Способ моделирования фасциопатии у экспериментальных животных Российский патент 2020 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования подошвенной фасциопатии у лабораторных животных, с целью воспроизведения дегенеративных процессов в структурах подошвенного апоневроза для оценки эффективности консервативных и оперативных способов лечения, а также для изучения механизмов патогенеза.

Подошвенная фасциопатия относится к тендинопатиям, характеризующимся хронической болью в сухожилиях, апоневрозах и фасциях, связанной, как правило, с чрезмерной физической и осевой нагрузкой. Патогенетически изученными факторами патологического процесса являются: дегенерация коллагена, снижение васкуляризации, а также увеличение количества свободных афферентных нервных окончаний [Alfredson H, Ohberg L, Forsgren S. Is vasculoneural ingrowth the cause of pain in chronic Achilles tendinosis? An investigation using ultrasonography and colour Doppler, immunohistochemistry and diagnostic injections. Knee Surg Sports Traumatol Arthosc. 2003;11:334-338.], протекающие при отсутствии воспалительной реакции [Tasto, J.P. Radiofrequency-Based Micro-Tenotomy for Treatment of Chronic Tendinosis. 2003].

В настоящее время нет единого мнения о выборе метода лечения подошвенной фасциопатии. Консервативные варианты лечения обеспечивают ремиссию у 60-90% пациентов в течение полугода [Neufeld SK, Cerrato R. Plantar fasciitis: Evaluation and treatment. J Am Acad Orthop Surg 2008 June;16(6):338-46.]. При устойчивых к консервативным методам лечения случаях используют оперативные методы лечения, такие, как открытый или эндоскопический релиз апоневроза, чрескожное или открытое биполярное радиочастотное воздействие и пр. [Thomas ZM, Thomas KJ. Foot Ankle Spec. 2017 Jun;10(3):240-241. Technique Tip: Single-Incision Endoscopic Plantar Fasciotomy. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27885102]. Но, так как количество резистентных к консервативному лечению случаев подошвенной пяточной боли остается стабильным, сохраняется необходимость научного поиска новых методов хирургического лечения. Моделирование подошвенной фасциопатии на экспериментальных животных позволит оценивать эффективность оперативных методов лечения, основываясь на изучении патогенеза и патологической анатомии пораженного апоневроза. На данный момент в доступной научной литературе модели формирования подошвенной фасциопатии у экспериментальных животных не представлены.

Известен способ моделирования тендинопатии ахиллова сухожилия у крыс с использованием беговых дорожек и оценкой состояния сухожилия на 4, 8 и 16 неделе [Silva RD, Glazebrook MA, Campos VC, Vasconcelos AC, 2011; Kim BS, Joo YC, Choi BH, Kim KH, Kang JS, Park SR, 2015]. Хроническая перегрузка вызывала изменения в матриксе сухожилия и составе коллагена лабораторных животных, а также микроповреждения ткани сухожилия, выявляемые при морфометрической оценке гистологического материала. Недостатками этого способа являются сложная воспроизводимость метода, длительность формирования (4 месяца) и недостаточная эффективность модели – у 25% лабораторных животных не достигались выраженные клинические и морфологические проявления тендинопатии.

Известна модель дегенерации ткани ахиллова сухожилия у крыс путем перитендинозного введения эластазы [Wu YT, Wu PT, Jou IM, 2016], после чего авторы выявляли утолщение сухожилия, повышение клеточности и появление очаговых дегенеративных изменений в тканях, что соответствовало изменениям в сухожилиях при тендинопатии. Также известен способ формирования тендинопатии ахиллова сухожилия у кроликов при помощи введения коллагеназы [Novel animal model for Achilles tendinopathy: Controlled experimental study of serial injections of collagenase in rabbits / de Cesar Netto C et al. //PLoS One, 2018 13;13(2): e0192769.]. Наличие тендинопатии было подтверждено гистологически с использованием шкалы Bonar [Movin and Bonar scores a ssess the sa me chara cteristics of tendon histology / N. Maffulli [et al.] // Clin. Orthop. Relat. Res. – 2008. – Vol. 466. – P. 1605–1611.]. Недостатками этих моделей являются опасность развития глубоких некротических изменений в сухожилиях при интратендинозном введении, а также недоступность препаратов эластазы/коллагеназы в ампулах, необходимых для приготовления вводимого раствора.

