МИКРОФЛЮИДНОЕ УСТРОЙСТВО И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ, ОЧИСТКИ И КОНЦЕНТРАЦИИ КОМПОНЕНТОВ ТЕКУЧИХ СРЕД Российский патент 2021 года по МПК B01L3/00 B01L7/00 C12Q1/00 C12N15/10 G01N1/34 

[0001] Изобретение относится к микрофлюидному устройству и способу его использования при разделении, очистке и концентрации компонентов текучих сред. В частности, настоящее изобретение относится к микрофлюидному устройству и способу подготовки образцов крови, а также способу очистки нуклеиновых кислот и способу сочетания вышеуказанных способов со способом обнаружения биологических ингредиентов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Разделение, очистка, фракционирование и концентрация компонентов текучей среды или газообразных сред и расщепление отдельных компонентов с последующими отделением, очисткой, фракционированием и концентрацией компонентов традиционно связаны с множеством этапов обработки.

[0003] В то время как в химических науках используются дистилляционные колонки, встряхивание колб или мембраны, и обычно обрабатываются большие объемы, в биологических науках, например, обрабатываются небольшие объемы, и используются другие технологии.

[0004] В биологических науках основными технологиями являются центрифугирование и технологии, основанные на колонках или частицах. В данном случае, например, образец, подлежащий разделению, применяют к градиентам плотности текучей среды, и различные фракции получают в соответствии с размером. Длительные этапы обработки и центрифугирование, зачастую также ультрацентрифугирование в данном случае являются утомительными. Альтернативно компоненты образца связываются с пористыми поверхностями, которые служат колонками. Для усиления образца посредством этой колонки используют центрифугирование, причем этапы ручной промывки с повторяющимися этапами центрифугирования делают этот способ сложным. Управляемые давлением колонки со специфическим или полуспецифическим связыванием целевых молекул или фракционированием целевых компонентов согласно размеру и их последующее вымывание посредством управляемого давлением входного потока текучей среды являются дополнительными методами. Альтернативно к текучим средам или газам также могут быть добавлены частицы. В зависимости от поверхностных свойств частиц компоненты образца могут прилипать к этим частицам и освобождаться опять же посредством реагентов, под действием температуры или сочетанием реагентов и температуры. В этих процессах применяют большие автоматизированные системы, которые, в частности, используются для очистки нуклеиновых кислот.

[0005] Для упрощения разделения и очистки в основном небольших объемов в области микрофлюидики известны некоторые разработки, в которых для разделения и очистки используются такие элементы как мембраны, фильтры или фритты. Однако они зачастую являются трудноуправляемыми, не позволяют использовать желательный объем образца и предоставляют мало возможностей очистки полученных компонентов в достаточной степени для последующих процессов. Кроме того, процессы, необходимые для достижения желательных результатов, например, в области обработки крови или извлечения нуклеиновых кислот, не рассматриваются подробно, так что ни одна известная система в настоящее время не подходит для стандартного использования.

[0006] Таким образом, задача настоящего изобретения состоит в создании микрофлюидного устройства, которое является простым в изготовлении и может быть адаптировано к количествам образца, подлежащего обработке, а также к предшествующим и последующим процессам. Кроме того, задача настоящего изобретения состоит в создании способа использования этого устройства.

[0007] Настоящее изобретение описывает микрофлюидное устройство с системой каналов для текучей среды по меньшей мере с одним портом для текучей среды. Микрофлюидное устройство выполнено в виде закрытого блока и имеет по меньшей мере один вставленный функциональный элемент, который предпочтительно выполнен в виде пористого функционального элемента. Образец и/или среда может проходить через пористый функциональный элемент. Впоследствии дополнительные текучие среды или газы могут быть направлены через указанный функциональный элемент. Это означает, что функциональный элемент может последовательно выполнять различные задачи при обработке текучих сред в микрофлюидной системе.

[0008] Микрофлюидное устройство имеет по меньшей мере один структурированный компонент, который образует главный или основной компонент микрофлюидного устройства. Структурированный компонент обычно имеет плоский и/или зачастую кубовидный корпус, который может быть изготовлен инжекционным литьем под давлением. В этот структурированный компонент встроены структуры. В частности, они включают в себя микрофлюидную систему каналов. Каналы или часть их предпочтительно выполнены с верхней стороны и/или нижней стороны структурированного компонента. Структурированный компонент также может иметь резервуары для текучей среды, сужения канала, клапаны, переключатели, распределители, вентиляционные мембраны, камеры, полости и/или реакционные полости, которые либо встроены в структурированный компонент, либо вставлены в полости, обеспеченные для этой цели.

[0009] Микрофлюидное устройство также имеет по меньшей мере один конструктивный элемент, нанесенный на структурированный компонент. Конструктивный элемент также может быть выполнен в виде закрывающей пластины и называется закрывающей пластиной. Этот конструктивный элемент нанесен на верхнюю и/или нижнюю сторону структурированного компонента. Компонент может быть частично прозрачной или частично светонепроницаемой пластиной. Однако конструктивный элемент также может быть выполнен в виде пленки, которая приклеена, прикреплена швом, впрессована в верхнюю и/или нижнюю сторону или присоединена к ней сваркой, например, чтобы сделать микрофлюидные структуры уплотненными по текучей среде и в случае необходимости уплотненными по газу. Пленка предпочтительно выполнена из пластика и имеет очень малую толщину по сравнению с ее шириной и длиной, что обеспечивает ее высокую гибкость. Предпочтительная толщина в данном случае меньше или равна 1 мм. Пластина является менее гибкой, поскольку ее толщина больше по сравнению с ее шириной и длиной. Таким образом, предпочтительными являются пластины с толщиной, которая больше или равна 1 мм.

[0010] Кроме того, микрофлюидное устройство согласно настоящему изобретению включает в себя по меньшей мере один пористый функциональный элемент. Указанный по меньшей мере один функциональный элемент может быть реализован, например, в виде фильтра, мембраны, фритты или функциональной бумаги или подобных элементов. Один или более функциональные элементы могут содержать реагенты, т.е. реагенты могут быть применены к одному или более фильтрам, мембранам, фриттам или функциональным бумагам. Все эти примеры функциональных элементов по меньшей мере частично являются проницаемыми для текучих сред. Они могут быть мембранами и/или фильтрами для разделения по размеру, такими как структурированные лазером мембраны (с травлеными дорожками) с точно заданным размером пор, кремниевыми ситами или фильтровальной бумагой с крупноячеистой сеткой. Функциональные элементы, которые используются для разделения по размеру, и/или дополнительное приспособление, расположенное на поверхности указанного функционального элемента, являются различными элементами, такими как пористые объемные структуры, подобные фриттам, кремниевые мембраны, мембраны из двуокиси кремния, объемные объединенные частицы, фильтровальные покрытия, выполненные из различных материалов, покрытия из двуокиси кремния, фильтры из полиэтилентерефталата (ПЭТ), тонкослойные хроматографические материалы или, например, мембраны для выработки плазмы/сыворотки. Все эти функциональные элементы могут быть дополнительно снабжены реагентами для обеспечения возможности специфического связывания целевых молекул с этими функциональными элементами и целенаправленного отделения целевых молекул от этих функциональных элементов.

[0011] Микрофлюидное устройство имеет по меньшей мере один порт для текучей среды для подачи среды. Предпочтительно в микрофлюидном устройстве расположены два порта для текучей среды. По меньшей мере один порт для текучей среды в микрофлюидном устройстве может быть расположен вертикально, горизонтально и/или под произвольным углом и может использоваться для добавления среды и/или применения положительного или отрицательного давления, а также просто для вентиляции.

[0012] Кроме того, микрофлюидное устройство может быть закрыто с использованием по меньшей мере одного встроенного клапана, по меньшей мере одного внешнего переключателя или по меньшей мере одного клапана, или по меньшей мере одного колпачка.

[0013] Микрофлюидное устройство согласно настоящему изобретению служит, в частности, для разделения, очистки, фракционирования и концентрации компонентов подаваемой среды или подаваемого образца.

[0014] Предпочтительные варианты реализации микрофлюидного устройства включают в себя множество функциональных элементов и при необходимости могут иметь один или более резервуаров для текучей среды.

[0015] Согласно настоящему изобретению микрофлюидным устройством управляют соответствующим способом, согласно которому в соответствии с настоящим изобретением в дополнение к разделению, очистке, фракционированию и концентрации компонентов также могут выполняться промежуточные этапы реакций для получения, отделения и/или концентрации желательных целевых компонентов.

