ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕЕ БИОСОВМЕСТИМОСТЬ ПОКРЫТИЕ ДЛЯ НЕПРЕРЫВНОГО ИЗМЕРЕНИЯ АНАЛИТА Российский патент 2021 года по МПК A61B5/145 G01N33/543 C12Q1/26 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к биосенсору для определения аналита, содержащему сенсорный модуль, по меньшей мере частично покрытый обеспечивающим биосовместимость слоем, причем обеспечивающий биосовместимость слой содержит полимер, имеющий боковые группы -СО-NR¹R², где R¹ и R² независимо выбраны из -Н и C₁-С₆-алкила. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу изготовления указанного биосенсора, а также к применениям и способам использования, относящимся к указанному биосенсору.

Уровень техники

Биосенсоры для измерения аналитов в биологических жидкостях, в частности сенсоры, рассчитанные на имплантацию, должны выполнять ряд функций: с одной стороны, сенсор должен обеспечивать специфичность и чувствительность измерения, исключая воздействие помех, возникающих, например, от определенных соединений, таких как клетки, содержащихся в физиологических жидкостях. С этой целью биосенсоры часто покрывают мембранами, задерживающими определенные соединения, чтобы обеспечить возможность доступа к собственно сенсорному модулю только для низкомолекулярных соединений, т.е. соединений с низким молекулярным весом. С другой стороны, для имплантируемых сенсоров предпочтительно, чтобы такие сенсоры могли оставаться на месте их установки в течение долгого времени без снижения качества измерения, чтобы избавить пациента от необходимости частой замены сенсора. Соответственно, имплантируемые сенсоры покрывают биосовместимыми полимерами, чтобы избежать восприятия организмом имплантированного сенсора как инородного тела и отторжения сенсора. Кроме того, подходящий биосовместимый слой должен препятствовать осаждению на мембране составных компонентов физиологических жидкостей, например полипептидов или клеток, поскольку это ведет к забиванию пор мембраны, что вызывает увеличение измерительного шума и уменьшение интенсивности полезного сигнала.

В частности, было замечено, что на имплантированных биосенсорах часто образуется слой клеток, что препятствует прохождению к сенсору молекул, неспособных легко диффундировать через слой клеток, в том числе, например, молекул глюкозы. Соответственно, было предложено предусмотреть мембрану, мешающую образованию барьерного клеточного слоя, и защитить чувствительные зоны имплантируемого устройства от биообрастания за счет включения в биоинтерфейсную мембрану биоактивных агентов (US 2006/0198864 А1). Кроме того, для улучшения характеристик биосенсоров применяются биосовместимые полимеры, такие как составы ADAPT™. Hu и коллеги разработали предохраняющее от обрастания цвиттерионное покрытие для биосенсоров на базе ферментов (Hu и соавт., Langmuir, 2016, 32, 11763-11770), основанное на pSBMA (поли-N-(3-сульфопропил)-N-(метакрилоксиэтил)-N,N-диметиламмонийбетаин) с использованием электрохимически индуцированной радикальной полимеризации с переносом атома (eATRP). Krishnan и коллеги в своей работе (Krishnan и соавт., J. Mater. Chem., 2008, 18, 3405-3413) обсуждают ряд полимеров с противобиообрастающим действием, в том числе гидрофильные пегилированные полимеры, цвиттерионные полимеры и полимеры, содержащие олигосахаридные группы, главным образом в контексте судовых покрытий.

Тем не менее, у биосенсоров, например у имплантируемых биосенсоров для непрерывного мониторирования гликемии (НМГ), с используемыми в настоящее время биосовместимыми полимерами проявление признаков ощутимого обрастания может начаться после относительно короткого времени ношения.

Решаемая задача

Поэтому в основу настоящего изобретения была положена задача предложить усовершенствованные средства и способы для покрытия биосенсоров, позволяющие по меньшей мере частично устранить недостатки уровня техники, что в особенности касается процессов обрастания и капсулирования.

Раскрытие сущности изобретения

Эта задача решается в предлагаемых в настоящем изобретении средствах и способах, охарактеризованных признаками независимых пунктов формулы изобретения. Предпочтительные варианты осуществления изобретения, которые могут быть реализованы в отдельности или в любой комбинации, указаны в зависимых пунктах формулы изобретения.

Соответственно, настоящее изобретение относится к сенсору для определения аналита, содержащему сенсорный модуль, по меньшей мере частично снабженный обеспечивающим биосовместимость покрытием, причем обеспечивающее биосовместимость покрытие содержит полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², где R¹ и R² независимо выбраны из -Н и C₁-C₆-алкила.

В тексте описания и формулы изобретения термины "имеет", "содержит", "включает (в себя)" или любые их грамматические разновидности употребляются неисключительным образом, оставляя соответствующие формулировки открытыми. Таким образом, эти термины могут использоваться как в ситуации, в которой в соответствующем объекте в контексте изобретения отсутствуют какие-либо иные признаки, кроме признака, вводимого этими терминами, так и в ситуации, в которой также присутствует один или несколько других признаков. Например, выражения "А имеет Б", "А содержит Б" и "А включает в себя Б" могут использоваться как в ситуации, в которой в объекте А отсутствуют другие элементы, кроме Б (т.е. в ситуации, в которой А состоит из Б и только из Б), так и в ситуации, в которой в объекте А, помимо Б, присутствует один или несколько других элементов, например, элемент В, элементы Г и Д или другие дополнительные элементы.

Далее, ниже по тексту выражения "предпочтительно", "более предпочтительно", "особенно", "преимущественно", "в частности", "прежде всего" или аналогичные выражения используются в отношении факультативных признаков, не ограничивая других возможностей. Поэтому признаки, вводимые этими выражениями, являются факультативными, т.е. необязательными, и предполагается, что они никоим образом не ограничивают объема патентных притязаний. Как должно быть понятно специалисту, осуществление изобретения возможно с использованием альтернативных признаков. Аналогичным образом, признаки, вводимые выражением "в одном варианте (осуществления изобретения)" или аналогичными выражениями, предполагаются факультативными и не подразумевают каких бы то ни было ограничений в отношении других вариантов осуществления изобретения, в отношении объема правовой охраны изобретения и в отношении возможностей комбинирования вводимых таким образом признаков с другими факультативными или обязательными признаками изобретения.

В контексте изобретения термин "стандартные условия", если не указано иное, относится к стандартным условиям ИЮПАК в отношении температуры и давления окружающей среды, т.е., в одном варианте осуществления изобретения он относится к температуре 25°С и абсолютному давлению 100 кПа; также в одном варианте осуществления изобретения стандартные условия включают в себя рН=7. Кроме того, если не оговорено иное, слова "примерно", "приблизительно" или "около", предваряющие указание того или иного значения, означают применимость технических допусков на указанное значение, общепринятых в соответствующей области техники, причем в одном варианте осуществления изобретения эти слова указывают на то, что допустимые отклонения указанного значения составляют ±20%, в еще одном варианте осуществления изобретения допустимые отклонения составляют ±10%, в еще одном варианте осуществления изобретения допустимые отклонения составляют ±5%. Кроме того, термин "по существу" указывает на то, что отклонения, влияющие на указанный результат или применение, отсутствуют, т.е. потенциальные отклонения не приводят к тому, что указанный результат отклоняется более чем на ±20%, в еще одном варианте осуществления изобретения более чем на ±10%, в еще одном варианте осуществления изобретения - более чем на ±5%. Так, выражение "состоящий по существу из" означает включение в состав указанных в этом выражении компонентов и исключение других компонентов, кроме материалов, присутствующих в виде примесей, материалов, неизбежно присутствующих в результате проведения процессов, используемых для получения этих компонентов, и компонентов, добавляемых с иной целью, нежели достижение технического результата изобретения. Например, композиция, определяемая с использованием фразы "состоящая по существу из", включает в себя любую известную приемлемую добавку, наполнитель, разбавитель, носитель и т.п. В одном варианте осуществления изобретения композиция, состоящая по существу из некоего набора компонентов, будет содержать неуказанный(-ые) в этом наборе компонент(-ы) в количестве менее 5 мас. %, в еще одном варианте осуществления изобретения в количестве менее 3 мас. %, в еще одном варианте осуществления изобретения в количестве менее 1%, в еще одном варианте осуществления изобретения - в количестве менее 0,1 мас. %.

Термин "биосенсор" в контексте изобретения относится к устройству, содержащему средства, рассматриваемые в данном описании. Биосенсор содержит по меньшей мере сенсорный модуль и обеспечивающий биосовместимость слой, которые описываются ниже. В одном варианте осуществления изобретения биосенсор является имплантируемым, в частности имплантируемым подкожно. В одном варианте осуществления изобретения биосенсор является полностью имплантируемым, т.е. биосенсор имплантируется вместе со своими средствами внешней связи, т.е. связи с внешними устройствами, при этом, в частности, для работы биосенсора не требуется отверстие в коже субъекта. Так, в одном варианте осуществления изобретения взаимодействие биосенсора с внешними устройствами осуществляется посредством беспроводной связи. Как должно быть понятно специалисту, для введения биосенсора в тело может требоваться отверстие в коже субъекта.

В одном варианте осуществления изобретения сенсор также имеет окно, т.е. отверстие, позволяющее сенсорному модулю контактировать с окружающей средой, в частности физиологической жидкостью. В одном варианте осуществления изобретения указанное окно расположено вблизи сенсорного модуля, а обеспечивающий биосовместимость слой, при необходимости в комбинации с диффузионной мембраной, отделяет сенсорный модуль от анализируемой среды. Кроме того, в частном случае, когда биосенсор является имплантируемым, он также содержит электрические и электронные средства, в том числе, например, источник энергии, такой как батарея, и/или коммуникационный блок для обмена информацией с внешним устройством, например для передачи значений аналита. Из уровня техники широко известны средства, подходящие для реализации источников энергии и коммуникационных блоков. В одном варианте осуществления изобретения биосенсор также содержит обрабатывающий блок, преобразующий обнаруживаемый сигнал или полученный из него физический сигнал, например электрический сигнал, в сигнал, передаваемый в считывающий блок, например считыватель. В еще одном варианте осуществления изобретения обрабатывающий блок преобразует обнаруживаемый сигнал или полученный из него физический сигнал в измеренное значение (результат измерения), например в концентрацию аналита. Следует иметь в виду, что вышеупомянутые средства могут выполнять дополнительные функции, и что биосенсор может содержать и другие средства, уместные с точки зрения специалиста.