Наиболее близким аналогом к предлагаемому способу (прототипом) является способ моделирования тендинопатии ахиллова сухожилия у крыс при помощи перитендинозных инъекций синтетического простагландина Е1 (PGE1) в дозе 5000 нг в 1 мл один раз в неделю в течение 4 недель [А. Sullo, N. Maffulli, G. Capasso, V. Testa, 2001]. По сообщению авторов, первоначально перитендинозные инъекции PGE1 вызывали острое воспаление в сухожилии и окружающих его тканях. На 7-й день показатели среднего содержания воды и средней массы влажных сухожилий были значительно выше в сухожилиях крыс, получающих PGE1, нежели в контрлатеральных контрольных сухожилиях (анализ рассеивания ANOVA; P 5 = 0, 02). На 21-й день около половины сухожилий, обработанных PGE1, демонстрировали фиброз паратенона с адгезией и внутрисухожильной (внутриствольной) дегенерацией, а другая половина по-прежнему демонстрировала картину острого воспаления. На 35-й день, во всех сухожилиях, обработанных PGE1, отмечались фиброз паратенона с адгезией и внутрисухожильной дегенерацией. На всех трех этапах забора материала не было доказательств наличия патологических изменений в сухожилиях, необрабатываемых PGE1. Авторы пришли к однозначному мнению, что длительное введение PGE1 вызывало пери- и интратендинозную дегенерацию, обеспечивая стабильное получение модели тендинопатии ахиллова сухожилия.

Однако, несмотря на схожие изменения, возникающие в тканях сухожилия при тендинопатии и в фасции при подошвенной фасциопатии, различия в биомеханике, физических параметрах и структуре сравниваемых анатомических образований делает некорректным изучение патологических изменений и ограничивает возможность изучения эффективности лечения фасциопатии на экспериментальной модели тендинопатии. Это является принципиальным препятствием использования всех вышеперечисленных моделей в изучении подошвенной фасциопатии и служит основанием для разработки экспериментальной модели.

Целью изобретения является создание доступной, воспроизводимой модели формирования подошвенной фасциопатии у половозрелых собак.

Изобретение направлено на разработку способа моделирования подошвенной фасциопатии с гистологической оценкой полученных изменений, в том числе и в соответствии с полуколичественной шкалой T. Movin и S. Bonar при окраске гематоксилином-эозином. Данная шкала основана на оценке соотношения коллагеновых волокон разных типов, состояния ядер теноцитов, межклеточного пространства, а также на наличии зон мукоидного набухания и количества новообразованных сосудов.

Сущностью заявляемого изобретения является то, что моделирование подошвенной фасциопатии проводится путем интра- и параапоневротического введения алпростадила – синтетического аналога естественного простагландина Е1, разведенного до концентрации 5000 нг в 1 мл конечного раствора, с периодичностью 1 раз в 7 дней на протяжении 28 дней. В результате у животных развивается медикаментозная фасциопатия, которая подтверждается гистологически с подсчетом по шкале T. Movin и S. Bonar после взятия биоптатов через 7 дней после последней инъекции (на 35 день от начала эксперимента).

Для технического решения поставленной задачи были использованы беспородные половозрелые собаки, массой 7,7 ± 2,1 кг, возрастом от 10 до 16 месяцев, препарат «Алпростан» (Alprostan®, ZENTIVA k.s. (Чешская Республика), действующее вещество: алпростадил (Alprostadil) в дозировке 5000 нг на каждое введение.

