БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ РАСТЕНИЙ И ЗАЩИТЫ ИХ ОТ БОЛЕЗНЕЙ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2021 года по МПК A01N63/27 A01N63/22 A01C1/06 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биопрепаратам для повышения урожайности растений и защиты их от болезней.

Известно большое число биопрепаратов для использования в качестве биопестицидов и/или биоудобрений. Значительная часть таких микроорганизмов является представителями родов Bacillus и Pseudomonas. Именно эти бактерии чаще всего встречаются в ризосфере и ризоплане растений и образуют с ними взаимовыгодные ассоциации, способные оказывать комплексное положительное воздействие на растения

В настоящее время в сельском хозяйстве используют, как правило, бактериальные препараты на основе одной культуры микроорганизмов, которые либо ингибируют развитие фитопатогенных грибов и бактерий, либо стимулируют рост и развитие растений, либо способствуют фиксации атмосферного азота или переводу нерастворимых почвенных фосфатов в растворимые формы.

В частности, известны такие биопрепараты, как Фитоспорин, созданный на основе штамма Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 [RU 2099947, 1997], Алирин Б (RU 2081167, 1997), на основе В. subtilis, Бактофит на основе штамма Bacillus subtilis ИПМ-215 [RU 2019966, 1994]. «Экстрасол» [RU 2259397, 2005] на основе штамма Bacillus sp. 739.

Недостатками указанных препаратов являются ограниченная область применения, недостаточная эффективность против болезней в условиях открытого грунта. Кроме того, технология получения препарата многостадийна и сложна.

Наиболее перспективным из препаратов данного типа является биопрепарат Агат-25К [RU 2111196, 1998], содержащий суспензию бактерий штамма Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-1973Д в количестве 3-6⋅10¹⁰ клеток в 1 мл, раствор макро- и микроэлементов, автолизат материала проростков сои, хвойный экстракт и хлорофиллокаротиновую пасту, способствующий повышению урожая растений. Однако он недостаточно эффективен в качестве препарата для защиты растений от возбудителей заболеваний.

Известны также биопрепараты на основе ассоциации микроорганизмов разной систематической принадлежности. В частности, известен препарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней - Экстрагран [RU 2302114, 2007], содержащий штаммы Bacillus mycoides var. В.А. ВНИИСХМ № Д138 и Azotobacter vinelandii var. НП ВНИИСХМ № Д24. Биопрепарат для осенней, весенней и летней обработок почвы, корневой и прикорневой подкормок в период вегетации растений, а также предпосевной обработки семян, содержит смесь суспензий тринадцати различных штаммов [RU 2322061, 2008]. Биопрепарат для повышения плодородия почвы, ее оздоровления и стимуляции роста растений разработан на основе ассоциации штаммов Bacillus subtilis K-4, Bacillus subtilis Be-12, Bacillus amyloliquefaciens 30-40 с добавлением гидролизата смеси хвойного экстракта и каротиновой пасты [RU 2314693, 2008].

Существенным недостатком таких препаратов является многокомпонентность видового и родового состава микроорганизмов с различными питательными потребностями, требующих как отдельных условий культивирования, так и различных условий среды для максимального проявления свойств. Кроме того, указанные биопрепараты недостаточно эффективны в защите растений против широкого спектра возбудителей заболеваний растений.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является препарат Альбит [RU 2147181, 2000]. Препарат содержит гидролизат бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-1973Д (18-20%), гидролизат бактерий Bacillus megaterium, содержащий поли-β-гидроксимасляную кислоту (39-40%), хвойный экстракт (5-6%), хлорофилло-каротиновую пасту (1-2%) и раствор макро- и микроэлементов (32-37%). Гидролизат бактерий Pseudomonas aureofaciens готовят путем смешивания суспензии бактерий с оптической плотностью 50-60 единиц с равным объемом автолизата проростков сои и инкубации смеси при 45-55°С в течение 1-5 ч. Гидролизат бактерий Bacillus megaterium готовят путем смешивания суспензии бактерий оптической плотности 100-150 единиц, содержащей 20-80% биополимера поли-β-гидромасляной кислоты, с равным объемом автолизата проростков сои и выдерживания полученной смеси при температуре 50-55°С в течение 1-5 ч.

Недостатком известного препарата является недостаточная эффективность при влиянии на урожайность растений, обусловленная низким содержание биоауксинов и отсутствием в нем подвижных форм калия, фосфора и других жизненно важных для растений микроэлементов.

Технической задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание более эффективного препарата бактериальной природы способного существенно повышать урожай растений и защищать растения от болезней.