[0016] В частности, предпочтительный вариант реализации микрофлюидного устройства выполнен в виде функционального блока или микрофлюидной системы.

[0017] Микрофлюидным устройством можно управлять вручную или посредством простых устройств или оборудования, которые соединены или связаны с указанным микрофлюидным устройством или закрывают его, например, для обеспечения давления или подачи технологической среды.

[0018] Обеспечен приведенный для примера способ очистки нуклеиновых кислот, согласно которому образец вводят через порт (4.1) для текучей среды, а реагенты добавляют в реакционную камеру (6). Затем клетки, включенные в образец, разлагаются. Затем образец перемещают через функциональный элемент, в то время как порт (4.2) для текучей среды закрыт, а нежелательные молекулы либо входят в резервуар (7) для отходов непосредственно с образцом, либо освобождаются промывкой/полосканием функционального элемента (5) реагентами из резервуаров (8) для текучей среды, в то время как целевые молекулы, нуклеиновые кислоты остаются в функциональном элементе (5) и освобождаются только специальным реагентом из одного из резервуаров (8) для текучей среды, причем порт (4.3) для текучей среды в резервуаре (7) для отходов закрывают, а порт (4.2) для текучей среды открывают заранее, при этом полученные нуклеиновые кислоты могут быть удалены из системы для обработки текучей среды через теперь уже открытый порт (4.2) для текучей среды.

[0019] Предпочтительно нуклеиновые кислоты являются кислотой ДНК или РНК.

[0020] Согласно еще одному способу очистки нуклеиновых кислот образец подают через порт (4.1) для текучей среды и фильтруют функциональным элементом (5), так что клетки остаются позади, а нежелательные компоненты входят в резервуар (7) для отходов, у которого порт (4.3) для текучей среды открыт, что достигается закрытием портов (4.2 и 4.3) для текучей среды позади второго функционального элемента (5) в направлении потока, после чего происходит лизирование клеток при их контакте с реагентами в камере (6) над первым функциональным элементом (5), затем транспортируют лизат текучими средами из одного из резервуаров (8) для реагентов, соединенного с первым функциональным элементом (5), после чего транспортируют лизат к второму функциональному элементу (5), причем теперь порт (4.3) для текучей среды позади второго функционального элемента (5) открыт, а другие порты для текучей среды закрыты, при этом целевые молекулы и дополнительные молекулы связываются с функциональным элементом (5), и путем промывки текучими средами из резервуаров (8) для реагентов происходит отделение нежелательных молекул, и, наконец, после закрытия порта (4.3) для текучей среды и открытия порта (4.2) для текучей среды нуклеиновые кислоты освобождаются реагентом, а элюат выталкивается и удаляется через порт (4.2) для текучей среды.

[0021] Согласно предпочтительному способу очистки нуклеиновых кислот образец подают через порт (4.1) для текучей среды и фильтруют функциональным элементом (5), так что клетки остаются позади, а нежелательные компоненты входят в резервуар (7) для отходов, у которого порт (4.3) для текучей среды открыт, что достигается при закрытии портов (4.2 и 4.3) для текучей среды позади второго функционального элемента (5) в направлении потока, после чего происходит лизирование клеток при их контакте с реагентами в камере (6) над первым функциональным элементом (5), после чего транспортируют лизат текучими средами из одного из резервуаров (8) для реагентов, соединенного с первым функциональным элементом (5), после чего транспортируют лизат к второму функциональному элементу (5), в котором теперь уже порт (4.3) для текучей среды позади второго функционального элемента (5) открыт, а другие порты для текучей среды закрыты, причем целевые молекулы и дополнительные молекулы связываются с функциональным элементом (5), и путем промывки текучими средами из резервуаров (8) для реагентов происходит отделение нежелательных молекул, и наконец после закрытия порта (4.3) для текучей среды и открытия порта (4.2) для текучей среды нуклеиновые кислоты освобождаются реагентом, а элюат выталкивается и удаляется из порта (4.2) для текучей среды, при этом нуклеиновой кислотой является ДНК, или нуклеиновой кислотой является РНК.

[0022] Очищенная нуклеиновая кислота может быть подвергнута последующей амплификации и обнаружению.

[0023] Очищенная нуклеиновая кислота может быть кислотой РНК и затем может быть подвергнута первой обратной транскрипции, и затем амплификации и обнаружению.

[0024] Все реагенты могут быть обеспечены в форме текучей среды или сухой форме в микрофлюидной системе.

[0025] Очищенная нуклеиновая кислота может быть кислотой ДНК и может быть подвергнута амплификации и обнаружена реакцией КПЦР и/или подвергнута амплификации и обнаружена изотермической амплификацией.

[0026] Очищенная нуклеиновая кислота может быть ДНК, которую подвергают предварительной амплификации в первой камере (20) неспецифической реакцией ПЦР и затем обнаруживают специфической реакцией КПЦР.

[0027] Очищенная нуклеиновая кислота может быть РНК, которую подвергают обратной транскрипции в первой камере (20) и подвергают амплификации и обнаруживают реакцией КПЦР во второй камере (20).

[0028] Очищенная нуклеиновая кислота может быть РНК, которую подвергают в одной камере (20) как реакции обратной транскрипции, так и реакции КПЦР (одноступенчатой реакции ОТ-ПЦР).

[0029] Множество параллельных камер (20) для реакции КПЦР могут быть образованы для осуществления реакции КПЦР в параллельных камерах для реакции ПЦР.

[0030] Реакция КПЦР может проходить как дуплексная реакция ПЦР с внутренним контролем амплификации, и/или реакция КПЦР может проходить как мультиплексная реакция ПЦР с внутренним контролем амплификации.

[0031] Предпочтительно реакцией ПЦР является известная реакция ПЦР, которая при необходимости впоследствии может быть обнаружена матричной гибридизацией.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0032] Ниже настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на сопроводительные чертежи, на которых:

[0033] На ФИГ. 1а показан вид сверху первого варианта реализации микрофлюидного устройства;

[0034] На ФИГ. 1b показан вид в разрезе первого варианта реализации по ФИГ. 1а, взятый вдоль непоказанной линии от входного отверстия до выходного отверстия;

[0035] На ФИГ. 2а показан вид сверху второго варианта реализации микрофлюидного устройства;

[0036] На ФИГ. 2b показан вид в разрезе второго варианта реализации по ФИГ. 2а, взятый вдоль непоказанной линии от входного отверстия до выходного отверстия;

[0037] На ФИГ. 3а показан вид сверху третьего варианта реализации микрофлюидного устройства;

[0038] На ФИГ. 3b показан вид в разрезе третьего варианта реализации по ФИГ. 3а, взятый вдоль линии 3b;

[0039] На ФИГ. 3с показан вид в разрезе третьего варианта реализации по ФИГ. 3а, взятый вдоль линии 3cd;

[0040] На ФИГ. 3d показан вид в разрезе третьего варианта реализации с колпачками, показанными на ФИГ. 3а, взятый вдоль линии 3cd;

[0041] На ФИГ. 4а показан вид сверху четвертого варианта реализации микрофлюидного устройства;

[0042] На ФИГ. 4b показан вид в разрезе четвертого варианта реализации по ФИГ. 4а, взятый вдоль линии 4b;

[0043] На ФИГ. 4с показан вид в разрезе четвертого варианта реализации по ФИГ. 4а, взятый вдоль линии 4cd;

[0044] На ФИГ. 4d показан вид в разрезе четвертого варианта реализации с колпачками, как показано на ФИГ. 4а, взятый вдоль линии 4cd;

[0045] На ФИГ. 5а показан вид сверху пятого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению;

[0046] На ФИГ. 5b показан вид в разрезе пятого варианта реализации по ФИГ. 5а, взятый вдоль линии 5b;

[0047] На ФИГ. 5с показан вид в разрезе пятого варианта реализации по ФИГ. 5а, взятый вдоль линии 5cd;

[0048] На ФИГ. 5d показан вид в разрезе пятого варианта реализации с колпачками, как показано на ФИГ. 5а, взятый вдоль линии 4cd;

[0049] На ФИГ. 5е показан вид в разрезе пятого варианта реализации с колпачками, как показано на ФИГ. 5а, взятый вдоль линии 5е;

[0050] На ФИГ. 6а показан вид сверху шестого варианта реализации микрофлюидного устройства;

[0051] На ФИГ. 6b показан вид в разрезе шестого варианта реализации по ФИГ. 6а вдоль непоказанной линии от входного отверстия до выходного отверстия;

