ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS PUMILUS BIS88 В КАЧЕСТВЕ УНИВЕРСАЛЬНОГО СРЕДСТВА ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПИТАНИЯ, УСКОРЕНИЯ РОСТА И УВЕЛИЧЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЗЕРНОВЫХ, ОВОЩНЫХ И ТЕХНИЧЕСКИХ КУЛЬТУР, А ТАКЖЕ ИХ ЗАЩИТЫ ОТ БОЛЕЗНЕЙ И СТРЕССОВЫХ ФАКТОРОВ ХЛОРИДНОГО ЗАСОЛЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма эндофитных бактерий Bacillus pumilus BIS88 для растениеводства.

В земледелии России применяется около 3,0 млн тонн действующего вещества минеральных удобрений в год, что соответствует 40 кг д.в. на 1 га посевов. Из внесенного количества питательных веществ в составе минеральных удобрений растениями на формирование урожая потребляется менее половины [Сычев В.Г. Современное состояние плодородия почв и основные аспекты его регулирования. М.: Из-во РАН, 2019. 325 с.]. Повышение коэффициента использования растениями элементов питания из минеральных удобрений на формирование урожая имеет важное экономическое и экологическое значение для оптимального функционирования агроландшафтов [Завалин А.А., Соколов О.А. Коэффициент использования азота и удобрений и его регулирование// Международный сельскохозяйственный журнал. 2019. № 4. С. 71-75]. Одним из приёмов повышения эффективности внесения минеральных удобрений и увеличения коэффициента использования растениями азота удобрений может стать применение микробиологических препаратов, созданных на основе агрономически полезных микроорганизмов, обладающих комплексом положительных свойств.

Специалистам в области сельскохозяйственной микробиологии известно, что в случае ассоциативного симбиоза на корнях растений в строго определенных местах формируются колонии ризосферных бактерий, которые способны обеспечить для растения целый ряд полезных функций.

Среди них:

- подавление стрессовых реакций у растения;

- регулирование поступления загрязнителей окружающей среды в растения;

- выработка растительных гормонов в строго определенных соотношениях и концентрациях, которые позволяют ускорить рост корневой системы и тем самым обеспечить растению успех в захвате необходимой площади питания, а также регулировать развитие растений;

- оптимизация усвоения фосфорных труднодоступных соединений;

- индукция системной реакции по защите от фитопатогенов;

- ограничение (биоконтроль) роста фитопатогенов на корнях растений с помощью таких механизмов, как выделение антибиотических соединений, растворение гиф патогенных грибов, конкуренция за места заселения на корнях, перехват питательных веществ, необходимых для развития фитопатогена и др. [И.А. Тихонович, А.П. Кожемяков, В.К. Чеботарь, Ю.В. Круглов, Н.В. Кандыбин, Г.Ю. Лаптев. Биопрепараты в сельском хозяйстве: методология и практика применения микроорганизмов в растениеводстве и кормопроизводстве / Рос. акад. с.-х. наук, Всероссийский научно-исследовательский институт с/х микробиологии. М.: ВНИИСХМ, 2005,154 с., стр.8 - ISBN 5-85941-231-2].

Известно изобретение «Биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней» по патенту РФ № 2099947 с приоритетом от 15.11.1996 г. на имя Института Микробиологии и вирусологии НАН Украины (UA) и НПО «Башкирское»(RU), МПК А01N63/00; С12N1/20; С12R1:125, публикация 27.12.1997 г.

Основу биопрепарата «Фитоспорин» составляет штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 с концентрацией клеток 10⁹ - 10¹⁰ на 1 мл физраствора в количестве 92-98 об.% и наполнителем в количестве 2-8 об.%.

При этом штамм Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов, что позволяет использовать его для защиты различных видов сельскохозяйственных, декоративных, древесных растений.

Недостатком биопрепарата «Фитоспорин» является отсутствие сведений о его способности защищать растения от стрессовых факторов, а также улучшать питание и стимулировать рост сельскохозяйственных культур.

Известно изобретение «Штамм бактерий Bacillus pumilus А 1.5 в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами» по патенту РФ №2551968 с приоритетом от 01.08.2013 г. на имя Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии), МПК C12N 1/20, A01N 63/00, C12R 1/07, публикация: 10.06.2015 г. (прототип).

Штамм Bacillus pumilus A1.5 депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов с/х назначения в ГНУ ВНИИСХМ 06.05.2013г. под регистрационным номером RCAM 02057 и характеризуется ростостимулирующей и антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов. Биопрепарат на основе штамма эндофитных бактерий Bacillus pumilus A1.5 в жидкой форме с концентрацией клеток 3×10⁸ КОЕ/мл применяется в сельском хозяйстве в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами.

Недостатком биопрепарата на основе этого штамма является отсутствие сведений о его способности защищать растения от стрессовых факторов.

Задачей изобретения является выявление штамма, пригодного для использования в сельском хозяйстве в качестве универсального средства улучшения питания, ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и технических культур, а также их защиты от болезней и стрессов.

Указанная задача решается за счет того, что в качестве универсального средства для улучшения питания, ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и технических культур, а также защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами, и борьбы со стрессовыми факторами растений в сельском хозяйстве используется штамм эндофитных бактерий Bacillus pumilus BIS88.

Штамм эндофитных бактерий Bacillus pumilus BIS88 был выделен из семян томатов и депонирован 24.02.2015 г. в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (ВКСМ) при ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM 03199.

