Пример 3. Формирование солеустойчивости растений с использованием суспензии гриба.

Следующий вегетационный эксперимент проведен по аналогичной схеме с растениями томата, которые были инокулированы популяциями Fusarium equiseti, выращенными на средах с внесением хлорида натрия в концентрации 0,5 и 1,0 моль/л и соли цинка в концентрации 100 и 200 мг/л.

Схемой опыта было предусмотрено выращивание растений, инокулированных популяциями гриба (без гриба А0 (абсолютный контроль); контрольная популяция А1; популяции, выращенные в условиях содержания хлорида натрия 0,5 (А2) и 1,0 моль/л (А3); популяции, выращенные в условиях содержания цинка 100 (А4) и 20 (А5) мг/л (А3)), выращенные на контрольном субстрате В0 (без внесения солей) и на субстратах, содержащих хлорид натрия (в концентрациях 0,5 моль/л (В1)) и цинк в концентрации 50 (В2), 100 (В3) и 200 (В4) мг/л. Повторность вариантов четырехкратная.

Оценка устойчивости растений проведена на основе: анализа морфометрических показателей растений; содержания фотосинтетических пигментов (хлорофиллы а и в, каротиноиды); биомассы надземной части и корневой системы растений, содержания сухого вещества. Содержание фотосинтетических пигментов (хлорофиллов а и в, каротиноидов) определяли спектрофотометрическим методом (спектрофотометр ПЭ-5400 ВИ) в ацетоновых экстрактах (поглощение 662, 644 и 440,5 нм, соответственно), расчет концентрации пигментов проведен по уравнениям Холма-Веттштейна. Математическую обработку материалов осуществляли с применением статистического пакета программы “Statistica 6,0”. Для интерпретации полученных данных использовали методы описательной статистики. В процессе сравнения и анализа полученных результатов использовали достоверные различия между признаками (при p < 0,05).

Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Физиолого-биохимические показатели растений томата в опытах