Предлагаемый способ моделирования подошвенной фасциопатии у собак осуществляли следующим образом. Препарат «Алпростан» разводили физиологическим раствором до концентрации 5000 нг в 1 мл конечного раствора. Раствор вводили в тазовую конечность на 1 см дистальнее места прикрепления апоневроза к пяточной кости пери- и интраапоневротически один раз в неделю в течение 4 недель. Суммарная доза алпростадила, введенная в апоневроз составила 20000 нг. Для обезболивания использовали только поверхностный наркоз препаратом «Пропофол», вводимый дробно внутривенно.

После первого введения препарата собаки начинали щадить эту лапу, прихрамывать; после последнего – четвертого – практически не наступали на нее. Забор материала для морфологического исследования, с целью подтверждения наличия фасциопатии у экспериментальных животных производился на 35-е сутки от начала эксперимента (через 7 суток после последнего введения препарата) из конечности, куда вводился препарат в стерильных условиях. Размер резецируемого участка апоневроза составлял 2х0,5 см, что не нарушало функционирования сохранившихся тканей (Фиг.1). Рана после забора материала ушивалась наглухо, собаки помещались в стандартные лабораторные условия. В процессе исследования все животные остались живыми, не отмечалось ни одного случая инфекции в области инъекций препарата в подошвенный апоневроз. Эвтаназия после окончания эксперимента либо после вывода животного из эксперимента не производилась.

После серии инъекций алпростадила подошвенный апоневроз макроскопически выглядел отечным, с диффузными участками размягчения, гиперемии, а также расширенными поверхностными сосудами. При гистологическом исследовании (на 35-е сутки от первого введения алпростадила) у всех животных в апоневрозе была получена картина фасциопатии, заключающаяся в диффузной дегенерации соединительной ткани с небольшим количеством воспалительных клеток, повышенной волнистостью и разделением коллагеновых волокон, неравномерным гофрированием, разной степенью потери ими упорядоченности и параллельной ориентации (Фиг.2). Кроме того, отмечалось снижение общей плотности коллагена в волокнах, уменьшение диаметра, микроразрывы и очаговая потеря структурности самих волокон, приводящие в ряде случаев к их гиалинизации. Изменялся и клеточный состав апоневроза: при общем увеличении васкуляризации и клеточности апоневроза, массово определялись пикнотически измененные ядра фибробластов. Полученные микроскопические данные при оценке по шкале Bonar составили 7,1±1,97 баллов, достигая в отдельных полях зрения 11 баллов. В 95% всех измерений этот показатель варьировался в большинстве полей зрения в пределах 5–9 баллов, что объективизировало патологические изменения. Таким образом, введение алпростандила обеспечивало развитие клинической модели подошвенной фасциопатии, подтвержденной морфологическими изменениями при гистологической верификации дегенеративного процесса, отличающейся репрезентативностью, доступностью, воспроизводимостью, технической простотой, не требующей применения сложного оборудования и длительной анестезии животных.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования подошвенной фасциопатии у лабораторных животных. Способ включает введение в подошвенный апоневроз тазовой конечности собак препарата алпростадил, разведенного до концентрации 5000 нг в 1 мл конечного раствора. Раствор алпростадила вводят интра- и параапоневротически на 1 см дистальнее места прикрепления подошвенного апоневроза к пяточной кости один раз в неделю в течение 4 недель в суммарной дозе 20000 нг. Использование изобретения позволяет смоделировать у 100% экспериментальных животных длительно текущие дегенеративные изменения в структуре апоневроза, сходные с таковыми у человека, что необходимо для разработки способов лечения подошвенной фасциопатии и оценки их эффективности, клиническая модель отличается репрезентативностью, доступностью, воспроизводимостью, технической простотой и не требует применения сложного оборудования и длительной анестезии животных. 2 ил.

Способ моделирования подошвенной фасциопатии у экспериментальных животных, включающий введение в подошвенный апоневроз тазовой конечности собак препарата алпростадил, разведенного до концентрации 5000 нг в 1 мл конечного раствора, отличающийся тем, что раствор алпростадила вводят интра- и параапоневротически на 1 см дистальнее места прикрепления подошвенного апоневроза к пяточной кости один раз в неделю в течение 4 недель в суммарной дозе 20000 нг.