Среда культивирования штамма: питательный агар (готовая питательная среда производства ООО «Биокомпас-С», ТУ 10-02-02-789-176-94). Оптимальная температура для роста 32°С. Культивирование в течение 48 часов.

Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

На питательном агаре образует кожистые колонии кремового, пастообразной консистенции с неровными изрезанными ризоидными краями и плоским профилем, матовая консистенция в центре переходит в блестящую к краю колонии. Диаметр колоний 10-15 мм. Оптимальная температура для роста 32°С. При температуре более 45°С и менее 15°С рост замедленный. Оптимальное значение рН среды 7,1, рост происходит также при рН от 4,5 до 8,0. Представляет собой мелкие прямые палочки, 1,5-2 мкм в длину, образует споры. В качестве единственного источника углерода штамм использует декстрин, мальтозу, целлобиозу, сахарозу, туранозу, стахиозу, раффинозу, глюкозу, маннозу, фруктозу, галактозу, манитол, глицерол, пектин. Использует минеральные формы азота - соли аммония и нитраты. Каталазо-иоксидазоположительный. Растет при 8% NaCl. Желатин не гидролизует. Утилизирует аминокислоты: L-аланин, L-аргинин, L-аспартам, L-глутамин, L-серин; органические кислоты: лимонную, яблочную, γ-аминомасляную, α-кетомасляную, ацетоуксусную, уксусную.

Выявлено и экспериментально установлено, что штамм бактерий Bacillus pumilus BIS88 обладает ростостимулирующей активностью.

Оценку ростостимулирующей активности штамма Bacillus pumilus BIS88 проводили в лабораторном опыте на кресс-салате сорта «Широколистный». В качестве прототипа использовали штамм-прототип бактерий Bacillus pumilus A1.5. Для этого семена салата обрабатывали суспензиями штаммов указанных бактерий с титром 10⁵ КОЕ/мл и раскладывали по чашкам Петри с увлажненной до полной влагоемкости ватой и фильтровальной бумагой. В контрольном варианте семена салата обрабатывали стерильной водой. Опыт проводили в 3-кратной повторности, в каждой повторности использовали по 50 семян. Чашки с семенами культивировали в течение 72 часов при температуре 28°С, после чего измеряли длину корней и проростков салата.

Результаты измерений представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Ростостимулирующая активность бактерий, определенная в отношении проростков салата

Вариант обработки
семян салата Средняя длина корня,
мм Средняя длина зеленой
части ростка, мм Контроль - вода 5,7±0,6 13,1±1,6 Штамм бактерий
Bacillus pumilus A1.5 -
прототип 8,7±1,9 14,0±1,5 Штамм бактерий
Bacillus pumilus BIS88 -
заявленный 13,5±2,5 16,7±1,5

Из данных, приведенных в Таблице 1, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus pumilus BIS88 обладает более сильной ростостимулирующей активностью по сравнению со штаммом - прототипом бактерий Bacillus pumilus A1.5.

Также экспериментально установлено, что штамм бактерий Bacillus pumilus BIS88 обладает фунгицидной активностью против фитопатогенных грибов Alternaria alternata, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium sporotrichioides, фитопатогенных бактерий Clavibacter michiganens ss. sepedonicus, Erwinia carotovora ss. atroseptica, Pseudomonas syringae и фитостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам (редис, салат, вико-овсяная смесь, яровая пшеница).

Оценку антагонистической активности по отношению к фитопатогенным микроорганизмам проводили в опытах со штаммом бактерий Bacillus pumilus BIS88 и штаммом - прототипом Bacillus pumilus A1.5.

Бактерицидную активность проверяли в отношении 4-х штаммов фитопатогенных бактерий из коллекции ООО «Бисолби-Интер»: Pseudomonas syringae (штамм 213), Pseudomonas syringae (штамм 8511), Erwinia carotovora var. atroseptica (штамм 822), Clavibacter michiganense subs. sepedonicus (штамм 6028). Сначала высевали бактерии бактериологической петлей сплошным газоном на поверхности питательного агара и культивировали 48 часов при 28°С. В день проверки на бактерицидную активность высевали сплошным газоном на голодном картофельном агаре штаммы указанных фитопатогенных бактерий. Затем переносили на поверхность только что засеянной среды вырезанные стерильным пробочным сверлом агаровые блочки со зрелой культурой тестируемых бактерий. Перенос осуществляли с помощью стерильного скальпеля и прокаленного пинцета. Чашки с блочками культивировали в течение 24 часов при температуре 28°С, после чего замеряли диаметр зоны ингибирования вокруг блочков.

Результаты измерений представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Антагонистическая активность штаммов бактерий по отношению к фитопатогенным бактериям

Штамм
бактерий Зона ингибирования роста бактерий, мм Pseudomonas
syringiae
(штамм 213) Pseudomonas
syringiae
(штамм 8511) Erwinia carotovora var. atroseptica
(штамм 822) Clavibacter
michiganense subs sepedonicus (штамм 6028) Bacillus pumilus A1.5 - прототип 10,3+0,5 9,7+0,2 14,5+1,1 13,3+1,0 Bacillus pumilus BIS88 - заявленный 15,1+1,0 13,1+0,9 22,7+1,3 19,7+1,3

Из данных, приведенных в Таблице 2, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus pumilus BIS88 обладает большей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным бактериям по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus pumilus A1.5.