В одном варианте осуществления изобретения биосенсор также содержит диффузионную мембрану. Термин "диффузионная мембрана" в контексте изобретения относится к полимеру, допускающему диффузию аналита, т.е. позволяющему аналиту диффундировать через себя, в частности относится к полимеру толщиной от 1 до 100 мкм, в частности - толщиной от 2,5 до 50 мкм. В одном варианте осуществления изобретения диффузионная мембрана содержит биосовместимый полимер, в частности полимер, полученный полимеризацией мономеров бутилметакрилата (BUMA) и/или 2-гидроксиэтилметакрилата (НЕМА), или состоит из такого биосовместимого полимера. В еще одном варианте осуществления изобретения диффузионная мембрана содержит а гидрофильный полиуретановый полимер (HPU). В еще одном варианте осуществления изобретения диффузионная мембрана допускает диффузию аналита, но не высокомолекулярных компонентов, содержащихся в анализируемой среде, например в физиологической жидкости. Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения диффузионная мембрана, в частности, допускает диффузию молекул с молекулярной массой менее 10 кДа, в частности менее 5 кДа, в частности менее 1 кДа. Так, в одном варианте осуществления изобретения диффузионная мембрана представляет собой полупроницаемую мембрану, в частности диализную мембрану, прежде всего биосовместимую диализную мембрану.

В одном варианте осуществления изобретения биосенсор полностью покрыт обеспечивающим биосовместимость слоем. В еще одном варианте осуществления изобретения сенсор изготовлен из инертного материала и содержит окно, описанное выше, причем такое окно по меньшей мере частично покрыто обеспечивающим биосовместимость слоем; или окно и/или сенсорный модуль по меньшей мере частично покрыты по меньшей мере обеспечивающим биосовместимость слоем, причем выражение "по меньшей мере частично покрыто" означает, что обеспечивающим биосовместимость слоем покрыта по меньшей мере площадь поверхности, достаточная для выполнения измерения аналита. В одном варианте осуществления изобретения мембраной, обеспечивающей биосовместимость, покрыто по меньшей мере 25%, в еще одном варианте по меньшей мере 50%, в еще одном варианте по меньшей мере 75%, в еще одном варианте - по меньшей мере 90%, площади окна и/или тестового поля сенсорного модуля, как указано ниже.

В одном варианте осуществления изобретения биосенсор представляет собой электрохимический биосенсор; таким образом, биосенсор может содержать дополнительные электрические выводы и контакты. В одном варианте осуществления изобретения биосенсор содержит дополнительные электроды, которыми могут быть электроды, обладающие описанными ниже признаками, или электроды, отличающиеся от них конструктивно и/или функционально. Дополнительные электроды могут быть приспособлены, например, для использования при контроле заполнения, в качестве датчика температуры и т.п. В одном варианте осуществления изобретения биосенсор также содержит противоэлектрод, в еще одном варианте осуществления изобретения также содержит электрод сравнения и противоэлектрод. Из уровня техники известно, что биосенсор может содержать три электрода, каждому из которых соответствует рабочий (индикаторный) электрод, противоэлектрод и электрод сравнения ("трехэлектродная схема"); или биосенсор может содержать два электрода, одним из которых является рабочий электрод, а вторым - противоэлектрод и электрод сравнения ("двухэлектродная схема"). Как указано выше, биосенсор также может содержать дополнительные электроды. В контексте настоящего изобретения по меньшей мере рабочий электрод находится в электрическом, т.е. проводящем, контакте по меньшей мере с участком тестового поля.

В одном варианте осуществления изобретения биосенсор представляет собой оптический биосенсор; таким образом, биосенсор может содержать дополнительные оптические средства, например осветительный блок и/или чувствительный к оптическому излучению (светочувствительный) элемент, например фотоэлемент. В одном варианте осуществления изобретения сенсорный модуль содержит по меньшей мере один источник света для освещения по меньшей мере части тестового поля, рассматриваемого в данном описании, и содержит по меньшей мере один чувствительный к оптическому излучению элемент, способный определять свет обнаружения (отклика), исходящий от указанного тестового поля. Так, в одном варианте осуществления изобретения сенсорный модуль содержит по меньшей мере один источник света, например светоизлучающий диод (СИД). В одном варианте осуществления изобретения вышеупомянутый свет обнаружения (отклика) выбран из группы, состоящей из света, отражаемого тестовым полем, света, пропускаемого тестовым полем, и света, излучаемого тестовым полем. В одном варианте осуществления изобретения чувствительный к оптическому излучению элемент включает в себя по меньшей мере один элемент, способный регистрировать свет, излученный источником света и отраженный и/или пропущенный тестовым полем. Указанный чувствительный к оптическому излучению элемент может представлять собой, например, фотодиод. В одном варианте осуществления изобретения чувствительный к оптическому излучению элемент включает в себя по меньшей мере одну одномерную или двумерную матрицу чувствительных к оптическому излучению элементов, в одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один чип камеры, в частности по меньшей мере один чип на приборах с зарядовой связью (ПЗС). В одном варианте осуществления изобретения оптический сигнал после его регистрации преобразуется в электрический сигнал, и таким образом биосенсор может содержать дополнительные элементы, описанные выше для электрохимического сенсора и уместные с точки зрения специалиста.

Термин "сенсорный модуль" в контексте изобретения относится к устройству, содержащему по меньшей мере одно тестовое поле, генерирующее в присутствии аналита обнаруживаемый сигнал, а при необходимости также содержащему узел обнаружения сигналов, обнаруживающий и/или преобразующий обнаруживаемый сигнал в выходной сигнал, например электрический выходной сигнал, например в ток, напряжение и т.п. В одном варианте осуществления изобретения сенсорный модуль выбран из оптического сенсорного модуля и электрохимического сенсорного модуля, как указано выше. В принципе, оба этих типа сенсорного модуля известны из уровня техники.

Термин "обнаруживаемый сигнал" в контексте изобретения относится к свойству аналитического (индикаторного) реагента, которое изменяется в присутствии аналита и которое может быть переведено в физический сигнал любого рода. В одном варианте осуществления изобретения изменение этого измеряемого свойства и/или генерируемого на его основе сигнала является пропорциональным концентрации аналита в пробе. В одном варианте осуществления изобретения, как описано выше, измеряемое свойство представляет собой изменение цвета и/или интенсивности цвета аналитического реагента, т.е. в частности, изменение спектра поглощения и/или излучения аналитического реагента. Таким образом, при изменении измеряемого свойства оптическое свойство в одном варианте осуществления изобретения выбрано из группы, состоящей из: свойства отражения, в частности отражающей способности и/или диффузного отражения; свойства пропускания, в частности поглощения; цвета; люминесценции, в частности флуоресценции. Также в одном варианте осуществления изобретения измеряемое свойство представляет собой концентрацию восстановившегося или окислившегося окислительно-восстановительного соединения, например медиатора, как это рассматривается в данном описании. Методы преобразования измеряемого свойства, определенного выше, в физический сигнал, который может считываться в качестве измеренного значения, хорошо известны в уровне техники и описаны, например, в публикациях ЕР 0821234, ЕР 0974303 и US 2005/0023152.

В одном варианте осуществления изобретения измеряемое свойство представляет собой состояние окисления-восстановления окислительно-восстановительного соединения, содержащегося в аналитическом реагенте, и обнаруживается электрохимическими средствами, например, путем измерения напряжения, емкости, полной проводимости (адмитанса), тока или любого параметра, уместного с точки зрения специалиста. Так, настоящее изобретение также предусматривает, что аналитический реагент включает в себя химический реагент для реагирования с аналитом с выработкой электрохимического сигнала, характеризующего присутствие аналита в пробе жидкости. В случае глюкозы как предпочтительного аналита активные компоненты аналитического реагента, как правило, включают в себя фермент, использующий, в частности использующий специфически, глюкозу, и при необходимости медиатор окисления-восстановления. В еще одном варианте осуществления изобретения указанный фермент включает в себя глюкозооксидазу и/или глюкозодегидрогеназу. В одном варианте осуществления изобретения фермент в присутствии аналита продуцирует восстановленный кофактор, например НАД(Ф)Н, а медиатор, в свою очередь, реагирует с восстановленным кофактором. Затем медиатор переносит окислительно-восстановительный эквивалент продукта аналита на поверхность электрода за счет диффузии. Там медиатор окисляется количественно при определенном анодном потенциале, и результирующий ток соотносится с кажущейся концентрацией глюкозы. Предпочтительными медиаторами окисления-восстановления обычно являются быстро восстанавливающиеся и окисляющиеся молекулы. В качестве примеров можно назвать феррицианид, нитрозоанилин и их производные, а также ферроцен и его производные. В еще одном варианте осуществления изобретения фермент, например глюкозооксидаза, продуцирует пероксид, в частности пероксид водорода, который определяется электрохимически. Существует ряд систем реагентов, пригодных для определения глюкозы, к примерам которых относятся решения, касающиеся возбуждения переменным током, сенсоров аналита и биосенсоров, описанные в патентах US 5385846, US 5997817 и в заявке №10/008788 на перевыдачу патента США ("Тест-полоска с электрохимическим биосенсором"); реагента кНАД (карбаНАД), описанного в публикациях WO 2007/012494, WO 2009/103540, WO 2011/012269, WO 2011/012270 и WO 2011/012271, и реагента SCV, описанного в публикациях ЕР 0354441, ЕР 0431456.

В еще одном варианте осуществления изобретения аналитическая реакция сопровождается изменением цвета аналитического реагента или по меньшей мере его части. В одном варианте осуществления изобретения аналитический реагент включает в себя по меньшей мере один фермент, который, в частности непосредственно или опосредованно, реагирует с аналитом, прежде всего реагирует с высокой специфичностью, причем в аналитическом реагенте также присутствует одно или несколько оптических индикаторных веществ, которые при реакции по меньшей мере одного фермента с аналитом свидетельствуют по меньшей мере об одном изменении оптически обнаруживаемого свойства. Так, по меньшей мере один индикатор может включать в себя один или несколько красителей, участвующих в окрашивающей реакции, свидетельствующей о ферментативной реакции по меньшей мере одного фермента и аналита. Пример оптического определения аналита раскрыт, например, в публикации WO 2015/005953 А1.