Вариант Биомасса наземной части, г Биомасса корней, г Содержание сухого вещества, г Содержание хлорофилла а, мг/л Содержание хлорофилла в, мг/л Содержание каротиноидов А₀В₀ 18,61 ± 2,95* 11,28…25,93 2,22 ± 0,10 1,98…2,45 94,842 ± 0,130 94,520…95,163 0,183 ± 0,038 0,089…0,277 0,073 ± 0,015 0,037…0,109 0,587 ± 0,098 0,344…0,829 А₁В₀ 2,06 ± 0,79 0,10…4,02 0,21 ± 0,04 0,10…0,32 90,821 ± 3,530 82,053…99,588 0,095 ± 0,032 0,016…0,173 0,036 ± 0,012 0,007…0,064 0,333 ± 0,101 0,082…0,584 А₂В₀ 2,08 ± 0,69 0,37…3,79 0,40 ± 0,20 -0,10…0,89 93,681 ± 2,631 87,146…100,215 0,170 ± 0,074 -0,013…0,352 0,068 ± 0,031 -0,008…0,143 0,546 ± 0,179 0,101…0,991 А₃В₀ 0,92 ± 0,17 0,48…1,35 0,23 ± 0,02 0,18…0,28 94,122 ± 1,045 91,527…96,716 0,138 ± 0,021 0,087…0,189 0,053 ± 0,008 0,033…0,073 0,494 ± 0,100 0,246…0,741 А₄В₀ 1,76 ± 0,15 1,39…2,13 0,21 ± 0,05 0,09…0,34 89,100 ± 1,983 84,175…94,024 0,094 ± 0,020 0,044…0,144 0,037 ± 0,008 0,018…0,055 0,337 ± 0,057 0,196…0,477 А₅В₀ 3,79 ± 1,01 1,28…6,30 0,63 ± 0,13 0,31…0,96 96,924 ± 0,111 96,649…97,198 0,169 ± 0,003 0,162…0,176 0,067 ± 0,001 0,065…0,069 0,561 ± 0,014 0,526…0,596 А₁В₁ 0,94 ± 0,17 0,51…1,37 0,19 ± 0,06 0,04…0,35 96,337 ± 0,896 94,112…98,561 0,037 ± 0,014 0,002…0,072 0,014 ± 0,005 0,002…0,026 0,149 ± 0,046 0,036…0,262 А₂В₁ 0,81 ± 0,00 0,81…0,81 0,18 ± 0,00 0,18…0,18 64,129 ± 54,834 -72,087…200,346 0,281 ± 0,460 -0,860…1,423 0,275 ± 0,465 -0,879…1,430 0,321 ± 0,425 -0,734…1,377 А₃В₁ 0,76 ± 0,15 0,40…1,13 0,21 ± 0,05 0,10…0,32 95,592 ± 0,916 93,317…97,866 0,033 ± 0,014 -0,001…0,066 0,013 ± 0,005 0,001…0,025 0,129 ± 0,049 0,007…0,251 А₁В₂ 14,89 ± 0,22 14,35…15,43 1,43 ± 0,16 1,03…1,83 95,940 ± 1,173 93,026…98,854 0,208 ± 0,011 0,182…0,234 0,081 ± 0,005 0,069…0,093 0,655 ± 0,027 0,589…0,721 А₄В₂ 17,49 ± 2,51 11,26…23,73 1,98 ± 0,50 0,73…3,24 93,819 ± 1,380 90,391…97,247 0,188 ± 0,015 0,152…0,224 0,074 ± 0,005 0,062…0,086 0,592 ± 0,033 0,510…0,674 А₁В₃ 13,34 ± 3,33 5,07…21,60 1,30 ± 0,34 0,45…2,15 94,913 ± 1,457 91,295…98,531 0,212 ± 0,032 0,133…0,290 0,084 ± 0,014 0,050…0,117 0,645 ± 0,073 0,464…0,826 А₄В₃ 13,46 ± 2,74 6,66…20,26 1,27 ± 0,37 0,34…2,20 95,643 ± 0,718 93,860…97,425 0,192 ± 0,011 0,166…0,218 0,076 ± 0,005 0,064…0,087 0,596 ± 0,025 0,535…0,657 А₅В₃ 12,31 ± 3,68 3,18…21,44 1,20 ± 0,45 0,07…2,32 95,369 ± 0,681 93,677…97,061 0,163 ± 0,028 0,094…0,231 0,064 ± 0,011 0,037…0,091 0,528 ± 0,070 0,355…0,700 А₁В₄ 5,15 ± 0,96 2,78…7,53 0,69 ± 0,02 0,63…0,75 94,128 ± 1,442 90,547…97,709 0,136 ± 0,020 0,086…0,186 0,053 ± 0,009 0,032…0,074 0,456 ± 0,060 0,308…0,603 А₅В₄ 6,43 ± 2,07 1,30…11,57 0,44 ± 0,13 0,13…0,75 96,324 ± 0,166 95,913…96,735 0,160 ± 0,038 0,067…0,253 0,064 ± 0,016 0,025…0,102 0,516 ± 0,105 0,255…0,777

Примечания. * - указано среднее значение показателя ± стандартное отклонение, доверительный интервал для среднего значения.

Анализы корневой системы на наличие микоризной инфекции показали: частота встречаемости микоризной инфекции равна 95,8 %; интенсивность развития микоризной инфекции равна 4,3 %.

Результаты показали, что инокуляция растений популяциями Fusarium equiseti «0,5 моль/л NaCl» и «Zn 100 мг/л» повлияла на ряд биометрических и биохимических показателей растений: растения отличались более высоким содержанием фотосинтетических пигментов (хлорофиллов а и в, каротиноидов) в листьях по сравнению с контролем. Инокуляция грибами вызвала снижение содержания аскорбиновой кислоты в листьях томата, что свидетельствует о защитных адаптивных реакциях растений.

Пример 4. Эффективность применения инокуляции для формирования устойчивости растений к солям тяжелых металлов.

Согласно схеме эксперимента выращены изоляты (популяции) гриба на субстратах с внесением разных концентраций солей тяжелых металлов (А₀ - контрольный изолят; А₁ − на субстрате с Zn₁₀₀ мг/л, далее А₂ − Cu_50, А₃ − Cu₁₀₀, А₄ − Cu₁₅₀, А₅ − Pb₅₀, А₆ − Pb₁₀₀, А₇ − Cr_2,5, А₈ − Cr₁₀ мг/л). Затем подготовлены суспензионные культуры этих популяций и проведена инокуляция тестовых растений томата. Согласно схеме эксперимента заложены варианты опыта, где инокулированные томаты (инокуляция контрольным изолятом) выращивались на субстратах с разным содержанием солей тяжелых металлов аналогично вариантам для подготовки популяций гриба) и томаты, инокулированные популяциями грибов, адаптированными к тяжелым металлам, выращивались на субстратах без внесения солей тяжелых металлов (ТМ) и с внесением солей ТМ. Контрольным вариантом принят вариант, где растения, инокулированные контрольной популяцией гриба, выращивались на субстрате без внесения солей тяжелых металлов. Повторность вариантов опыта четырехкратная. Субстрат представлял собой смесь торфа низкой зольности и песка 1:2. Растения выращивались в климатической камере Binder KBWF720 при соблюдении оптимальных условий культивирования культуры томата.