Для определения фунгицидной активности штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88 и штамма-прототипа Bacillus pumilus A1.5 был использован метод «колодцев». Для испытания были отобраны следующие фитопатогенные грибы (из коллекции ООО «Бисолби-Интер»): Fusarium culmorum, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea. В разогретый и остывший до температуры 45°С картофельно-декстрозный агар (PDA, Sigma, USA) добавляли суспензию спор грибов (10⁵ КОЕ/мл) из расчета 1мкл суспензии на 1мл среды. Полученную смесь разливали по чашкам Петри, после застывания в ней делали прокаленным пробочным сверлом 4 ровных сквозных отверстия, расположенных квадратом. В эти отверстия заливали по 100 мкл бактериальной суспензии с титром клеток 10⁸ КОЕ/мл. Одна чашка была оставлена с пустыми «колодцами» как контрольный вариант. Все чашки с «колодцами» культивировали в течение 72 часов при температуре 28°С. Фунгицидную активность определяли как зоны ингибирования роста фитопатогенного гриба вокруг «колодцев».

Результаты измерений представлены в Таблице 3.

Таблица 3. Антагонистическая активность штаммов бактерий по отношению к фитопатогенным грибам

Штамм
бактерий Зона ингибирования роста грибов, мм Fusarium
culmorum Pithium
ultimum Rhizoctonia
solani Botrytis
cinerea Bacillus pumilus A1.5 - прототип 8,7+0,5 7,5+0,3 12,1+0,8 10,3+0,7 Bacillus pumilus BIS88 -
заявленный 11,9+1,0 11,1+0,7 18,3+1,1 17,7+1,0

Из данных, приведенных в Таблице 3, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus pumilus BIS88 обладает большей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus pumilus A1.5.

Реакция растений на стресс, как правило, опосредуется выработкой фитогормонов (Mulholland et al., 2003). Наиболее известные гормоны, стимулирующие рост растений, которые могут синтезироваться бактериями, включают индол-3-уксусную кислоту, зеатин, абсцизовую кислоту, цитокинин, гибберелловую кислоту и этилен (Role et al., 2013). Индол-3-уксусная кислота (ИУК) является одним из механизмов, которые бактерии используют для взаимодействия с растениями, сигнализируя молекулами в бактериях и влияя на рост и развитие растений (Hoffman et al., 2013). В дополнение к стимулированию роста непосредственно за счет выработки ИУК, микроорганизмы также могут стимулировать рост растений, повышая устойчивость растений к абиотическим стрессам. Некоторые штаммы, стимулирующие рост растений, могут продуцировать ИУК для повышения устойчивости семян кукурузы и пшеницы к засолению во время прорастания в засоленных почвах (Soltani et al., 2023). Например, солевой стресс индуцирует способность к биосинтезу ИУК у стимулятора роста растений штамма Acineto-bacter pittii. Таким образом, соевые бобы, обработанные штаммом A. pittii демонстрируют значительное улучшение роста растений в условиях солевого стресса (Kang et al., 2023).

Солеустойчивые штаммы, выделенные из засоленной почвы, и продуцирующие ИУК, были способны стимулировать рост хлопчатника (Saleem et al., 2021; Tang et al., 2023).

Среди различных эндогенных фитогормонов растение увеличивает биосинтез абсцизовой кислоты (АБК) в ответ на стресс от засоления (Santner, Estelle, 2009). Защитная роль АБК важна в развитии растений, поскольку она вызывает закрытие устьиц и тем самым уменьшает потерю воды (Herrera-Medina et al., 2007).

Цитокинины являются еще одной важной группой растительных гормонов, участвующих в поддержании клеточной пролиферации и дифференцировки и предотвращении старения [Schmülling, 2002]. Однако в стрессовых условиях, особенно при водном стрессе, наблюдалась повышенная концентрация цитокинина в соке ксилемы [Borrell et al., 2000]. Чжан и соавт. [Zhang et al., 2010] продемонстрировали, что трансгенная маниока, сверхэкспрессирующая цитокины, проявляет большую устойчивость к засухе по сравнению с растениями дикого типа.

Экспериментально было показано, что штамм бактерий Bacillus pumilus BIS88 способен продуцировать фитогормоны: индолилуксусную кислоту (ИУК), абсцизовую кислоту (АБК) и цитокин транс-зеатин (ТЗ) при его культивировании на питательной среде. В опыте использовали жидкую стерильную питательную среду следующего состава:

патока - 15 г/л,

кукурузный экстракт - 12,5 г/л,

MgSO₄×7Н2О - 0,2 г/л,

CaCl₂×2Н₂О - 1,0 г/л,

MnSO4 - 0,1 г/л.

Культивирование штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88 в указанной жидкой питательной среде при рН (7,2 -7,5) проводили на качалке или в ферментере при 28°С в течение 36 часов.

Концентрацию фитогормонов: индолилуксусной кислоты, абсцизовой кислоты и транс-зеатина в экстракте определяли с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа (Agilent 1200, США) с масс-селективным детектором Varian 920-LC System. Для определения фитогормонов отбирали 50 мл жидкой культуры (и 50 мл стерильной жидкой среды, используемой в качестве контрольной) и центрифугировали при скорости 3000-5000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали в разделительную воронку. Осадок дважды взбалтывали с 30 мл дистиллированной воды и центрифугировали после смешивания надосадочной жидкости в разделительной воронке. Объединенный супернатант в делительной воронке подкисляли 10%-ным раствором уксусной кислоты до рН 2, после чего фитогормоны экстрагировали 10 мл этилацетата. Верхний слой этилацетата пропускали через безводный сульфат натрия и выпаривали до высыхания на ротационном испарителе при температуре не более 40°C. Экстракцию проводили трижды. Хроматографию проводили в градиентном режиме (фаза А, метанол + 0,1% муравьиной кислоты; фаза В, деионизированная вода +0,1% муравьиной кислоты). В хроматографической системе использовалась колонка Cosmosil C18 4.6 ID 150 мм. Хроматограф был откалиброван с использованием внутренних стандартов SIGMA-ALDRICH для стандартов гормонов. Идентификация гормонов проводилась в режиме масс-спектрометрии.