Термин "тестовое поле" в контексте изобретения относится к непрерывному (связному) или прерывному (несвязному) количеству аналитического реагента, которое, в частности, расположено на по меньшей мере одном носителе, например, на по меньшей мере одном пленочном носителе. Так, аналитический реагент, рассматриваемый в других местах описания, может образовывать одну или несколько пленок или слоев тестового поля или может содержаться в такой(-их) пленке(-ах) или в таком(-их) слое(-ях) тестового поля, и/или тестовое поле может содержать слоистую структуру с одним или несколькими слоями, в которой по меньшей мере один из слоев содержит аналитический реагент. Так, тестовое поле может содержать расположенную на носителе слоистую структуру, причем проба может контактировать со слоистой структурой по меньшей мере с одной стороны нанесения пробы. В одном варианте осуществления изобретения тестовое поле имеет многослойную структуру, содержащую по меньшей мере один аналитический слой, имеющий по меньшей мере один аналитический реагент, а также содержащую по меньшей мере один разделительный слой, способный отделять по меньшей мере один состоящий из частиц компонент, содержащийся в физиологической жидкости, причем разделительный слой расположен между аналитическим слоем и местом доступа пробы.

Термины "аналитический реагент" или "аналитический материал" относятся к веществу или смеси веществ, которое(-ые) в присутствии аналита способно(-ы) вызывать изменение по меньшей мере одного измеряемого свойства. В одном варианте осуществления изобретения аналитический материал в присутствии аналита участвует по меньшей мере в одной оптически или электрохимически обнаруживаемой аналитической реакции. В одном варианте осуществления изобретения аналитическая реакция протекает, по меньшей мере частично, при посредстве по меньшей мере одного фермента, и соответственно в одном варианте осуществления изобретения аналитический материал включает в себя по меньшей мере один фермент, способный в присутствии аналита участвовать по меньшей мере в одной ферментативной реакции. Что касается аналитического реагента, из уровня техники известны различные возможности получения аналитических реагентов. Аналитический реагент выбирают по определяемому аналиту.

Термин "фермент" в контексте изобретения относится к биологической макромолекуле, в частности к полипептиду, катализирующей в присутствии аналита химическую реакцию, в результате которой образуется или расходуется соединение, обеспечивающее обнаруживаемый сигнал. В одном варианте осуществления изобретения фермент представляет собой оксидоредуктазу, в частности оксидазу; в еще одном варианте осуществления изобретения фермент производит в присутствии аналита пероксид, в частности производит пероксид водорода; таким образом, в одном варианте осуществления изобретения фермент представляет собой производящую пероксид водорода оксидазу, например глюкозооксидазу (КФ 1.1.3.4), гексозооксидазу (КФ 1.1.3.5), холестериноксидазу (КФ 1.1.3.6), галактозооксидазу (КФ 1.1.3.9), алкогольоксидазу (КФ 1.1.3.13), L-гулонолактоноксидазу (КФ 1.1.3.8), НАД(Ф)Н-оксидазу (образующую Н₂О₂, КФ 1.6.3.1), НАДН-оксидазу (образующую Н₂О₂, КФ 1.6.3.3) или каталазу (КФ 1.11.1.6). В одном варианте осуществления изобретения, рассматриваемом в других местах описания, аналит представляет собой глюкозу. Таким образом, по меньшей мере один фермент может включать в себя фермент, в частности оксидоредуктазу, имеющий в качестве субстрата глюкозу, в частности может включать в себя глюкозооксидазу и/или глюкозодегидрогеназу. В еще одном варианте осуществления изобретения фермент представляет собой глюкозооксидазу (КФ 1.1.3.4). В этом отношении можно сослаться на вышеупомянутые документы уровня техники. В частности, можно сослаться на работу и соавт.: The Technology Behind Glucose Meters: Test Strips (Технические средства глюкометров: тест-полоски), Diabetes Technology & Therapeutics, том 10, дополнение 1, 2008, стр. 10-26. Вместе с тем, могут использоваться и другие типы ферментов и/или другие типы аналитического реагента или активных компонентов аналитического реагента.

Термин "обеспечивающий биосовместимость слой" в контексте изобретения относится к слою, в частности крайнему наружному слою, биосенсора или его части, состоящему из биосовместимого материала. В одном варианте осуществления изобретения обеспечивающий биосовместимость слой имеет толщину от 5 нм до 100 мкм, в частности от 10 нм до 1 мкм. В одном варианте осуществления изобретения обеспечивающий биосовместимость слой по меньшей мере частично покрывает тестовое поле сенсорного модуля, в еще одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере частично покрывает сенсорный модуль, в частности полностью покрывает участки сенсорного модуля, не контактирующие с другими элементами биосенсора, прежде всего по меньшей мере частично или полностью покрывает биосенсор. В одном варианте осуществления изобретения обеспечивающий биосовместимость слой является крайним наружным слоем сенсорного модуля и/или биосенсора. Так, в одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере часть обеспечивающего биосовместимость слоя контактирует с физиологической жидкостью субъекта. В одном варианте осуществления изобретения обеспечивающий биосовместимость слой не ограничивает диффузию для аналита, как это рассматривается в других местах описания; в еще одном варианте осуществления изобретения обеспечивающий биосовместимость слой не ограничивает диффузию для малых молекул, имеющих молекулярный вес менее 2000 Да, в частности менее 1000 Да. В одном варианте осуществления изобретения обеспечивающий биосовместимость слой не содержит добавленного фермента, в частности не содержит добавленного полипептида; как должно быть ясно специалисту, это не исключает того, что молекулы фермента или полипептида диффундируют в обеспечивающий биосовместимость слой из соседних слоев, тканей или физиологических жидкостей.

Термин "биосовместимый материал" в контексте изобретения относится к материалу, пригодному для использования с живой тканью или в живой системе благодаря тому, что такой материал не является или является лишь в уменьшенной степени токсичным, вредным или вызывающим физиологические реакции, и/или тому, что он вызывает лишь в уменьшенной степени или не вызывает иммунологического отторжения. В одном варианте осуществления изобретения биосовместимый материал представляет собой материал, не вызывающий системного ответа организма, например инертный материал или материал, содержащий химические соединения, предотвращающие возникновение системных ответов организма в области обеспечивающего биосовместимость слоя. В еще одном варианте осуществления изобретения биосовместимый материал представляет собой материал, препятствующий прикреплению клеток к указанному обеспечивающему биосовместимость слою. В еще одном варианте осуществления изобретения, как указано выше, биосенсор содержит по меньшей мере два слоя, из которых наружным слоем является слой,

содержащий указанный полимер с боковыми группами -C(O)-NR¹R², т.е. обеспечивающий биосовместимость слой. В одном варианте осуществления изобретения вторым слоем является диффузионная мембрана, рассматриваемая в других местах описания. В одном варианте осуществления изобретения обеспечивающий биосовместимость слой и диффузионная мембрана ковалентно связаны, в частности путем фотоактивации, посредством поперечно сшиваемой боковой группы, как указано ниже.

Раскрытый в данном описании обеспечивающий биосовместимость слой содержит полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², где R¹ и R² независимо выбраны из -Н и C₁-C₆-алкила, в частности состоит из такого полимера. Так, в одном варианте осуществления изобретения указанный полимер содержит незамещенные амидные боковые группы. В одном варианте осуществления изобретения максимум один из R¹ и R² представляет собой -Н. Так, в одном варианте осуществления изобретения указанный полимер содержит моно- и/или ди-N-замещенные амидные боковые группы.

В контексте изобретения термин "алкил" относится к одновалентной боковой группе, полученной из алкана путем удаления атома водорода от любого атома углерода. В одном варианте осуществления изобретения алкил представляет собой насыщенную углеводородную группу с прямой или разветвленной цепью. Далее, алкильные группы представляют собой алкилы с прямой цепью, например, в частности, метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил, или алкильные группы с разветвленной цепью, например, -СН(СН₃)₂, -СН(СН₂СН₃)₂, -С(СН₃)₃, -С(СН₂СН₃)₃, -СН(СН₃)(СН₂СН₃), -СН₂СН(СН₃)₂, -СН₂СН(СН₃)(СН₂СН₃), -СН₂СН(СН₂СН₃)₂, -СН₂С(СН₃)₃, -СН(СН₃)СН(СН₃)(СН₂СН₃), -СН₂СН₂СН(СН₃)₂, -СН₂СН₂СН(СН₃)(СН₂СН₃), -СН₂СН₂С(СН₃)₃ или -СН(СН₃)СН₂СН(СН₃)₂. Соответственно, алкильные группы включают в себя первичные алкильные группы, вторичные алкильные группы и третичные алкильные группы. Также предусматриваемыми алкильными группами являются низшие алкильные группы, т.е. в частности, алкильные группы, имеющие не более 6 атомов углерода, прежде всего алкильные группы, имеющие не более 3 атомов углерода, предпочтительно алкильные группы с одним атомом углерода, т.е. метальные группы. В одном варианте осуществления изобретения алкил представляет собой низший алкил с прямой цепью, в частности выбранный из перечня, состоящего из н-гексила, н-пентила, н-бутила, н-пропила, этила и метила.

В соответствии с изобретением указанный полимер имеет химическую структуру, представленную формулой (II) или (IIa):

где R⁴ представляет собой поперечно сшиваемую боковую группу, n составляет от 0,01 до 0,99, a m составляет от 0,99 до 0,01, причем, в частности, сумма m и n равна 1. В одном варианте осуществления изобретения n составляет от 0,5 до 0,99, m составляет от 0,5 до 0,01, а сумма m и n равна 1. Как должно быть понятно специалисту, сумма m и n может быть меньше 1, если в полимере содержатся другие боковые цепочки или боковые группы; так, в одном варианте осуществления изобретения сумма m плюс n равна максимум 1; в одном варианте осуществления изобретения сумма m плюс n равна 1, т.е. полимер только имеет боковые группы, как показано в формуле (II). В еще одном варианте осуществления изобретения полимер имеет боковые группы, как показано в формуле (IIa). Кроме того, как должно быть понятно специалисту, поперечно сшиваемая боковая группа R⁴ также может быть поперечно сшитой боковой группой, т.е. может представлять собой поперечно сшиваемую боковую группу после поперечного сшивания, обеспечивающего образование ковалентной связи с другой молекулой полимера или с диффузионной мембраной.