Поставленная цель достигается тем, что биопрепарат, содержащий автолизаты бактерий Pseudomonas aureofaciens и Bacillus megaterium, раствор макро- и микроэлементов, хвойный экстракт и хлорофилло-каротиновую пасту, дополнительно содержит автолизат Bacillus subtilis ВКПМ В-3679, глауконит и Трилон Б, в качестве автолизатов бактерий Pseudomonas aureofaciens и Bacillus megaterium - автолизаты Pseudomonas aureofaciens ВКПМ B-2883 и Bacillus megaterium ВКПМ В-607 при следующем соотношении компонентов (% масс).:

автолизат Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-2883 - 15-25;

автолизат Bacillus megaterium ВКПМ В-607, содержащий поли-β-гидроксимасляную кислоту - 15-25;

автолизат Bacillus subtilis ВКПМ В-3679 - 15-25;

глауконит - 8-15;

хвойный экстракт - 3-8;

хлорофилло-каротиновая паста 1-2;

раствор макро- и микроэлементов 15-25;

Трилон Б - 0,5-2;

вода - остальное.

Оптимальные концентрации ингредиентов в пределах заявляемых концентраций подбираются исходя из природы растения, на развитие которого биопрепарат действует. Изменение соотношения аутолизатов бактерий вне рамок патентуемых концентраций приводит к снижению эффективности их воздействия на урожай.

Биопрепарат получил условное наименование «ГлАуксин».

Лучшие результаты достигаются при использовании биопрепарата, содержащего смесь автолизатов бактерий в соотношении 1:1:1, а именно Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-2883 - 20% масс, Bacillus megaterium ВКПМ В-607, содержащий биополимер поли-β-гидроксимасляную кислоту - 20% масс, Bacillus subtilis ВКПМ В-3679 20% масс, глауконит -10% масс, раствор макро- и микроэлементов -20% масс., динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (Трилон Б) -2% масс.

В основе изобретения лежат новые штаммы бактерий, выделенные заявителем (справки о депонировании прилагаются). Полученные автолизаты обогащены α-аланином, α-глутаминовой кислотой, 3-индолилуксусной кислотой, протеазой и гидролитическими ферментами, фолиевой кислотой и другими биологически активными веществами, способствующими росту растений и защите их от болезней.

Введение в композицию динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (Трилон Б) позволяет переводить соли в хелатные легкоусвояемые формы, а использование глауконита обогащает композицию подвижными формами микроэлементов.

В качестве хвойного экстракта (ХЭ) используют, как правило, коммерческий препарат марки ФС 42-2699-89, а в качестве хлорофиллокаротиновой пасты (ХКП) - коммерческий препарат марки ГОСТ 21802-84.

Использовался состав макро- и микроэлементов (РММ): азотнокислый калий, магний сернокислый, медь сернокислая, марганец сернокислый, цинк сернокислый, аммоний молибденовокислый, кислота борная, кобальт азотнокислый, калий фосфорнокислый, который выбирается исходя из особенностей природы обрабатываемых растений и включает в себя ионы натрия, калия, меди, марганца, цинка, бора, молибдена, железа, серы, кобальта, никеля, магния, селена, йода, азота и фосфора находящихся в хелатной и подвижной форме, что существенно облегчает питание растений и увеличивает их усвоение.

Концентрации глауконита, ХЭ, ХКП, РММ и Трилона Б меньше заявляемых снижают эффективность удобрения, использование больших концентраций возможно, но не дает значимого эффекта и экономически нецелесообразно.

Способ получения удобрения заключается в том, что проводят культивирование вышеупомянутых штаммов бактерий проводят раздельно, после чего их объединяют, в культуральную жидкость добавляют 15-25% масс промышленно выпускаемых смесей макро- и микроэлементов (РММ), например, азотнокислый калий, магний сернокислый, медь сернокислая, марганец сернокислый, цинк сернокислый, аммоний молибденовокислый, кислота борная, кобальт азотнокислый, калий фосфорнокислый, выдерживают полученную взвесь до завершения лизиса клеток, после чего в полученные аутолизаты вводят при тщательном перемешивании глауконит, ХЭ, ХКП и Трилон Б в заданных концентрациях.

Полученное удобрение готово к использованию. Дополнительным преимуществом удобрения является сохранение его эффективности в течении по крайней мере трех лет после изготовления при хранении в закрытой емкости при температуре от +10 до -10°С.

Культивирование микроорганизмов осуществляют следующим образом.