В результате было показано, что в образцах бактериальной суспензии штамма Bacillus pumilus BIS88, содержится 366,1 мкг/л индолилуксусной кислоты, 0,646 мкг/л абсцизовой кислоты и 0,822 мкг/л транс-зеатина (Табл.4).

Таблица 4. Содержание фитогормонов в образцах бактериальной суспензии штамма Bacillus pumilus BIS88

№ образца ИУК, мкг/литр АБК, мкг/литр Транс-зеатин, мкг/литр Bacillus pumilus BIS88 366,1±12,5 0,646±0,02 0,822±0,04

Таким образом, экспериментально было показано, что препарат на основе штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88 содержит фитогормоны: индолилуксусную кислоту (ИУК), абсцизовую кислоту (АБК) и транс-зеатин (ТЗ).

Была проведена оценка влияния различных поллютантов (хлорид натрия, кадмий, свинец) на штаммы эндофитных бактерий: прототип - Bacillus pumilus A1.5 и заявляемый - Bacillus pumilus BIS88. Концентрации поллютантов и штаммы эндофитных бактерий были отобраны на основании полученных экспериментальных данных. Так, за минимальную концентрацию принималась концентрация поллютантов, уменьшающая длину надземной части растения пшеницы в два и более раз. Для свинца минимальная концентрация составила - 500, 800, 1500 мг/л, для кадмия - 300, 600, 900 мкмоль/л; для хлорида натрия 10 г/л (1%).

В качестве испытуемой культуры была выбрана озимая пшеница, сорт «Батько» (семена 1-ой репродукции). Загрязнение тяжелыми металлами имитировали растворимыми в воде солями: нитратом свинца (Pb(NO3)2) и сульфатом кадмия (CdSO4). Засоление субстрата проводили хлоридом натрия (NaCl). Для проведения опытов с тяжелыми металлами, была выбрана следующая схема: негативный контроль без поллютанта, позитивный контроль - с добавлением различных концентраций металла (для свинца- 500, 800, 1500 мг/л, для кадмия- 300, 600, 900 мкмоль/л) и инокуляцией штаммами эндофитных бактерий.

В каждую пробирку вносилось 34 мл кварцевого песка, затем добавляли 10 мл раствора, содержащего поллютант: нитрат свинца (Pb(NO3)2) и сульфат кадмия (CdSO4) и 15% питательный раствор (PNS). В случае со свинцом PNS не вносился, чтобы избежать образования малорастворимых соединений. Затем, пробирки стерилизовали в автоклаве в течение часа, при 1,5 атм. Стерилизацию семян проводили растворами этанола и гипохлорита натрия. Семена выдерживали в 70% растворе этанола, в течение 2-х минут и промывали в стерильной воде. Затем семена помещали в 30% раствор гипохлорита натрия и помещали на качалку на 20 минут, после промывали в стерильной воде и повторяли процедуру. Тщательно отмытые в стерильной воде семена раскладывались в стерильные чашки Петри, на фильтровальную бумагу, смоченную стерильной водой (5мл на чашку) и проращивались при температуре 28°С в течение суток. Инокуляция семян проводилась ночной (20-часовой) культурой микроорганизмов, выращенных на жидкой среде Луриа-Бертани, следующего состава (г/л): триптон -10,0, дрожжевой экстракт -5,0, Mg₂SO₄ - 2,5, pH=7,2. Стерильные проростки пшеницы, инокулировали бактериальной суспензией в течение 30 мин. В экспериментах использовали суспензии с концентрацией клеток 10⁶ КОЕ/мл. Инокулированные семена высаживали в песок, по 2 растения на пробирку (6 растений в варианте) и выращивали в течение 12 суток. Затем растения извлекали и измеряли длину побегов и корней. Результаты опытов представлены в Таблицах 5 и 6.

Таблица 5. Влияние кадмия на растения озимой пшеницы с. Батько при инокуляции семян штаммами эндофитных бактерий

Концентрация
кадмия Вариант опыта Средняя длина растений, см Средняя длина корней, см 300 мкмоль/л -Контроль 20,7 15,3 +Контроль 20,1 9,7 Bacillus pumilus A1.5
прототип 16,9 3,6 Bacillus pumilus BIS88
заявленный 18,5 11,6 600 мкмоль/л -Контроль 20,7 15,3 +Контроль 12,2 3,5 Bacillus pumilus A1.5
прототип 14,3 3,7 Bacillus pumilus BIS88
заявленный 15,1 3,9 900 мкмоль/л -Контроль 20,7 15,3 +Контроль 12,6 2,7 Bacillus pumilus A1.5
прототип 14,4 2,2 Bacillus pumilus BIS88
заявленный 14,8 4,5

Из данных в Таблице 5 видно, что штамм бактерий Bacillus pumilus BIS88 способен снимать абиотический стресс растений, вызываемый наличием солей кадмия в питательной среде, особенно при его высоких концентрациях - до 900 мкмоль/л. При этом штамм Bacillus pumilus BIS88 более эффективен по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus pumilus A1.5.