В одном варианте осуществления изобретения R¹ и R² независимо выбраны из -Н и C₁-С₃-алкила. В еще одном варианте осуществления изобретения R¹ и R² независимо выбраны из -Н, этила и метила, в частности, по меньшей мере один из R¹ и R² представляет собой метил, в частности, как R¹, так и R² представляют собой метил.

В одном варианте осуществления изобретения полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², является полученным или получаемым из композиции, содержащей мономеры, как указано ниже, и называемой в данном описании "мономерной композицией". В одном варианте осуществления изобретения полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², является полученным или получаемым из композиции, содержащей мономеры, имеющие общую структуру (I):

где R³ - полимеризационноспособная группа. Из уровня техники известны подходящие полимеризационноспособные химические группы и методы их полимеризации. В одном варианте осуществления изобретения R³ выбран из С₂-С₄-алкенильной группы.

В контексте изобретения термин "алкенил" относится к углеводородной группе, образованной при удалении водорода из алкена. В одном варианте осуществления изобретения R³ выбран из винила (т.е. этенила, -СН=СН₂), пропенила (-СН=СН-СН₃) и изопропенила (-С(СН₃)=СН₂). В еще одном варианте осуществления изобретения R³ представляет собой винил; таким образом, в одном варианте осуществления изобретения полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², является полученным или получаемым из мономерной композиции, содержащей акриламидные мономеры, в частности содержащей мономеры моно- и/или ди-N-замещенного акриламида.

В одном варианте осуществления изобретения мономерная композиция содержит множество неодинаковых мономеров, имеющих общую структуру (I), указанную выше, например по меньшей мере два неодинаковых мономера, имеющих общую структуру (I). В одном примере осуществления изобретения мономерная композиция содержит акриламидные мономеры и по меньшей мере один тип мономера моно- и/или ди-N-замещенного акриламида; или мономерная композиция содержит по меньшей мере один тип моно- и/или ди-N-замещенного мономера, где R¹ и/или R² представляет(-ют) собой C₁-С₃-алкил, в варианте осуществления изобретения, улучшающем биосовместимость полимера, и по меньшей мере один тип моно- и/или ди-N-замещенного мономера, где R¹ и/или R² представляет(-ют) собой С₄-С₆-алкил, в варианте осуществления изобретения, улучшающем механические свойства полимера; или мономерная композиция содержит по меньшей мере один тип моно- и/или ди-N-замещенного мономера, где R¹ и R² представляют собой C₁-С₃-алкил, и по меньшей мере один тип моно- и/или ди-N-замещенного мономера, где R¹ и R² представляют собой С₄-С₆-алкил.

В одном варианте осуществления изобретения мономерная композиция, рассматриваемая в данном описании, также содержит по меньшей мере один другой мономер, не соответствующий общей структуре (I). В одном варианте осуществления изобретения такой мономер представляет собой мономер, пригодный для образования поперечных связей (поперечного сшивания) и/или ветвления полимерных цепей. Из уровня техники известны оба этих типа мономеров. Так, в одном варианте осуществления изобретения мономерная композиция также содержит по меньшей мере один мономер, содержащий поперечно сшиваемую боковую группу.

В контексте изобретения термин "поперечно сшиваемая боковая группа" относится к химически реакционноспособной или активируемой группе, пригодной для установления ковалентной связи от молекулы, содержащей указанную поперечно сшиваемую боковую группу, к другой химической молекуле или к другой части той же молекулы. В одном варианте осуществления изобретения такая поперечная связь устанавливается с другой молекулой полимера или с диффузионной мембраной, рассматриваемой в других местах описания. Как известно из уровня техники, образование поперечных связей может достигаться путем включения в полимер боковой группы, способной вступать в реакцию с химически реакционноспособной группой, или путем включения в полимер химически реакционноспособной или активируемой боковой группы. В одном варианте осуществления изобретения поперечно сшиваемая группа представляет собой боковую группу, включающую в себя группу -ОН или -NH₂, содержащуюся в полимере, который может поперечно сшиваться многофункциональным, в частности бифункциональным, сшивающим агентом, известным из уровня техники, в том числе, например, диглицидиловыми эфирами, такими как диглицидиловый эфир поли(этиленгликоля) и диглицидиловый эфир поли(пропиленгликоля), бис-альдегиды и сукцинимидиловые эфиры. В еще одном варианте осуществления изобретения поперечно сшиваемая боковая группа представляет собой активируемую боковую группу, т.е. боковую группу, которая в стандартных условиях и/или в темноте является по существу химически нереакционноспособной, но становится химически реакционноспособной после активации, например при освещении светом с соответствующей длиной волны. В одном варианте осуществления изобретения поперечно сшиваемая боковая группа выбрана из перечня, состоящего из бензофенонов, арилазидов, азидо-метилкумаринов, антрахинонов, определенных диазосоединений, диазиринов и производных псоралена. В еще одном варианте осуществления изобретения поперечно сшиваемая боковая группа представляет собой бензофеноновую боковую группу. В еще одном варианте осуществления изобретения поперечно сшиваемая боковая группа является полученной или получаемой из мономеров О-замещенного метакрилата, в частности из мономеров 4-бензоилфенилметакрилата.

В одном варианте осуществления изобретения полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², является полученным или получаемым из композиции, содержащей мономеры моно-N- или ди-N-замещенного акриламида, в частности содержащей мономеры N,N-диметилакриламида. В еще одном варианте осуществления изобретения полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой сополимер, в частности статистический сополимер. В других вариантах осуществления изобретения такой сополимер, помимо -CO-NR¹R², содержит еще одно повторяющееся звено, которое может выполнять дополнительную функцию, такую как образование поперечных связей, улучшение биосовместимости или механического свойства, как указано выше. В еще одном варианте осуществления изобретения полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой сополимер мономеров моно-N- или ди-N-замещенного акриламида и/или мономеров О-замещенного метакрилата.

В одном варианте осуществления изобретения полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой сополимер, полученный или получаемый из композиции, содержащей мономеры, имеющие общую структуру (I), как указано выше, и мономеры, содержащие поперечно сшиваемую боковую группу, в частности бензофеноновую боковую группу. В еще одном варианте осуществления изобретения полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², содержит от 1 до 50 мол. %, в частности от 2 до 25 мол. %, в частности от 3 до 10 мол. %, звеньев, полученных из мономеров, содержащих поперечно сшиваемую боковую группу, по отношению к общему количеству полимера, имеющего боковые группы -CO-NR¹R². В одном варианте осуществления изобретения полимер имеет химическую структуру, представленную формулой (III), (IIIa), (IIIb) и/или (IIIc):

где R⁵ представляет собой другую полимерную молекулу или молекулу диффузионной мембраны.

В одном варианте осуществления изобретения полимер имеет химическую структуру, представленную формулой (III) или (IIIa). В одном варианте осуществления изобретения полимер имеет химическую структуру, представленную формулой (IIIb) или (IIIc).

Так, в одном варианте осуществления изобретения полимер имеет химическую структуру, представленную формулой (IV) или (IVa):

где n составляет от 0,01 до 0,99, a m составляет от 0,99 до 0,01, и где R⁶ представляет собой -CO-C₆H₅ (бензоил) или -C(OH)R⁵-C₆H₅, причем R⁵ - как указано в описании выше, причем, в частности, сумма m и n равна 1. В одном варианте осуществления изобретения n составляет от 0,5 до 0,99, m составляет от 0,5 до 0,01, а сумма m и n равна 1.

В еще одном варианте осуществления изобретения полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой терполимер по меньшей мере из двух неодинаковых мономеров моно-N- или ди-N-замещенного акриламида, рассматриваемых в других местах описания, и мономеров О-замещенного метакрилата, в частности мономеров 4-бензоилфенилметакрилата.

Термин "аналит" в контексте изобретения относится к химическому соединению, присутствующему в жидкости, в частности физиологической жидкости. В одном варианте осуществления изобретения аналитом является органическая молекула, в частности органическая молекула, способная претерпевать окислительно-восстановительную реакцию в присутствии фермента по смыслу настоящего изобретения. В одном варианте осуществления изобретения аналитом является молекула, участвующая в метаболизме субъекта, т.е. молекула, образующаяся и/или расходуемая в ходе по меньшей мере одной химической реакции, происходящей по меньшей мере в одной ткани указанного субъекта. Кроме того, в одном варианте осуществления изобретения аналитом является низкомолекулярное химическое соединение, в частности химическое соединение с молекулярной массой менее 5000 а.е.м. (5000 Да; 1 а.е.м.=1,66×10^-27 кг), в частности менее 1000 а.е.м., прежде всего менее 500 а.е.м. То есть, в одном варианте осуществления изобретения аналит не является биологической макромолекулой. В еще одном варианте осуществления изобретения указанный аналит выбран из перечня, состоящего из глюкозы, малата, этанола, аскорбиновой кислоты, холестерина, глицерина, мочевины, 3-гидроксибутирата, лактата, пирувата, кетонов и креатинина; в еще одном варианте осуществления изобретения аналит представляет собой глюкозу.

Термин "определение" в контексте изобретения относится к количественному определению аналита в смысле определения значений количества аналита, присутствующего в пробе физиологической жидкости, т.е. к измерению количества или концентрации указанного аналита, в частности к полуколичественному или количественному измерению. Определение количества аналита может осуществляться множеством способов, известных специалисту или подробно рассматриваемых в других местах описания. В соответствии с настоящим изобретением определение количества аналита может выполняться любыми известными средствами для определения количества указанного аналита в пробе. В одном варианте осуществления изобретения определение представляет собой специфическое определение аналита в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления изобретения определение аналита представляет собой определение указанного аналита в живом организме (в условиях in vivo), в еще одном варианте осуществления изобретения определение аналита представляет собой непрерывное мониторирование гликемии, в частности непрерывное мониторирование гликемии в живом организме (в условиях in vivo), прежде всего у субъекта, как он определен в описании.