[0052] На ФИГ. 6с показан вид в разрезе шестого варианта реализации с колпачками, как показано на ФИГ. 6а, вдоль непоказанной линии от входного отверстия до выходного отверстия;

[0053] На ФИГ. 7а показан вид сверху седьмого варианта реализации микрофлюидного устройства;

[0054] На ФИГ. 7b показан вид в разрезе седьмого варианта реализации по ФИГ. 7а вдоль непоказанной линии, проходящей через резервуары для текучей среды;

[0055] На ФИГ. 7с показан вид в разрезе седьмого варианта реализации с колпачками, как показано на ФИГ. 7а, вдоль непоказанной линии от входного отверстия до выходного отверстия;

[0056] На ФИГ. 8а показан вид сверху восьмого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению;

[0057] На ФИГ. 8b показан вид в разрезе восьмого варианта реализации по ФИГ. 8а вдоль непоказанной линии, проходящей через резервуары для текучей среды;

[0058] На ФИГ. 8с показан вид в разрезе восьмого варианта реализации с колпачками, как показано на ФИГ. 8а, вдоль непоказанной линии от входного отверстия до выходного отверстия;

[0059] На ФИГ. 9а показан вид сверху девятого варианта реализации микрофлюидного устройства;

[0060] На ФИГ. 9b показан вид в разрезе девятого варианта реализации по ФИГ. 9а вдоль непоказанной линии, проходящей через резервуары для текучей среды;

[0061] На ФИГ. 9с показан вид в разрезе девятого варианта реализации с колпачками, как показано на ФИГ. 9а, вдоль непоказанной линии от входного отверстия до выходного отверстия;

[0062] На ФИГ. 10а показан вид сверху десятого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению;

[0063] На ФИГ. 10b показан вид в разрезе десятого варианта реализации по ФИГ. 10а вдоль непоказанной линии, проходящей через резервуары для текучей среды;

[0064] На ФИГ. 10с показан вид в разрезе десятого варианта реализации с колпачками, как показано на ФИГ. 10а, вдоль непоказанной линии от входного отверстия до выходного отверстия;

[0065] На ФИГ. 11а показан вид сверху одиннадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению;

[0066] На ФИГ. 11b показан вид в разрезе одиннадцатого варианта реализации по ФИГ. 11а вдоль непоказанной линии, проходящей через резервуары для текучей среды;

[0067] На ФИГ. 11с показан вид в разрезе одиннадцатого варианта реализации с колпачками, как показано на ФИГ. 11а, вдоль непоказанной линии от входного отверстия до выходного отверстия;

[0068] На ФИГ. 12а показан вид сверху двенадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению;

[0069] На ФИГ. 13а показан вид сверху тринадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению;

[0070] На ФИГ. 13b показан вид в разрезе тринадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению в сечении 1;

[0071] На ФИГ. 13с показан вид в разрезе четырнадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению в сечении 2;

[0072] На ФИГ. 14а показан вид сверху четырнадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению;

[0073] На ФИГ. 14b показан вид в разрезе четырнадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению в сечении 1;

[0074] На ФИГ. 14с показан вид в разрезе четырнадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению в сечении 2;

[0075] На ФИГ. 15а показан вид сверху пятнадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению;

[0076] На ФИГ. 15b показан вид в разрезе пятнадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению в сечении 1;

[0077] На ФИГ. 15с показан вид в разрезе четырнадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению в сечении 2;

[0078] На ФИГ. 16а показан вид сверху шестнадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению;

[0079] На ФИГ. 16b показан вид в разрезе шестнадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению в сечении 1;

[0080] На ФИГ. 17а показан вид сверху семнадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению;

[0081] На ФИГ. 17b показан вид в разрезе семнадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению в сечении 1;

[0082] На ФИГ. 18а показан вид сверху восемнадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению;

[0083] На ФИГ. 19 показан вид сверху девятнадцатого варианта реализации микрофлюидного устройства согласно настоящему изобретению;

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0084] На ФИГ. 1 и 2 показан основной вариант реализации микрофлюидного устройства. Микрофлюидное устройство имеет два порта 4.1. и 4.2 для текучей среды. Структурированный компонент 1 выполнен в виде плоского или кубовидного компонента и имеет два порта 4.1 и 4.2 для текучей среды, расположенные на его боковых или передних сторонах. Кроме того, в структурированный компонент 1 встроена или вставлена система 2 каналов для текучей среды. Дополнительный конструктивный элемент 3 закрывает верхнюю сторону структурированного компонента 1 таким образом, что система 2 каналов для текучей среды и структуры для текучей среды закрыты с уплотнением по текучей среде, и, если в качестве среды используются газы, также с уплотнением по газу.

[0085] Кроме того, функциональный элемент 5, предпочтительно пористый функциональный элемент 5 расположен рядом со структурированным компонентом 1 или в нем. Поток через пористый функциональный элемент 5 может быть вертикальным, как показано на ФИГ. 1b, или горизонтальным, как показано на ФИГ. 2b. Также возможен двунаправленный поток в обоих направлениях. Функциональный элемент 5 может быть или выполнен за одно целое со структурированным компонентом 1 в процессе изготовления структурированного компонента 1, например, путем литья под давлением со вставкой указанного функционального элемента, или он может быть впоследствии вставлен в микрофлюидное устройство. На ФИГ. 1 показано, что функциональный элемент 5 вставлен в камеру 6 и омывается сверху, т.е. вертикально, причем канал 2 образован после функционального элемента 5 на нижней стороне структурированного компонента 1 и закрыт другим конструктивным элементом 3, аналогичным верхнему конструктивному элементу 3. Камера 6 остается над функциональным элементом 5, и в нее поперечно протекает среда, прибывающая из порта 4.1 для текучей среды.

[0086] Альтернативно, как показано на ФИГ. 2b, канал 2 сначала проходит в качестве продолжения порта 4.1 для текучей среды и затем продолжается на нижней стороне структурированного компонента 1. Опять же, канал 2 закрыт другим конструктивным элементом 3. На нижней стороне структурированного компонента 1 образована камера, в которую функциональный элемент 5 вставлен или будет вставлен таким образом, что он может омываться горизонтально, и текучая среда протекает к противоположному порту 4.2 для текучей среды для выпуска через него.

[0087] Способ использования указанного микрофлюидного устройства таков, что образец вводят через порт 4.1 для текучей среды, оставляя некоторые заданные компоненты образца в функциональном элементе 5. Это достигается заданным размером частиц функционального элемента 5. Затем может быть выполнено промывание функционального элемента 5, при котором через функциональный элемент 5 пропускают различные реагенты или воздух. Затем целевой компонент может быть смыт из функционального элемента 5, что может быть осуществлено специальными реагентами, под давлением, с использованием нагрева или сочетанием этих способов.

[0088] В частности, предпочтительным является повторное нагнетание со смещением среды, в качестве которой особенно предпочтительным является использование масел или сред с более высокой вязкостью, чем предыдущие текучие среды, причем также могут использоваться одни и те же текучие среды после отделения целевого компонента от функционального элемента 5 для обеспечения вымывания целевого компонента с количественным определением.

[0089] Этот способ обеспечивает возможность не только очистки полученного целевого компонента в элюате, но также и его обогащения по сравнению с исходной средой. Таким образом, путем промывки различными средами также обеспечивается фракционирование, т.е. вымывание различных компонентов исходной среды из функционального элемента 5.

[0090] На ФИГ. 3a-3d показан еще один вариант реализации микрофлюидного устройства. В данном случае в микрофлюидное устройство добавлены резервуары 8 для реагентов. Структурированный компонент 1 включает в себя систему 2 каналов для текучей среды и дополнительный конструктивный элемент 3 с нижней стороны, который закрывает с уплотнением по текучей среде структуры для текучей среды и также с уплотнением по газу, когда в качестве среды используются газы, причем функциональным элементом 5 предпочтительно является пористый функциональный элемент, который расположен рядом со структурированным компонентом 1 или в нем, а также три порта 4.1, 4.2, 4.3 для текучей среды, причем образец (среда), подаваемый через порт 4.1 для текучей среды, расположенный с верхней стороны, а также реагенты, хранящиеся в резервуарах 8 для реагентов, могут протекать через функциональный элемент 5 в любом порядке, и потоком указанной текучей среды или выпуском текучей среды можно управлять путем выборочного закрытия портов 4.1, 4.2 и 4.3 для текучей среды колпачками 11 (показанными на ФИГ. 3d). Резервуары 8 для реагентов могут быть выполнены в виде блистеров, причем заданные текучие среды хранятся в инкапсулированных контейнерах. Это означает, что указанные три резервуара 8 для реагентов могут содержать текучие среды различных типов и/или различное количество указанных текучих сред для обеспечения возможности их добавления специально для обработки образца. В блистерном седле 9 имеются небольшие штырьки 10, которые при задействовании блистера (вдавливании в блистер) вызывают открытие инкапсулированных контейнеров таким образом, что текучая среда может без помех подаваться в систему 2 каналов или функциональный элемент 5.