Таблица 6. Влияние свинца на растения озимой пшеницы с. Батько при инокуляции семян штаммами эндофитных бактерий

Концентрация
свинца Вариант опыта Средняя длина растений, см Средняя длина корней, см 500 мг/л -Контроль 17,1 16,4 +Контроль 15,5 11,0 Bacillus pumilus A1.5
прототип 16,1 11,5 Bacillus pumilus BIS88
заявленный 16,8 13,9 800 мг/л -Контроль 17,1 16,4 +Контроль 12,2 13,5 Bacillus pumilus A1.5
прототип 16,7 14,4 Bacillus pumilus BIS88
заявленный 18,4 15,6 1500 мг/л -Контроль 17,1 16,4 +Контроль 13,8 3,9 Bacillus pumilus A1.5
прототип 14,6 5,9 Bacillus pumilus BIS88
заявленный 15,8 7,5

Из данных, приведенных в Таблице 6, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus pumilus BIS88 способен снимать абиотический стресс растений, вызываемый наличием в питательной среде нитрата свинца (Pb(NO3)2), более эффективно по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus pumilus A1.5, особенно при его высоких концентрациях - до 1500 мг/л.

Результаты опытов с хлоридом натрия представлены в Таблице 7.

Таблица 7. Влияние хлорида натрия концентрацией 10 г/л на растения озимой пшеницы с. Батько при инокуляции штаммами эндофитных бактерий

Вариант опыта Средняя длина растений, см Средняя длина корней, см -Контроль 16,6 7,9 +Контроль 2,6 2,9 Bacillus pumilus A1.5 -
прототип 6,2 5,2 Bacillus pumilus BIS88 -
заявленный 9,0 8,9

Из данных в таблице 7 видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus pumilus BIS88 способен снимать абиотический стресс растений, вызываемый внесением в питательную среду 10 г/л хлорида натрия (поваренной соли), причем более эффективно по сравнению со штаммом- прототипом Bacillus pumilus A1.5.

Высокая ростостимулирующая активность заявляемого штамма эндофитных бактерий Bacillus pumilus BIS88 вызвана способностью создавать с растением растительно-микробную систему путем колонизация эндофитными бактериями корневой системы и внутренних тканей (эндосферы) растения, что было подтверждено опытным путем. Для исследований использовали следующие материалы. В качестве растительного материала использовали редис (Raphanus sativus L. var. Sativus) сорта «Дуро» и озимую мягкую пшеницу (Triticum aestivum L.) сорта «Веда».

Были отобраны по две грамположительные бактерии: Bacillus pumilus BIS88 и Bacillus pumilus A1.5 для использования в опыте по колонизации корней редиса сорта «Дуро» и озимой пшеницы сорта «Веда».

Бактерии выращивали на среде LС (г/л) - триптон 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; NaCl - 8,0; MgSO₄⋅7H₂O - 2,5; агар - 18, 1 мл 1М Tris буфера.

Колонизацию корней редиса и пшеницы бактериями изучали в гнотобиотических системах (Simons et al., 1996), содержащих стерильный кварцевый песок с добавлением 15% питательного раствора (PNS) следующего состава (на 1л): 5 mM KNO₃, 5 mM Ca(NO₃)₂, 2 mM MgSO₄, 1 mM KH₂PO₄.

Семена пшеницы стерилизовали 70% - раствором этилового спирта в течение 30 сек, затем 6 мин - 0,1% сулемы (HgCl₂).

Семена редиса стерилизовали 70% раствором этилового спирта в течение 30 сек, затем 5 мин - 3% раствором гипохлорита (HСlO).

После стерилизации все семена тщательно отмывали стерильной водой, меняя воду 5-6 раз и 30 минут на качалке.

Затем семена раскладывали в стерильные чашки Петри на увлажненные фильтровальные бумажки (5 мл на чашку) и проращивали при температуре 28°С в течение суток. Для инокуляции использовали ночную (20 часовую) культуру микроорганизмов, выращенную на качалке на жидкой среде LС при температуре 28°С. Клетки бактерий отделяли от ростовой среды центрифугированием и отмывали 0,85% раствором NaCl. Для инокуляции стерильные проростки редиса и пшеницы замачивали в течение 30 мин в суспензии с титром бактериальных клеток 10⁵ KOE/мл. Инокулированные проростки растений высаживали в кварцевый песок (на глубину 5-6 мм) в гнотобиотические системы по 1 растению на каждую систему. Повторность опыта - шестикратная. Растения пшеницы и редиса выращивали в фитотроне при 21°С в течение 5 суток, после чего их извлекали из системы и определяли приживаемость бактерий путем измерения их количества в ризосфере и на корнях растений.

Результаты измерений приведены в Таблицах 8 и 9.

Таблица 8. Приживаемость бактерий в ризосфере и на корнях озимой пшеницы с. «Веда»

Штамм
бактерий Численность бактерий Отношение числа бактерий на корне к числу бактерий в ризосфере, % Ризосфера Корень 10⁵
KOE/растение 10⁵ KOE/г
ризосферы 10⁵
KOE/корень Bacillus pumilus A1.5 - прототип 47 ± 5 35± 5 13 ± 3 27,6 Bacillus pumilus BIS88 - заявленный 79 ± 11 67 ± 9 25± 5 31,6

Таблица 9. Приживаемость бактерий в ризосфере и на корнях редиса с. «Дуро»

Штамм
бактерий Численность бактерий Отношение числа бактерий на корне к числу бактерий в ризосфере, % Ризосфера Корень 10⁵KOE/растение 10⁵ KOE/г
ризосферы 10⁵
KOE/корень Bacillus pumilus A1.5 - прототип 135 ± 11 290 ± 21 11,5 ± 1,7 8,5 Bacillus pumilus BIS88 - заявленный 217 ± 17 330 ± 23 14,5 ± 3,0 10,1

Результаты опытов по изучению приживаемости бактерий, в ризосфере и на корнях растений пшеницы и редиса, приведенные в таблицах 8 и 9, показали, что штаммы эндофитов способны эффективно колонизировать ризосфе-ру и корневую систему как однодольных (пшеница), так и двудольных растений (редис). Так, заявляемый штамм Bacillus pumilus BIS88 способен к более активной колонизации корней и ризосферы этих растений по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus pumilus A1.5.