Термин "количество" в контексте изобретения включает в себя абсолютное количество аналита, относительное количество или концентрацию аналита, о котором идет речь в данном описании, а также любое значение или параметр, соотносящееся(-ийся) с ними. Такие значения или параметры включают в себя полученные путем измерений значения сигналов интенсивности, относящихся к любым конкретным физическим или химическим свойствам аналита, о котором идет речь в данном описании. Следует иметь в виду, что значения, соотносящиеся с вышеупомянутыми величинами или параметрами, также можно получать посредством любых стандартных математических операций.

В контексте изобретения термин "физиологическая жидкость" относится к любым физиологическим жидкостям субъекта, в отношении которых известно или предполагается, что они содержат аналит по смыслу настоящего изобретения, в том числе к таким жидкостям, как интерстициальная жидкость, кровь, плазма, слезная жидкость, моча, лимфа, цереброспинальная жидкость, желчь, кал, пот и слюна. В одном варианте осуществления изобретения физиологическая жидкость представляет собой интерстициальную жидкость или кровь; так, в одном варианте осуществления изобретения физиологическая жидкость содержит по меньшей мере один состоящий из частиц компонент, в частности клетки. В еще одном варианте осуществления изобретения физиологическая жидкость представляет собой интерстициальную жидкость. Термин "проба" понятен специалисту и относится к любой подпорции физиологической жидкости, в частности взятой из организма субъекта перед нанесением указанной пробы на тест-элемент. Пробы можно получать широко известными методами, включающими, например, прокол вены или артерии, прокол кожи и т.п.

В ходе работы, результаты который положены в основу настоящего изобретения, было установлено, что описываемые полимеры особенно подходят в качестве биосовместимых покрытий для биосенсоров. Неожиданно было установлено, что описываемые полимеры обладают уменьшенной склонностью к обрастанию вследствие накопления биологических макромолекул и/или вследствие прилипания клеток, имеют низкую цитотоксичность и низкую активность в отношении активизации иммунной системы. Таким образом, предлагаемые в изобретении биосенсоры имеют повышенную длительность использования и низкую склонность к капсулированию.

Приведенные выше определения применимы, с соответствующими изменениями, к нижеследующему описанию. Дополнительные определения и пояснения, приведенные ниже, также относятся, с соответствующими изменениями, ко всем вариантам осуществления изобретения, рассмотренным в данном описании.

Объектом настоящего изобретения также является способ изготовления имплантируемого биосенсора для определения аналита, включающий в себя по меньшей мере частичное покрытие указанного биосенсора обеспечивающим биосовместимость слоем, предлагаемым в настоящем изобретении.

Способы получения полимерных слоев и покрытий на биосенсорах и/или сенсорных модулях известны из уровня техники. В данном контексте процесс формирования покрытия может быть реализован любым методом, уместным с точки зрения специалиста, в том числе методами, позволяющими создавать покрытие на месте его нахождения (in situ) путем нанесения на биосенсор раствора мономеров, которому предшествует, сопутствует или за которым следует начало полимеризации, а также путем нанесения на биосенсор предварительно изготовленной мембраны. В одном варианте осуществления изобретения способ изготовления имплантируемого биосенсора включает в себя применение по меньшей мере одного из следующих методов: метод нанесения покрытия погружением, метод нанесения покрытия напылением и контактный метод нанесения покрытия. Также может использоваться метод, выбранный из числа методов нанесения покрытия погружением, нанесения покрытия напылением, нанесения покрытия центрифугированием, нанесения покрытия печатью, нанесения покрытия ножевым устройством или капельного процесса. Вместе с тем, в принципе также могут использоваться комбинации указанных методов и/или другие методы. В одном варианте осуществления изобретения обеспечивающий биосовместимость слой образуют на диффузионной мембране. В одном варианте осуществления изобретения способ также включает в себя шаг поперечного сшивания обеспечивающего биосовместимость слой с нижележащим слоем, в частности с диффузионной мембраной, например путем облучения, в частности воздействием излучения с длиной волны 365 нм. В одном варианте осуществления изобретения способ изготовления имплантируемого биосенсора также включает дополнительный шаг экстракции неполимеризовавшихся моно- и олигомеров из обеспечивающего биосовместимость слоя биосенсора, например путем обработки биосенсора растворителем, например органическим растворителем и/или водой.

Объектом настоящего изобретения также является применение обеспечивающего биосовместимость слоя, соответствующего настоящему изобретению, для изготовления имплантируемого биосенсора.

Настоящее изобретение также относится к применению предлагаемого в настоящем изобретении биосенсора для непрерывного определения аналита в физиологических условиях (in situ). Как указано в других местах описания, в одном варианте осуществления изобретения аналит представляет собой глюкозу.

Объектом настоящего изобретения также является способ непрерывного определения аналита в организме субъекта, характеризующийся тем, что определение указанного аналита осуществляют посредством биосенсора, предлагаемого в настоящем изобретении.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу непрерывного определения аналита в организме субъекта, включающему в себя:

(а) имплантацию биосенсора, предлагаемого в настоящем изобретении, по меньшей мере в одну ткань субъекта; и

(б) определение указанного аналита посредством указанного сенсора.

Способы непрерывного определения аналита по смыслу настоящего изобретения представляют собой, в одном варианте осуществления изобретения, способы, осуществляемые в живом организме (в условиях in vivo). Кроме того, они могут включать в себя шаги, дополнительные к шагам, прямо указанным выше. Например, дополнительные шаги могут относиться, в частности, к выдаче количества или концентрации аналита на основании результата определения указанного аналита, или к выдаче сигнала тревоги в случае, если указанный результат определения аналита находится ниже первого порогового значения или выше второго порогового значения. Кроме того, один или несколько из указанных шагов может выполняться средствами автоматизации. В одном варианте осуществления изобретения указанный способ не включает в себя диагностирования заболевания на основании результат указанного измерения.

В контексте изобретения термин "субъект" относится к позвоночному животному. В одном варианте осуществления изобретения субъектом является млекопитающее, в частности мышь, крыса, кошка, собака, хомяк, морская свинка, овца, коза, свинья, корова или лошадь. В частности, субъектом является примат. Прежде всего, субъектом является человек. В одном варианте осуществления изобретения субъект страдает или предположительно страдает заболеванием или состоянием, связанным с поддающимся измерению отклонением по меньшей мере одного аналита от нормального значения. В еще одном варианте осуществления изобретения субъект страдает диабетом.

Термин "непрерывное определение" в контексте изобретения относится к определению аналита путем многократного использования в организме субъекта одного и того же биосенсора, в частности биосенсора, раскрытого в данном описании. Таким образом, термин "непрерывное определение" включает в себя дискретные измерения, в частности измерения, выполняемые по меньшей мере каждые 6 часов, в частности по меньшей мере каждые 2 часа, в частности по меньшей мере каждый час. Вместе с тем, этот термин также охватывает более частые измерения, в частности измерения, выполняемые по меньшей мере каждые 30 мин, в частности по меньшей мере каждые 15 мин, в частности по меньшей мере каждые 10 мин, в частности по меньшей мере каждые 5 мин. В одном варианте осуществления изобретения этот термин относится к квазинепрерывному измерению, выполняемому, в частности, каждые 30 секунд, в частности каждые 20 секунд, в частности по меньшей мере каждые 10 секунд, в частности по меньшей мере каждые 5 секунд. Вместе с тем, изобретение предусматривает возможность и более частых измерений. В одном варианте осуществления изобретения непрерывное определение аналита осуществляют посредством одного и того же биосенсора в течение по меньшей мере одной недели, в еще одном варианте по меньшей мере двух недель, в еще одном варианте по меньшей мере трех недель, в еще одном варианте по меньшей мере четырех недель.

Исходя из вышеизложенного, предпочтительными являются следующие варианты осуществления изобретения:

1. Биосенсор для определения аналита, содержащий сенсорный модуль, по меньшей мере частично покрытый обеспечивающим биосовместимость слоем, причем обеспечивающий биосовместимость слой содержит полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², где R¹ и R² независимо выбраны из -Н и C₁-С₆-алкила, в частности, где максимум один из R¹ и R² представляет собой -Н.

2. Биосенсор по варианту 1, в котором R¹ и R² независимо выбраны из -Н и C₁-С₃-алкила.

3. Биосенсор по варианту 1 или 2, в котором R¹ и R² независимо выбраны из -Н, этила и метила.

4. Биосенсор по одному из вариантов 1-3, в котором по меньшей мере один из R¹ и R² представляет собой метил.

5. Биосенсор по одному из вариантов 1-4, в котором R¹ и R² представляют собой метил.

6. Биосенсор по одному из вариантов 1-5, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², является полученным или получаемым из композиции, содержащей мономеры, имеющие общую структуру (I):

где R³ - полимеризационноспособная группа, в частности выбранная из винила, пропенила и изопропенила, в частности представляющая собой винил.

7. Биосенсор по одному из вариантов 1-6, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², является полученным или получаемым из композиции, содержащей мономеры моно-N- и/или ди-N-замещенного акриламида, в частности содержащей мономеры N,N-диметилакриламида.

8. Биосенсор по одному из вариантов 1-7, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой сополимер, в частности статистический сополимер.

9. Биосенсор по одному из вариантов 1-8, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой сополимер мономеров моно-N- или ди-N-замещенного акриламида и/или мономеров О-замещенного метакрилата.

10. Биосенсор по варианту 9, в котором указанные мономеры О-замещенного метакрилата представляют собой мономеры 4-бензоилфенилметакрилата.

11. Биосенсор по одному из вариантов 1-10, в котором указанный полимер имеет химическую структуру, представленную формулой (II) или (IIa):

где R⁴ представляет собой поперечно сшиваемую или поперечно сшитую боковую группу, n составляет от 0,01 до 0,99, a m составляет от 0,99 до 0,01, причем, в частности, сумма m и n равна 1.

12. Биосенсор по одному из вариантов 1-11, в котором n составляет от 0,5 до 0,99, m составляет от 0,01 до 0,5, а сумма m и n равна 1.

13. Биосенсор по одному из вариантов 1-12, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой сополимер, полученный или получаемый из композиции, содержащей мономеры, охарактеризованные в варианте 6 или 7, и мономеры, содержащие поперечно сшиваемую боковую группу, в частности бензофеноновую боковую группу.