[0091] Текучая среда может удерживаться в камере 7 для отработанной текучей среды микрофлюидного устройства или транспортироваться наружу через порт 4.3 для текучей среды, расположенный с верхней стороны. При закрытии каждого из портов 4.1 и 4.3 для текучей среды колпачком 11 текучая среда также может быть удалена через порт 4.2 для текучей среды, который затем открывают. Таким образом, целевая текучая среда может быть удалена, и в то же время, когда образец применен через порт 4.1 для текучей среды, указанный порт после этого закрывается колпачком.

[0092] Функциональный элемент 5 может быть или выполнен за одно целое со структурированным компонентом 1 в процессе изготовления указанного структурированного компонента, например, путем литья под давлением со вставкой указанного функционального элемента 5, или он может быть вставлен впоследствии.

[0093] Способ использования микрофлюидного устройства таков, что образец вводят через порт 4.1 для текучей среды, порт 4.1 для текучей среды закрывают после ввода образца, и порт 4.3 для текучей среды также закрывают колпачком 11 для удаления отходов. Компоненты образца остаются в функциональном элементе 5. Впоследствии функциональный элемент 5 может быть промыт, причем функциональный элемент 5 промывают различными реагентами или продувают воздухом. На следующем этапе из функционального элемента 5 вымывают целевой компонент, что может быть осуществлено специальными реагентами, под давлением, с использованием нагрева или сочетанием этих способов, причем нежелательные фракции или хранят в камере 7 для отходов, или смывают из микрофлюидного устройства через порт 4.3 для текучей среды. Таким образом, получают целевые компоненты через порт 4.2 для текучей среды, причем повторное нагнетание среды смещения после выделения целевого компонента из функционального элемента 5 является особенно предпочтительным для вымывания целевого компонента с количественным определением, так что с использованием этого способа целевой компонент в полученном элюате не только может быть очищен, но также и обогащен по сравнению с исходной средой. Кроме того, поток различных сред обеспечивает возможность фракционирования, т.е. вымывания различных компонентов исходной среды из функционального элемента 5.

[0094] Согласно предпочтительному варианту реализации микрофлюидное устройство может иметь клапаны в системе 2 каналов для текучей среды, которые могут быть выполнены в виде мембранных клапанов, вращательных клапанов или других клапанов и которые выполнены с возможностью закрытия системы 2 каналов или ее части, например, для рассоединения сегмента микрофлюидного устройства на определенное время или на время реакции, или на время операции по обработке и, таким образом, направления текучей среды внутри микрофлюидного устройства выборочно в другие области системы каналов или к другим дополнительным функциональным элементам 5, или определенному порту 4.1, 4.2, 4.3 для текучей среды.

[0095] В предпочтительной конфигурации микрофлюидное устройство может иметь расположенную выше по ходу потока реакционную камеру 6, как показано на ФИГ. 4а. В микрофлюидном устройстве, показанном на ФИГ. 4a - 4d, структурированный компонент 1 имеет систему 2 каналов для текучей среды, расположенную с нижней стороны структурированного компонента 1. Нижняя сторона структурированного компонента 1 и система 2 каналов для текучей среды в этой области закрыта с уплотнением по текучей среде другим конструктивным элементом 3 и также с уплотнением по газу, когда в качестве среды используются газы.

[0096] Между портом 4.1 для текучей среды, который служит входным отверстием и расположен на верхней стороне структурированного компонента 1, и функциональным элементом 5, который предпочтительно является пористым функциональным элементом 5, расположена камера или реакционная камера 6 в качестве части системы для обработки текучей среды. Микрофлюидное устройство по ФИГ. 4a - 4d имеет множество резервуаров 8 для реагентов, по меньшей мере один из которых может обеспечивать подачу текучей среды перед камерой 6. Схожим образом, возможна подача текучей среды после камеры 6, но перед функциональным элементом 5, что в данном случае на чертеже не показано. Три дополнительных резервуара 8 для реагентов расположены таким образом, что возможна подача текучей среды или реагента в функциональный элемент 5, т.е. резервуары 8 для реагентов выпускают свои среды в функциональный элемент 5. Добавление может быть выполнено с временной задержкой.

[0097] Микрофлюидное устройство по ФИГ. 4a - 4d имеет дополнительные порты для текучей среды, из которых один порт 4.3 для текучей среды соединен позади камеры 7, и другой порт 4.2 для текучей среды соединен параллельно камере 7.

[0098] Через порт 4.1 для текучей среды (ФИГ. 4d), который необходимо закрывать впоследствии, образец достигает камеры 6 и смешивается с реагентом из резервуара 8 для реагентов. Затем результирующая текучая среда передается через функциональный элемент 5, причем через функциональный элемент 5 могут проходить как среды из камеры/реакционной камеры 6, так и реагенты из других резервуаров 8 для реагентов в любом порядке.

[0099] Потоком текучей среды можно управлять путем выборочного закрытия портов 4.1, 4.2, 4.3 для текучей среды колпачками 11.

[0100] Текучая среда может быть удержана в камере 7 для отходов в микрофлюидном устройстве или может быть выпущена наружу через порт 4.3 для текучей среды, соединенный с камерой 7 в верхней части структурированного компонента 1.

[0101] Затем при закрытии портов 4.1 и 4.3 для текучей среды текучая среда может быть выпущена через открытый порт 4.2 для текучей среды, например, для удаления целевой текучей среды, в то же время когда образец применен через порт 4.1 для текучей среды, этот порт впоследствии закрывают.

[0102] Согласно предпочтительному варианту реализации микрофлюидное устройство может иметь дополнительный функциональный элемент 5, как показано на ФИГ. 5a - 5d. В этой конфигурации обеспечены множество резервуаров 8 для реагентов, которые могут подавать жидкости или среды перед первым функциональным элементом 5 или подавать текучие среды к второму функциональному элементу 5. Первый и второй функциональные элементы 5 соединены последовательно. Микрофлюидное устройство имеет две камеры 7, одна из которых связана с первым функциональным элементом 5 и обеспечена портом 4.4 для текучей среды. Первый порт 4.1 для текучей среды расположен с верхней стороны структурированного компонента 1 и соединен системой 2 каналов с первым функциональным элементом 5, который промывается вертикально. Второй функциональный элемент 5, который соединен со второй камерой 7, расположен с нижней стороны структурированного компонента 1. Вторая камера 7 соединена с портом 4.3 для текучей среды, причем канальная ветвь, ведущая к порту 4.2 для текучей среды, расположена перед второй камерой 7.

[0103] Структурированный компонент 1 покрыт в данном случае двумя дополнительными конструктивными элементами 3, которые закрывают систему 2 каналов для текучей среды с уплотнением по текучей среде и также с уплотнением по газу, когда в качестве среды используют газы. Верхний конструктивный элемент 3 не покрывает верхнюю сторону структурированного компонента 1 полностью, так что множество портов 4.1, 4.2, 4.3 и 4.4 для текучей среды не закрыты верхним конструктивным элементом 3. Нижний конструктивный элемент полностью закрывает структурированный компонент 1.

[0104] Через порт 4.1 для текучей среды, подлежащий закрытию, образец вводят в полость/реакционную камеру 6, в которой расположен первый функциональный элемент 5. Частицы удерживаются первым функциональным элементом 5 и направляются через систему 2 каналов для текучей среды к второму функциональному элементу 5 при закрытии порта 4.1 для текучей среды, и оттуда через камеру 7 направляются к порту 4.3 для текучей среды или непосредственно из микрофлюидного устройства через порт 4.4 для текучей среды. Затем подача реагента вызывает реакцию с частицами, так что более мелкие частицы теперь достигают второго функционального элемента 5 при открытии системы 2 каналов для текучей среды, причем целевые молекулы могут быть удержаны на этом втором функциональном элементе, при этом целевые молекулы могут быть элюированы (вымыты) после подачи реагента из резервуаров 8 для реагентов, в то время как фракции, подлежащие утилизации, могут быть сохранены во второй камере или резервуаре 7 для отходов или смыты из микрофлюидного устройства.