При использовании заявляемого штамма бактерии Bacillus pumilus BIS88 в составе микробных препаратов важным является также и то, что бактерии образуют споры, что позволяет сохранять эти препараты без потери жизнеспособности бактерий в течение длительного срока, не менее 12 месяцев после получения препарата.

Концентрация (количество жизнеспособных клеток и спор) штамма бактерии Bacillus pumilus BIS88 для его эффективного использования в составе различных биопрепаратов должна составлять 10⁵-10⁹ клеток в 1 мл культуральной жидкости. Так как экспериментально установлено, что использование штамма в концентрации менее 10⁵ кл/мл ведет к снижению ростостимулирующего действия, а увеличение концентрации свыше 10⁹ кл/мл приводит к ингибированию роста растений.

Ниже приведен пример получения жидкой формы микробного препарата на основе заявляемого штамма эндофитных бактерий Bacillus pumilus ВIS88

Маточная культура

Для получения маточной культуры штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88 использовали жидкую питательную среду следующего состава:

патока - 15 г/л; кукурузный экстракт- 12,5 г/л; MgSO₄х7Н2О - 0,2 г/л; CaCl₂х2 Н₂О - 1,0 г/л; MnSO₄ - 0,1 г/л; рН 7,2 -7,5.

Полученную жидкую питательную среду разливали в 750 мл качалочные колбы по 100 мл и стерилизовали при 1 атм 30 минут. Затем провели инокуляцию питательной среды в колбах стерильно микробиологической петлей из пробирки со скошенным питательным агаром (состав среды см. выше), содержащим чистую культуру Bacillus pumilus BIS88. После этого колбы поместили на качалку (220 об/мин) и культивировали в течение 48 часов при температуре 33°С. Таким образом в колбах была получена маточная культура Bacillus pumilus BIS88 с титром бактерий около 3⋅10⁹ КОЕ/мл, которую хранили в холодильнике до 1 месяца при температуре (4-6)°С для последующего получения рабочей культуры в бутылях или ферментерах.

Рабочая культура

Для промышленного культивирования штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88 рабочую культуру получали в бутылях или ферментерах на аналогичной указанной выше среде. Норма инокуляции маточной культурой 5-7%, продолжительность культивирования 48 часов при температуре 33°С. При выращивании рабочих культур допускается повышение температуры до 35°С. Так получили концентрат бактериальной суспензии на основе штамма Bacillus pumilus BIS88 с титром бактерий не менее 3⋅10⁹ КОЕ/мл.

Жидкая форма биопрепарата на основе штамма Bacillus pumilus BIS88

Полученный концентрат бактериальной суспензии на основе штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88 разводили стерильной водой в соотношении 1:10 или 1:15. Полученную жидкую форму выдерживали в течение 3-5 дней при температуре 20-25°С до получения титра бактерий не менее 1,2⋅10⁸ КОЕ/мл препарата, после чего препарат можно применять для обработки сельскохозяйственных культур. Жидкий препарат стерильно разливали в полиэтиленовые бутылки или канистры емкостью 0,25; 0,5; 1,0 и 10,0 литров, которые предварительно ополаскивали спиртом.

Благодаря относительно высокой биологической активности используемого штамма и высокой скорости его роста, жидкий препарат в готовом виде, а также в производстве практически не заражается посторонней микрофлорой. Тем не менее, необходим постоянный контроль всех этапов получения биопрепарата на основе штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88.

Эффективность биопрепарата, полученного на основе штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88 указанным выше способом, была проверена в полевых опытах в Курганской области в отношении продуктивности яровой пшеницы районированного с. «Исеть 45» и ярового ячменя с. «Прерия».

Полевые опыты с пшеницей и ячменем проводили на черноземе, выщелоченном среднемощном среднесуглинистом, среднегумусном, гумус по Тюрину - 3,24%, нитратный азот - 8,3 мг/кг, фосфор - 64 мг/кг, калий - 150 мг/кг, РН водная 6,46. Предшественник - пар без выращивания растений. Фон удобрения - N6Р52 (аммофос). Предпосевная обработка - культивация на глубину 5-7 см, норма высева яровой пшеницы 5,0 млн всхожих зерен на гектар, ярового ячменя - 4 млн зерен.

Полевые опыты проводили согласно методике проведения исследований ВИУА (Оценка эффективности микробных препаратов в земледелии / под ред. Завалина А.А. - М.: Россельхозакадемия, 2000 г. - 82 с.). Размер учетной делянки- 25 м². Количество повторностей - 4 (четырехкратное).

В день посева часть семян пшеницы и ячменя ничем не обрабатывали (контроль), другие части этих семян обрабатывали жидким биопрепаратом на основе штамма-прототипа Bacillus pumilus A1.5, а последние части обрабатывали жидким препаратом на основе штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88, полученным описанным выше способом. При этом инокуляцию семян пшеницы и ячменя проводили из расчета 1л препарата на 9л воды. Опрыскивание растений проводили в фазу 3-5 листьев из расчета 1 л/га и в начале фазы трубкования из расчета 1л/га вручную с помощью ранцевого опрыскивателя из расчета 1л препарата на 100л воды на гектар. Агротехника выращивания пшеницы и ячменя соответствовала зональной технологии. Уборку урожая проводили комбайном «Сампо». Результаты в Таблицах 10-13.

