Способ получения биопрепарата на минеральной основе для растениеводства Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к созданию пастообразных средств для защиты растений на основе бактериальных агентов и минеральных наполнителей.

Известно органо-минеральное удобрение с ростостимулирующими свойствами, включающее микробную суспензию инактивированных на ультразвуковой установке штаммов почвенных бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ B-3162D, Bacillus megaterium ВКМ B-3138D, Bacillus atrophaeus ВКМ B-3137D в соотношении 1:1:1; раствор макро- и микроэлементов в хелатной форме; хвойный гидролизат; хвойную хлорофилло-каротиновую пасту; ЭДТА; аэросил А-300 (RU 2731730, МПК C05F 11/08, A01N 63/20, C12R 1/07, C12R 1/38, опубл. 08.09.2020).

Недостатком является использование инактивированных культур бактерий. Также препарат позволяет обеспечить повышение урожайности, но не обеспечивает защиты от фитопатогенов.

Известен способ получения биологического препарата на основе бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475 с титром клеток (2-3)×10⁹ КОЕ/мл и носителя в виде диатомита (RU 2528058, МПК C12N 1/20, A01N 63/00, C12R 1/07, опубл. 10.09.2014).

Недостатком данного способа является использование в препарате одного штамма бактерий, что сужает спектр действия.

Известен способ получения биологического препарата для стимуляции роста и защиты растений от заболеваний, включающий совместное культивирование штаммов бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-11634 и Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5787 на питательной среде на основе мелассы в соотношении 2:1 и выращивание до достижения титра клеток не менее 10¹⁰-10¹¹ КОЕ/мл (RU 2675503, МПК, A01N 63/00, C12N 1/205, C12R 2001/065, C12R 2001/38, C12N 1/20, опубл. 19.12.2018).

Недостатком данного способа является жидкая форма препарата, что ограничивает срок хранения.

Известен способ получения жидких бактериальных препаратов с добавлением диатомита и желатина из расчета 10 г на 1 л среды. В качестве микроорганизмов используют бактериальные штаммы Bacillus mojavensis PS17 или Pseudomonas fluorescens WCL5365 (RU 2774687, МПК A01N 63/20, A01N 63/22, A01N 63/27, A01P 3/00, опубл. 21.06.2022).

Недостатком данного способа является использование одного вида микроорганизма в препарате, а также снижение количества жизнеспособных клеток до 10⁵ КОЕ/мл спустя 6 месяцев хранения.

Известен способ получения микробного препарата, включающий смешивание суспензии культуры микроорганизмов с носителем, причем в качестве культуры микроорганизмов используют штамм ризосферных спорообразующих бактерий в виде концентрата бактериальной суспензии с титром не менее 1×10⁹ КОЕ/мл, при этом в качестве ризосферных спорообразующих бактерий используют бактерии вида Bacillus subtilis и их метаболиты, а в качестве носителя используют природный сорбент на основе кремнийсодержащих пород. Смешивание производят в смесителе с одновременным тонкодисперсным распылением концентрата бактериальной суспензии на носитель через форсунку под давлением при соотношении концентрата бактериальной суспензии и носителя 0,02:1 мас.ч (RU 2694570, МПК C05F 11/08, C05D 9/00, опубл. 16.07.2019).

Недостатком данного способа является присутствие в препарате одного вида бактерий и низкий титр в конечной форме.

Задачей изобретения является разработка способа получения новых форм биологического препарата на основе на минеральной основе для растениеводства, при использовании которого может быть достигнут технический результат, заключающийся в увеличении сроков хранения.

Технический результат заключается в продлении срока хранения биопрепаратов с сохранением их функциональных свойств за счет внесения минеральных наполнителей.

Сущность изобретения заключается в том, что способ получения биопрепаратов на минеральной основе для растениеводства включает совместное культивирование бактерий Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis и Azotobacter vinelandii на мелассной среде до достижения титра не менее 10¹³ КОЕ/мл. Измельченные порошки цеолита, диатомита или доломитовой муки смешивают с культуральной жидкостью (КЖ) в соотношениях 1:1, 5:4 и 3:2 соответственно.

Способ получения биопрепарата на минеральной основе для растениеводства заключается в следующем.

Хранение штаммов осуществляют на скошенной питательной среде состава, г/л: глюкоза - 10, дрожжевой экстракт - 5, пептон - 10, агар-агар - 18; рН 6,8 - 7,0. Культуры микроорганизмов засевают на питательный агар и культивируют при температуре 28°С в течении 2-3 суток.

Для приготовления инокулятов исследуемые бактерии культивируют в перемешиваемых условиях (150 об/мин) в течение суток при 28 °С на глюкозопептонной среде состава, г/л: глюкоза - 10, дрожжевой экстракт - 5, пептон - 10.

Совместное культивирование микроорганизмов Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis и Azotobacter vinelandii проводят глубинным способом на мелассной среде состава, г/л: меласса - 40, фосфат калия одноосновный - 0,2, фосфат калия двухосновный - 0,8, нитрат натрия - 1. Бактерии вносят в количестве 3% от общего объема среды, культивируют при 28 °С в течение 3 суток в перемешиваемых условиях в шейкере-инкубаторе (150 об/мин).

Предварительно измельченные и простерилизованные при температуре 180 °С в течение 1 часа наполнители, в качестве которых используются цеолит, диатомит и доломитовая мука, смешивают с КЖ в соотношениях 1:1, 5:4 и 3:2 соответственно.

Пример 1.