Культуральную жидкость бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-2883 готовят путем культивирования на мясо-пептонном агаре при 28±1°С в течение 36-48 часов при перемешивании со скоростью 0,1 об/мин в течение суток, а затем со скоростью 1,0-1,5 об/мин, при насыщении кислородом до 30-50% и рН 6,8-7,0 до оптической плотности 50-60 единиц.

Культуральную жидкость бактерий Bacillus megaterium ВКПМ В-607 готовят путем культивирования на среде, содержащей 0,5% дрожжевого экстракта, 1,5% пептона, 0,5% хлорида натрия, 1,5% агара, вода остальное при 30±1°С в течение 10-12 часов при перемешивании 250 об/мин, при насыщении кислородом до 100% и рН 7,0±0,1 до оптической плотности 100-150 единиц.

Культуральную жидкость бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3679 готовят путем культивирования на среде, содержащей 0,5% дрожжевого экстракта, 1,5% пептона, 0,5% хлорида натрия, 1,5% агара, вода - остальное при 30-38°С в течение 24-38 часов при перемешивании со скоростью 320 об/мин, при насыщении кислородом до 50% и рН 7,0±0,1 до оптической плотности 80-120 единиц.

Препаратом "ГлАуксин" обрабатывают семена растений перед посевом и/или сами растения во время вегетации. При предпосевной обработке семена обрабатывают раствором препарата до полного смачивания их поверхности, исходя из нормы расхода 20-30 г препарата на 1 тонну семян зерновых или 200-300 г на 1 тонну семян подсолнечника. Обработанные семена высевают в течение 3 суток после обработки. При обработке вегетирующих растений, препарат "ГлАуксин" берут из расчета 20-30 г/гектар посевов, смешивая препарат с удобным для каждой культуры и используемой техники количеством воды.

Сущность и промышленная применимость изобретения поясняется нижеприведенными примерами.

Пример. 1. Суспензию бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-2883 культивировали на мясо-пептонном агаре при 28±1°С в течение 40 часов при перемешивании со скоростью 0,1 об/мин в течение первых суток, а затем со скоростью 1,5 об/мин, при насыщении кислородом до 50% и рН 7,0 до оптической плотности 55 единиц.

Суспензию бактерий Bacillus megaterium ВКПМ В-607 культивировали на среде, содержащей 0,5% дрожжевого экстракта, 1,5% пептона, 0,5% хлорида натрия, 1,5% агара, вода остальное. Культивирование проводили при температуре 30±1°С в течение 10 часов при перемешивании со скоростью 250 об/мин, при насыщении кислородом до 100% и рН 7,0±0,1 до оптической плотности 100 единиц. Полученный продукт содержит поли-β-гидроксимасляную кислоту в количестве 5 г/кг суспензии.

Суспензию бактерий Bacillus subtilis ВКПМ-3679 готовили путем культивирования на среде, содержащей 0,5% дрожжевого экстракта, 1,5% пептона, 0,5% хлорида натрия, 1,5% агара, вода - остальное. Культивирование проводили при 36-38°С в течение 30 часов при перемешивании со скоростью 320 об/мин, при насыщении кислородом 50% и рН 7,0±0,1 до оптической плотности 100 единиц.

Полученную культуральную жидкость, содержащую суспензию бактерий объединяли в заданном соотношении и добавляли промышленно выпускаемый раствор микро- и макроэлементов, выдерживали при перемешивании до полного лизиса бактериальных клеток, после чего добавляли заданные количества глауконита, хвойного экстракта, хлорофиллокаротиновой пасты, и Трилона Б.

Получают препарат в виде вязкой текучей пасты зеленовато-коричневого цвета с плотностью 1,1-1,3 г/мл. Препарат содержит 5 г/кг биополимера поли-β-гидроксимасляной кислоты, α-аланина не менее 60 мг/кг, α-глутаминовой кислоты не менее 70 мг/кг, 3-индолилуксусной кислоты не менее 18 мг/кг, индолил-3-уксусная кислоты около 10 мкг/мл, суммарное содержание ауксинов не менее 11 мкг/мл.

Состав полученных композиций приведен в таблице 1.

Пример 2.