Оценка устойчивости растений проведена на основе: анализа морфометрических показателей растений; содержания фотосинтетических пигментов (хлорофиллы а и в, каротиноиды); содержания в листьях метаболитов, обладающих антиоксидантной активностью (аскорбиновая кислота по ГОСТ 24556-89); содержания нитратов в листьях(по ГОСТ 29270-95); содержания сухого вещества в надземной части и корневой системе растений (по ГОСТ 28561-90).Содержание фотосинтетических пигментов (хлорофиллов а и в, каротиноидов) определяли спектрофотометрическим методом (спектрофотометр ПЭ-5400 ВИ) в ацетоновых экстрактах (поглощение 662, 644 и 440,5 нм, соответственно), расчет концентрации пигментов проведен по уравнениям Холма-Веттштейна.

Математическую обработку материалов осуществляли с применением статистического пакета программы “Statistica 6,0”. Для интерпретации полученных данных использовали методы описательной статистики. В процессе сравнения и анализа полученных результатов использовали достоверные различия между признаками (при p < 0,05).

Анализ результатов лабораторных экспериментов включал: оценку влияния различных тяжелых металлов в разных концентрациях (В₁-В₈) на физиологические показатели растений, инокулированных контрольной популяцией гриба (А₀); оценку влияния популяций гриба Cylindrocarpon magnusianum (выращенных на субстратах с разными содержанием тяжелых металлов А₁-А₈) на физиологические показатели инокулированных растений (выращивание растений на контрольном субстрате (В₀); оценку совместного влияния популяции гриба, используемой для инокуляции (А₁-А₈), и содержания ТМ в субстратах при выращивании инокулированных растений (В₁-В₈), на физиологические показатели последних (рис. 9-11, таблица 5). В качестве контроля использован вариант А₀В₀.