14. Биосенсор по одному из вариантов 1-13, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², содержит от 1 до 50 мол. %, в частности от 2 до 25 мол. %, в частности от 3 до 10 мол. %, звеньев, полученных из мономеров, содержащих поперечно сшиваемую боковую группу, по отношению к общему количеству полимера, имеющего боковые группы -CO-NR¹R².

15. Биосенсор по одному из вариантов 1-14, в котором указанный полимер имеет химическую структуру, представленную формулой (III), (IIIa), (IIIb) и/или (IIIc):

где n составляет от 0,01 до 0,99, a m составляет от 0,99 до 0,01, причем, в частности, сумма m и n равна 1; и где R⁵ представляет собой другую полимерную молекулу или молекулу диффузионной мембраны.

16. Биосенсор по одному из вариантов 1-15, также содержащий диффузионную мембрану, причем обеспечивающий биосовместимость слой является крайним наружным слоем.

17. Биосенсор по одному из вариантов 1-16, также содержащий диффузионную мембрану, причем указанная диффузионная мембрана содержит гидрофильный полиуретановый полимер.

18. Биосенсор по одному из вариантов 1-17, являющийся имплантируемым, в частности имплантируемым подкожно.

19. Биосенсор по одному из вариантов 1-18, в котором указанным аналитом является аналит, имеющий молекулярный вес менее 1000 Да.

20. Биосенсор по одному из вариантов 1-19, в котором указанный аналит выбран из перечня, состоящего из глюкозы, малата, этанола, аскорбиновой кислоты, холестерина, глицерина, мочевины, 3-гидроксибутирата, лактата, пирувата, кетонов и креатинина, в частности аналит представляет собой глюкозу.

21. Биосенсор по одному из вариантов 1-20, в котором указанное определение аналита представляет определение указанного аналита в живом организме (в условиях in vivo).

22. Биосенсор по одному из вариантов 1-21, в котором указанное определение аналита представляет собой непрерывное мониторирование гликемии.

23. Способ изготовления имплантируемого биосенсора для определения аналита, включающий в себя по меньшей мере частичное покрытие указанного биосенсора обеспечивающим биосовместимость слоем, причем обеспечивающий биосовместимость слой содержит полимер, имеющий боковые группы -СО-NR¹R², где R¹ и R² независимо выбраны из -Н и С₁-С₆-алкила, в частности, где максимум один из R¹ и R² представляет собой -Н.

24. Способ по варианту 23, в котором R¹ и R² независимо выбраны из -Н и C₁-С₃-алкила.

25. Способ по варианту 23 или 24, в котором R¹ и R² независимо выбраны из -Н, этила и метила.

26. Способ по одному из вариантов 23-25, в котором по меньшей мере один из R¹ и R² представляет собой метил.

27. Способ по одному из вариантов 23-26, в котором R¹ и R² представляют собой метил.

28. Способ по одному из вариантов 23-27, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², является полученным или получаемым из композиции, содержащей мономеры, имеющие общую структуру (I):

где R³ - полимеризационноспособная группа, в частности выбранная из винила, пропенила и изопропенила, в частности представляющая собой винил.

29. Способ по одному из вариантов 23-28, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², является полученным или получаемым из композиции, содержащей мономеры моно-N- и/или ди-N-замещенного акриламида, в частности содержащей мономеры N,N-диметилакриламида.

30. Способ по одному из вариантов 23-29, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой сополимер, в частности статистический сополимер.

31. Способ по одному из вариантов 23-30, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой сополимер мономеров моно-N- или ди-N-замещенного акриламида и/или мономеров О-замещенного метакрилата.

32. Способ по варианту 31, в котором указанные мономеры О-замещенного метакрилата представляют собой мономеры 4-бензоилфенилметакрилата.

33. Способ по одному из вариантов 23-32, в котором указанный полимер имеет химическую структуру, представленную формулой (II) или (IIa):

где R⁴ представляет собой поперечно сшиваемую боковую группу, n составляет от 0,01 до 0,99, a m составляет от 0,99 до 0,01, причем, в частности, сумма m и n равна 1.

34. Способ по одному из вариантов 23-33, в котором n составляет от 0,5 до 0,99, m составляет от 0,5 до 0,01, а сумма m и n равна 1.

35. Способ по одному из вариантов 23-34, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой сополимер, полученный или получаемый из композиции, содержащей мономеры, охарактеризованные в варианте 28 или 29, и мономеры, содержащие поперечно сшиваемую боковую группу, в частности бензофеноновую боковую группу.

36. Способ по одному из вариантов 23-35, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², содержит от 1 до 50 мол. %, в частности от 2 до 25 мол. %, в частности от 3 до 10 мол. %, звеньев, полученных из мономеров, содержащих поперечно сшиваемую боковую группу, по отношению к общему количеству полимера, имеющего боковые группы -CO-NR¹R².

37. Способ по одному из вариантов 23-36, в котором указанный полимер имеет химическую структуру, представленную формулой (III), (IIIa), (IIIb) и/или (IIIc):

где n составляет от 0,01 до 0,99, a m составляет от 0,99 до 0,01, причем, в частности, сумма m и n равна 1.

38. Способ по одному из вариантов 1-37, также включающий в себя по меньшей мере частичное покрытие указанного биосенсора диффузионной мембраной, причем обеспечивающий биосовместимость слой является крайним наружным слоем.

39. Способ по варианту 38, в котором указанная диффузионная мембрана содержит гидрофильный полиуретановый полимер.

40. Применение обеспечивающего биосовместимость слоя для изготовления имплантируемого биосенсора, причем обеспечивающий биосовместимость слой содержит полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², где R¹ и R² независимо выбраны из -Н и C₁-С₆-алкила, в частности, где максимум один из R¹ и R² представляет собой -Н.

41. Применение по варианту 40, в котором R¹ и R² независимо выбраны из -Н и C₁-С₃-алкила.

42. Применение по варианту 40 или 41, в котором R¹ и R² независимо выбраны из -Н, этила и метила.

43. Применение по одному из вариантов 40-42, в котором по меньшей мере один из R¹ и R² представляет собой метил.

44. Применение по одному из вариантов 40-43, в котором R¹ и R² представляют собой метил.

45. Применение по одному из вариантов 40-44, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², является полученным или получаемым из композиции, содержащей мономеры, имеющие общую структуру (I):

где R³ - полимеризационноспособная группа, в частности выбранная из винила, пропенила и изопропенила, в частности представляющая собой винил.

46. Применение по одному из вариантов 40-45, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², является полученным или получаемым из композиции, содержащей мономеры моно-N- и/или ди-N-замещенного акриламида, в частности содержащей мономеры N,N-диметилакриламида.

47. Применение по одному из вариантов 40-46, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой сополимер, в частности статистический сополимер.

48. Применение по одному из вариантов 40-47, в котором указанный полимер представляет собой линейный полимер.

49. Применение по одному из вариантов 40-48, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой сополимер мономеров моно-N- или ди-N-замещенного акриламида и/или мономеров О-замещенного метакрилата.

50. Применение по варианту 49, в котором указанные мономеры О-замещенного метакрилата представляют собой мономеры 4-бензоилфенилметакрилата.

51. Применение по одному из вариантов 40-50, в котором указанный полимер имеет химическую структуру, представленную формулой (II) или (IIa):

где R⁴ представляет собой поперечно сшиваемую боковую группу, n составляет от 0,01 до 0,99, a m составляет от 0,99 до 0,01, причем, в частности, сумма m и n равна 1.

52. Применение по одному из вариантов 40-51, в котором n составляет от 0,5 до 0,99, m составляет от 0,5 до 0,01, а сумма m и n равна 1.

53. Применение по одному из вариантов 40-52, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой сополимер, полученный или получаемый из композиции, содержащей мономеры, охарактеризованные в варианте 45 или 46, и мономеры, содержащие поперечно сшиваемую боковую группу, в частности бензофеноновую боковую группу.

54. Применение по одному из вариантов 40-53, в котором полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², содержит от 1 до 50 мол. %, в частности от 2 до 25 мол. %, в частности от 3 до 10 мол. %, звеньев, полученных из мономеров, содержащих поперечно сшиваемую боковую группу, по отношению к общему количеству полимера, имеющего боковые группы -CO-NR¹R².

55. Применение по одному из вариантов 40-54, в котором указанный полимер имеет химическую структуру, представленную формулой (III), (IIIa), (IIIb) и/или (IIIc):

где n составляет от 0,01 до 0,99, a m составляет от 0,99 до 0,01, причем, в частности, сумма m и n равна 1.

56. Применение биосенсора по одному из вариантов 1-55 для непрерывного определения аналита в физиологических условиях (in situ).

57. Способ непрерывного определения аналита в организме субъекта, характеризующийся тем, что определение указанного аналита осуществляют посредством биосенсора по одному из вариантов 1-22.

58. Способ непрерывного определения аналита в организме субъекта, включающий в себя:

(а) имплантацию биосенсора по одному из вариантов 1-22 по меньшей мере в одну ткань субъекта; и

(б) определение указанного аналита посредством указанного сенсора.

59. Способ по варианту 57 или 58, характеризующийся тем, что указанное непрерывное определение осуществляют посредством одного и того же биосенсора в течение по меньшей мере одной недели, в частности по меньшей мере двух недель, в частности по меньшей мере трех недель, в частности по меньшей мере четырех недель.

Все источники информации, цитируемые в данном описании, включены в него путем отсылки в отношении всего их содержания и конкретных сведений, указанных в данном описании.

Описание чертежей

Фиг. 1а: Результаты исследования адсорбции белков в экспериментах с пьезокварцевым микровзвешиванием (ПКМВ). На графиках показано изменение частоты (Δf, Гц) во времени (мин); моменты добавления белка и моменты промывки(-ок) буферным раствором показаны стрелками. Нижними кривыми в районе времени 20 мин являются кривые, представляющие эксперименты с использованием p(BUMA/HEMA/HPMA) - сополимера бутилметакрилата, гидроксиэтилметакрилата и гидроксипропилметакрилата, а верхними кривыми в районе времени 20 мин являются кривые, представляющие эксперименты с использованием p(DMAA) - сополимера диметилакриламида и бензофенонметакрилата. Испытательными белками были альбумин (на графике А) и фибриноген (на графике В).