Препаратом "ГлАуксин А" проводили предпосевную обработку семян культуры озимой пшеницы сорт "Гармония", обрабатывая раствором препарата до полного смачивания их поверхности, исходя из нормы расхода 20 г препарата на 1 тонну семян зерновых Обработанные семена высевали в течение 3 суток после обработки. В контрольных вариантах семена обрабатывали водой. Для контроля и опыта использовали по 6 делянок площадью по 1 м². Опыты проводят в открытом грунте, результаты опытов обрабатывают статистически. Для опыта использовали препарат, хранившийся в течение 1 месяца и в течение 3 лет. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Разница в урожае зерна между опытом и контролем составила 37,6%, по клейковине 12%. Данная прибавка урожая за счет применения препарата "ГлАуксин А" статистически достоверна. Отмечено снижение пораженности растений корневыми гнилями при обработке препаратом "ГлАуксин А". Биологическая эффективность (определяемая как разность между долей пораженных растений в контроле и опыте, в процентах к контролю) препарата "ГлАуксин А" против корневых гнилей составила величину 80%.

Статистически достоверной разницы по урожаю зерна и по биологической эффективности защиты растений против корневых гнилей между вариантами препарата "ГлАуксин А" различного срока хранения не обнаружено. Таким образом, препарат "ГлАуксин А" не только способствует повышению урожая пшеницы, но и защищает растение от корневых гнилей.

Пример 3 Препарат "ГлАуксин С", приготовленный по Примеру 1, использовали на культуре озимой пшеницы сорт Мироновская 808. Эффективность определялась по урожаю зерна и по уровню поражения растений пыльной головней. Для опыта использовали семена пшеницы с уровнем пораженности пыльной головней 0,25%. Предпосевную обработку семян в опыте проводят из расчета 30 г препарата на 1 тонну семян, затем дважды проводили обработку растений по вегетации из расчета 20 г/га посевов, (первая - в стадии выхода растений в трубку, вторая - в стадии колошения). Для контроля проводили обработку растений препаратом Альбит из расчета 20 г препарата на 1 га посевов. \полученные результаты приведены в таблице 3.

Обработанные семена высевали в течение 3 суток после обработки. Для контроля и опыта использовали по 6 делянок площадью по 1 м². Опыты проводят в открытом грунте, результаты опытов обрабатывают статистически. Для опыта использовали препарат, хранившийся в течение 1 месяца и в течение 3 лет.

Разница в урожае зерна между опытом (обработка препаратом) и контролем (обработка Альбитом) статистически достоверна и составляет величину 12%. Биологическая эффективность препарата "ГлАуксин С" против пыльной головни равна 77%.

Статистически достоверной разницы по урожаю зерна и по биологической эффективности защиты растений против пыльной головни между вариантами препарата "ГлАуксин С" различного срока хранения не обнаружено.

Пример 4. Препараты "ГлАуксин Б" и "ГлАуксин Д" использовали для предпосевной обработки семян кукурузы гибрида Поволжский 89МВ на урожайность зерна, содержание в зерне белка и поражение растений болезнями из расчета 20 г препарата "ГлАуксин" на 1 га посевов. Для контроля проводили обработку растений препаратом Альбит из расчета 20 г препарата на 1 га посевов.

Для контроля и опыта использовали по 6 делянок площадью по 1 м². Опыты проводят в открытом грунте, результаты опытов обрабатывают статистически. Для опыта использовали препарат, хранившийся в течение 1 месяца и в течение 3 лет. Для контроля проводили обработку растений препаратом Альбит из расчета 20 г препарата на 1 га посевов. \полученные результаты приведены в таблице 3.

Разница в урожае между опытом и контролем статистически достоверна и равна 12%. Биологическая эффективность препарата "ГлАуксин" против поражения растений пузырчатой головней равна 53%.

Результаты вышеприведенных опытов показывают, что препарат "ГлАуксин" обладает способностью повышать урожай растений на уровне биопрепарата Альбит, но и обладает более выраженной способностью защищать растения от болезней и повышать их урожайность. Кроме того, предлагаемые препараты "ГлАуксин" обладают способностью после 3 лет хранения не снижать свою биологическую активность, повышать урожай растений на 20-40% и эффективно защищать растения от болезней (биологическая эффективность 50-77%).