Таблица. Морфологические и биохимические показатели растений томата в опыте

Варианты Показатели биомасса, г содержание сухого вещества, % биохимические показатели надземная
часть корни наземная
часть корни нитраты, мг/100г витамин С,
мг/100г А0В1 29,37±2,23*
23,84…34,90 4,70±0,28
4,00…5,39 94,52±1,77
91,70…99,16 96,67±1,19
93,71…99,63 3890,43±159,98
3493,02…4287,84 37,84±4,45
26,80…48,88↓ А0В2 25,54±0,80
23,56..27,52 ↓** 3,81±0,24
3,21…4,42 95,43±1,50
91,70…99,16 96,11±0,34
95,72…96,94 4327,69±144,58
3968,54…4686,85 ↑ 23,58±1,54
28,76…36,40↓ А0В3 24,31±1,86
19,70…28,92 4,40±0,30
3,64…5,15 95,88±0,65
94,27…97,48 97,57±1,15
94,72…100,41 5326,66±110,37
5052,49…5600,83↑ 64,62±3,57
55,76…73,49 А0В4 27.60±0,70
25,85…29,35 3,63±0,24
3,02…4,73 95,46±0,99
93,00…97,92 98,08±0,49
96,86..99,30 4308,72±298,07
3568,82…5049.16 48,83±1,12
46,05…51,61↓ А0В5 24,51±1,28
21,32…27,70 3,88±0,35
3,02…4,73 94,74±1,71
90,49…98,99 98,33±0,88
96,15…100,50 4321,20±258,40
3679,31…4963,10 42,43±0,55
41,50…43,80↓ А0В6 28,81±0,39
27,83…29,79 3,81±0,07
3,64…3,98 95,05±1,36
91,68..98,41 97,81±0,01
97,79…97,83 5014,62±466,07
3856,83…6172,41 60,59±0,59
59,13…62,50 А0В7 26,87±0,35
26,00…27,74 3,30±0,14
2,95…3,65↓ 96,54±0,22
95,99…97,09 97,90±0,74
96,07…99,72 4415,13±331,23
3592,31…5237,96 46,72±3,02
39,22…54,22↓ А0В8 25,58±0,45
24,46…26,69 ↓ 4,72±0,28
4,02…5,41 96,59±1,39
93,15…100,03 95,66±0,52
94,38…96,94 3213,16±96,82
2972,64…3453,67 ↓ 59,32±3,08
51,67…66,97 А1В0 25,58±0,73
23,76…27,40 ↓ 3,84±0,12
3,56…4,13 96,72±0,85
94,62…98,82 98,16±0,48
96,69…99,53 3476,33±325,75
2552.84…4399,81 53,06±2,67
28,42…41,70↓ А1В1 27,80±0,64
26,20…29,39 4,72±0,45
3,60…5,84 96,40±1,72
92,12…100,67 96,40±1,72
92,12…100,67 3585,72±606,07
2080,15…5091,29 34,18±2,46
28,07…40,30 А2В0 23,96±1,63
19,91…28,00 2,16±0,18
1,72…2,60↓ 96,59±0,86
94,46…98,73 98,45±0,53
97,13…99,77 3365,41±72,51
3185,30…3545,53 55,48±3,54
46,68…64,28 А2В2 29,68±1,05
27,08…32,28 2,13±0,23
1,56…2,70 79,29±0,21
96,77…97,81 97,29±0,21
96,77..97,81 4638,21±346,77
3776,78…5499,64 ↑ 45,06±1,53
41,26…48,86 А3В0 19,82±0,40
18,83…20,81 ↓ 2,30±0,15
1,93…2,67↓ 96,16±1,36
92,78…99,54 98.53±0,54
97,20…99,86 4837,86±206,82
2324,10…5351,62 49,83±3,69
39,99…59,68 А3В3 35,29±0,25
34,66…35,92 ↑ 2,39±0,69
0,67…4,10 96,70±0,41
95,69…97,71 96,70±0,41
95,69..97,71 3534,60±99,78
32286,72…3782,48 52,70±5,29
39,75…65,84 А4В0 27,99±0,81
25,98…30,00 1,93±0,04
1,84…2,02↓ 96,00±1,02
93,47…98,53 98,60±0,83
96,53…100,66 3058,14±25,50
2994,80…3121,48 ↓ 39,20±4,92
26,98…51,41↓ А4В4 24,16±1,12
21,39…26,93 2,23±0,18
1,79…2,67 97,06±0,22
96,52…97,60 97,06±0,22
96,52…97,60 4487,60±103,26
4231,09…4744,11 ↑ 32,57±4,80
20,65…44,50 А5В0 32,66±2,01
27,66…37,65 2,98±0,15
2,61..3,35 ↓ 93,83±3,07
86,21…101,45 98,28±0,25
97,66…98,89 3356,96±241,51
2428,09…3889,82 46,72±2,28
41,05…52,39 ↓ А5В5 26,30±0,87
24,13…28,47 2,36±0,22
1,81…2,91 95,86±1,59
91,92…99,80 95,86±1,59
91,92…99,80 4488,58±102,55
4233,83…4243,33 ↑ 51,93±1,64
47,85…56,01 А6В0 21,88±1,31
18,63…25,13 ↓ 1,55±0,10
1,30…1,80↓ 95,74±0,98
93,30…98,18 98,00±0,53
96,69…99,31 3986,02±82,59
3780,87…4191,18 62,36±2,98
54,96…69,77 А6В6 28,16±1,30
24,94…31,38 2,49±0,36
1,59…3,39 96,39±0,50
95,14…97,64 96,39±0,50
95,14…97,64 4229,96±177,36
3789,37…4670,55 48,05±0,90
45,82…50,29 ↓ А7В0 21,59±2,04
16,52…26,67 ↓ 1,92±0,08
1,73…2,11↓ 95,64±1,50
91,92…99,35 95,64±1,50
91,92...99,35 4384,27±195,22
3899,31…4896,23 47,81±3,02
40,32…55,31 ↓ А7В7 29,54±0,09
29,33…29,76 ↑ 2,50±0,01
2,47…2,54↑ 96,62±0,64
95,04…98,19 96,62±0,64
95,04..98,19 4161,79±494,02
2934,58…5389,00 71,09±0,80
69,10…73,80 ↑ А8В0 16,36±0,94
14,02…18,71 ↓ 1,56±0,15
1,18…1,93↓ 97,07±0,55
95,71…98,44 97,07±0,55
95,71…98,44 5188,76±622,04
3643,52…6733,99 50,53±1,66
46,41…54,65 ↓ А8В8 27,30±0,26
26,65…27,95 ↑ 2,06±0,22
1,51…2,61 96,11±1,43
92,56…99,66 96,11±1,43
92,56…99,66 3583,89±471,03
2413,79…4753,98 64,82±7,75
45,57…84,08 А0В0 29,30±0,70
27,55…31,05 5,44±0,63
3,88..7,00 93,90±1,69
89,70…98,11 96,17±165
92,06…100,27 3693,55±87,76
3475,53…3911,57 63,48±2,50
58,39…68,57