[0105] Согласно некоторым вариантам реализации микрофлюидное устройство может быть выполнено как показано на ФИГ. 6а - 6с с двумя функциональными элементами 5, соединенными последовательно. Первый функциональный элемент 5 расположен в камере 6 и промывается сверху, т.е. вертикально. Первый функциональный элемент 5 связан с резервуаром 8 для реагентов. Второй функциональный элемент 5 расположен с нижней стороны и связан с выходным отверстием первого функционального элемента 5 через систему 2 каналов, с дополнительным резервуаром 8 для реагентов, предназначенным для дополнительной подачи текучей среды, соединенным между указанными функциональными элементами.

[0106] Первый функциональный элемент 5 принимает образец через порт 4.1 для текучей среды. Затем образец или проходит через первый функциональный элемент 5 самостоятельно, или его транспортируют дополнительно во второй функциональный элемент 5 реагентами из резервуара 8 для реагентов. Затем элюат удаляют из микрофлюидного устройства через второй функциональный элемент 5 и порт 4.2 для текучей среды. Реагенты могут быть перемещены из резервуара 8 для реагентов, который соответствует системе 2 каналов для текучей среды перед первым функциональным элементом 5, или из резервуара 8 для реагентов, который соответствует системе 2 каналов для текучей среды перед вторым функциональным элементом 5.

[0107] Первый функциональный элемент 5 является блоком для выработки плазмы или сыворотки из крови, а второй функциональный элемент 5 используют для удаления гемолизированных эритроцитов.

[0108] Этот вариант реализации по ФИГ. 6а-6 с обеспечивает возможность путем объединения двух функциональных элементов 5 подавать большие объемы образца через первый функциональный элемент 5 и удалять мешающие компоненты посредством второго функционального элемента 5, так что проблема вырабатывания больших объемов плазмы/сыворотки в микрофлюидном чипе устраняется на следующем этапе, и, кроме того, могут использоваться образцы крови, которые уже демонстрируют признаки старения или в целом уже имеют лизированные эритроциты.

[0109] Согласно одному варианту реализации по ФИГ. 7а - 7с микрофлюидное устройство имеет два функциональных элемента 5, соединенных последовательно, причем первый функциональный элемент 5 открыт действию образца через порт 4.1 для текучей среды.

[0110] Затем образец или протекает независимо через первый функциональный элемент 5, или переносится дополнительно во второй функциональный элемент 5 реагентами из первого назначенного резервуара 8 для реагентов.

[0111] Затем второй функциональный элемент 5 обеспечивает возможность выпуска элюата из указанного устройства через порт 4.2 для текучей среды, причем реагенты могут быть перемещены из резервуара 8 для реагентов, который соединен с системой 2 каналов для текучей среды перед первым функциональным элементом 5, или из резервуара для реагентов, который соединен с системой 2 каналов для текучей среды только перед вторым функциональным элементом 5.

[0112] При таком расположении первый функциональный элемент 5 является блоком для выработки плазмы или сыворотки из крови, в то время как второй функциональный элемент 5 используется для извлечения нуклеиновых кислот из полученной плазмы/сыворотки.

[0113] Резервуар 8 для реагентов соединен с первым функциональным элементом 5 для разбавления и выталкивания плазмы/сыворотки.

[0114] Резервуары 8 для реагентов, расположенные выше по ходу потока второго функционального элемента 5, используются для выталкивания нежелательных компонентов и отделения целевого компонента.

[0115] Для способствования отделению целевого компонента может быть обеспечен нагрев для ускорения разделения.

[0116] Поток текучей среды внутри микрофлюидного устройства обеспечен открытием и закрытием соответствующих портов 4.1, 4.2 и 4.3 для текучей среды, так что целевая фракция может быть получена без загрязнения через один из портов 4.2 или 4.3 для текучей среды или может быть транспортирована непосредственно в смежные области системы 2 каналов для текучей среды.

[0117] Ниже описано микрофлюидное устройство по ФИГ. 8а-8 с. Три функциональных элемента 5 соединены последовательно, причем в первый функциональный элемент 5 подают образец через порт 4.1 для текучей среды.

[0118] Затем образец или протекает автономно через первый функциональный элемент 5, или его вводят дополнительно во второй функциональный элемент 5 посредством реагентов из первого резервуара 8 для реагентов, причем указанный этап обработки повторяют во втором функциональном элементе 5, и затем элюат передают в третий функциональный элемент 5, при этом одну часть оставляют в третьем функциональном элементе 5, а нежелательные компоненты могут быть смыты посредством резервуаров 8 для реагентов и либо оставлены в камере 7 для отходов, либо выпущены через один из портов 4.2 или 4.3 для текучей среды.

[0119] Желательный компонент может быть получен при закрытии части системы 2 каналов для текучей среды, которая непосредственно соединена с резервуаром 7 для отходов через порт 4.2 для текучей среды, или он может быть направлен для дополнительной обработки в системе 2 каналов для текучей среды.

[0120] Ниже описано микрофлюидное устройство по ФИГ. 9а - 9с, выполненное подобно устройству по ФИГ. 8а - 8с, причем в данном случае доступна дополнительная камера 6 обнаружения. Камера обнаружения покрыта по меньшей мере частично прозрачной частью конструктивного элемента 3, или структурированный компонент 1 по меньшей мере частично является прозрачным в области камеры 6 обнаружения для обеспечения возможности визуального инспектирования состояния элюата.

[0121] В данном случае также три функциональных элемента 5 расположены последовательно, причем первый функциональный элемент 5 открыт действию образца через порт 4.1 для текучей среды.

[0122] Затем образец или протекает через функциональный элемент 5 самостоятельно, или его направляют также к второму функциональному элементу 5 реагентами из первого резервуара 8 для реагентов, причем указанный этап обработки повторяют во втором функциональном элементе 5, и затем элюат передают через третий функциональный элемент 5, причем часть элюата оставляют в третьем функциональном элементе 5, а нежелательные компоненты смывают реагентами из резервуаров 8 для реагентов и либо оставляют в камере 7 для отходов, либо выпускают.

[0123] Желательный компонент может быть получен путем закрытия части системы 2 каналов для текучей среды, которая непосредственно соединена с резервуаром 7 для отходов, и может быть или удален через порт 4.2 для текучей среды или передан к другой функции в системе 2 каналов для текучей среды.

[0124] Затем элюат выводят из указанного устройства через второй функциональный элемент 5 и через выходной порт 4.2 для текучей среды, причем реагенты могут быть перемещены из резервуара 8 для реагентов, который соединен с системой 2 каналов для текучей среды перед первым функциональным элементом 5, или из резервуара для реагентов, который соответствует только системе 2 каналов для текучей среды перед вторым функциональным элементом 5.

[0125] Первый функциональный элемент 5 является блоком для выработки плазмы или сыворотки из крови. Второй функциональный элемент 5 используют для извлечения нуклеиновых кислот из полученной плазмы/сыворотки. Резервуар 8 для реагентов, соединенный с первым функциональным элементом 5, предусмотрен для разбавления и выталкивания полученной плазмы/сыворотки. Резервуары 8 для реагентов, расположенные выше по ходу потока второго функционального элемента 5, используют для выталкивания нежелательных компонентов и удаления целевого компонента. Разделение целевого компонента также может быть ускорено добавлением нагрева. Направление текучей среды обеспечено открытием и закрытием соответствующих портов для текучей среды, так что целевая фракция может быть получена без загрязнения через порт 4.2 или 4.3 для текучей среды или может быть транспортирована непосредственно в смежные области системы 2 каналов для текучей среды.

[0126] Вариант реализации по ФИГ. 10а - 10с подобен варианту реализации по ФИГ. 9а - 9с. В данном случае имеется дополнительная вторая камера 6 обнаружения. Путем добавления индикаторных растворов из одного из резервуаров 8 для реагентов могут быть выработаны оптически распознаваемые реакции, например, цветовые изменения, которые затем могут наблюдаться в одной из двух камер 6 обнаружения.

[0127] Вариант реализации по ФИГ. 11a - 11с подобен варианту реализации по ФИГ. 10а - 10с. В данном случае массив реагентов расположен во второй камере обнаружения. Эти реагенты вызывают реакцию элюата, которая затем может быть обнаружена визуально.