Фиг. 16: Результаты исследования адсорбции белков на полистироле (PS) в экспериментах с ПКМВ. Испытательными белками были альбумин (на графике А) и фибриноген (на графике В).

Фиг. 2: Результаты испытаний на адгезию клеток, проведенных на дефункционализированной стеклянной поверхности (-), на стеклянной подложке, функционализированной полимером p(BUMA/HEMA/HPMA), на стеклянной подложке, функционализированной поперечно сшитым (сетчатым) полимером p(DMAA), и на полистироле (PS) после 20-суточного периода инкубации. Для съемки использовали 2,5-кратное (2.5х) или 20-кратное (20х) увеличение. Клетки, видимые при 20-кратном увеличении в случае с полимером p(DMAA), представляют собой клеточные сгустки, не сцепленные с подложкой.

Фиг. 3: Процентный рост клеток относительно контрольного образца (необработанная среда), определенный при помощи теста с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолием (МТТ-тест) или теста с 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилидом (ХТТ-тест), после 24-часовой инкубации с экстрактами из образцов, покрытых полимером p(DMAA), образцов, покрытых полимером p(BUMA/HEMA/HPMA), или кусочков латекса. В качестве контрольного образца 100% использовали необработанную культуральную (питательную) среду. В качестве положительного контрольного образца использовали кусочки латекса, а в качестве отрицательного контрольного образца использовали полиэтилентерефталатные (ПЭТ) подложки без покрытия.

Фиг. 4: Относительная продукция цитокинов клетками ТНР-1, контактирующими с фибриногеном, активированным полиэтилентерефталатом (ПЭТ), покрытым полимером p(BUMA/HEMA/HPMA), или полиэтилентерефталатом (ПЭТ), покрытым полимером p(DMAA). В качестве отрицательного контрольного образца использовали ПЭТ без покрытия, в качестве контрольного образца (100%) использовали фибриноген, нанесенный непосредственно на ПЭТ. ПЭТ-подложки, непосредственно покрытые фибриногеном, использовали в качестве контрольного образца (100%).

Ниже приведены Примеры, которые лишь иллюстрируют изобретение. Они не должны толковаться каким бы то ни было образом, ограничивающим объем охраны изобретения.

Использованные в Примерах реагенты

p(BUMA/HEMA/HPMA): сополимер гидроксиэтилметакрилата, гидроксипропилметакрилата и бутилметакрилата, взятых в молярном отношении 90:5:5; PS: полистирол; p(DMAA): сополимер из 97% диметилакриламида и 3% бензофенонметакрилата; латекс: ACCUTech LOT 1307530704; натрий-фосфатный буфер (PBS) - буферный раствор Дульбекко без кальция или магния, производства фирмы Lonza (BE17-512F), состав: 0,2 г/л KCl, 0,2 г/л KH₂PO₄, 8,0 г/л NaCl, 2,16 г/л Na₂HPO₄ ⋅ 7 H₂O; стерильный физиологический солевой раствор (SPSS).

Растворы белков: раствор альбумина: 10 мг/мл в PBS-буфере; раствор фибриногена: 0,5 мг/мл в смеси натрий-фосфатного буфера (PBS) и стерильного физиологического солевого раствора (SPSS) при отношении PBS:SPSS=1:1.

Клетки и культуральная среда для их роста: фибробластные клетки L-929 (АТСС® CCL-1™) выдерживали в среде RPMI 1640 GlutaMAX (Gibco 72400-021) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки ЭТС (Sigma F7524), 1% пирувата натрия (Gibco 11360-070) и 1% пенициллин-стрептомицина (Gibco 15140-122).

ХТТ-тест: Плотность клеток довели до приблизительно 10⁵/мл; по 100 мкл этой суспензии использовали на каждую лунку 96-луночного планшета.

Пример 1: Адсорбция белков

Адсорбцию белков полимерными слоями изучали с использованием экспериментов с пьезокварцевым микровзвешиванием (ПКМВ) при помощи устройства Q-Sense QSX301. В этих экспериментах подложки для ПКМВ (производства компании Q-Sense) сначала покрывали полимером или сетчатым полимером. Снабженные покрытием образцы помещали в измерительную ячейку и возбуждали в них вибрации. Регистрировали резонансную частоту вибрации. Затем поверхность образцов покрывали буферным раствором PBS, и полимерное покрытие начинало набухать до достижения им равновесного состояния, в результате чего резонансная частота вибрации переставала изменяться. Затем начинали эксперимент в отношении адсорбции белка, снова записывая частоту вибрации и регистрируя конечную резонансную частоту вибрации в буферном растворе. Спустя примерно 15 мин поверхность образца снова покрыли буферным раствором, в измерительную ячейку добавили раствор белка и оставили его покрывающим поверхность образца примерно на 15 мин, после чего эту поверхность снова промыли буферным раствором для удаления неприкрепленных белков. Адсорбировавшиеся на поверхности образца белки приводили к уменьшению частоты, и это уменьшение коррелирует с количеством адсорбировавшихся белков. Для наших экспериментов полимер p(BUMA/HEMA/HPMA) наносили непосредственно на поверхность подложки для ПКМВ. Для функционализации подложки сетчатым полимером p(DMAA) на подложку сначала нанесли слой полистирола, на который методом центрифугирования нанесли полимер p(DMAA), который затем зафиксировали в виде сетчатой структуры путем УФ-облучения.

Результаты экспериментов в отношении адсорбции белков для полимера p(BUMA/HEMA/HPMA) и сетчатого полимера p(DMAA) представлены на фиг. 1. Добавление на поверхность раствора альбумина привело к значительному уменьшению частоты для поверхности, покрытой полимером p(BUMA/HEMA/HPMA). Большую часть этого уменьшения удавалось вернуть обратно путем промывки поверхности буфером, но к исходному уровню частота не возвращалась, что свидетельствует о том, что небольшое количество белка необратимо адсорбировалось на поверхности, покрытой полимером p(BUMA/HEMA/HPMA). Гораздо меньшее уменьшение частоты наблюдали после добавления раствора альбумина на поверхность полимера p(DMAA), и это уменьшение удавалось полностью вернуть путем промывки буфером. Для адсорбции фибриногена уменьшение частоты, вызванное раствором белка на поверхность, покрытую полимером p(BUMA/HEMA/HPMA), не удавалось вернуть путем промывки буфером, и адсорбировавшиеся белки вызывали уменьшение частоты на 2 Гц. С другой стороны, аналогично тому, что наблюдали и с альбумином, частота вибрации образца, покрытого полимером p(DMAA), уменьшалась после воздействия на поверхность раствора белка лишь незначительно. Эту частоту удавалось вернуть обратно к исходному уровню путем удаления белков буфером. Таким образом, сетчатый полимер p(DMAA) продемонстрировал улучшенную сопротивляемость адсорбции альбумина, а также фибриногена.

Пример 2: Адгезия клеток

Адгезию клеток исследовали на стеклянных покровных пластинках, использовавшихся в качестве подложек. Покровные пластинки состояли из кварцевого стекла и имели круглую форму диаметром 1,5 см (VWR, ECN631-1579). Между соответствующими этапами эксперимента покровные пластинки держали по одной в 24-луночных планшетах обращенными покрытием кверху и в среде с низкой запыленностью и низким содержанием микроорганизмов. Покровными пластинками оперировали посредством вакуумного пинцета. Поверхность покровных пластинок покрыли полимером p(BUMA/HEMA/HPMA) методом центрифугирования, нанеся полимер непосредственно на поверхность; для покрытия из полимера p(DMAA) поверхность покровных пластинок сначала покрыли методом центрифугирования полистиролом (PS), затем нанесли методом центрифугирования покрытие из полимера p(DMAA), опять же с последующим УФ-облучением (с длиной волны 365 нм, удельной мощностью 0,35 Вт/м², в течение 2 мин). В качестве контрольных образцов использовали покровные пластинки без покрытия и только с полистирольным покрытием.

Во избежание загрязнения клеток микроорганизмами снабженные покрытием покровные пластинки стерилизовали путем погружения на 15 секунд в 70%-ный раствор этанола в воде или в раствор Perform (состоящий на 25% из этанола, на 35% из пропан-1-ола и на 40% из воды) и тем, что покровными пластинками оперировали в стерильном кожухе. После высушивания стерилизационного раствора покровные пластинки поместили в лунки 24-луночного планшета, содержавшие 500 мкл культуральной среды. Воздушные пузырьки удалили из-под покровных пластинок путем прижатия покровных пластинок к дну лунок пинцетом. Перед использованием снабженные покрытием покровные пластинки оставили набухать в культуральной среде приблизительно на один час.

Клетки линии L929 выращивали в питательной среде во флаконе или сосуде Т75 до заселенности 90%. Клетки отделяли от культурального флакона путем промывки натрий-фосфатным буферным раствором Дульбекко с последующим добавлением 1 мл смеси трипсина/ЭДТА. Клетки трипсинизировали в течение приблизительно пяти минут при температуре 37°С, после чего добавили 9 мл среды. Клетки тщательно ресуспендировали и центрифугировали в течение двух минут с перегрузкой 500 g. Сгусток клеток после центрифугирования ресуспендировали в 5 мл свежей среды (сначала серологической пипеткой 10 мл с последующим ресуспендированием пипеткой Eppendorf 1 мл). Плотность клеток отрегулировали путем разбавления 2 мл ресуспендированных клеток культуральной средой в количестве 73 мл; из отрегулированной таким образом суспензии на покровные пластинки поместили порции по 1 мл, так что в каждую лунку было внесено приблизительно 30.000 клеток. После посева клетки выращивали в стандартном углекислотном (СО₂) инкубаторе.

Результаты этого эксперимента после 20-суточного периода инкубации представлены на фиг. 2. Как видно на приведенных изображениях, дефункционализированная поверхность стеклянной подложки была полностью, например сплошным образом, покрыта слоем клеток, и это свидетельствует о том, что эта поверхность не обладает сопротивляемостью адгезии клеток. К поверхности, покрытой полимером p(BUMA/HEMA/HPMA), клеткам спустя первые 3 суток не удавалось прикрепиться. После более долгого периода инкубации некоторые клетки смогли успешно и необратимо прикрепиться к поверхности и начали расти и размножаться. Через 20 суток клетками была покрыта большая часть поверхности, снабженной покрытием из полимера p(BUMA/HEMA/HPMA) (фиг. 2). На поверхности, покрытой сетчатым полимером p(DMAA), значительной адгезии клеток не наблюдали. Спустя 20 суток клетки смогли прикрепиться только друг к другу с образованием клеточных сгустков. При осторожном перемещении образцов наблюдали, что клеточные сгустки свободно плавали и не смогли прикрепиться к поверхности, покрытой сетчатым полимером p(DMAA). Результаты этого эксперимента продемонстрировали, что поверхность, покрытая сетчатым полимером p(DMAA), обладает сильной сопротивляемостью адгезии клеток.