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен препарат для повышения урожайности растений и защиты их от болезней, содержащий автолизаты бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-2883, Bacillus megaterium ВКПМ В-607, содержащий поли β-гидроксимасляную кислоту и Bacillus subtilis ВКПМ В-3679, раствор макро- и микроэлементов, хвойный экстракт, глауконит, хлорофиллокаротиновую пасту, Трилон Б и воду при заданном соотношении компонентов и способ его получения. Способ получения препарата для повышения урожайности растений и защиты их от болезней предусматривает раздельное культивирование штаммов бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-2883, Bacillus megaterium ВКПМ В-607 и Bacillus subtilis ВКПМ В-3679 на питательных средах с получением культуральных жидкостей. Полученные культуральные жидкости смешивают в соотношении 1:1:1, добавляют раствор макро- и микроэлементов и выдерживают полученную суспензию до завершения лизиса клеток и последующим введением и тщательном перемешивании глауконит, хвойный экстракт, хлорофиллокаротиновую пасту и Трилон Б в заданных соотношениях. При этом штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-2883 культивируют на мясо – пептоном бульоне при температуре 28±1°С в течение 36-48 ч при перемешивании до оптической плотности 50- 60 единиц. Штамм бактерий Bacillus megaterium ВКПМ В-607 культивируют на питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, хлорид натрия, агар и воду при заданных соотношениях при температуре 30±1°С в течение 10-12 ч при перемешивании до оптической плотности 100-150 единиц, а штамм бактерий subtilis ВКПМ В-3679 культивируют на питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, хлорид натрия, агар и воду при заданных соотношениях при температуре 30-38°С и при перемешивании до оптической плотности 80-120 единиц. Изобретение позволяет расширить ассортимент бактериальных препаратов для повышения урожайности растений. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 табл., 4 пр.

1. Препарат для повышения урожая растений и защиты их от болезней, включающий автолизаты бактерий Pseudomonas aureofaciens и Bacillus megaterium, содержащий поли-Р-гидроксимасляную кислоту, раствор макро- и микроэлементов, хвойный экстракт, хлорофиллокаротиновую пасту и воду, отличающийся тем, что он дополнительно содержит автолизат Bacillus subtilis ВКПМ В-3679, глауконит и Трилон Б, в качестве автолизатов бактерий Pseudomonas aureofaciens и Bacillus megaterium - автолизаты Pseudomonas aureofaciens ВКПМ B-2883 и Bacillus megaterium ВКПМ В-607 при следующем соотношении компонентов (% масс.):

автолизат Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-2883 - 15-25;

автолизат Bacillus megaterium ВКПМ В-607,

содержащий поли-β-гидроксимасляную кислоту - 15-25;

автолизат Bacillus subtilis ВКПМ В-3679 - 15-25;

глауконит - 8-15;

хвойный экстракт - 3-8;

хлорофиллокаротиновая паста - 1-2;

раствор макро- и микроэлементов - 15-25;

Трилон Б - 0,5-2;

вода - остальное.

2. Препарат по п. 1, отличающийся тем, что он содержит смесь автолизатов бактерий в соотношении 1:1:1 - 60% масс., глауконит - 10% масс., раствор макро- и микроэлементов - 20% масс., хвойный экстракт - 5% масс.; хлорофиллокаротиновую пасту 1-2% масс.; Трилон Б - 2% масс.

3. Способ получения препарата по п. 1, заключающийся в том, что проводят раздельное культивирование штаммов бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-2883, Bacillus megaterium ВКПМ В-607 и Bacillus subtilis ВКПМ В-3679, после чего полученные культуральные жидкости смешивают, добавляют 15-25% масс. раствора макро- и микроэлементов, выдерживают полученную суспензию до завершения лизиса клеток, после чего вводят в нее при тщательном перемешивании глауконит - 8-15% масс.; хвойный экстракт - 3-8% масс.; хлорофиллокаротиновую пасту - 1-2% масс.; Трилон Б - 0,5-2%.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что культивирование штаммов бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-2883 проводят на мясо-пептонном агаре при 28±1°С в течение 36-48 часов при перемешивании со скоростью 0,1 об/мин в течение суток а затем со скоростью 1,0-1,5 об/мин, при насыщении кислородом до 30-50% и рН 6,8-7,0 до оптической плотности 50-60 единиц.

5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что культивирование штаммов бактерий Bacillus megaterium ВКПМ В-607 проводят на среде, содержащей 0,5% дрожжевого экстракта, 1,5% пептона, 0,5% хлорида натрия, 1,5% агара, вода остальное, при 30±1°С в течение 10-12 часов при перемешивании 250 об/мин, при насыщении кислородом до 100% и рН 7,0±0,1 до оптической плотности 100-150 единиц.

6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что культивирование штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3679 проводят на среде, содержащей 0,5% дрожжевого экстракта, 1,5% пептона, 0,5% хлорида натрия, 1,5% агара, вода - остальное при 30-38°С в течение 24-38 часов при перемешивании со скоростью 320 об/мин, при насыщении кислородом до 50% и рН 7,0±0,1 до оптической плотности 80-120 единиц.