Таблица 10. Структура урожая яровой пшеницы с. «Исеть 45»

Вариант
обработки препаратом
на основе Количество растений перед уборкой, шт/м² Количество продуктивных стеблей,
шт/ м² Длина колоса, см Кол-во колосков
в колосе, шт. Число зерен в колосе, шт. Масса 1000 зерен, г Контроль
(без обработки) 328 296 6,2 11,5 20,1 32 Штамм Bacillus
pumilus A1.5 -
прототип 340 300 6,5 12,6 24,0 33 Штамм Bacillus
pumilus BIS88 -
заявленный 360 324 6,8 13,4 24,2 34

Таблица 11. Урожайность и качество зерен яровой пшеницы с. «Исеть 45»

Вариант
обработки препаратом
на основе Урожайность, ц/га +/-
к контролю,
ц/га Содержание сырой
клейковины в зерне,
% Содержание
белка в зерне,
% Контроль
(без обработки) 21,1 - 26,4 12,4 Штамм Bacillus pumilus A1.5 - прототип 21,4 0,3 28,2 13,6 Штамм Bacillus рumilus BIS88 - заявленный 23,6 2,5 28,4 13,6

Сравнение данных по урожаю яровой пшеницы в Таблицах 10, 11, позволяет сделать вывод, что биопрепарат, полученный на основе заявленного штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88, обладает более сильным воздействием на урожайность (продуктивность) пшеницы по сравнению воздействием биопрепарата на основе штамма - прототипа Bacillus pumilus A1.5. Так, урожай зерна пшеницы увеличился на 2,5 ц/га по сравнению с контролем, а в варианте Bacillus pumilus A1.5 - только на 0,3 ц/га.

Таблица 12. Структура урожая ярового ячменя с. «Прерия»

Вариант
обработки препаратом на основе Количество растений перед уборкой, шт/м² Количество продуктивных стеблей,
шт/м² Длина колоса, см. Кол-во колосков в колосе, шт. Число зерен в колосе, шт. Масса 1000 зерен,
г Контроль
(без обработки) 216 608 6,7 13,2 13,9 49 Штамм Bacillus
pumilus A1.5 -
прототип 260 652 7,1 14,2 14,8 53 Штамм Bacillus
pumilus BIS88 -
заявленный 276 664 8,9 15,1 15,9 53

Таблица 13. Урожайность и качество ярового ячменя с. «Прерия»

Вариант
обработки препаратом на основе Урожайность, ц/га +/-
к контролю, ц/га Содержание белка
в зерне, % Контроль
(без обработки) 45,3 - 9,0 Штамм Bacillus pumilus A1.5 - прототип 47,6 2,3 10,6 Штамм Bacillus рumilus BIS88 - заявленный 48,9 3,5 11,6

Сравнение данных по урожаю ярового ячменя, приведенных в Таблицах 12 и 13, позволяет сделать вывод, что биопрепарат, полученный на основе заявленного штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88, обладает более сильным воздействием на урожайность (продуктивность) ячменя по сравнению воздействием биопрепарата на основе штамма - прототипа Bacillus pumilus A1.5. Так, урожай зерна Урожай зерна ячменя в варианте Bacillus pumilus BIS88 увеличился на 3,6 ц/га по сравнению с контролем, а в варианте Bacillus pumilus A1.5 - только на 2,3 ц/га. При этом содержание белка в зерне увеличилось на 1% по сравнению с вариантом - прототипом.

Эффективность биопрепарата на основе штамма Bacillus pumilus BIS88, была проверена в полевых опытах в Московской обл. на белокочанной капусте сорта «Амагер 611». Почвы опытного участка дерново-подзолистые среднесуглинистые. Агрохимическая характеристика пахотного (до 20 см) слоя почвы перед высадкой рассады была следующей: содержание гумуса по Тюрину -1,62%, реакция среды рНkcl - 6,1, гидролитическая кислотность 1,32 мг-экв./100 г почвы, сумма поглощенных оснований 19,2 мг-экв./100 г почвы, степень насыщенности основаниями 93,6%, содержание подвижного фосфора в среднем 472 мг/кг почвы, обменного калия 167 мг/кг почвы, минерального азота 9 мг/кг. Площадь опытной делянки - 20 м², учетной делянки - 10 м². Повторность опыта - 4-кратная.

Варианты опыта:

1. Контроль. Фон N120P120K180.

2. Фон NPK + опрыскивание биопрепаратом на основе штамма-прототипа Bacillus pumilus A1.5.

3. Фон NPK + опрыскивание биопрепаратом на основе штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88.

Обработка в вариантах 2 и 3: опрыскивание рассады перед высадкой, расход препарата - 1,0 л/га; опрыскивание растений: 1-е через 15 дней после высадки рассады, 2-е в фазе завязывания кочана, расход препарата - 4,5 л/га, расход рабочего раствора - 300 л/га.

Некорневую подкормку растений проводили путем опрыскивания растений при помощи опрыскивателя SOLO 444, с нормой расхода 300 л/га.

В течение периода вегетации проводили механизированные междурядные обработки и ручную прополку. Для борьбы с листогрызущими вредителями проводили 4-кратную обработку инсектицидами «БИ-58 новый» и «Децис-профи». Закладку полевых опытов, учеты и наблюдения проводили в соответствии с требованиями методики полевого опыта (Доспехов Б.А., 1985). Уборку капусты проводили вручную, урожай кочанов взвешивали на весах. Результаты опыта представлены в Таблице 14.