Пример 3: Тест на токсичность

Для теста на токсичность обе стороны ПЭТ-подложки (размером 2×2 см) покрыли сетчатым полимером p(DMAA), нанеся покрытие из полимера p(DMAA) методом центрифугирования с последующим воздействием УФ-излучения. Образцы перед использованием стерилизовали электронно-лучевым методом (поглощенная доза 25 кГр). Три испытательных образца погрузили в 4 мл культуральной среды на 24 часа при температуре 37°С. 1 мл инкубированной культуральной среды (элюат) перенесли в лунку свежего 96-луночного планшета, добавили фибробластные клетки линии L929 и инкубировали еще 24 часа, после чего при помощи ХТТ-теста измерили процент выживших клеток. Результаты представлены в виде процентного роста клеток, причем в качестве контрольного образца (например 100%) использовали необработанную культуральную среду. Таким образом, чем ниже значение процентного роста, тем сильнее токсическое действие образца в клетках. В качестве контрольных образцов использовали кусочки, вырезанные из латексных перчаток, и элюаты, приготовленные, как указано выше, из ПЭТ-подложек, покрытых сополимером p(BUMA/HEMA/HPMA). Например, в качестве положительного контрольного образца использовали кусочки, вырезанные из латексных перчаток, а в качестве отрицательного контрольного образца использовали ПЭТ-подложки без покрытия. Как показано на фиг. 3, покрытие из p(DMAA) не показало обнаруживаемой токсичности на клетках линии L929.

Пример 4: Активация клеток покрытыми фибриногеном полимерами

Для анализа на провоспалительный потенциал полимеров использовали клеточную линию человека ТНР-1. Клетки ТНР-1 представляют собой моноцитарные клетки, которые могут активироваться экзогенными факторами влияния, заставляющими клетки увеличивать секрецию цитокинов в культуральную среду. Такая активация может индуцироваться непосредственно поверхностным контактом с индуцирующим материалом или растворимыми компонентами, высвобождающимися из такого материала. Еще одной возможностью является активация клеток фибриногеном, активированным за счет контакта с поверхностью полимера. Такая активация фибриногена приводит к изменению в экспонирующих конформацию центрах связывания, связывающихся с иммунными рецепторами на клетках ТНР-1, тем самым вызывая активацию клеток. Еще одной возможностью является активация клеток на поверхности покрытия за счет адсорбции фибриногена. Такое прикрепление к поверхности вызывает конформационное изменение в фибриногене, вследствие которого центры связывания экспонируются и способны связываться с иммунными рецепторами на клетках ТНР-1, тем самым вызывая активацию клеток.

В данном эксперименте небольшие пластинчатые подложки из полиэтилентерефталата (ПЭТ) покрыли с одной стороны полимером (p(BUMA/HEMA/HPMA) или p(DMAA)). Покрытие подложек фибриногеном выполняли путем добавления на подложки раствора фибриногена в концентрации 2 мг/мл и инкубирования при температуре 37°С в течение 16 часов. Удалили излишек раствора фибриногена и добавили клетки ТНР-1. После 48-часового инкубирования при температуре 37°С в инкубаторе супернатант отделили от клеток и подвергли анализу выделившиеся в супернатант цитокины. Анализ цитокинов выполняли при помощи тест-систем "Cytometric Bead Array (СВА)" производства компании "BD Biosciences" (набор хемокинов человека и набор воспалительных цитокинов человека, оба согласно указаниям производителя). Подложки, покрытые только фибриногеном, использовали в качестве контрольных образцов.

Уровни цитокинов, наблюдавшиеся на поверхностях полимеров p(BUMA/HEMA/HPMA) и p(DMAA), были нормализованы к уровням цитокинов на поверхности контрольного образца и представлены на фиг. 4. Образцы, покрытые полимерами p(BUMA/HEMA/HPMA) и p(DMAA), показали сопоставимые результаты по активации человеческого интерлейкина-1β (IL-1β), человеческого фактора некроза опухоли (TNF) и человеческого интерлейкина-8 (IL-8). Кроме того, продуцирование цитокинов моноцитарного хемоаттрактного белка-1 (МСР-1), человеческого фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) было несколько ниже на поверхности полимера p(DMAA), чем на поверхности полимера p(BUMA/HEMA/HPMA). Что интересно, на поверхности полимера p(DMAA) был показан значительно меньший уровень человеческого интерферон-γ индуцибельного белка (IP-10), чем на поверхности полимера p(BUMA/HEMA/HPMA). Результаты этого эксперимента показывают, что по сравнению с полимером p(BUMA/HEMA/HPMA) поверхность, покрытая сетчатым полимером p(DMAA), демонстрирует повышенную биосовместимость.

Список цитируемой литературы

US 2006/0198864 А1

ЕР 0821234

ЕР 0974303

US 2005/0023152

US 5385846

US 5997817

US 10/008788

WO 2007/012494

WO 2009/103540

WO 2011/012269

WO 2011/012270

WO 2011/012271

EP 0354441

EP 0431456

WO 2015/005953 A1

J. Hones и соавт. The Technology Behind Glucose Meters: Test Strips (Технические средства глюкометров: тест-полоски), Diabetes Technology & Therapeutics, том 10, дополнение 1, 2008, стр. 10-26.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен биосенсор для определения аналита, способ изготовления имплантируемого биосенсора, применение обеспечивающего биосовместимость слоя и способ непрерывного определения аналита в организме субъекта. Биосенсор покрыт обеспечивающим биосовместимость слоем. Указанный слой содержит полимер содержит боковые группы -CO-NR¹R², где R¹ и R² независимо выбраны из -Н и C₁-С₆-алкила, и имеет химическую структуру (II) или (IIa):

где R⁴ представляет собой поперечно сшиваемую или поперечно сшитую боковую группу, n составляет от 0,01 до 0,99, a m составляет от 0,99 до 0,01. Способ изготовления включает частичное покрытие биосенсора указанным обеспечивающим биосовместимость слоем. Способ определения аналита включает определение аналита посредством указанного биосенсора. Изобретения обеспечивают устранение обрастания и капсулирования имплантируемых биосенсоров. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 пр.

1. Биосенсор для определения аналита, содержащий сенсорный модуль, по меньшей мере частично покрытый обеспечивающим биосовместимость слоем, причем обеспечивающий биосовместимость слой содержит полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², где R¹ и R² независимо выбраны из -Н и C₁-С₆-алкила, и имеющий химическую структуру, представленную формулой (II) или (IIa):

где R⁴ представляет собой поперечно сшиваемую или поперечно сшитую боковую группу, n составляет от 0,01 до 0,99, a m составляет от 0,99 до 0,01, причем, в частности, сумма m и n равна 1.

2. Биосенсор по п. 1, в котором R¹ и R² независимо выбраны из -Н и С₁-С₃-алкила, в частности R¹ и R² независимо выбраны из метила, -Н и этила, в частности R¹ и R² представляют собой метил.

3. Биосенсор по п. 1 или 2, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², является полученным или получаемым из композиции, содержащей мономеры, имеющие общую структуру (I):

где R³ - полимеризационноспособная группа, в частности выбранная из винила, пропенила и изопропенила, в частности представляющая собой винил.

4. Биосенсор по одному из пп. 1-3, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой статистический сополимер.

5. Биосенсор по одному из пп. 1-4, в котором указанный полимер, имеющий боковые группы -CO-NR¹R², представляет собой сополимер мономеров моно-N- или ди-N-замещенного акриламида и/или мономеров О-замещенного метакрилата, причем, в частности, указанные мономеры О-замещенного метакрилата представляют собой мономеры 4-бензоилфенилметакрилата.

6. Биосенсор по одному из пп. 1-5, в котором n составляет от 0,5 до 0,99, m составляет от 0,01 до 0,5, а сумма m и n равна 1.

7. Биосенсор по одному из пп. 1-6, в котором указанный полимер имеет химическую структуру, представленную формулой (III), (IIIa), (IIIb) и/или (IIIc):

где n составляет от 0,01 до 0,99, a m составляет от 0,99 до 0,01, причем, в частности, сумма m и n равна 1; и где R⁵ представляет собой другую полимерную молекулу или молекулу диффузионной мембраны.

8. Биосенсор по одному из пп. 1-7, также содержащий диффузионную мембрану, причем указанная диффузионная мембрана содержит гидрофильный полиуретановый полимер.

9. Биосенсор по одному из пп. 1-8, являющийся имплантируемым, в частности имплантируемым подкожно.

10. Биосенсор по одному из пп. 1-9, в котором указанный аналит выбран из перечня, состоящего из глюкозы, малата, этанола, аскорбиновой кислоты, холестерина, глицерина, мочевины, 3-гидроксибутирата, лактата, пирувата, кетонов и креатинина, в частности аналит представляет собой глюкозу, причем указанное определение аналита представляет собой, в частности, непрерывное мониторирование гликемии.

11. Способ изготовления имплантируемого биосенсора для определения аналита, включающий в себя по меньшей мере частичное покрытие указанного биосенсора обеспечивающим биосовместимость слоем, охарактеризованным в одном из пп. 1-7.

12. Применение обеспечивающего биосовместимость слоя, охарактеризованного в одном из пп. 1-7, для изготовления имплантируемого биосенсора.

13. Способ непрерывного определения аналита в организме субъекта, характеризующийся тем, что определение указанного аналита осуществляют посредством биосенсора по одному из пп. 1-10.

14. Способ по п. 13, характеризующийся тем, что указанное непрерывное определение осуществляют посредством одного и того же биосенсора в течение по меньшей мере одной недели, в частности по меньшей мере двух недель, в частности по меньшей мере трех недель, в частности по меньшей мере четырех недель.