[0128] В варианте реализации по ФИГ. 12 показаны приведенные для примера измерительные окна 13, через которые может быть осуществлено оптическое считывание, и предпочтительным является обеспечение нескольких глубин измерений для расширения динамического диапазона измерений. Особенно предпочтительным является использование измерительных окон для определений концентрации элюированных образцов, например, определения концентрации элюированных нуклеиновых кислот или белков. Соответствующее измерительное окно 13 расположено позади второго и третьего функциональных элементов 5.

[0129] Вариант реализации по ФИГ. 13а - 13с представляет собой систему каналов для обработки текучей среды, непосредственно связанную с шприцевым насосом 14, 15, который образован за одно целое со структурированным компонентом 1 или может быть изготовлен отдельно. Шприцевой насос включает в себя корпус 14 и плунжер 15. Шприцевой насос может управляться плунжером 15 и может использоваться для хранения текучей среды, отходов, собранных во время использования системы каналов для обработки текучей среды, а также для управления текучей средой во время использования системы каналов для обработки текучей среды. Шприцевой насос соединен с системой 2 каналов.

[0130] Вариант реализации по ФИГ. 14а - 14с в дополнение к компонентам варианта реализации по ФИГ. 13 включает в себя вращательный клапан 16, который может переключать отдельные сегменты сети каналов для текучей среды или канальные линии, которые в данном случае для примера начинаются от шприцевого насоса 14, так что указанные сегменты могут управляться по текучей среде как по отдельности, так и вместе. На ФИГ. 14b показан вид в разрезе вдоль линии 14b, и на ФИГ. 14 с показан вид сверху по линии 14с.

[0131] Вариант реализации по ФИГ. 15а - 15с включает в себя систему каналов для обработки текучей среды, подобную системе в варианте реализации по ФИГ. 14, которая включает в себя вместо реакционной камеры или камеры 12 обнаружения с массивом реагента, расположенным ниже по ходу потока, как показано на ФИГ. 14а, множество параллельных реакционных камер 20, которые могут использоваться для полимеразной цепной реакции (ПЦР), реакции ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦР), количественной реакции ПЦР в режиме реального времени (КПЦР) или объединенной реакции ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ПЦР, ОТ-ПЦР, КПЦР). Заполнение камер 20 выполняется параллельно или последовательно и достигается вентилированием в конце этой области системы каналов для текучей среды через газопроницаемую мембрану 23. Альтернативно может использоваться закрытый резервуар для воздуха благодаря сжимаемости воздуха и эффекту Бойля-Мариотта. Реагенты могут присутствовать в системе 2 каналов, а также в реакционных камерах 6.

[0132] Вариант реализации по ФИГ. 16а, 16b включает в себя дополнительную камеру 20, которая может содержать реагенты, предпочтительно реагенты для реакции ПЦР или обратной транскрипции.

[0133] В вариантах реализации по предыдущим чертежам реагенты могут храниться в одной или более камерах 6 и камерах 20 для реакции ПЦР, особенно сухие реагенты для обратной транскрипции или реакции ПЦР (ОТ-ПЦР, КПЦР, обычной реакции ПЦР).

[0134] Вариант реализации по ФИГ. 17а, 17b дополнительно включает в себя опцию закрытия камеры 20 для реакции ПЦР одним мембранным клапаном 21 для каждой реакции, что является особенно предпочтительным для удерживания текучих сред в камере 20 для реакции ПЦР даже при высоких температурах.

[0135] Вариант реализации по ФИГ. 18а включает в себя приведенную для примера последовательность мембранных клапанов 21, которые обеспечивают управление текучей средой в системе каналов для обработки текучей среды и расположены в различных местоположениях в системе 2 каналов для закрытия частей системы 2 каналов и, таким образом, для обеспечения возможности осуществления управления потоком текучей среды внутри микрофлюидного устройства.

[0136] Вариант реализации по ФИГ. 19 имеет последовательность функциональных элементов, которые последовательно обрабатывают образец, поступающий из входного отверстия для текучей среды. Образец подается во входное отверстие 4.1 для текучей среды и затем входит в реакционную камеру 6, которая может содержать смешивающие элементы и реагенты, и в которую текучая среда может быть добавлена из резервуаров 8 для реагентов для реакции с образцом.

[0137] Через вращательные клапаны 16 указанная смесь достигает функционального элемента 5 для получения очищенных целевых молекул путем протекания с различными текучими средами из резервуаров 8 для реагентов, объем которых может быть впоследствии измерен посредством измерительных шлейфов 22 во втором вращательном клапане 16, и каждая из указанных молекул затем может достигать следующей реакционной камеры 6 с заданным объемом, в которой могут присутствовать сухие реагенты или текучие среды. Затем эта смесь проходит в параллельные реакционные полости 6, которые могут использоваться, например, для реакции ПЦР (КПЦР, ОТ-ПЦР, простой реакции ПЦР). Управление текучей средой выполняется посредством шприцевого насоса 14, вращательных клапанов 16 и выборочного опорожнения резервуаров 8 для реагентов.

[0138] Вариант реализации по ФИГ. 19 может использоваться таким способом, согласно которому выходные каналы и/или входные каналы, ведущие из камер 20 для реакции/реакции ПЦР, уплотнены способом уплотнения, например, сваркой, термосваркой или герметизацией, так что текучие среды остаются в камерах 20 даже во время температурных циклов реакции ПЦР.

[0139] В способе по ФИГ. 19 образец, включающий нуклеиновую кислоту всасывают в реакционную камеру 6 через порт 4.1 для текучей среды с использованием встроенного шприцевого насоса 14. В указанной реакционной камере 6 образец смешивают с лизирующим буфером из резервуаров 8 для реагентов, вследствие чего он активно разлагается. Образец лизата всасывают через указанный элемент встроенным шприцевым насосом 14 через вращательный клапан 16. Кроме того, образец в функциональном элементе 5 очищают промывочным буфером из резервуаров 8 для реагентов, так что в функциональном элементе 5 остаются чистые нуклеиновые кислоты. Избыточный образец и промывочный буфер отсасывают шприцевым насосом 14 и оставляют в нем в качестве отходов. Вытесняющий буфер из резервуаров 8 для реагентов удаляет остальные компоненты промывочных буферов, и затем их заливают элюирующим буфером из резервуаров 8 для реагентов. Элюирующий буфер после его инкубации в функциональном элементе 5 перекачивают давлением из остальных резервуаров для реагентов через вращательный клапан 16 в измерительный шлейф 22, таким образом точно размещая желательный объем в системе 2 каналов для текучей среды. Конструкция 7 для отходов, снабженная вентиляционным отверстием, служит переливным устройством для избыточного элюата. Затем элюат нуклеиновой кислоты вымывают из измерительного шлейфа 22 реагентом ПЦР или буфером из резервуара 8 для реагентов и транспортируют в реакционную камеру 6. Он может содержать высушенные реагенты ПЦР, которые суспендируют в реакционной камере 6. Дополнительным давлением из резервуаров 8 для реагентов смесь элюата и реагента ПЦР проталкивают через вращательный клапан 16 в камеры 6/20 для реакции ПЦР/КПЦР/ОТ-ПЦР, где они равномерно заливаются. Затем камеры 6/20 для реакции ПЦР могут быть термоизолированы на входе и выходе согласно предпочтительному варианту реализации, и затем выполняют температурный цикл с амплификацией и оптическим обнаружением.

[0140] Предпочтительный вариант включает в себя изотермическую амплификацию нуклеиновой кислоты.

[0141] Согласно еще одному предпочтительному варианту очищенной нуклеиновой кислотой является рибонуклеиновая кислота (РНК), которая подвергается обратной транскрипции перед амплификацией.

[0142] Микрофлюидное устройство или функциональный блок для обработки текучей среды согласно настоящему изобретению могут использоваться в качестве независимых конструктивных элементов, но в то же время они также могут быть частью расширенной системы каналов для обработки текучей среды. Это, в частности, имеет место в случае с микрофлюидными чипами, которые охватывают дополнительные функции, причем и микрофлюидное устройство, и способы его работы согласно настоящему изобретению охватывают только частичные области.

[0143] Портами для текучей среды являются элементы, которые могут использоваться для ввода или выпуска сред, для вентилирования, закрытия или открытия с целью создания давления или отрицательного давления, а также для соединения устройств с портами или для использования с ручным управлением. Такие порты для текучей среды могут иметь любую форму, например, форму отверстий, выемок, минилюэровского соединителя, люэровского соединителя, люэровского наконечника, соединителя типа "оливка" или другие геометрические формы, причем в случае варианта с вентилированием порты могут быть закрыты газопроницаемыми, но уплотненными по текучей среде компонентами, например, газопроницаемыми мембранами.