Таблица 14. Влияние биопрепаратов на основе штаммов эндофитных бактерий на урожайность белокочанной капусты сорта «Амагер 611»

Вариант опыта -
обработка био-
препаратом на
основе штамма Диаметр
кочана, см Высота
кочана, см Средняя масса кочана, кг Урожайность капусты, т/га Контроль
(без обработки) 15,7 13,8 1,80 45,5 Bacillus pumilus A1.5 - прототип 16,5 14,5 1,94 53,6 Bacillus pumilus BIS88 - заявленный 17,9 14,9 2,07 59,9

Данные в Таблице 14 позволяют сделать вывод, что биопрепарат на основе заявленного штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88, обладает более сильным воздействием на биометрические показатели и урожайность белокочанной капусты сорта «Амагер 611» по сравнению с биопрепаратом на основе штамма - прототипа Bacillus pumilus A1.5. Так, диаметр, высота и средняя масса кочана капусты в варианте со штаммом Bacillus pumilus BIS88 были больше, чем в варианте со штаммом - прототипом Bacillus pumilus A1.5. Урожай капусты в варианте со штаммом Bacillus pumilus BIS88 был больше, чем в контроле на 14,4 т/га, а в варианте с прототипом Bacillus pumilus A1.5 - только на 8,1 т/га.

Эффективность биопрепарата, полученного на основе штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88, была проверена в полевых опытах в Башкортостане на сахарной свекле сорта «Рамонская односеменная 47». Почва опытного поля представлена выщелоченным черноземом. Содержание гумуса в почве -5,8%, реакция среды рН 6,5, содержание фосфора по Чирикову - 91,1 мг/кг, содержание калия по Чирикову - 130,8 мг/кг. Сумма поглощенных оснований высокая 54-56 мг/экв., степень насыщенности основаниями - (96-98)%.

Площадь опытной делянки - 50 м², площадь учетной делянки - 25 м². Повторность опыта - четырехкратная.

Варианты опыта:

1. Контроль. Фон N120P140K140.

2. Фон NPK + опрыскивание биопрепаратом на основе штамма-прототипа Bacillus pumilus A1.5.

3. Фон NPK + опрыскивание биопрепаратом на основе штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88.

Опрыскивание растений: 1-е - в фазе 4-6 настоящих листьев, 2-е - в фазе смыкания ботвы в рядках, расход препарата- 3 л/га, расход рабочего раствора - 300 л/га. Некорневую подкормку проводили путем их опрыскивания при помощи опрыскивателя SOLO 444, с нормой расхода 300 л/га.

Уборку сахарной свеклы проводили вручную, урожай корнеплодов взвешивали на весах. Результаты опыта представлены в Таблице 15.

Таблица 15. Влияние штаммов эндофитных бактерий на урожайность сахарной свеклы сорта «Рамонская односеменная 47»

Вариант опыта -
обработка биопрепаратом на основе штамма Урожайность
сахарной свеклы, т/га Сахаристость
свеклы,
% Сбор сахара,
т/га Контроль
(без обработки) 27,43 16,70 8 Bacillus pumilus
A1.5 - прототип 30,27 17,06 5,16 Bacillus pumilus
BIS88 - заявленный 31,36 17,18 5,39

Данные в Таблице 15 позволяют сделать вывод, что биопрепарат на основе заявленного штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88, обладает более сильным воздействием на урожайность сахарной свеклы по сравнению с биопрепаратом на основе штамма - прототипа Bacillus pumilus A1.5. Урожай сахарной свеклы в варианте с штаммом Bacillus pumilus BIS88 был больше на 3,93 т/га, чем в контроле, а в варианте со штаммом - прототипом Bacillus pumilus A1.5 - только на 2,84 т/га. Кроме того, сахаристость свеклы в варианте со штаммом Bacillus pumilus BIS88 была выше, чем в варианте со штаммом - прототипом Bacillus pumilus A1.5 на 0,12%.

То есть результаты проведенных опытов подтверждают соответствующую высокую активность биопрепарата на основе штамма Bacillus pumilus BIS88 при возделывании сельскохозяйственных культур.

Таким образом, экспериментально было доказано, что штамм эндофитных бактерий Bacillus pumilus BIS88 является пригодным для использования в сельском хозяйстве в качестве эффективного универсального средства улучшения питания, ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и технических культур, а также для их защиты от фитопатогенных микроорганизмов и борьбы со стрессовыми факторами.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм эндофитных бактерий Bacillus pumilus BIS88, депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (ВКСМ) при ФГБНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 03199, проявляющий бактерицидную и фунгицидную активность, в качестве средства для улучшения питания, ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и технических культур и для борьбы со стрессовыми факторами хлоридного засоления и поллютантов. Установлено, что для эффективного использования штамма бактерий Bacillus pumilus BIS88 титр его жизнеспособных клеток и спор в составе различных биопрепаратов должен составлять 105-109 кл/мл культуральной жидкости. Изобретение позволяет ускорить рост и увеличить продуктивность зерновых, овощных и технических культур. 15 табл.

Штамм эндофитных бактерий Bacillus pumilus BIS88, депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (ВКСМ) при ФГБНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 03199, проявляющий бактерицидную и фунгицидную активность, в качестве средства для улучшения питания, ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и технических культур и для борьбы со стрессовыми факторами хлоридного засоления и поллютантов.