Совместное культивирование микроорганизмов Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis и Azotobacter vinelandii проводили глубинным способом на мелассной среде состава, г/л: меласса - 40, фосфат калия одноосновный - 0,2, фосфат калия двухосновный - 0,8, нитрат натрия - 1. Время культивирования 3 суток, температура 28 °С. Смешанная с наполнителями КЖ в определенных соотношениях представляет концентрированный биологический препарат (максимальный титр достигает 10¹⁷ КОЕ/г).

Количество жизнеспособных клеток определяли методом разведений Коха. Препараты хранились при комнатной температуре в течение 6 месяцев. Результаты оценки приведены в таблице 1.

Пример 2.

Совместное культивирование микроорганизмов Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis и Azotobacter vinelandii проводили глубинным способом на мелассной среде состава, г/л: меласса - 40, фосфат калия одноосновный - 0,2, фосфат калия двухосновный - 0,8, нитрат натрия - 1. Время культивирования 3 суток, температура 28 °С. Смешанная с наполнителями КЖ в определенных соотношениях представляет концентрированный биологический препарат (максимальный титр достигает 10¹⁷ КОЕ/г).

Рабочий раствор готовили путем разведения 1 г концентрированного биологического препарата в 200 мл воды.

Ростостимулирующую активность препаратов проверяли на семенах пшеницы. Обработка семян включала замачивание в количестве 50 шт. в рабочем растворе в течение 30 минут. Обработанные семена раскладывали на смоченной в воде фильтровальной бумаге в чашки Петри и помещали в климатическую камеру на 7 суток. Результаты приведены в таблице 2.

Пример 3.

Совместное культивирование микроорганизмов Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis и Azotobacter vinelandii проводили глубинным способом на мелассной среде состава, г/л: меласса - 40, фосфат калия одноосновный - 0,2, фосфат калия двухосновный - 0,8, нитрат натрия - 1. Время культивирования 3 суток, температура 28 °С. Смешанная с наполнителями КЖ в определенных в определенных соотношениях представляет концентрированный биологический препарат (максимальный титр достигает 10¹⁷ КОЕ/г).

Рабочий раствор готовили путем разведения 1 г концентрированного биологического препарата в 200 мл воды.

Антоганистическую активность препаратов проверяли в отношении тест-культур грибов: Botrytis cinerea, Alternaria alternata, Fusarium culmorum. На поверхность агара в чашке Петри засевали исследуемый препарат и выдерживали при 28°C в течение суток. В центр чашки вносили агаровый блок фитопатогена. По диаметру колонии гриба оценивали ингибирование роста фитопатогена (через 7 сут). Расчет ингибирующей активности препарата проводили по формуле Эббота (1) как процент ингибирования роста колонии гриба:

где Д_к - диаметр колонии гриба в контроле, мм; Д_о - диаметр колонии гриба в опыте, мм.

Результаты исследований представлены в таблице 3.

По сравнению с известными решениями заявленный способ позволяет продлить срок хранения биопрепаратов с сохранением их функциональных свойств за счет внесения минеральных наполнителей.

Таблица 1

Вариант Титр клеток, КОЕ/г 3 месяца хранения 6 месяцев хранения Доломитовая мука + КЖ 3:2 2,6×10¹⁷ 7,6×10¹⁶ Диатомит + КЖ 5:4 3,0×10¹⁷ 9,0×10¹⁶ Цеолит + КЖ 1:1 3,0×10¹⁷ 4,1×10¹⁶

Таблица 2

Вариант Срок хранения биопрепарата 1 месяц 6 месяцев Всхожесть, % Контроль (вода) 80 80 Доломитовая мука + КЖ 3:2 82 86 Диатомит + КЖ 5:4 82 96 Цеолит + КЖ 1:1 94 96 Длина корня, см Контроль (вода) 7,43±0,36 9,14±0,25 Доломитовая мука + КЖ 3:2 9,93±0,54 11,36±0,33 Диатомит + КЖ 5:4 9,86±0,28 11,29±0,45 Цеолит + КЖ 1:1 9,36±0,15 11,71±0,36 Длина листа, см Контроль (вода) 10,50±0,11 10,86±0,28 Доломитовая мука + КЖ 3:2 11,14±0,39 12,57±0,19 Диатомит + КЖ 5:4 12,29±0,34 13,26±0,35 Цеолит + КЖ 1:1 11,86±0,13 12,79±0,18

Таблица 3

Вариант Тест-культура B. cinerea A. alternata F. culmorum Доломитовая мука + КЖ 3:2 97 95 96 Диатомит + КЖ 5:4 96 94 95 Цеолит + КЖ 1:1 98 95 97

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к созданию пастообразных средств для защиты растений на основе бактериальных агентов и минеральных наполнителей. Изобретение представляет собой способ получения биопрепаратов на минеральной основе для растениеводства, включающий совместное культивирование бактерий Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis и Azotobacter vinelandii на мелассной среде до достижения титра не менее 10¹³ КОЕ/мл. Измельченные порошки цеолита, диатомита или доломитовой муки смешивают с культуральной жидкостью в соотношениях 1:1, 5:4 и 3:2 соответственно. Заявленное изобретение позволяет продлить срок хранения биопрепаратов с сохранением их функциональных свойств за счет внесения минеральных наполнителей. 3 табл.

Способ получения биопрепарата на минеральной основе для растениеводства, включающий совместное культивирование бактерий Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis и Azotobacter vinelandii на мелассной среде до достижения титра не менее 1013 КОЕ/мл, смешивание наполнителя с культуральной жидкостью, где в качестве наполнителя используют доломитовую муку в соотношении 3:2 по массе, или измельченный диатомит в соотношении 5:4 по массе, или измельченный цеолит в соотношении 1:1 по массе.