[0144] Закрытие портов для текучей среды в целом может быть достигнуто дополнительными элементами, такими как колпачки, или с использованием клапанов на функциональном элементе в виде мембранных клапанов, вращательных клапанов или пассивных клапанов, например, сквозных сужений канала, или изменений поверхности основного материала. Клапанами обычно управляет соответствующее рабочее устройство, при этом альтернативно в некоторых вариантах реализации возможно ручное управление.

[0145] Элементы (фильтры, мембраны, фритты, бумага или подобные элементы) могут быть соединены непосредственно со структурированным элементом во время процесса его изготовления, например, в виде вставной части при литье под давлением или после него.

[0146] Части системы каналов для текучей среды, описанные как камера 6, 7, могут быть выполнены в виде камеры, канала и т.п. и не обязательно отличаются геометрическими размерами перед или после указанной камеры, например, поперечными сечениями канала.

[0147] Резервуары 8 для реагентов, показанные в различных вариантах реализации, также могут быть выполнены в виде портов для текучей среды и могут быть питаемы из внешних резервуаров для реагентов, например, из рабочего устройства.

[0148] Транспортировка текучей среды через функциональный элемент может быть достигнута внешним давлением или вакуумом, нагнетанием среды из резервуаров для реагентов, встроенными насосными клапанами, силами поверхностного натяжения, капиллярными силами и т.п.

[0149] В настоящем изобретении описано микрофлюидное устройство с системой каналов для обработки текучей среды, имеющей по меньшей мере один порт для текучей среды и по меньшей мере один вставленный пористый функциональный элемент, через который проходит образец, и через который впоследствии могут быть направлены дополнительные текучие среды или газы. Все устройство содержит по меньшей мере один структурированный конструктивный элемент, и по меньшей мере один конструктивный элемент, нанесенный на указанный структурированный конструктивный элемент, а также предпочтительно пористый функциональный элемент.

[0150] Функциональный блок согласно настоящему изобретению обеспечивает разделение, очистку, фракционирование и концентрацию компонентов.

[0151] Предпочтительные варианты реализации функционального блока включают в себя множество функциональных элементов и также содержат резервуары для текучей среды в микрофлюидном устройстве.

[0152] Согласно настоящему изобретению, микрофлюидным устройством следует управлять соответствующим способом.

[0153] Системой можно управлять вручную или посредством простых устройств или оборудования.

[0154] Если говорить о камере 20 для реакции ПЦР, она может быть аналогом камеры для различных форм реакции ПЦР, такой как реакция ОТ-ПЦР, КПЦР, обратная транскрипция, комбинированная обратная транскрипция или даже изотермические способы амплификации нуклеиновых кислот, такие как амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (nucleic acid sequence-based amplification, NASBA), рандомизированное контролируемое исследование (multicenter randomized controlled trial, RCT) и т.п.

ССЫЛОЧНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

1 - структурированный компонент

2 - Система каналов для текучей среды

3 - Конструктивный элемент

4 - Порт для текучей среды

4.1 - Входной порт для текучей среды

4.2 - Выходной порт для текучей среды

4.3 - Выходной порт для текучей среды, например, для отходов, вентиляции

5 - Функциональный элемент/пористый элемент (фильтр/мембрана/фритта/бумага или подобный элемент)

6 - Реакционная камера - компонент системы каналов для текучей среды

7 - Камера для отходов

8 - Резервуар для реагентов/блистер, например

9 - Блистерное седло

10 - Прокалывающий элемент

11 - Колпачок

12 - Область обнаружения

13 - Поле измерения

14 - Корпус шприцевого насоса

15 - Плунжер шприцевого насоса

16 - Вращательный клапан

17 - Седло вращательного клапана

18 - Корпус вращательного клапана

19 - Колпачок вращательного клапана

20 - Камера для реакции ПЦР/КПЦР/ОТ-ПЦР

21 - Мембранный клапан

22 - Элемент для измерения объема (измерительный шлейф)

23 - Вентиляционная мембрана

Изобретение относится к микрофлюидному устройству и способу его использования для разделения, очистки и концентрации компонентов текучих сред. Микрофлюидное устройство для разделения, очистки и концентрации компонентов текучих сред, содержащее: структурированный компонент (1), образованный в виде плоского корпуса; микрофлюидную систему (2) каналов, образованную в структурированном компоненте (1); по меньшей мере один конструктивный элемент, выбранный из пластины или пленки, нанесенный на верхнюю сторону и/или нижнюю сторону структурированного компонента (1) для закрытия микрофлюидной системы (2) каналов с уплотнением; по меньшей мере один пористый функциональный элемент (5), выбранный из фильтра, мембраны, фритты или функциональной бумаги, и по меньшей мере один порт (4.1, 4.2, 4.3) для текучей среды, расположенный в структурированном компоненте (1), для подачи сред в микрофлюидную систему (2) каналов и реагенты и/или сухие реагенты, обеспеченные по меньшей мере в одной реакционной камере (6) и/или по меньшей мере в одной камере (20) для реакции ПЦР. Технический результат – повышение степени разделения и очистки компонентов. 4 н. и 22 з.п. ф-лы, 19 ил.

1. Микрофлюидное устройство для разделения, очистки и концентрации компонентов текучих сред, содержащее:

структурированный компонент (1), образованный в виде плоского корпуса;

микрофлюидную систему (2) каналов, образованную в структурированном компоненте (1);

по меньшей мере один конструктивный элемент, выбранный из пластины или пленки, нанесенный на верхнюю сторону и/или нижнюю сторону структурированного компонента (1) для закрытия микрофлюидной системы (2) каналов с уплотнением;

по меньшей мере один пористый функциональный элемент (5), выбранный из фильтра, мембраны, фритты или функциональной бумаги, и

по меньшей мере один порт (4.1, 4.2, 4.3) для текучей среды, расположенный в структурированном компоненте (1), для подачи сред в микрофлюидную систему (2) каналов, и

реагенты и/или сухие реагенты, обеспеченные по меньшей мере в одной реакционной камере (6) и/или по меньшей мере в одной камере (20) для реакции ПЦР.

2. Микрофлюидное устройство по п. 1, также содержащее: по меньшей мере один резервуар (8, 16) для текучей среды, сужение канала, клапан, переключатель, распределитель, вращательный клапан, вентиляционную мембрану, камеру (7), полость (7) или сочетание вышеперечисленного.

3. Микрофлюидное устройство по п. 1 или 2, в котором конструктивный элемент (3) имеет по меньшей мере частично прозрачные и/или по меньшей мере частично светонепроницаемые области.

4. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-3, в котором конструктивный элемент (3) образован в виде пленки, приклеенной к верхней стороне и/или нижней стороне структурированного компонента (1).

5. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-4, в котором по меньшей мере два порта (4.1, 4.2, 4.3) для текучей среды расположены в структурированном компоненте (1),

причем по меньшей мере один из портов (4.1, 4.2, 4.3) для текучей среды расположен вертикально, горизонтально и/или под любым углом по отношению к направлению потока в системе (2) каналов, и/или на поверхности структурированного компонента (1) микрофлюидного устройства,

при этом по меньшей мере один порт (4.1, 4.2, 4.3) для текучей среды предусмотрен для подачи сред, подачи образца, добавления сред и/или применения положительного или отрицательного давления, и/или для вентиляции.

6. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-5, в котором обеспечена возможность закрытия по меньшей мере одного порта (4.1, 4.2, 4.3) для текучей среды и/или системы (3) каналов, и/или их части по меньшей мере одним встроенным клапаном, по меньшей мере одним наружным переключателем или по меньшей мере одним клапаном и/или по меньшей мере одним колпачком (11),

причем клапаны выполнены в виде мембранных клапанов или вращательных клапанов.

7. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-6, в которое дополнительно встроены по меньшей мере один шприцевой насос (14) с относящимся к нему плунжером (15) и/или поршень.

8. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-7, в котором система (2) каналов выполнена с возможностью управления по текучей среде посредством вращательного клапана (16) и обеспечена возможность соединения каналов по меньшей мере через один вращательный клапан (16) для обеспечения возможности открытия и закрытия системы (2) каналов и/или измерения объемов посредством измерительных шлейфов (22).

9. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-8, в котором система (2) каналов выполнена с возможностью управления по текучей среде посредством вращательных и мембранных клапанов (16, 21), причем указанные клапаны обеспечивают открытие и/или закрытие части системы (2) каналов, и/или при этом обеспечена возможность управления потоком текучей среды в системе (2) каналов мембранными клапанами (21), т.е. мембранные клапаны обеспечивают открытие или закрытие канала.

10. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-9, в котором общая реакционная смесь, включающая в себя праймеры или праймеры и зонды, обеспечена в камерах (20) для реакции ПЦР в направлении потока ниже по ходу потока функционального элемента (5), причем параллельные камеры (20) для реакции ПЦР содержат различные праймеры, или в котором реакционная смесь без праймера и зондов обеспечена в одной из камер (6) в направлении потока ниже по ходу потока функциональных элементов (5), а последующие параллельные камеры (20) для реакции ПЦР, достигаемые текучей средой, содержат различные праймеры или праймеры и зонды.

11. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-10, в котором одна из камер (6) в направлении потока ниже по ходу потока функциональных элементов (5) обеспечена реагентами для обратной транскрипции, а параллельные камеры (20) для реакции ПЦР, впоследствии достигаемые текучей средой, содержат различные праймеры или праймеры и зонды с реакционной смесью.

12. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-11, в котором одна из камер (6) в направлении потока ниже по ходу потока функциональных элементов (5) содержит реагенты для обратной транскрипции, а также реакционную смесь для реакции ПЦР без праймеров или праймеров и зондов, а параллельные камеры (20) для реакции ПЦР, впоследствии достигаемые текучей средой, содержат различные праймеры или праймеры и зонды.

13. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-12, в котором одна из камер (6) в направлении потока ниже по ходу потока функциональных элементов (5) обеспечена реагентами для обратной транскрипции, причем последующая камера содержит реакционную смесь для реакции ПЦР без праймеров или праймеров и зондов, а при этом параллельные камеры (20) для реакции ПЦР, впоследствии достигаемые текучей средой, содержат различные праймеры или праймеры и зонды.

14. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-13, в котором одна из камер (6) в направлении потока ниже по ходу потока функциональных элементов (5) содержит реагенты для обратной транскрипции, а также реакционную смесь для реакции ПЦР без праймеров или праймеров и зондов, а параллельные камеры (20) для реакции ПЦР, впоследствии достигаемые текучей средой, содержат различные праймеры или праймеры и зонды.

15. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-14, в котором с наружной стороны резервуаров (8) для текучей среды, расположенных в указанном микрофлюидном устройстве, обеспечены сухие реагенты, и/или в микрофлюидном устройстве обеспечены сухие реагенты и текучая среда.

16. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-15, выполненное с возможностью разделения, очистки, фракционирования и/или концентрации компонентов подаваемой среды или подаваемого образца, и/или в указанном микрофлюидном устройстве обеспечена возможность выполнения промежуточных этапов реакций путем добавления реагентов для получения, разделения и/или концентрации целевых компонентов, причем предпочтительно целевыми молекулами являются нуклеиновые кислоты.

17. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-16, содержащее множество функциональных элементов (5), в частности пористых функциональных элементов (5), и/или один или более резервуаров для текучей среды, которые соединены выше по ходу потока множества функциональных элементов (5) и/или между ними.

18. Микрофлюидное устройство по п. 17, в котором первый функциональный элемент (5) предназначен для выработки плазмы или сыворотки из крови, а второй функциональный элемент (5) присоединен ниже по ходу потока первого функционального элемента (5) и выполнен с возможностью удаления гемолизированных эритроцитов.

19. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-18, выполненное в виде функционального блока или микрофлюидной системы, и/или выполненное с возможностью связи с одним или более другими микрофлюидными блоками для приема сред от них или доставки сред к ним, и/или выполненное с возможностью управления вручную, а также посредством присоединенных устройств или оборудования, связанных или соединенных с микрофлюидным устройством, для создания положительного и/или отрицательного давлений или подачи технологических сред.

20. Микрофлюидное устройство по любому из пп. 1-19, в котором структурированный компонент (1) изготовлен инжекционным литьем под давлением.

21. Способ обработки образца крови с использованием микрофлюидного устройства по любому из пп. 1-20, согласно которому образец подают к первому функциональному элементу (5) и функциональный элемент (5) вырабатывает плазму или сыворотку из указанного образца крови, а второй функциональный элемент (5), присоединенный ниже по ходу потока первого функционального элемента (5), удаляет гемолизированные красные кровяные тельца.

22. Способ очистки нуклеиновых кислот с использованием микрофлюидного устройства по любому из пп. 1-20, согласно которому образец подают через порт (4.1) для текучей среды, а в реакционную камеру (6) добавляют реагенты, которые разлагают клетки, присутствующие в указанном образце, после чего указанный образец пропускают через функциональный элемент, в то время как порт (4.2) для текучей среды закрыт, и нежелательные молекулы либо входят в резервуар (7) для отходов непосредственно с образцом, либо отделяются промывкой функционального элемента (5) реагентами из резервуаров (8) для текучей среды, в то время как целевые молекулы и нуклеиновые кислоты остаются в функциональном элементе (5) и удаляются только специальным реагентом из одного из резервуаров (8) для текучей среды, причем порт (4.3) для текучей среды в резервуаре (7) для отходов закрывают, а порт (4.2) для текучей среды открывают заранее, при этом обеспечена возможность удаления полученных нуклеиновых кислот из системы для обработки текучей среды через уже открытый порт (4.2) для текучей среды.

23. Способ очистки нуклеиновых кислот с использованием микрофлюидного устройства по любому из пп. 1-20, согласно которому образец подают через порт (4.1) для текучей среды и отфильтровывают функциональным элементом (5), так что клетки остаются позади, а нежелательные компоненты входят в резервуар (7) для отходов, у которого порт (4.3) для текучей среды открыт, что достигается закрытием портов (4.2 и 4.3) для текучей среды позади второго функционального элемента (5) в направлении потока, затем происходит лизирование клеток при их контакте с реагентами в полости над первым функциональным элементом (5), после чего транспортируют лизат текучими средами из одного из резервуаров (8) для реагентов, соединенного с первым функциональным элементом (5), после чего транспортируют лизат к второму функциональному элементу (5), в котором порт (4.3) для текучей среды позади второго функционального элемента (5) уже открыт, а другие порты для текучей среды закрыты, причем целевые молекулы и дополнительные молекулы связываются с функциональным элементом (5), причем путем промывки текучими средами из резервуаров (8) для реагентов осуществляют отделение нежелательных молекул, и, наконец, после закрытия порта (4.3) для текучей среды и открытия порта (4.2) для текучей среды нуклеиновые кислоты высвобождаются посредством реагента, а элюат выталкивается и удаляется из порта (4.2) для текучей среды.

24. Способ по п. 22 или 23, согласно которому нуклеиновой кислотой является ДНК или нуклеиновой кислотой является РНК.

25. Способ по любому из пп. 22-24 в сочетании со способом по п. 21.

26. Способ по любому из пп. 22-25, согласно которому очищенную нуклеиновую кислоту подвергают последующей амплификации и обнаружению; и/или

очищенной нуклеиновой кислотой является РНК, которую впоследствии подвергают первой обратной транскрипции и затем амплификации и обнаружению; и/или

все реагенты обеспечены в текучей среде или в сухой форме в микрофлюидной системе; и/или

очищенной нуклеиновой кислотой является ДНК, которую затем подвергают амплификации и обнаруживают реакцией КПЦР; и/или

очищенной нуклеиновой кислотой является ДНК, которую затем подвергают амплификации и обнаруживают изотермической амплификацией; и/или

очищенной нуклеиновой кислотой является ДНК, которую предварительно подвергают амплификации в первой камере (20) посредством неспецифической реакции ПЦР и впоследствии обнаруживают посредством специфической реакции КПЦР; и/или

очищенной нуклеиновой кислотой является РНК, которую подвергают обратной транскрипции в первой камере (20) и подвергают амплификации и обнаруживают во второй камере (20) посредством реакции КПЦР; и/или

очищенной нуклеиновой кислотой является РНК, которую подвергают в камере (20) как обратной транскрипции, так и реакции КПЦР (одноступенчатой реакция ОТ-ПЦР); и/или

множество параллельных камер (20) для реакции КПЦР предусмотрены для осуществления реакции КПЦР в параллельных камерах для реакции ПЦР; и/или

реакцией КПЦР является дуплексная реакция ПЦР с внутренним контролем амплификации; и/или

реакцией КПЦР является мультиплексная реакция ПЦР с внутренним контролем амплификации; и/или

реакцией ПЦР является обычная реакция ПЦР, которая при необходимости впоследствии обнаруживается матричной гибридизацией.