Примечания. * - указано среднее значение показателя ± стандартное отклонение, доверительный интервал для среднего значения; ** показано достоверное отличие от контроля, увеличение ↑ или снижение ↓ показателя по сравнению с контролем.

Анализ корневой системы на наличие микоризной инфекции показали: частота встречаемости микоризной инфекции равна 97,5 %; интенсивность развития микоризной инфекции равна 4,9 % .

Анализ полученных результатов показал, что наибольший положительных эффект для формирования устойчивости растений имеют варианты, где растения инокулированы адаптированными к ТМ популяциями Cylindrocarpon magnusianum и затем выращивались на субстратах с внесением солей тяжелых металлов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ приготовления и внесения суспензии из культур грибов, отличающийся тем, что суспензию гриба производят на основе стерильного картофельного бульона с декстрозой (Potato Dextrose Broth) с внесением антибиотика стрептомицина, в бульон вносят высечки культуры гриба Fusarium equiseti или Cylindrocarpon magnusianum, при этом высечки готовятся стерильным металлическим сверлом заданного диаметра (диаметр 6 мм, не менее 10 высечек на 250 мл бульона), суспензию готовят в течение 1-2 недель в термо-шейкере-инкубаторе при температуре +20-35 °С и вращении 50-60 об/мин, готовая суспензия содержит: споры – 1-10 млн шт./мл; фрагменты мицелия – 100-200 шт./мл, при этом суспензию вносят однократно в грунт в лунку, где в момент пикировки растений, в лунку вставляется воронка из фильтровальной бумаги и в нее заливают 10-50 мл суспензии, сроки инокуляции растений составляют не более 20-22 дней, при этом суспензией, разбавленной дистиллированной водой до 3÷10 раз, поливают растения из расчета 100-300 мл суспензии на 1 м² грунта или под 1 древесное растение, полив производят однократно в момент формирования корневых всасывающих корней у трав в стадии проростков; у древесных растений в стадии сеянцев либо саженцев, в последнем случае в апреле или сентябре в период формирования молодых корней, сроки инокуляции растений составляют 20-30 дней. Изобретение позволяет ускорить эффективность и сроки инокуляции растений, повысить устойчивость растений уже на ранних этапах онтогенеза к неблагоприятным факторам, включая действие солей, в том числе солей тяжелых металлов. 2 з.п. ф-лы, 11 ил., 5 табл.

1. Способ приготовления и внесения суспензии из культур грибов, отличающийся тем, что суспензию гриба производят на основе стерильного картофельного бульона с декстрозой (Potato Dextrose Broth) с внесением антибиотика стрептомицина, в бульон вносят высечки культуры гриба Fusarium equiseti или Cylindrocarpon magnusianum, при этом высечки готовятся стерильным металлическим сверлом заданного диаметра (диаметр 6 мм, не менее 10 высечек на 250 мл бульона), суспензию готовят в течение 1-2 недель в термо-шейкере-инкубаторе при температуре +20-35 °С и вращении 50-60 об/мин, готовая суспензия содержит: споры – 1-10 млн шт./мл; фрагменты мицелия – 100-200 шт./мл, при этом суспензию вносят однократно в грунт в лунку.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в момент пикировки растений в лунку вставляется воронка из фильтровальной бумаги и в нее заливают 10-50 мл суспензии, сроки инокуляции растений составляют не более 20-22 дней.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что суспензией, разбавленной дистиллированной водой до 3÷10 раз, поливают растения из расчета 100-300 мл суспензии на 1 м² грунта или под 1 древесное растение, полив производят однократно в момент формирования корневых всасывающих корней у трав в стадии проростков; у древесных растений в стадии сеянцев либо саженцев, в последнем случае в апреле или сентябре в период формирования молодых корней, сроки инокуляции растений составляют 20-30 дней.